PT1805199E - Métodos de amplificação de ácidos nucleicos - Google Patents

Description

ΕΡ 1 805 199/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Métodos de amplificação de ácidos nucleicos"

CAMPO TÉCNICO

Este invento refere-se a reacções de amplificação de ácidos nucleicos, incluindo as amplificações que utilizam a reacção em cadeia da polimerase, e a ensaios que utilizam estas reacções em combinação com a sequenciação e métodos de detecção de sondas de hibridação.

ANTECEDENTES

As técnicas e os ensaios de amplificação de ácidos nucleicos são bem conhecidos. Algumas reacções de amplificação são isotérmicas, tais como a amplificação baseada na sequência de ácidos nucleicos (NASBA de "Nucleic Acid Sequence Based Amplification"). Outras utilizam ciclos térmicos, como a reacção em cadeia da polimerase (PCR de "Polymerase Chain Reaction"). Os ensaios de amplificação preferidos que recorrem à detecção do produto amplificado por fluorescência são homogéneos, isto é, não requerem a separação fisica dos reagentes para permitir a detecção (por exemplo, uma separação das sondas ligadas das sondas não ligadas) e podem ser efectuados num único recipiente fechado. Estes ensaios poderão ser em ponto final, em que o produto é detectado após a amplificação, ou poderão ser em tempo real, em que o produto é detectado à medida que a amplificação decorre. A amplificação de ácidos nucleicos e os ensaios que utilizam a reacção de PCR estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 4,683,202; 4,683,195 e 4,965,188 e, de um modo geral, em PCR PROTOCOLS, A Guide to Methods and Applications, Innis et al. eds., Academic Press (San Diego, CA (USA) 1990). Os ensaios de PCR homogéneos, incluindo os ensaios em tempo real, em que o produto amplificado é detectado durante alguns ciclos ou durante todos os ciclos de PCR à medida que a reacção decorre, estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5,994,056; 5,487,972; 5,925,517 e 6,150,097. 2 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ

As reacções de amplificação por PCR são geralmente concebidas para serem simétricas, isto é, para produzir amplicões de cadeia dupla exponencialmente mediante a utilização de um iniciador directo e de um iniciador inverso em concentrações equimolares e com temperaturas de fusão (Tm de "Melting Temperature") iguais. Uma técnica que encontrou uma utilização limitada para produzir directamente ADN de cadeia simples, numa reacção de PCR, é a "reacção de PCR assimétrico". Gyllensten and Erlich, "Generation of Single-Stranded dna by the Polymerase Chain Reaction and Its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA Locus", Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85: 7652-7656 (1988); e Patente U.S. 5,066,584. A reacção de PCR assimétrico é um método de amplificação por PCR não simétrico, que difere da reacção de PCR simétrico na medida em que um dos iniciadores é diluído 5 a lOOx de modo a estar presente numa quantidade limitante de 1-20% da concentração do outro iniciador. Como consequência, a amplificação consiste numa fase exponencial em que ambos os iniciadores sofrem extensão, gerando o produto de cadeia dupla, ou amplicão, seguida de uma amplificação linear em que apenas resta um iniciador, gerando um amplicão de cadeia simples.

Mais recentemente, desenvolvemos um método de amplificação por PCR assimétrico conhecido por PCR "Linear-After-The-Exponential" ("linear após a exponencial") ou, abreviadamente, "LATE-PCR". A reacção de LATE-PCR é uma amplificação por PCR assimétrico consistindo numa fase exponencial na qual ambos os iniciadores são hibridados e sofrem extensão, seguida de uma fase linear após o esgotamento do iniciador limitante, em que apenas o iniciador em excesso é hibridado e sofre extensão. Consultar Sanchez et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 101:1933-1938, Pedido internacional de patente publicado WO 03/054233 (3 de Julho de 2003) e Pierce et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 102:8609-8614.

Um método conveniente e barato de monitorização da produção do amplicão de cadeia dupla, numa reacção de amplificação por PCR, consiste em utilizar um corante que emite fluorescência ao ser intercalado em, ou ao interagir de outro modo com, ADN de cadeia dupla, tal como SYBR Green I ou 3 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ SYBR Gold. Consultar, por exemplo, Patente U.S. 5,994,056. A análise da temperatura de fusão dos amplicões, efectuada quer em tempo real durante uma amplificação por PCR quer após a amplificação, é utilizada para a identificação dos produtos. Um problema com a utilização desta análise das temperaturas de fusão é o facto de a fluorescência do corante ser uma função do tamanho do amplicão. Outro problema é o facto de os corantes se redistribuírem dos produtos de amplificação, ou amplicões, que possuem temperaturas de fusão baixas para os amplicões com temperaturas de fusão mais elevadas durante a análise, distorcendo assim os resultados. Avançaram-se duas abordagens para solucionar estes problemas. Uma abordagem, a desactivação G ("G quenching"), impõe restrições graves à concepção dos iniciadores e origina uma grande fluorescência de fundo (Crockett AO, Wittwer CT. "Fluorescein-Labeled Oligonucleotides for Real-Time PCR: Using the Inherent Quenching of Deoxyguanosine Nucleotides" Anal. Biochem. 290:89-97 (2001)). A outra, a substituição dos corantes SYBR pelo corante LC Green, origina uma percentagem muito pequena de sinal para as sequências que não estão presentes em abundância e requer um software e um hardware extremamente especializados (Wittwer et al. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen", Clin. Chem. 49:853-860 (2003).

As sondas marcadas por fluorescência são utilizadas em ensaios homogéneos de amplificação de ácidos nucleicos, incluindo os ensaios de PCR, para medir a acumulação do amplicão desejado, quer em tempo real quer por análise em ponto final. Vários tipos de sondas disponíveis são significativamente discriminatórios de alelos em comparação com as sondas de cadeia simples lineares. As sondas de tempo real incluem sondas lineares duplamente marcadas que são clivadas pela actividade de exonuclease 5' para 3' da ADN-polimerase durante a etapa de extensão de um ciclo de PCR (ver Patentes U.S. 5,210,015; 5,487,972 e 5,538,848); sondas do tipo faróis moleculares (ver Patentes U.S. 5,925,517; 6,103,476 e 6,365,729); sondas de ligação a sulcos menores ("minor groove binding probes") (ver Afonina et al. "Minor Groove Binder-Conjugated DNA Probes for Quantitative DNA Detection by Hybridization-Triggered Fluorescence", Biotechniques 32: 946-949 (2002)); pares de sondas lineares 4 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ que FRET quando hibridam adjacentemente numa cadeia-alvo; sondas lineares, de cadeia dupla, desactivadas pelas quais um alvo compete para hibridar com a cadeia da sonda marcada (ver Li, Q. et ai. (2002), Nucl. Acid. Res. 30: e5); e as denominadas sondas "light-up", que são oligómeros de ácidos nucleicos peptidicos (PNA de "Peptide Nucleic Acid") ligados a um corante de cianina assimétrico, que emite fluorescência quando a sonda se liga ao alvo para formar uma região de cadeia dupla. Para a reacção de LATE-PCR, utilizámos sondas discriminatórias de alelos de baixa temperatura, como sejam as sondas do tipo faróis moleculares de baixa temperatura (ver WO 03/045233). As sondas oligonucleotídicas marcadas poderão ser ligadas aos iniciadores por meio de adaptadores, de modo que as sondas não sejam copiadas durante a amplificação, mas estejam livres para hibridar com uma sequência-alvo resultante da extensão do iniciador. Os exemplos são Scorpions®, iniciadores aos quais estão ligadas sondas do tipo faróis moleculares, e Anglers®, iniciadores aos quais estão ligadas sondas lineares marcadas com fluoróforos. Lee, M.A. et al. (2002), Analytica Clinica Acta 457: 61:70; Whitcombe, D. et al. (1999), Nature Biotechnology 17: 804-807. A porção de sonda destas estruturas compósitas, que transporta a marca fluorescente, híbrida separadamente a partir da porção de iniciador. Estas estruturas são, assim, sondas marcadas e iniciadores não marcados, tal como esses termos são aqui utilizados. As sondas específicas para um determinado alvo não possuem, contudo, a capacidade de monitorizar a produção total de produtos de cadeia dupla.

Determinadas sondas são tolerantes a emparelhamentos incorrectos ("mismatch"). As sondas tolerantes a emparelhamentos incorrectos hibridam com, e geram um sinal detectável para, mais de uma sequência-alvo a uma temperatura de detecção num ensaio, e vários híbridos formados desta maneira terão diferentes pontos de fusão. As sondas de cadeia simples lineares ou em espiral aleatória ("random coil") são geralmente tolerantes a emparelhamentos incorrectos. Os exemplos destas sondas consistem em sondas lineares com um grupo fluorescente interno, cujo nível de fluorescência aumenta ao dar-se a hibridação com uma ou outra cadeia-alvo; sondas lineares marcadas por fluorescência, utilizadas em combinação com os corantes SYBR Gold e SYBR Green I, de modo 5 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ que a fluorescência da marca ocorre por FRET proveniente do corante quando a sonda híbrida com um ou outro alvo (ver Publicação de patente US 2002/0119450, 28 de Agosto de 2002); os denominados "sloppy beacons" e variações de pares de sondas lineares que FRET (ver Patente U.S. 6,472,156). A utilização de múltiplas sondas, em que cada uma delas se liga apenas a um amplicão-alvo possível gerado numa reacção de amplificação, cria um problema para analisar misturas de reacção complicadas ou para detectar um ou alguns alvos entre numerosos alvos possíveis. A detecção de fluorescência disponível permite a resolução de um número limitado de fluoróforos, geralmente não mais de oito. É possível uma multiplexagem limitada, por exemplo, concebendo uma sonda farol molecular discriminatória de alelos diferente para cada alvo e marcando cada sonda diferencialmente. (Ver, por exemplo, Tyagi et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 1191-1196). As misturas de sondas discriminatórias de alelos, cada uma delas compreendendo alíquotas de múltiplas cores, aumentam o número de assinaturas de sondas e funcionam bem se apenas estiver efectivamente presente um de muitos (pelo menos até 56) alvos, mas encontram resultados ambíguos se estiver presente mais de um alvo. Há muitas situações que envolvem alvos complexos ou um entre muitos alvos possíveis. Desenvolveram-se ou propuseram-se vários esquemas para estas situações, mas todos eles possuem graves desvantagens e limitações. Tyagi et al., Pedido internacional de patente publicado WO 01/31062, descreveram uma técnica por vezes designada por "sloppy beacons", que são sondas do tipo faróis moleculares possuindo sequências compridas em volta, o que as torna tolerantes a emparelhamentos incorrectos e capazes de até certo ponto se ligarem a múltiplos alvos à temperatura de hibridação de uma reacção de amplificação por PCR. Estas sondas padecem de uma cinética de reacção fraca contra os alvos que contêm correspondências incorrectas ("mismatched") e é provável que permanecem hibridadas com os alvos perfeitamente complementares ("perfectly matched") à temperatura de extensão de uma amplificação por PCR e sejam clivadas pela ADN-polimerase Taq. Além disso, obtém-se apenas uma indicação indirecta das temperaturas de fusão dos híbridos sonda-alvo 6 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ nas condições do ensaio, e isso assume que se alcançou o equilíbrio. A multiplexagem em tempo real em amplificações por PCR simétrico com sondas FRET já foi descrita. De modo a não interferir com a amplificação, as temperaturas de fusão de todos os híbridos sonda-alvo estão restringidas ao intervalo de temperaturas estreito compreendido entre a temperatura de hibridação dos iniciadores e a temperatura de extensão dos iniciadores. Adicionalmente, esse esquema não é quantitativo. Ensaios multissonda após a amplificação empregando sondas FRET de diferentes cores já foram descritos. Wittwer et al., "Real-Time Multiplex PCR Assays, Methods" 25:430-442 (2001). A mistura reaccional após uma amplificação por PCR simétrico é rapidamente arrefecida e, em seguida, lentamente aquecida para determinar as curvas de fusão para os vários fluoróforos presentes. Esta abordagem não é quantitativa. Adicionalmente, devido à grande dispersão observada entre as réplicas de amplificações por PCR simétrico, os ensaios em ponto final em geral tendem a ser apenas qualitativos. A sequenciação dos produtos de reacção fornece uma alternativa à utilização de sondas. A sequenciação pelo método de Sanger tradicional poderá utilizar os produtos de reacções de amplificação, como sejam a reacção de PCR simétrico ou de LATE-PCR, como materiais de partida para a sequenciação cíclica. O produto amplificado é purificado por precipitação com etanol ou utilizando uma coluna de afinidade para remover os dNTP e os iniciadores remanescentes, sujeito a uma reacção de sequenciação cíclica usando um iniciador de sequenciação e didesoxinucleótidos marcados por fluorescência e submetido a electroforese capilar em gel. A "pirossequenciação" é um método isotérmico e em tempo real de sequenciar através de síntese, que é conhecido na arte. Caso sejam utilizados métodos de amplificação exponencial, por exemplo a reacção de PCR, na preparação do material de partida para a pirossequenciação, o produto amplificado terá obrigatoriamente de ser purificado por isolamento do produto de cadeia simples, assim como por remoção dos dNTP, do pirofosfato e dos iniciadores não incorporados a partir da reacção de amplificação. A reacção de LATE-PCR simplifica a preparação da amostra, uma vez que produz essencialmente 7 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ produto de cadeia simples, mas não elimina, em e por si, a necessidade de purificar o produto.

Um aspecto deste invento consiste em métodos para a detecção homogénea dos produtos de reacções de amplificação, com ciclos de temperatura ou isotérmicas, utilizando a detecção de fluorescência proveniente de iniciadores oligonucleotidicos lineares marcados com fluoróforos e indirectamente excitados mediante a excitação de um corante de ADN fluorescente como SYBR Green I ou, preferencialmente, SYBR Gold. Estes corantes tornam-se fluorescentes quando se associam a ADN de cadeia dupla, no qual se intercalam. Os métodos precedentes poderão ser realizados em tempo real ou após a reacção de amplificação, quer por leitura da fluorescência a uma temperatura de detecção (detecção em ponto final) quer por verificação das alterações da fluorescência em função da temperatura através de uma análise de fusão após a amplificação. À medida que uma mistura reaccional é aquecida ao longo das temperaturas de fusão dos vários produtos de reacção, a fluorescência diminui progressivamente à medida que os vários amplicões compreendendo um determinado iniciador que inclui um fluoróforo atingem as suas temperaturas de fusão e passam a cadeias simples. Os métodos preferidos incluem o cálculo da razão do sinal do iniciador para o sinal do corante.

Outros aspectos ainda deste invento são métodos homogéneos para detectar os produtos de reacções de LATE-PCR, empregando uma etapa de detecção a baixa temperatura.

Determinadas concretizações compreendem a inclusão, na mistura reaccional, de pelo menos uma sonda discriminatória de alelos de acordo com este invento, nomeadamente, uma sonda de cadeia dupla desactivada, geralmente do tipo descrito por Li, Q. et al. (2002) Nucl. Acids Res. 30:e5, com a excepção de ser uma sonda específica para um determinado alvo, de baixa temperatura (baixa Tm ou super baixa Tm) e indirectamente excitada através da excitação de um corante de ADN fluorescente intercalado no híbrido sonda-alvo tal como, de preferência, SYBR Gold. Outras concretizações compreendem a inclusão, na mistura reaccional, de pelo menos uma sonda tolerante a emparelhamentos incorrectos indirectamente excitável de acordo com este invento, nomeadamente, uma sonda 8 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ de cadeia simples desactivada, geralmente do tipo descrito por Lee e Furst, Pedido de patente U.S. publicado No. US 2002/0119450, com a excepção de ser uma sonda de baixa temperatura desactivada. Estes vários métodos incluem a excitação do corante durante as etapas de detecção a baixa temperatura de uma amplificação por LATE-PCR, e a detecção da fluorescência proveniente das sondas nestas condições para fornecer uma medida da sequência-alvo de cadeia simples. Concretizações particulares poderão incluir ainda a medição da quantidade total de produto(s) de cadeia dupla na mistura de reacção através da detecção da fluorescência do corante, preferencialmente durante ou no final da etapa de extensão dos ciclos de PCR enquanto a temperatura da mistura reaccional está acima da(s) temperatura(s) de fusão das sondas. Determinados métodos preferidos incluem o cálculo da razão do sinal da sonda para o sinal do corante. No caso de amostras replicadas, esta razão corrige as diferenças nos rendimentos de amplificação das amostras replicadas, que se sabe terem lugar nas amplificações por PCR.

Outros aspectos deste invento consistem em métodos de detecção homogéneos para utilizar quando estão presentes ou poderão estar presentes múltiplos amplicões, em que este método compreende a inclusão, numa mistura reaccional de amplificação por LATE-PCR, de uma ou mais sondas de detecção de baixa temperatura tolerantes a emparelhamentos incorrectos que, devido à sua Tm baixa, não interferem com a amplificação e não são hidrolisadas (cortadas) por uma ADN-polimerase possuindo actividade de exonuclease 5'-3', e que emitem um sinal fluorescente quando hibridam e são excitadas, quer directamente por uma fonte de excitação adequada quer indirectamente por um corante de ADN fluorescente que é excitado por uma fonte de excitação adequada. Estes métodos incluem ensaios com uma sonda única e ensaios com múltiplas sondas para aplicações como a genotipagem. É possível marcar mais de uma sonda com o mesmo fluoróforo, caso em que a discriminação assenta numa alteração da fluorescência com a temperatura, tal como quando se utiliza uma sonda única. As sondas poderão ser marcadas com fluoróforos diferentes, caso em que a diferença de cores também é utilizada para a discriminação. A distinção entre alvos para fins de identificação e quantificação poderá incluir razões de 9 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ fluorescência entre fluoróforos à mesma ou a diferentes temperaturas, bem como razões de fluorescência do fluoróforo para o corante. A detecção é preferencialmente efectuada durante a amplificação (tempo real), mais preferencialmente, durante uma etapa de detecção a baixa temperatura incluída num protocolo de amplificação por LATE-PCR, e a etapa de detecção poderá incluir a detecção a múltiplas temperaturas. Outro aspecto ainda deste invento é uma sonda linear de cadeia simples útil nestes métodos de detecção, em que esta sonda é do tipo descrito na Publicação de pedido de patente U.S. 2002/0119450 (29 de Agosto de 2002), isto é, uma sonda que é excitada pela emissão de fluorescência de um corante de ADN fluorescente, com a excepção de ser uma sonda de baixa temperatura (baixa Tm ou super baixa Tm), tolerante a emparelhamentos incorrectos e incluir um grupo de desactivação que desactiva a fluorescência que, caso contrário, resultaria da estrutura secundária a baixa temperatura.

SUMARIO

Neste pedido fazem-se referências às temperaturas de fusão, Tm, dos iniciadores, sondas e amplicões de ácidos nucleicos. Tm designa a temperatura à qual metade do material em questão existe na forma de cadeia dupla e a restante é de cadeia simples. Geralmente, exceptuando no caso de LATE-PCR, a Tm de um iniciador é um valor calculado utilizando o método "%GC" (Wetmar, J.G. (1991) "DNA Probes: Applications of the Principies of Nucleic Acid Hybridization", Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227-259) ou o método "2(A+T) mais 4(G+C)", ambos bem conhecidos, numa condição padrão de concentração de iniciador e de sal. A reacção de LATE-PCR, contudo, tem em consideração as temperaturas de fusão efectivas dos iniciadores numa reacção particular, levando em linha de conta as concentrações dos iniciadores no início da amplificação. Consultar Sanchez et al. (2004) PNAS (USA) 101: 1933-1938 e Pierce et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 102: 8609-8614.

Neste pedido, designamos esta temperatura de fusão ajustada à concentração no início da amplificação por Tm[0], que pode ser determinada empiricamente, como acontece quando 10 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ se utilizam nucleótidos não naturais, ou calculada de acordo com o método do "vizinho mais próximo" (Santa Lucia, J. (1998), PNAS (USA) 95:1460-1465; e Allawi, H.T. & Santa

Lucia, J. (1997), Biochem. 36:10581-10594) utilizando um ajuste da concentração do sal, que nos exemplos abaixo consistiu numa concentração de catião monovalente igual a 0,07 Μ. A reacção de LATE-PCR também poderá ter em consideração a temperatura de fusão do amplicão, que é calculada utilizando a fórmula: Tm = 81,5 + 0,41 (%G+%C) - 500/L + 16,6 log [M]/(1 +0,7 [M]), em que L é o comprimento ("length") em nucleótidos e [M] é a concentração molar dos catiões monovalentes. As temperaturas de fusão das sondas lineares, ou em espiral aleatória, são calculadas tal como no caso dos iniciadores. As temperaturas de fusão das sondas estruturadas, por exemplo, as sondas do tipo faróis moleculares, podem ser determinadas empiricamente.

Tal como utilizado neste pedido, o termo "LATE-PCR" designa uma amplificação de ADN assimétrica que emprega o processo de reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando um iniciador oligonucleotidico (o "iniciador em excesso") num excesso de pelo menos cinco vezes em relação ao outro iniciador (o "iniciador limitante"), que é, ele próprio, utilizado a baixa concentração, até 200 nM, de forma a esgotar-se num número de ciclos de PCR aproximadamente suficiente para produzir o amplicão de cadeia dupla detectável por fluorescência, em que a temperatura de fusão ajustada à concentração do iniciador limitante no início da amplificação, Tm[0]L, não é mais de 5°C inferior à temperatura de fusão ajustada à concentração do iniciador em excesso no início da amplificação, Tm[0]X, preferencialmente é pelo menos tão elevada e, mais preferencialmente, é 3-10°C mais elevada; e em que o ciclo térmico prossegue durante múltiplos ciclos após o esgotamento do iniciador limitante para produzir produto de cadeia simples, nomeadamente, o produto de extensão do iniciador em excesso, por vezes designado por "cadeia do iniciador em excesso".

Os iniciadores e sondas deste invento ou úteis nos métodos e kits deste invento são oligonucleótidos no sentido amplo, o que significa que poderão ser ADN, ARN, misturas de ADN e ARN e poderão incluir nucleótidos não naturais (por 11 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ exemplo, 2'-O-metil-ribonucleótidos) e ligações internucleotídicas não naturais (por exemplo, ligações fosforotioato). Ambos os iniciadores e as sondas funcionam, em parte, por hibridação com uma sequência de interesse numa mistura de reacção. Um iniciador é um oligonucleótido de cadeia simples que pode hibridar com a sua sequência complementar, à temperatura de hibridação dos iniciadores de uma reacção de amplificação, e sofrer extensão na sua extremidade 3' por uma ADN-polimerase. Um iniciador deste invento é um iniciador que sinaliza a hibridação da sua sequência iniciadora por meio de um fluoróforo que é indirectamente excitável. Uma sonda deste invento ou útil nos métodos e kits deste invento é ou inclui um oligonucleótido de cadeia simples que pode hibridar com a sua sequência-alvo (ou sequências-alvo) pretendida à temperatura (ou temperaturas) de detecção, numa ou após uma reacção de amplificação, e sinalizar de forma fluorescente esse evento de hibridação por meio de um fluoróforo que é indirectamente excitável. Tal como o termo é aqui utilizado, uma "sonda" não sofre extensão por uma ADN-polimerase na reacção de amplificação. As sondas que são muito especificas para uma sequência-alvo perfeitamente complementar e que rejeitam fortemente as sequências muito próximas possuindo uma ou algumas bases que são correspondências incorrectas são "discriminatórias de alelos". As sondas que hibridam, em pelo menos uma condição de detecção aplicável, não só com sequências perfeitamente complementares, mas também com sequências parcialmente complementares possuindo uma ou mais bases que são correspondências incorrectas são sondas "tolerantes a emparelhamentos incorrectos". 0 termo "corante de ADN fluorescente", tal como aqui utilizado, designa uma composição, por exemplo, SYBR Green I ou SYBR Gold, que se torna excitável por fluorescência quando se associa a ADN de cadeia dupla. Foi referido que os corantes de ADN fluorescentes se intercalam no ADN de cadeia dupla, mas nós não desejamos ficar limitados por qualquer teoria de actuação.

Os iniciadores deste invento são utilizados em conjunção com um corante de ADN fluorescente e são oligonucleótidos de cadeia simples, lineares e marcados com um fluoróforo que é 12 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ excitável de modo indirecto, isto é, quando o iniciador híbrida com uma cadeia do molde, na mistura reaccional, para formar uma região de ADN de cadeia dupla, e luz (geralmente, mas não necessariamente luz visível) de um comprimento de onda que excita, ou é absorvido pelo, corante de ADN fluorescente, mas não pelo fluoróforo, é irradiada na amostra, o fluoróforo emite. Foi referido que a energia se transfere de um corante de ADN fluorescente para um fluoróforo vizinho por transferência de energia de ressonância (FRET de "Fluorescence Resonance Energy Transfer"), mas não desejamos ficar limitados por qualquer teoria de actuação. Designamos um fluoróforo que emite nestas circunstâncias por um fluoróforo que é "indirectamente excitado". As sondas deste invento também são utilizadas em conjunção com um corante fluorescente que se liga a ADN de cadeia dupla (um "corante de ADN fluorescente") e marcadas com um fluoróforo indirectamente excitável deste tipo, de modo que quando a sonda híbrida com uma cadeia-alvo na mistura reaccional e o corante é excitado, o fluoróforo emite.

Tal como aqui utilizado, o termo "kit" designa uma colecção de reagentes para efectuar uma amplificação ou um ensaio. Um kit poderá ser "completo", isto é, incluir todos os reagentes necessários para todas as etapas de uma amplificação ou amplificação-detecção. Em alternativa, um kit poderá ser "parcial", omitindo determinados reagentes necessários para aquelas operações. Ambos os kits completos e parciais deste invento poderão incluir adicionalmente reagentes para a preparação das amostras, por exemplo, para isolamento dos ácidos nucleicos e transcrição inversa. A sequenciação poderá envolver dois kits, por exemplo, um kit completo para amplificação por LATE-PCR e um kit completo para sequenciação cíclica, ou os dois poderão ser combinados num único kit.

Tal como aqui utilizado, um "conjunto de oligonucleótidos" designa uma colecção de iniciadores ou de iniciadores e sondas para efectuar uma amplificação ou um ensaio. Para a sequenciação, um conjunto de oligonucleótidos poderá incluir, por exemplo, um iniciador limitante e um iniciador em excesso para uma amplificação por LATE-PCR e um 13 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ ou mais iniciadores de sequenciação adicionais para a sequenciação cíclica. Para um ensaio com sondas de hibridação, um conjunto de oligonucleótidos poderá incluir, por exemplo, um iniciador limitante e um iniciador em excesso para uma amplificação por LATE-PCR e pelo menos uma sonda de hibridação marcada com um fluoróforo.

Tal como aqui utilizado, um método em "tubo único" designa uma série de pelo menos duas operações, por exemplo, preparação da amostra, amplificação ou sequenciação, que pode ser realizada sem transferir a amostra de um recipiente, seja ele um tubo de ensaio, um poço de reacção, uma câmara num dispositivo microfluídico, uma lamela de vidro ou qualquer outro aparelho capaz de suportar uma mistura reaccional, para outro recipiente.

As sondas que têm temperaturas de fusão baixas (isto é, as sondas que formam híbridos sonda-alvo possuindo temperaturas de fusão baixas) podem ser adicionadas às misturas reaccionais de amplificação antes do início da amplificação e utilizadas apenas quando desejado. Ao manter as temperaturas acima da temperatura de fusão de uma sonda durante toda ou partes de uma reacção de amplificação, a sonda é impedida de hibridar com o seu alvo e, eventualmente, reduzir a eficácia da reacção. Determinadas concretizações de ensaios de LATE-PCR utilizam sondas de baixa temperatura. Tal como aqui utilizado, o termo "sonda de baixa Tm" designa uma sonda de hibridação que possui uma temperatura de fusão ajustada à concentração no início da amplificação, Tm[0], pelo menos 5°C abaixo da Tm[o] do iniciador limitante num ensaio de LATE-PCR; e uma "sonda de super baixa Tm" designa uma sonda de hibridação que possui uma Tm[0] que está pelo menos 5°C abaixo da temperatura média de hibridação dos iniciadores da fase exponencial de uma reacção de LATE-PCR. As sondas são frequentemente adicionadas às reacções de LATE-PCR numa concentração de 1 micromolar (μΜ). Por conseguinte, ao concebermos as sondas, por vezes utilizamos uma Tm[0] nominal calculada da forma descrita anteriormente, mas utilizando uma concentração nominal de 1 μΜ. A maioria das sondas de baixa Tm e super baixa Tm possui uma Tm[0], calculada à concentração de 1 μΜ, no intervalo entre 30-55°C. 14 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ A detecção utilizando sondas de baixa temperatura requer uma detecção a baixa temperatura, em que a temperatura da mistura sonda-alvo é reduzida o suficiente para que as sondas marcadas de forma fluorescente hibridem e sinalizem. Isto pode ser efectuado no final da amplificação (ponto final) ou numa análise de fusão após a amplificação. Em alternativa, para um ensaio em tempo real, uma etapa de detecção a baixa temperatura poderá ser incluída em alguns ou em todos os ciclos da fase linear de uma amplificação por LATE-PCR. Preferencialmente, esta etapa ocorre após a extensão dos iniciadores e antes da fusão das cadeias a alta temperatura (ou "desnaturação"), embora pudesse ser incluída na etapa de hibridação dos iniciadores. Uma etapa de detecção a baixa temperatura, num ensaio de LATE-PCR, significa uma redução da temperatura de pelo menos 5°C abaixo da temperatura de hibridação dos iniciadores.

Determinados métodos de acordo com este invento utilizam iniciadores ou sondas de hibridação marcados com fluoróforos, em combinação com corantes fluorescentes que se ligam a adn de cadeia dupla, e incluem a estimulação de um corante a um comprimento de onda que excita o corante, mas não o(s) fluoróforos, e a detecção da fluorescência emitida por um fluoróforo que é indirectamente estimulado por este procedimento. Algumas concretizações de métodos de acordo com este invento incluem igualmente a detecção da emissão de fluorescência pelo corante. Certos métodos preferidos incluem ainda o cálculo da razão da emissão do fluoróforo para a emissão do corante.

Uma concretização deste invento inclui adicionar, a uma mistura de amplificação de ácidos nucleicos, um corante de ADN fluorescente, tal como SYBR Green I ou, preferencialmente, SYBR Gold, e pelo menos um iniciador de amplificação de acordo com este invento, ou seja, um oligonucleótido de cadeia simples, linear, que pode sofrer extensão por uma ADN-polimerase e que está marcado com um fluoróforo que é indirectamente excitável para sinalizar a iniciação conforme descrito acima; efectuar uma reacção de amplificação, preferencialmente uma reacção de PCR (incluindo LATE-PCR), que inclui hibridar e efectuar a extensão desse iniciador marcado; e durante a amplificação (detecção em 15 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ tempo real) ou após o final da amplificação (quer uma detecção em ponto final no final da reacção de amplificação quer durante uma análise térmica subsequente (curva de fusão)), excitar o corante e detectar a emissão de fluorescência proveniente do fluoróforo, quer isoladamente quer em combinação com a detecção da emissão de fluorescência por parte do corante. Concebendo um protocolo de amplificação apropriado, a análise de fusão dos produtos de cadeia dupla pode ser incluída em pontos desejados numa reacção de amplificação. Nesta concretização, apenas os iniciadores que estão incorporados no ADN de cadeia dupla apresentarão fluorescência. Os iniciadores não incorporados não apresentarão fluorescência, pelo que não há necessidade de separar fisicamente os iniciadores não ligados. O método é homogéneo. Adicionalmente, a emissão do fluoróforo provém apenas das regiões de cadeia dupla dos produtos que incluem um iniciador marcado, não de todos os produtos de cadeia dupla. O Exemplo 1 abaixo demonstra estes aperfeiçoamentos. Ele mostra que, num ciclo de extensão único concebido para produzir produtos de extensão misturados de vários comprimentos, uma curva de fusão baseada na detecção das emissões do fluoróforo do iniciador mostrou todos os produtos, ao passo que uma curva de fusão baseada na detecção das emissões do corante não o fez. O Exemplo 1 demonstra também a utilização do método desta concretização em reacções isotérmicas.

Como um perito na arte compreenderá, normalmente é importante corrigir a sobreposição de fluorescência quando um corante de ADN fluorescente, por exemplo SYBR Green I, é utilizado em conjunção com uma sonda ou um iniciador marcado por fluorescência que é excitado por FRET proveniente do corante intercalado. Isto verifica-se porque os corantes de ADN fluorescentes geralmente emitem luz ao longo de um intervalo espectral amplo que poderá incluir o comprimento de onda da luz utilizado para medir a fluorescência emitida pelo iniciador ou pela sonda. A correcção desejada pode ser obtida por: 1) estabelecimento do espectro de emissão do corante isolado; 2) medição da intensidade da emissão do corante em cada amostra a um comprimento de onda que é mais curto que o comprimento de onda de emissão do iniciador ou da sonda; 3) cálculo da intensidade da emissão do corante ao comprimento 16 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ de onda de emissão do iniciador ou da sonda com base no conhecimento dos passos 1 e 2; e 4) subtracção dessa intensidade calculada do corante da intensidade total medida ao comprimento de onda de emissão do iniciador ou da sonda. Muitos equipamentos comerciais, tais como o ABI 7700 e o Cepheid Smart Cycler, disponibilizam software para efectuar esta correcção. Em alternativa, as medições do espectro do corante, emissão do corante sozinho e emissão corante/sonda total podem ser realizadas, e uma fórmula satisfatória para correcção pode ser manualmente aplicada. Por exemplo, Lee e Fuerst, Pedido de patente U.S. publicado n.° US 2002/0119450, descreve uma fórmula destas para a medição e a correcção manual da sobreposição de fluorescência de SYBR Green I no Light Cycler.

Todos os exemplos descritos neste pedido foram realizados no equipamento ABI 7700, e o software do equipamento foi utilizado para corrigir a sobreposição de fluorescência em todos os casos em que um corante de ADN fluorescente foi utilizado em conjunção com um iniciador ou sonda fluorescente indirectamente excitado, independentemente de a fluorescência do corante isolado ter sido ou não registada.

Para as amplificações por PCR utilizando um único par de iniciadores, em que pelo menos um iniciador está marcado com um fluoróforo para excitação indirecta como descrito acima, uma análise da curva de fusão de acordo com esta concretização pode distinguir entre o(s) produto(s) pretendido(s) e os produtos não específicos. Para as amplificações por PCR multiplex utilizando múltiplos pares de iniciadores, em que pelo menos um membro de cada par está marcado com um fluoróforo e um fluoróforo diferente é utilizado para cada par, os diferentes produtos pretendidos podem ser distinguidos pela cor e pelas temperaturas de fusão associadas aos diferentes fluoróforos. Para as amplificações por PCR em geral, a(s) emissão(ões) do(s) fluoróforo(s) e as emissões dos corantes podem ser monitorizadas durante a reacção para seguir a acumulação dos produto(s) específico(s) e para seguir a acumulação de todos os produtos de cadeia dupla, respectivamente. 17 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ

As análises das reacções de amplificação poderão utilizar a razão das emissões dos fluoróforos, um sinal especifico dos iniciadores ou das sondas hibridados, para o sinal das emissões dos corantes, que não é tão especifico. Esta razão, por exemplo, corrige as variações que surgem entre as reacções replicadas. Além disso, as análises poderão utilizar o pico de fusão do iniciador-molde, que diminui em magnitude à medida que o iniciador marcado é incorporado no(s) produto(s) de extensão.

Este invento inclui kits e kits parciais de amplificação que compreendem um corante de ADN fluorescente, pelo menos um par de iniciadores que inclui um iniciador marcado com um fluoróforo que é excitado indirectamente quando o corante é excitado, e reagentes para amplificar a região definida pelos iniciadores, preferencialmente por LATE-PCR.

Outra concretização de um método de acordo com este invento inclui adicionar, a uma mistura de amplificação de ácidos nucleicos, um corante de ADN fluorescente, tal como SYBR Green I ou, preferencialmente, SYBR Gold, e pelo menos uma sonda de hibridação de baixa Tm ou super baixa Tm, discriminatória de alelos, desactivada e indirectamente excitável, que poderá ser uma sonda deste invento. As sondas discriminatórias de alelos deste invento são o tipo de sondas de cadeia dupla descritas por Li, Q. et al. (2002), "A New Class of Homogeneous Nucleic Acid Probes Based on Specific Displacement Hybridization", Nucl. Acid Res. 30:(2)e5 (uma cadeia oligonucleotidica de sonda linear, marcada com um fluoróforo e complementar do alvo, e uma cadeia complementar marcada com um desactivador, que é mais curta que a cadeia da sonda geralmente em cerca de 2-10 nucleótidos), com a excepção de estarem marcadas com um fluoróforo que é indirectamente excitado pela excitação do corante e de terem uma temperatura de fusão baixa adequada para utilização em amplificações por LATE-PCR como sondas de baixa Tm ou super baixa Tm. A capacidade de discriminação dos alelos das sondas de cadeia dupla pode ser ajustada como foi descrito por Li et al., assim como o pode o nivel da fluorescência de fundo. Adicionalmente, a fluorescência de fundo pode ser reduzida através da inclusão de resíduos de guanidina adjacentes ao grupo fluorescente, a chamada "desactivação G". 18 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ

Os métodos desta concretização incluem a amplificação utilizando uma mistura deste tipo e a detecção a uma temperatura à qual a sonda híbrida de uma maneira discriminatória dos alelos. As concretizações preferidas incluem a utilização de uma etapa de detecção a baixa temperatura durante a fase de amplificação linear de uma reacção de LATE-PCR, em que as sondas anteriores hibridam com o amplicão de cadeia simples que está a ser sintetizado, a excitação do corante de ADN fluorescente a um comprimento de onda que não excita directamente o(s) fluoróforo(s), e a leitura da fluorescência proveniente do fluoróforo da sonda ou dos fluoróforos das sondas, que é ou são indirectamente excitados desta forma. Outras concretizações incluem a amplificação seguida de uma detecção a baixa temperatura como uma determinação em ponto final. Algumas concretizações incluem adicionalmente a detecção da emissão proveniente do corante, e determinadas concretizações preferidas incluem o cálculo de uma razão da emissão da(s) sonda(s) para a emissão do corante. A detecção da emissão do corante é mais preferencialmente efectuada mesmo no início da etapa de detecção, enquanto a temperatura da mistura de reacção está acima das temperaturas de fusão de todas as sondas que estão presentes. Os resultados das moléculas de cadeia dupla a acumular-se ou acumuladas (o sinal do corante) e das moléculas de cadeia simples a acumular-se ou acumuladas (o sinal de cada sonda) podem ser utilizados para construir razões da forma descrita. Os métodos desta concretização também incluem a utilização de sondas do tipo faróis moleculares de baixa temperatura, como descrito no Pedido publicado WO 03/054233, se o fluoróforo que constitui a marca for estimulada pela emissão proveniente do corante, mas não pelo comprimento de onda utilizado para excitar o corante.

Outra concretização ainda de um método de acordo com este invento inclui a adição a uma mistura reaccional de amplificação assimétrica, preferencialmente uma mistura reaccional de LATE-PCR, de reagentes de detecção compreendendo um corante de ADN fluorescente, como SYBR Gold, e pelo menos uma sonda de hibridação linear, de cadeia simples, tolerante a emparelhamentos incorrectos que é perfeitamente complementar de uma possível sequência-alvo do amplicão de cadeia simples que poderá ou não estar presente 19 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ para amplificação na reacção e que é menos do que perfeitamente complementar de pelo menos uma outra possível sequência-alvo do amplicão de cadeia simples que poderá estar presente. As sondas úteis nesta concretização são cadeias simples marcadas com um fluoróforo que é indirectamente excitável pela emissão de fluorescência proveniente do corante. Elas são sondas de baixa Tm ou, preferencialmente, super baixa Tm em relação aos respectivos alvos o mais complementares possíveis que poderão estar presentes, significando isto geralmente um alvo com uma correspondência perfeita. É preferido que possuam uma Tm[0] contra o alvo perfeitamente complementar não mais de alguns graus acima, e preferencialmente abaixo, mais preferencialmente pelo menos 5°C abaixo, da temperatura de hibridação dos iniciadores durante a fase de amplificação exponencial da reacção de amplificação. As sondas poderão ser sondas lineares (ou de espiral aleatória), ou sondas de espiral aleatória de acordo com este invento, isto é, desactivadas para eliminar o sinal devido a formação de uma estrutura secundária a baixas temperaturas. As sondas lineares desactivadas de acordo com este invento têm preferencialmente um fluoróforo numa extremidade e um grupo desactivador não fluorescente na outra extremidade, em que a espécie presente na extremidade 3' da sonda substitui a capa fosfato que de outro modo é adicionada para impedir que a sonda sofra extensão, isto é, que funcione como iniciador.

Esta concretização compreende sujeitar a mistura precedente a uma amplificação assimétrica, preferencialmente um LATE-PCR, para gerar moléculas de amplicão de cadeia simples e sujeitar a mistura reaccional de amplificação a uma análise térmica, utilizando pelo menos uma sonda tolerante a emparelhamentos incorrectos que emite um sinal ao dar-se a hibridação. A análise térmica pode ser efectuada não só após a reacção de amplificação ter terminado, como também durante uma etapa de detecção a baixa temperatura da reacção de LATE-PCR, durante os ciclos térmicos em que está a ser produzido o produto de cadeia simples, isto é, após o esgotamento do iniciador limitante. A análise térmica revela os alvos de cada sonda de acordo com as temperaturas de fusão dos híbridos sonda-alvo que se formam ou que se destabilizam à medida que a temperatura é reduzida ou aumentada, 20 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ respectivamente. À medida que a temperatura é reduzida, uma sonda hibridará primeiro com o seu alvo perfeitamente complementar (caso esteja presente) e emitirá um sinal fluorescente. À medida que a temperatura é adicionalmente reduzida, a sonda hibridará sucessivamente com alvos que contêm proqressivamente "mais correspondência incorrectas" e emitirá um sinal fluorescente maior em cada ocasião. Como explicado em relação a concretizações anteriores, a emissão do corante de ADN fluorescente também pode ser detectada, preferencialmente quando as sondas não estão hibridadas, isto é, a uma temperatura acima da Tm da(s) sonda(s), para permitir monitorizar a acumulação de moléculas de cadeia dupla na reacção e para permitir a utilização de razões de modo a reduzir a dispersão entre as amostras replicadas.

Os métodos de acordo com este invento que utilizam uma etapa de detecção a baixa temperatura nos ensaios de LATE-PCR, preferencialmente uma etapa de detecção a baixa temperatura após a extensão dos iniciadores e antes da fusão das cadeias, incluem ensaios multiplex que contêm mais de um par de iniciadores e geram um ou mais amplicões de cadeia simples (uma sonda para cada alvo), bem como ensaios multissonda que contêm pelo menos uma sonda para múltiplos alvos. Determinados métodos preferidos com uma etapa de detecção a baixa temperatura incluem uma etapa de detecção a baixa temperatura após a extensão dos iniciadores e antes da fusão das cadeias. Durante a etapa de detecção nestes ensaios, a temperatura poderá cair 30°C ou mesmo 40°C abaixo da temperatura de hibridação dos iniciadores, proporcionando uma grande janela de temperaturas para a detecção. As sondas discriminatórias de alelos, além de serem diferenciáveis pela cor (comprimento de onda de emissão do fluoróforo), podem ser distinguidas através de diferenças na temperatura de fusão. Por exemplo, quatro sondas diferentes discriminatórias de alelos, marcadas com FAM e com Tm de 30, 35, 40 e 45°C contra os seus alvos, respectivamente, podem ser distinguidas em tempo real ou após a amplificação como uma determinação em ponto final, à medida que a temperatura da reacção é reduzida ou aumentada, e não apenas por análise de fusão após a amplificação. Este grau de liberdade adicional multiplica significativamente o número de sondas diferentes que podem ser utilizadas na mesma reacção. As sondas tolerantes a 21 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ emparelhamentos incorrectos terão Tm mais baixas contra os alvos incorrectamente emparelhados do que contra os alvos perfeitamente correspondentes. As combinações de sondas de baixa temperatura, tolerantes a emparelhamentos incorrectos e distintamente coloridas, que emitem um sinal ao dar-se a hibridação, produzem modelos de curvas de emissão de fluorescência dependente da temperatura durante a detecção a baixa temperatura. Os métodos de acordo com este invento incluem a utilização destas curvas de emissão, de curvas derivadas e de razões de qualquer uma delas a uma temperatura ou a diferentes temperaturas, para identificar os constituintes de misturas de alvos através da análise de fusão após a amplificação, e também em tempo real por monitorização da fluorescência a várias temperaturas dentro da janela da etapa de detecção a baixa temperatura da reacção de LATE-PCR. As razões poderão incluir razões sonda/mesma sonda, razões sonda/sonda diferente, razões sonda/corante e combinações destas.

Este invento inclui métodos melhorados para preparar os produtos de amplificação das reacções de amplificação por LATE-PCR para as reacções de sequenciação, seja esta uma sequenciação pelo método de Sanger ou por métodos de sequenciação através de síntese como a pirossequenciação. Em particular, explicámos a geração e preparação destes materiais de partida num único recipiente de reacção, por exemplo, um tubo de microcentrífuga. As concretizações preferidas incluem, na mistura de reacção de LATE-PCR, um reagente para inibir a iniciação errónea ("mispriming"), mais preferencialmente um reagente descrito no nosso Pedido de patente U.S. provisório n° 60/619,620, intitulado "Reagents and Methods for Improving Reproducibility and Reducing Mispriming in PCR Amplificatior". No caso da sequenciação de Sanger, explicámos a preparação dos produtos de amplificação por LATE-PCR para sequenciação através da etapa única de diluição da amostra, um método que designamos por "diluir e seguir". No caso da pirossequenciação, explicámos métodos que requerem apenas a adição de reagentes substrato/enzima para pirossequenciação à mistura do produto de LATE-PCR antes da hibridação dos iniciadores. 22 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ

Os métodos de acordo com este invento também incluem a amplificação por LATE-PCR e a preparação da amostra para pirossequenciação no mesmo recipiente, como seja o mesmo tubo de reacção ou a mesma câmara de um dispositivo microfluidico, em que todos eles são designados abreviadamente por métodos em "tubo único". Na pirossequenciação tradicional, o ADN é amplificado por reacção de PCR simétrica, em que um iniciador está marcado na extremidade 5' com uma molécula de biotina. Após a amplificação, utilizam-se esferas revestidas com estreptavidina em conjunção com equipamento magnético ou de vácuo para isolar o ADN de cadeia simples e lavar os componentes residuais da reacção de PCR que interferem com a pirossequenciação, incluindo o pirofosfato (PPi), os dNTP e os iniciadores de PCR. Em virtude da sua capacidade para gerar ADN de cadeia simples, a reacção de LATE-PCR elimina a necessidade de separação das cadeias e simplifica a preparação da amostra quando combinada com um método no "mesmo recipiente" para eliminar os quatro componentes interferentes deixados pelo PCR. Num destes métodos, a necessidade de remover os dNTP remanescentes no final da amplificação é minimizada mediante a utilização de quantidades limitantes de dNTP na mistura reaccional de amplificação por LATE-PCR, tendo cuidado para utilizar uma quantidade suficiente para produzir ADN de cadeia simples suficiente para a pirossequenciação. Uma enzima com actividade de pirofosfatase, por exemplo uma pirofosfatase como a pirofosfatase de levedura, é adicionada ao produto de amplificação para remover o PPi, e a mistura é aquecida para desnaturar essa enzima antes de se prosseguir para a pirossequenciação. Como o iniciador limitante não permanece após a amplificação por LATE-PCR e o iniciador em excesso residual não pode iniciar a cadeia prolongada a partir do iniciador em excesso durante a amplificação (cadeia do iniciador em excesso), os iniciadores remanescentes em muitos casos não precisam de ser removidos. Contudo, a potencial iniciação errónea pode ser evitada através da inclusão, na mistura de reacção de LATE-PCR, de um oligonucleótido que híbrida com o iniciador em excesso a temperaturas abaixo da Tm do iniciador em excesso, incluindo a temperatura utilizada para a pirossequenciação. Em alternativa, um oligonucleótido bloqueado em termos de extensão na extremidade 3' e totalmente complementar do iniciador em excesso pode ser 23 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ adicionado após a amplificação por LATE-PCR, mas antes da pirossequenciação, para evitar uma potencial iniciação errónea pelo iniciador em excesso às temperaturas usadas para a pirossequenciação. Uma terceira estratégia para evitar a iniciação errónea pelo iniciador em excesso na extremidade 3' da cadeia prolongada a partir do iniciador limitante durante a amplificação (cadeia do iniciador limitante) envolve a utilização de uma concentração suficiente de um oligonucleótido bloqueado em 3' contendo a mesma sequência que o iniciador em excesso para competir com o iniciador em excesso pelos locais de ligação. 0 nosso método mais preferido de preparação da amostra em "tubo único" evita a necessidade de determinar as concentrações limitantes de dNTP apropriadas para amplificações particulares. Neste método, primeiro adicionamos os reagentes substrato/enzima para pirossequenciação ao produto de LATE-PCR, o que remove os dNTP e o PPi. Seguimos este passo com a hibridação dos iniciadores utilizando um iniciador de sequenciação adicionado e depois adicionamos dNTP individuais para a pirossequenciação. Em alternativa, é possível eliminar os dNTP por adição de uma enzima purificada com uma actividade de dNTPase, como a apirase da batata, seguida de aquecimento para inactivar a enzima, e é possível eliminar a pirofosfatase por adição de uma enzima purificada com actividade de pirofosfatase, como a pirofosfatase de levedura, seguida de aquecimento para inactivar a enzima. Se ambas as enzimas forem empregues, elas podem ser adicionadas ao mesmo tempo.

Os ensaios de acordo com este invento, particularmente os ensaios de late-pcr, incluem meios para evitar uma iniciação errónea, que pode causar uma diminuição do sinal da sonda nas etapas tardias da reacção. Evitámos com êxito este "efeito de gancho" através da inclusão, na mistura de reacção, de um reagente de supressão da iniciação errónea descrito no nosso Pedido de patente U.S. provisório referido acima. Também evitámos esse efeito por ajuste da concentração da polimerase adicionada à reacção. A diminuição da iniciação errónea por ajuste da polimerase pode ser observada em termos da cinética da reacção de LATE-PCR utilizando uma sonda do 24 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ ADN de cadeia simples, assim como pela composição do produto final revelada por vários meios conhecidos na arte.

Os detalhes de uma ou mais concretizações do invento estão apresentados nas figuras anexas e na descrição abaixo. Outras caracteristicas, objectos e vantagens do invento serão evidentes a partir da descrição, das figuras e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. 1 mostra a utilização de iniciadores marcados por fluorescência de acordo com os métodos do invento para a análise de curvas de fusão. A FIG. 2 ilustra a redução da dispersão do sinal através da utilização de razões do produto de cadeia simples para o produto de cadeia dupla de acordo com os métodos do invento. A FIG. 3 representa uma comparação da identificação de cinco espécies de micobactérias via análise das curvas de fusão, obtida quer com sondas tolerantes a emparelhamentos incorrectos convencionais contra o gene do ARN ribossómico 16S quer com duas versões diferentes de sondas tolerantes a emparelhamentos incorrectos desactivadas contra o mesmo alvo, concebidas de acordo com os métodos do invento. A FIG. 4 ilustra a identificação de cinco espécies de micobactérias, utilizando apenas duas sondas tolerantes a emparelhamentos incorrectos contra o gene do ARN ribossómico 16S de acordo com os métodos do invento. A FIG. 5 apresenta a identificação de cinco espécies de micobactérias via análise da primeira derivada das curvas de fusão ilustradas na FIG. 3, utilizando duas sondas tolerantes a emparelhamentos incorrectos contra o gene do ARN ribossómico 16S concebidas de acordo com os métodos do invento. A FIG. 6 representa a identificação de cinco espécies de micobactérias, utilizando razões dos sinais fluorescentes recolhidos a diferentes temperaturas de duas sondas 25 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ tolerantes a emparelhamentos incorrectos contra o gene do ARN ribossómico 16S de acordo com os métodos do invento. A FIG. 7 mostra a genotipagem em ponto final de amostras homozigóticas e heterozigóticas para a mutação G269 do gene HexA humano, utilizando a reacção de LATE-PCR e uma única sonda de baixa Tm, tolerante a emparelhamentos incorrectos contra o alelo de tipo selvagem de acordo com os métodos do invento. A FIG. 8 ilustra a identificação separada de três alelos diferentes do gene do regulador transmembranar da fibrose cística (CFTR) humano, utilizando a reacção de LATE-PCR, sondas de baixa Tm, discriminatórias de alelos, marcadas com a mesma cor e análise da primeira derivada das curvas de fusão. A FIG. 9 apresenta a identificação simultânea de diferentes combinações de vários alelos do gene do regulador transmembranar da fibrose cística (CFTR) humano, utilizando sondas de baixa Tm, discriminatórias de alelos, marcadas com a mesma cor e análise da primeira derivada das curvas de fusão. A FIG. 10 mostra a identificação de diferentes combinações de alelos do gene do regulador transmembranar da fibrose cística (CFTR) humano, através da representação gráfica das variações da fluorescência a duas temperaturas recolhidas de acordo com os métodos do invento. A FIG. temperaturas 11 representa ensaios de (com correcção do fundo). normalização a duas A FIG. 12 mostra ensaios de normalização a duas temperaturas (sem correcção do fundo). A FIG. 13 ilustra ensaios de normalização a três temperaturas. A FIG. 14 representa uma comparação do método "diluir e seguir" de preparação das amostras de LATE-PCR para pirossequenciação de acordo com os métodos do invento, em 26 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ relação ao método convencional de preparação das amostras de LATE-PCR para o mesmo ensaio. A FIG. 15 representa os pirogramas obtidos a partir de células únicas, preparados pelo método de LATE-PCR de "tubo único". As setas indicam o local IVS 110 da β-globina de a) células de tipo selvagem homozigóticas, b) células heterozigóticas e c) células mutantes homozigóticas. A FIG. 16 é o pirograma de uma reacção de pirossequenciação realizada para mais de cinquenta pares de bases. A ordem de distribuição dos nucleótidos está indicada abaixo de cada pico e a sequência esperada está indicada acima. A FIG. 17 ilustra os cromatogramas da sequenciação pelo método de Sanger, resultantes do método "diluir e seguir" de preparação das amostras de LATE-PCR para sequenciação de Sanger, de acordo com os métodos do invento, e do método convencional de preparação das amostras de LATE-PCR para o mesmo ensaio. A FIG. 18 é um gel de electroforese de uma amplificação por LATE-PCR de mais de um produto proveniente do mesmo molde de ADN na mesma reacção. A FIG. 19 representa os cromatogramas da sequenciação de Sanger "diluir e seguir" do produto da amplificação por LATE-PCR da FIG. 18. A FIG. 2 0 mostra que a quantidade de ADN de cadeia simples e de ADN de cadeia dupla gerada por uma amplificação por LATE-PCR pode ser medida de forma independente e pode ser utilizada para calcular a razão ADNsimples/ADNdupla que, pelo seu lado, pode ser usada para determinar se a quantidade de ADN de cadeia simples acumulada até esse momento é suficiente para a sequenciação subsequente via o método "diluir e seguir". A FIG. 21 ilustra os cromatogramas da sequenciação de Sanger resultantes do método "diluir e seguir" aplicado a uma 27 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ mistura 50:50 de amplicões de LATE-PCR possuindo duas sequências muito próximas, mas diferentes. A FIG. 22 apresenta o intervalo de sensibilidade de amplicões de LATE-PCR misturados possuindo sequências muito próximas, mas diferentes que podem ser distinguidas por meio do método "diluir e seguir". A FIG. 23 mostra que uma reacção de LATE-PCR, juntamente com pelo menos uma sonda única tolerante a emparelhamentos incorrectos, pode ser utilizada para gerar curvas de fusão em ponto final que, pelo seu lado, podem ser utilizadas para quantificar as quantidades relativas de dois ou mais amplicões de LATE-PCR misturados possuindo sequências muito próximas, mas diferentes. A FIG. 24 apresenta a cinética de vários ensaios de LATE-PCR, realizados utilizando duas concentrações diferentes de polimerase Taq com cada uma de três quantidades diferentes de ADN genómico.

Os simbolos de referência idênticos nas várias figuras indicam elementos idênticos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Este invento inclui ensaios de amplificação de ácidos nucleicos, por exemplo ensaios de PCR, que incluem a detecção da emissão de fluorescência proveniente de pelo menos um iniciador marcado com um fluoróforo que é excitado, não directamente pela aplicação de luz (visível ou não) de um comprimento de onda fortemente absorvido pelo fluoróforo, mas indirectamente pela aplicação de luz de um comprimento de onda que excita um corante de ADN fluorescente próximo, tal como SYBR Green ou, preferencialmente, SYBR Gold, bem como kits completos e parciais contendo todos ou alguns reagentes de amplificação e conjuntos de oligonucleótidos contendo estes iniciadores marcados, e também os próprios iniciadores.

Os iniciadores de amplificação são bem conhecidos. Os iniciadores de acordo com este invento são oligonucleótidos curtos, geralmente com menos de cinquenta bases de 28 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ comprimento, que hibridam com uma cadeia-alvo e sofrem extensão por meio de uma polimerase apropriada. Um iniciador poderá ser constituído por nucleótidos naturais ou poderá incluir nucleótidos não naturais e ligações internucleotidicas não naturais. Embora os iniciadores sejam geralmente oligonucleótidos lineares, eles poderão incluir uma estrutura secundária. (Ver, por exemplo, Nazarenko IA, Bhatnagar SK, Hohman RJ (1997), "A Closed Tube Format for Amplification and Detection of DNA Based on Energy Transfer", Nucleic Acids Res. 25:2516-2521). As amplificações incluem muitas vezes a utilização de um ou mais pares de iniciadores, em que cada um dos pares consiste num iniciador directo e um iniciador inverso. Nos métodos, kits e conjuntos de oligonucleótidos de acordo com este invento, um dos iniciadores de um par ou ambos os iniciadores do par poderão estar marcados com um fluoróforo ligado covalentemente, que emite fluorescência quando um corante de ADN fluorescente próximo é estimulado. Quando o iniciador marcado híbrida com a sua sequência complementar numa cadeia do molde, forma-se uma região de cadeia dupla. O corante de ADN fluorescente associa-se a essa região, intercalando-se aí ou de uma outra forma, e torna-se fluorescente nessa região, que está próxima do fluoróforo do iniciador, de modo que quando o corante é estimulado a um comprimento de onda que não excita directamente o fluoróforo, o fluoróforo emite ao seu comprimento de onda característico. Estes iniciadores poderão ser utilizados para monitorizar a síntese de produtos resultantes da extensão por uma ADN-polimerase, como sejam aqueles resultantes de ensaios de PCR e de extensão de iniciadores, em tempo real ou por detecção em ponto final, e/ou para avaliar a especificidade dos produtos via análise das curvas de fusão.

Os iniciadores de acordo com este invento, utilizados como substrato para a extensão por uma ADN-polimerase, incluindo os iniciadores para a amplificação por PCR (simétrico ou assimétrico, incluindo em particular LATE-PCR), estão marcados em qualquer posição nucleotídica com um fluoróforo ligado covalentemente, de tal modo que a extremidade 3' do iniciador oligonucleotídico permanece disponível para a extensão. Os iniciadores podem ter o design das sondas de cadeia dupla descritas por Li, Q. et al. (2002) 29 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ ("A New Class of Homogeneous Nucleic Acid Probes Based on Specific Displacement Hybridization", Nucl. Acid Res. 30:(2)e5). A única restrição à sequência no oligonucleótido do iniciador é o facto de o oligonucleótido não poder ter qualquer estrutura secundária que conduza, ela própria, à excitação indirecta do fluoróforo, o que significa que geralmente não existe uma estrutura secundária maior que dois pares de bases. O grupo do fluoróforo não deverá ser directamente excitado de forma considerável, embora o corante tenha de ser directamente excitado, pelo comprimento de onda da fonte de excitação utilizada; o fluoróforo tem de emitir quando o corante de ADN fluorescente é excitado na sua presença imediata, geralmente não superior a uma distância à qual o fluoróforo experimenta transferência de energia de ressonância (FRET); e o espectro de emissão do fluoróforo seleccionado tem de ser diferenciável do espectro de emissão do corante de ADN fluorescente, quer mediante a utilização de filtros ou de desconvolução espectral. Nestas condições, o fluoróforo emite fluorescência ao dar-se a incorporação no produto de cadeia dupla após a hibridação dos iniciadores, incluindo a extensão por uma ADN-polimerase. A perda de fluorescência tem lugar durante o aquecimento, quando a temperatura de fusão (Tm) do trecho particular de ADN de cadeia dupla contendo o fluoróforo é atingida.

As condições para a utilização dos iniciadores de acordo com este invento, juntamente com corantes de ADN fluorescentes (concentração do iniciador e do corante de ADN, comprimento de onda de excitação do corante de ADN), são as mesmas conhecidas na arte para monitorizar a síntese dos produtos das reacções de extensão dos iniciadores (incluindo PCR) no decurso da reacção e para avaliar a especificidade dos produtos de extensão através da análise das curvas de fusão utilizando apenas os corantes de ADN fluorescentes, com a excepção de a fluorescência ser recolhida ao comprimento de onda de emissão correspondente ao fluoróforo do iniciador em vez de, ou além do, comprimento de onda de emissão do corante. Nestas condições, os sinais de fluorescência têm origem em sequências de cadeia dupla contendo os iniciadores, em vez de em todas as sequências de cadeia dupla presentes na reacção. 30 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ A comparação do desempenho do corante de ADN com os métodos e sistemas de acordo com este invento foi efectuada através da experiência referida abaixo no Exemplo 1 e na FIG. 1. Um iniciador marcado com um fluoróforo foi sujeito a extensão pela ADN-polimerase, na presença do corante SYBR Green e na presença de um oligonucleótido relativamente longo e não extensível hibridado com a cadeia de molde, próximo da região de extensão do iniciador. Isto resultou numa mistura de produtos contendo híbridos cadeia de molde-iniciador não estendido, produtos curtos da extensão do iniciador e o oligonucleótido não extensível, de modo que os híbridos com o molde possuíam Tm variáveis entre 60°C (o iniciador marcado com o fluoróforo (Cy5)) e 79°C (o oligonucleótido não extensível), com os produtos da extensão do iniciador situando-se entre aquelas duas Tm. A análise das curvas de fusão padrão foi efectuada na mistura de reacção final (amostras em duplicado), utilizando tanto as leituras de fluorescência do corante como as leituras de fluorescência do fluoróforo. As curvas de fusão estão apresentadas na FIG. 1. O Painel A representa as curvas de fusão 1 obtidas utilizando as emissões do corante. O único pico é a 79°C, a temperatura de fusão do oligonucleótido não extensível. Não se observa qualquer outro pico, nem mesmo aquele do iniciador não estendido. O Painel A demonstra a migração do corante SYBR Green para o híbrido de Tm mais elevada durante a geração de uma curva de fusão, o que mascara a presença dos híbridos de Tm inferior. O Painel B representa as curvas de fusão 2 obtidas utilizando as emissões do fluoróforo. Ele mostra um pico a 60°C, a Tm do híbrido molde-iniciador não estendido, e um pico adicional a uma temperatura compreendida entre 69°C e 79°C, isto é, um pico indicativo do produto da extensão do iniciador. As Tm mais baixas são observadas apesar da tendência do corante para migrar, como ilustrado pelas curvas de fusão 1. A monitorização da emissão do fluoróforo de acordo com este invento revela todas as espécies de híbridos marcadas com o fluoróforo que estão presentes na mistura, à sua concentração correcta.

No caso das amplificações por PCR utilizando um único par de iniciadores, em que pelo menos um membro do par é um 31 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ iniciador de acordo com este invento, a análise das curvas de fusão pode distinguir entre os produtos específicos e não específicos utilizando um único fluoróforo, porque o produto específico possui uma temperatura de fusão esperada e o produto não específico possui uma temperatura de fusão inesperada. No caso de amplificações por PCR multiplex, utilizando mais de um par de iniciadores, em que pelo menos um membro de cada par de iniciadores é um iniciador de acordo com este invento, dois produtos específicos diferentes podem ser distinguidos um do outro quer porque possuem valores de Tm diferentes, mas esperados, quer porque os dois iniciadores diferentes empregues estão marcados com diferentes fluoróforos. Além disso, a análise das curvas de fusão utilizando iniciadores de acordo com este invento pode ser efectuada no decurso de uma reacção de amplificação ou no final de uma reacção. A incorporação de um ou mais iniciadores de acordo com este invento no decurso de uma reacção também pode ser utilizada para medir quantitativamente a extensão da amplificação de um ou mais alvos no decurso de uma reacção de PCR, ou a síntese de um ou mais trechos de ADN de cadeia dupla no decurso de uma reacção de extensão isotérmica. Em qualquer um dos casos, a quantidade da(s) molécula(s) de produto de cadeia dupla de sequência completa pode ser seguida ao longo do tempo através de detecção repetida da fluorescência crescente ou pode ser medida no final de uma reacção. Além disso, a incorporação de um ou mais iniciadores de acordo com este invento, no decurso quer de reacções isotérmicas quer de reacções cíclicas térmicas, pode ser utilizada para medir a existência e/ou a acumulação de produtos parciais, isto é, aqueles que iniciaram a extensão ao longo de uma cadeia do molde, mas que não atingiram o comprimento máximo possível. Nestes casos, as temperaturas de fusão dos produtos parciais são mais baixas que a temperatura de fusão do produto de sequência completa, mas são mais elevadas que a temperatura de fusão do iniciador marcado do qual derivam. Além disso, em simultâneo com a incorporação do iniciador marcado numa cadeia parcial ou de sequência completa do produto, a magnitude do pico da temperatura de fusão gerado a partir do híbrido ADN-ADN iniciador/molde 32 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ diminui e pode ser utilizada como uma medida adicional da síntese de adn.

Como referido acima, cada trecho de amplicão ou ADN de cadeia dupla sintetizado por incorporação de um iniciador de acordo com este invento gera um sinal fluorescente ao comprimento de onda de emissão do fluoróforo que está ligado covalentemente ao iniciador, quando é estimulado indirectamente por FRET ou outro mecanismo proveniente do corante SYBR ligado, um "sinal específico do iniciador"·. O mesmo ADN de cadeia dupla também gera um sinal fluorescente ao comprimento de onda de emissão do corante SYBR, o "sinal total de SYBR", a soma de todas as sequências de cadeia dupla presentes na reacção, uma vez que todas as sequências de cadeia dupla emitem fluorescência, independentemente de terem ou não incorporado um iniciador marcado. Assim, os iniciadores de acordo com este invento podem ser utilizados para analisar os sinais fluorescentes em termos da seguinte razão: (sinal específico do iniciador/sinal total de SYBR), a seguir designado por valor (SEP/STS) . A análise dos resultados em termos do valor (SEP/STS) corrige as variações observadas no sinal do corante de ADN fluorescente (STS) entre as reacções replicadas. Isto é particularmente útil no caso das amplificações por LATE-PCR, porque a velocidade de síntese do amplicão de cadeia simples é proporcional à quantidade de amplicão de cadeia dupla acumulada no final da fase exponencial da reacção. Assim, pequenas diferenças na quantidade de ADN de cadeia dupla entre as reacções replicadas alteram a velocidade de acumulação do amplicão de cadeia simples.

Também é possível utilizar mais de um iniciador marcado com o mesmo fluoróforo, desde que os amplicões sejam diferenciáveis através de uma análise das curvas de fusão após a amplificação. Ver FIG. 1, Painel B, para uma exemplificação deste princípio. O sinal do fluoróforo comum no final de uma etapa de extensão, que poderá ser a etapa de extensão final (ponto final) ou etapas de extensão intermediárias, fornece uma indicação do número total de amplicões que incorporam o fluoróforo. A análise das curvas de fusão distingue entre os produtos e proporciona uma medida quantitativa das suas concentrações. 33 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ A reacção de LATE-PCR é uma amplificação por PCR assimétrico que, entre outras vantagens, proporciona um grande "espaço de temperaturas" no qual poderão ser levadas a cabo acções. Ver WO 03/054233 e Sanchez et al. (2004), citado acima. O LATE-PCR permite a utilização de sondas de hibridação de "baixa Tm" e "super baixa Tm" para detectar os produtos de amplificação ("amplicões") que são de cadeia simples. Vários tipos de sondas que são específicas para um único alvo num determinado ensaio, incluindo sondas discriminatórias de alelos capazes de distinguir o emparelhamento incorrecto de um único par de bases, como as sondas do tipo faróis moleculares discriminatórias de alelos, podem ser utilizados na reacção de LATE-PCR como sondas de baixa Tm e super baixa Tm, da mesma forma que o podem as sondas tolerantes a emparelhamentos incorrectos, como sejam as sondas do tipo faróis moleculares ou as sondas lineares (em espiral aleatória) tolerantes a emparelhamentos incorrectos, que possuem um fluoróforo indirectamente excitável pela emissão de um corante SYBR. Nós concebemos uma nova classe de sondas discriminatórias de alelos, que são úteis como sondas de baixa Tm e super baixa Tm em ensaios de LATE-PCR, a qual permite a determinação das razões cadeia simples/cadeia dupla numa reacção, da mesma forma que as sondas do tipo faróis moleculares, discriminatórias de alelos e marcadas com um fluoróforo deste tipo o permitem.

As sondas discriminatórias de alelos de acordo com este invento são sondas desactivadas, discriminatórias de alelos, de cadeia dupla, modificadas de acordo com Li, Q. et al. (2002), Nucl. Acid Res. 30:(2)e5). Elas apresentam as seguintes modificações: estão marcadas com um fluoróforo que é indirectamente excitável através da excitação de um corante de ADN fluorescente de cadeia dupla, como SYBR Green ou SYBR Gold, mas não directamente excitável pelo comprimento de onda utilizado para estimular o corante (a este respeito são similares aos iniciadores discutidos acima) e estão construídas para serem sondas de baixa Tm ou super baixa Tm. Quando não está ligada à sua sequência-alvo, uma sonda deste tipo liga-se a um oligonucleótido complementar mais curto. É preferível que o oligonucleótido complementar inclua um desactivador, como seja um desactivador Dabcyl ou Black Hole , para reduzir a fluorescência de fundo da sonda. Em 34 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ alternativa ou adicionalmente, a fluorescência de fundo pode ser reduzida mediante a inclusão de resíduos de guanidina adjacentes ao fluoróforo (desactivação G). Na presença de uma cadeia-alvo perfeitamente complementar, a cadeia complementar mais curta é deslocada, a cadeia mais longa marcada com o fluoróforo hibrida com o alvo, e o fluoróforo deixa de estar desactivado e passa a ser capaz de receber energia do corante para emitir fluorescência ao seu comprimento de onda característico. É possível utilizar várias destas sondas para diferentes alvos, marcadas com diferentes fluoróforos, para ensaios multiplex.

Estas sondas discriminatórias de alelos são concebidas para terem uma temperatura de fusão ajustada à concentração, Tm[0], no ensaio que a torna uma baixa Tm ou super baixa Tm. A Tm[o] do híbrido sonda-alvo é convenientemente determinada e ajustada empiricamente, embora possa ser empregue um valor calculado, pelo menos como um bom ponto de partida para minimizar o ajuste. O comprimento e a concentração da cadeia complementar da sonda em relação à cadeia marcada com o fluoróforo são ajustados empiricamente para uma discriminação máxima dos alelos. Partimos de um comprimento de 1-3 nucleótidos mais curto que a cadeia marcada com o fluoróforo e uma concentração que é 1-1,2 vezes a concentração da cadeia marcada com o fluoróforo.

Num ensaio de LATE-PCR, estas sondas discriminatórias de alelos são utilizadas numa etapa de detecção a baixa temperatura, preferencialmente após a etapa de extensão dos iniciadores, em ciclos após o esgotamento do iniciador limitante. Para as leituras em tempo real ao longo de múltiplos ciclos, o corante SYBR é excitado, e a fluorescência é lida tanto a partir do corante como do(s) fluoróforo(s). É preferível ler o sinal do corante durante ou na conclusão da etapa de extensão da reacção de PCR, quando a temperatura está acima da Tm da(s) sonda(s), e ler a emissão do fluoróforo durante a etapa de detecção a baixa temperatura, quando as sondas (seja uma sonda discriminatória de alelos de acordo com este invento ou uma sonda do tipo farol molecular marcada de forma apropriada) estão hibridadas. Determinamos depois a razão da fluorescência de cada sonda para o sinal total de SYBR. Esta razão minimiza as 35 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ diferenças observadas entre os ensaios replicados devido a variações na acumulação do produto. Como as diferenças são minimizadas, estas razões podem ser igualmente utilizadas para a análise em ponto final. A utilização das razões de produto de cadeia simples para produto de cadeia dupla permitidas pelos iniciadores e sondas de acordo com este invento é uma técnica para reduzir a dispersão entre os ensaios replicados, como foi referido. Isto é particularmente importante para os ensaios em ponto final, que não revelam a cinética da reacção. Um exemplo é um ensaio de LATE-PCR para diferenciar amostras homozigóticas de amostras heterozigóticas, utilizando um par de iniciadores para ambos os alelos e uma sonda discriminatória de alelos de acordo com este invento. A FIG. 2 ilustra a redução da dispersão obtida quando a técnica é aplicada a uma amplificação por LATE-PCR com uma etapa de detecção a baixa temperatura, efectuada com um corante SYBR (neste caso, SYBR Gold), uma sonda discriminatória de alelos para um alelo, marcada com Cy5, excitação do corante e leituras dos sinais provenientes do corante (a 72°C, a temperatura de extensão) e do fluoróforo (a 55°C, uma detecção a baixa temperatura após a extensão dos iniciadores). O Painel A apresenta as leituras em tempo real do fluoróforo para as amostras homozigóticas replicadas (circulo 21) e para as amostras heterozigóticas replicadas (circulo 22) . Como é evidente, a dispersão entre as réplicas mascara a diferença. O Painel B, contudo, representa graficamente a razão dos sinais Cy5 para os sinais SYBR para as amostras homozigóticas (circulo 23) e as amostras heterozigóticas (circulo 24). A redução da dispersão é suficiente para permitir um ensaio em ponto final.

Este invento também inclui sondas de cadeia simples, lineares, de baixa Tm ou super baixa Tm, tolerantes a emparelhamentos incorrectos que estão marcadas, de preferência terminalmente marcadas, com um fluoróforo excitável pela emissão proveniente de um corante de ADN fluorescente (por exemplo, SYBR Green I ou SYBR Gold) e que estão desactivadas para reduzir a fluorescência de fundo. Estas sondas transportam um grupo desactivador que suprime a fluorescência na ausência do alvo. As sondas lineares tolerantes a emparelhamentos incorrectos têm tendência para 36 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ enrolar e formar regiões curtas de cadeia dupla à medida que a temperatura é reduzida. A utilização de uma etapa de detecção a baixa temperatura no ensaio de LATE-PCR exacerba esta tendência. Isto não ocorre quando a sequência da sonda está hibridada com a sequência-alvo. Se a sonda incluir um fluoróforo que é excitado pela emissão de um corante SBYR que está presente na mistura reaccional, o corante intercala-se, ou associa-se de outra forma com, a região de cadeia dupla não intencional das moléculas da sonda não ligada e excita o fluoróforo da sonda por FRET. O resultado é um aumento da fluorescência de fundo a baixa temperatura. A desactivação das sondas tolerantes a emparelhamentos incorrectos de acordo com este invento é obtida por adição de um grupo desactivador, por exemplo um desactivador DABCYL ou Black Hole™ (BHQ), à sonda, num local em que desactiva a fluorescência do fluoróforo resultante da estrutura secundária não intencional presente na sonda não ligada. É preferível adicionar o desactivador na extremidade oposta do fluoróforo sempre que possível. O Exemplo 2 abaixo exemplifica duas técnicas possíveis: adicionar simplesmente um desactivador ou construir um gancho de cabelo desactivado, isto é, uma estrutura secundária especificamente concebida que aproxima bastante o desactivador do fluoróforo, da estrutura secundária ou de ambos. Preferencialmente, a Tm da estrutura secundária construída é pelo menos 5°C mais elevada que a Tm de qualquer estrutura secundária alternativa, para que, na ausência do alvo, a maioria das moléculas da sonda estejam na configuração de gancho de cabelo e a fluorescência de fundo seja baixa. A Tm da haste construída é inferior à Tm da sonda hibridada com o alvo perfeitamente complementar e similar à Tm da sonda hibridada com os seus alvos contendo correspondências incorrectas, de modo que a hibridação com alvos possuindo a sequência presente na haste não é impedida pela formação da haste. A detecção e a identificação de alvos de ácidos nucleicos podem ser efectuadas mediante a utilização de uma ou de múltiplas sondas de baixa temperatura tolerantes a emparelhamentos incorrectos, que sinalizam quando estão hibridadas, incluindo sondas do tipo faróis moleculares tolerantes a emparelhamentos incorrectos, sondas lineares de 37 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ cadeia simples que são indirectamente excitadas pela excitação de um corante de ADN fluorescente e sondas lineares desactivadas de acordo com este invento. Para determinadas concretizações, uma mistura de sondas poderá incluir também pelo menos uma sonda específica para alelos de acordo com este invento. Uma técnica útil consiste em utilizar a razão da fluorescência de duas sondas em função da temperatura para distinguir entre os alvos que possuem uma Tm similar em relação a pelo menos uma das sondas. Por vezes designamos as curvas de uma razão deste tipo como uma "assinatura de fluorescência" de um alvo.

Com o ensaio de LATE-PCR que inclui uma etapa de detecção a baixa temperatura, é possível combinar o efeito da temperatura de detecção com o efeito da assinatura de fluorescência. Um ensaio que temos usado com múltiplas sondas tolerantes a emparelhamentos incorrectos, incluindo, embora não exclusivamente, sondas de cadeia simples, indirectamente excitáveis e desactivadas de acordo com este invento, é uma amplificação por late-pcr consistindo numa etapa a alta temperatura para desnaturar o ADN de cadeia dupla (95°C durante 2 min), seguida de amplificação em fase exponencial utilizando ambos os iniciadores limitante e em excesso (30 ciclos de 95°C durante 10 s, 60°C durante 15 s e 78°C durante 40 s), seguida da finalização da fase exponencial e da fase linear subsequente durante a qual estão incluídas as etapas de detecção das sondas (40 ciclos de 95°C durante 10 s, 60°C durante 15 s, 78°C durante 40 s, 55°C durante 20 s, 50°C durante 20 s, 45°C durante 20 s e 40°C durante 20 s) . Isto proporciona quatro temperaturas de detecção abaixo da temperatura de hibridação dos iniciadores, 60°C. A produção das cadeias duplas pode ser monitorizada através da emissão do corante SYBR à temperatura de extensão dos iniciadores, 78°C, que está acima da Tm de qualquer uma das sondas. A emissão do fluoróforo pode ser monitorizada a cada temperatura baixa entre 55 °C e 40 °C. Após o último ciclo, a temperatura pode ser reduzida para um valor baixo, por exemplo, 30 °C, e lentamente aumentada para a análise de fusão. Além dos níveis de fluorescência detectados, as razões da fluorescência do fluoróforo para a fluorescência do corante e as razões da fluorescência dos fluoróforos podem 38 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ ser utilizadas para gerar informações diferenciadoras dos amplicões.

Algumas das figuras são ilustrativas de técnicas que tiram vantagem das possibilidades anteriores. A FIG. 4 mostra o comportamento de fusão de duas sondas tolerantes a emparelhamentos incorrectos contra o gene do ARN ribossómico 16S de várias espécies de micobactérias. Utilizaram-se duas sondas: a sonda desactivada e que forma um gancho de cabelo descrita no Exemplo 2, possuindo a sequência 5'-Cy5- CTG GAT AGG ACC ACG AGG CCA G - BHQII -3' (SEQ. ID No. 2), e uma sonda marcada com TAMRA possuindo a sequência 5'-G CAT GTC TTG TGG TGG-TAMRA-3' (SEQ. ID No. 3). Verificou-se que a última sonda, que estava não desactivada, forneceu sinais discerniveis acima do fundo para várias espécies. O Painel A da FIG. 4 apresenta as curvas de fusão para a sonda em gancho de cabelo sem alvo (curva 41), M. asiaticum (curva 42), M. gordonae (curva 43), M. heidelburgense (curva 44), M. malmoense (curva 45) e M. marinum (curva 46). O Painel B apresenta as curvas de fusão para a sonda marcada com TAMRA sem alvo (curva 47), M. asiaticum (curva 48), M. gordonae (curva 49), M. heidelburgense (curva 50), M. malmoense (curva 51) e M. marinum (curva 52). O Painel C da FIG. 4 representa a razão da fluorescência TAMRA para a fluorescência Cy 5: M. asiaticum (curva 53), M. gordonae (curva 54), M. heidelburgense (curva 55), M. malmoense (curva 56) e M. marinum (curva 57).

Outra técnica analítica consiste em representar graficamente a velocidade de variação da fluorescência dos fluoróforos em função da temperatura. A FIG. 5 apresenta estas representações gráficas para a sonda em gancho de cabelo, desactivada e marcada com Cy5 de acordo com este invento e a sonda não desactivada e marcada com TAMRA, ambas descritas acima. O Painel A é a sonda em gancho de cabelo desactivada, e o Painel B é a sonda marcada com TAMRA. As representações gráficas ilustram os picos de fusão para M. asiaticum (curvas 61, 71), M. gordonae (curvas 62, 72), M. heidelburgense (curvas 63, 73), M. malmoense (curvas 64, 74) e M. marinum (curvas 65, 75). Utilizando ambas as sondas, é possível distinguir os cinco alvos pelos picos de fusão. A sonda marcada com Cy5 por si só foi capaz de distinguir 39 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ Μ. gordonae (curva 62) das outras espécies. A sonda marcada com TAMRA por si só conseguiu distinguir cada uma das espécies M. asiaticum (curva 71), M. gordonae (curva 72) e M. marinum (curva 75) umas das outras. Em conjunto, as sondas conseguiram distinguir M. heidelburgense de M. asiaticum, porque M. heidelburgense originou um pico elevado com a sonda Cy5 e um pico baixo com a sonda TAMRA, ao passo que M. asiaticum originou o oposto. Com uma única sonda por amplicão, as alturas relativas dos picos poderão reflectir diferenças na concentração dos produtos. Aqui, contudo, ambas as sondas detectam o mesmo amplicão, pelo que as alturas relativas dos picos reflectem diferenças nas características de fusão da sonda-alvo.

Outra ferramenta analítica, descrita acima, consiste em utilizar uma ou mais razões de fluorescência, tal como, na concretização particular aqui discutida, a razão da fluorescência TAMRA para a fluorescência Cy5 à mesma temperatura ou a diferentes temperaturas durante a reacção de PCR. Uma estratégia útil para a concepção de sondas inclui desenhar uma sonda para se ligar a uma região conservada que é comum a várias espécies para servir de referência, ou incluir, quando necessário, a utilização de uma porção da sequência do iniciador limitante como região conservada. Isto é uma opção para a reacção de LATE-PCR, uma vez que as Tm das sondas estão bem abaixo da Tm do iniciador limitante e da temperatura de hibridação, pelo que uma sonda com uma sequência comum não interfere com a amplificação. A FIG. 6 mostra os resultados utilizando uma combinação de razões da fluorescência. Nesta concretização, utilizámos como uma razão os valores da fluorescência TAMRA/Cy5, cada um deles recolhido à temperatura de detecção de 40°C, e como outra razão a razão dos sinais fluorescentes TAMRA/Cy5 recolhidos às temperaturas de detecção de 45°C e 55°C, respectivamente. A FIG. 6 representa ambas as razões num ciclo particular, neste caso no ciclo 50. Seis réplicas originaram dados não sobreponíveis para as várias espécies M. asiaticum (circulo 81), M. gordonae (circulo 82), M. heidelburgense (circulo 83), M. malmoense (circulo 84) e M. marinum (circulo 85). A medição da fluorescência das sondas a diferentes temperaturas durante a reacção de PCR tem vantagens em 40 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ relação a limitar a análise a fusões após a reacção PCR. Uma vantagem é a capacidade de comparar os valores da fluorescência a um número específico de ciclos após o ciclo de limiar, o valor CL, ser atingido. Isto permite utilizar razões com os corantes SYBR (ou outros corantes de intercalação) como descrito acima. Outra vantagem é o facto de cada amostra possuir uma fluorescência de fundo medida a cada temperatura durante os ciclos prévios à detecção do amplicão. Assim, é possível efectuar ajustes precisos para as variações amostra-a-amostra da fluorescência de fundo. É possível medir a fluorescência a muitas temperaturas durante a reacção de PCR, fornecendo uma análise de fusão quase completa ao longo do intervalo de temperatura a que uma sonda apresenta diferenças de hibridação com diferentes alvos. O número e a duração destas etapas dependem, em parte, das capacidades do equipamento de detecção. A detecção contínua da fluorescência durante aumentos ou diminuições da temperatura é possível com alguns termocicladores. A detecção a múltiplas temperaturas não precisa de ter início até um determinado momento pouco antes da subida inicial esperada da fluorescência. A detecção a múltiplas temperaturas pode ser efectuada em cada ciclo, ou utilizando algum outro intervalo, por exemplo, a cada quinto ciclo. A eliminação de múltiplas etapas de detecção durante os ciclos iniciais e a redução da frequência dessas etapas reduz o tempo global necessário para completar a reacção de amplificação. Ao utilizar a razão da fluorescência da sonda para a fluorescência do corante, a fluorescência da sonda é preferencialmente medida ao longo das temperaturas a que a sonda híbrida com os seus alvos, e a fluorescência de SYBR é medida às temperaturas a que as sondas não estão ligadas. Mais preferencialmente, a fluorescência de SYBR é medida à temperatura de extensão. Como a fluorescência da sonda aumenta em ciclos bem além do valor do ciclo de limiar (CL), ao passo que a fluorescência de SYBR atinge um patamar, estas razões variarão durante a reacção de amplificação. Por conseguinte, é importante comparar as razões das amostras individuais a um número específico de ciclos após o valor CL de cada amostra. A análise dos produtos de ADN de cadeia simples também pode ser obtida utilizando uma única sonda tolerante a emparelhamentos incorrectos, cujo sinal é medido a mais de 41 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ uma, por exemplo, duas ou três, temperaturas diferentes. Os resultados podem depois ser processados como razões utilizando os valores da fluorescência a duas ou mais temperaturas. A razão reduz significativamente as diferenças de sinal entre as amostras replicadas e proporciona uma medida quantitativa do alelo procurado. A FIG. 11 mostra os níveis de fluorescência da sonda a duas temperaturas. Tal como ilustrado na Fig. 11, os sinais da sonda provenientes da hibridação da sonda com a cadeia do iniciador em excesso são recolhidos a uma temperatura elevada em que a sonda é discriminatória de alelos e se liga apenas ao alelo totalmente complementar, assim como a temperaturas mais baixas em que a sonda é totalmente tolerante a emparelhamentos incorrectos e se liga a todas as variantes alélicas possíveis da sequência-alvo. A medição da fluorescência à temperatura elevada e à temperatura baixa e o cálculo das razões resultantes também podem ser efectuados como um ensaio em ponto final. Designamos estes ensaios por "Ensaios de normalização a duas temperaturas (sem correcção do fundo)". Eles distinguem prontamente os genótipos homozigóticos e heterozigóticos conforme ilustrado na FIG. 11. Este tipo de ensaio pode ser efectuado como ensaios de LATE-PCR homogéneo em ponto final, ensaios de LATE-PCR QE. A FIG. 11 representa os sinais de fluorescência corrigidos em termos da linha de base. Como discutido no Exemplo 5, preferimos utilizar os sinais de fluorescência em bruto, em vez de corrigidos em termos da linha de base do instrumento ABI 7700, como ilustrado na FIG. 12. A correcção da linha de base introduz potenciais artefactos nas razões fluorescentes normalizadas das amostras individuais, porque o factor de correcção é sensível a falsas flutuações nos sinais da fluorescência de fundo utilizados para definir a linha de base. As leituras da fluorescência em bruto não estão sujeitas a este artefacto. A confiança nos sinais fluorescentes em bruto torna o ensaio aplicável a qualquer termociclador de PCR com capacidades de fluorímetro, ou a termocicladores regulares utilizados em combinação com um fluorímetro regulado em termos de temperatura para leituras da fluorescência em ponto final. 42

ΕΡ 1 805 199/PT A genotipagem por LATE-PCR QE pode ser adicionalmente refinada mediante a construção de razões dos sinais detectados a mais de duas temperaturas. Um método a três temperaturas para normalizar os resultados em ponto final é dado pela seguinte fórmula: Valor de fluorescência normalizado = (Fs-Ft)/(Fb-Ft), em que (Ft = fluorescência à temperatura de topo), (Fb = fluorescência à temperatura de base), (Fs = fluorescência a qualquer terceira temperatura). O método a três temperaturas aplicado a genótipos homozigóticos e heterozigóticos de um local SNP no gene p53 humano está descrito no Exemplo 6 e ilustrado na FIG. 13. O Exemplo 11 e as FIGS. 18-19 ilustram estratégias para a amplificação por LATE-PCR de mais de um produto a partir do mesmo molde de ADN, na mesma reacção. Assim, estas reacções contêm dois pares de iniciadores (cada um deles constituído por um iniciador em excesso e um iniciador limitante) que amplificam duas sequências separadas num molde contíguo. Os dois pares de iniciadores podem ser arranjados de forma que ambos os iniciadores em excesso e ambos os iniciadores limitantes hibridem com a mesma cadeia do molde, ou com cadeias opostas do molde. Como um perito na arte compreenderá, quando iniciadores similares hibridam com cadeias opostas do molde, os dois iniciadores em excesso podem prolongar-se quer "para dentro" quer "para fora" nas suas respectivas cadeias do molde. A FIG. 19 também mostra que é possível obter sequências de ambas as cadeias de iniciador em excesso a partir da mesma mistura reaccional via o método "diluir e seguir". O Exemplo 12 e a FIG. 20 mostram que a quantidade de ADN de cadeia simples e ADN de cadeia dupla gerada por uma amplificação por LATE-PCR pode ser medida de forma independente e pode ser utilizada para calcular a razão ADNsimples/ADNdupla que, pelo seu lado, pode ser usada para determinar se a quantidade de ADN de cadeia simples acumulada até esse momento é suficiente para a sequenciação subsequente via o método "diluir e seguir".

O Exemplo 13 e a FIG. 21 ilustram o método "diluir e seguir" aplicado a uma mistura 50:50 de amplicões de LATE-PCR possuindo duas sequências muito próximas, mas diferentes. A 43 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ FIG. 22 ilustra como as misturas constituídas por razões 90:10 e 10:90 de dois amplicões de LATE-PCR possuindo sequências muito próximas, mas diferentes podem ser distinguidas de misturas 100:0 e 0:100 puras, assim como de misturas 30:70 e 70:30 via o método "diluir e seguir". De modo a realizar este tipo de análise, é necessário corrigir as amplitudes observadas de cada pico nucleotídico em cada posição heteroplásmica em termos da amplitude esperada do nucleótido "puro" equivalente nessa posição. Uma vez isto feito, quantidades relativas de cada sequência podem ser calculadas como a razão de amplitudes (nucleótido 1 corrigido)/(nucleótido 1 corrigido + nucleótido 2 corrigido). Assim, tal como no caso das sequências de ADN mitocondrial que diferem, os métodos "diluir e seguir" de LATE-PCR e sequenciação de Sanger aqui descritos podem ser utilizados para detectar a heteroplasmia. O método de Sanger para medir a heteroplasmia é particularmente vantajoso, uma vez que pode ser utilizado para sondar muitas centenas de nucleótidos numa única análise. Embora não desejando ficar limitados por qualquer teoria, acreditamos que os métodos aqui descritos funcionam, em contraste com as tentativas prévias baseadas em PCR simétrico e sequenciação de Sanger, porque a reacção de LATE-PCR gera populações extremamente homogéneas de amplicões de cadeia simples. A reacção de PCR simétrico, em contraste, tende a gerar populações de moléculas de sequência completa, juntamente com alguns amplicões parciais e alguns amplicões incorrectamente iniciados. O Exemplo 14 e a FIG. 23 mostram que uma reacção de LATE-PCR, juntamente com pelo menos uma sonda única tolerante a emparelhamentos incorrectos, podem ser utilizadas para gerar curvas de fusão em ponto final que, pelo seu lado, podem ser utilizadas para quantificar as quantidades relativas de dois ou mais amplicões de LATE-PCR misturados possuindo sequências muito próximas, mas diferentes. A análise de fusão em ponto final quantitativa, LATE-PCR (QE), de misturas de amplicões relacionados é tornada possível em virtude do facto de a reacção de LATE-PCR gerar produtos de cadeia simples. Assim, quando uma ou mais sondas marcadas e tolerantes a emparelhamentos incorrectos estão presentes na reacção, a(s) sonda(s) híbrida(m) primeiro com a sequência-alvo mais complementar e depois, se a temperatura for 44 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ suficientemente reduzida, com todas as sequências-alvo relacionadas. Assim, cada híbrido sonda/alvo no conjunto possui a sua própria temperatura de fusão e a magnitude do pico de fusão derivado de cada híbrido sonda/alvo reflecte correctamente a quantidade de cada sequência-alvo acumulada. Medições quantitativas da amplitude ou da área bidimensional de cada curva de fusão podem depois ser utilizadas para calcular a abundância relativa de cada sequência-alvo. Os resultados apresentados na FIG. 23 demonstram que este método pode ser utilizado com uma confiança de 99,7% para distinguir entre as misturas 0:100 - 10:90 - 50:50 - 90:10 - 100:0 de duas sequências que diferem num único nucleótido.

Os ensaios de acordo com este invento, efectuados na presença ou na ausência do reagente descrito no nosso Pedido provisório de patente U.S. 60/619,620, podem ser independentemente optimizados para evitar ou minimizar a iniciação errónea por ajuste da concentração da ADN- polimerase, por exemplo, a polimerase Taq, adicionada à reacção. A diminuição da iniciação errónea por ajuste da polimerase pode ser observada em termos da cinética da reacção de LATE-PCR utilizando uma sonda do ADN cadeia simples, assim como pela composição do produto final revelada por vários meios conhecidos na arte. Verificámos que é experimentalmente conveniente partir de uma concentração em excesso típica de polimerase Taq e depois diminuir esta concentração em etapas. Enquanto uma quantidade excessivamente pequena de polimerase pode fazer com que a reacção se torne ineficiente (manifestando-se como uma diminuição significativa da velocidade ou extensão da amplificação do produto), os níveis óptimos de polimerase resultam num ensaio de amplificação por LATE-PCR com uma amplificação eficiente do adn de cadeia dupla e uma síntese de ADN de cadeia simples mantida ao longo de muitos ciclos. O Exemplo 15 demonstra que o nível óptimo de polimerase pode ser avaliado pelo sinal do ADN de cadeia dupla observado utilizando um corante de cadeia dupla, como SYBR Green, mais a curva de fusão do produto de adn de cadeia dupla, também observada utilizando SYBR Green. O Exemplo 16 e a FIG. 24 mostram que quando estes ensaios são pesquisados com sonda quanto a um produto de ADN de cadeia simples específico, gerado a partir de diferentes quantidades de material de 45 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ partida, os gráficos resultantes são lineares e paralelos ao longo de muitos ciclos de produção de ADN de cadeia simples.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Corante de ligação versus corante de ligação mais iniciadores marcados.

Para comparar o desempenho de um corante de intercalação com o desempenho do corante utilizado em combinação com um iniciador que inclui um fluoróforo actuante, efectuou-se um ensaio de extensão. O corante utilizado foi o SYBR Green I a uma diluição de 1:40.000.

Incluíram-se três cadeias nucleotídicas. Um molde de ADN, um iniciador de ADN extensível (marcado em 5' com Cy5, complementar do molde e possuindo uma Tm de 60°C) e um oligonucleótido de ADN não extensível (bloqueado na extremidade 3' com um grupo fosfato) também complementar do alvo, numa posição 3' em relação ao iniciador, igualmente marcado com o fluoróforo Cy5 e possuindo uma Tm mais elevada de 79°C. O espaçamento entre o iniciador e o oligonucleótido não extensível foi seleccionado para que os produtos da extensão do iniciador até ao oligonucleótido não extensível tivessem todos Tm abaixo de 79°C. A mistura reaccional para o ensaio de extensão do iniciador incluiu: ADN do molde 0,5 μΜ, iniciador 1,5 μΜ e oligonucleótido não extensível 1,5 μΜ. A mistura também incluiu tampão de PCR lx, MgCl2 3 mM, cada dNTP 250 nM, SYBR Green I l:40.000x e ADN-polimerase Taq. A mistura reaccional foi aquecida a 50°C durante 2 minutos, de forma a ligar o iniciador e o oligonucleótido não extensível e a gerar os produtos da extensão do iniciador imediatamente antes de chegar ao oligonucleótido não extensível. Correram-se amostras em duplicado.

Após a reacção de extensão do iniciador, o produto foi submetido a análise de fusão, em que o corante SYBR Green foi excitado à medida que a temperatura foi variada. As leituras da fluorescência foram efectuadas ao comprimento de onda de emissão do corante e ao comprimento de onda de emissão do 46 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ fluoróforo, à medida que a temperatura foi aumentada ao longo do intervalo de temperaturas de fusão abrangendo o iniciador não estendido e o oligonucleótido não extensível. As curvas de fusão, a primeira derivada da fluorescência em relação à temperatura representada em função da temperatura, estão apresentadas na FIG. 1, em que o Painel A apresenta as curvas 1 para as duas amostras - resultados das emissões do corante, e o Painel B apresenta as curvas 2 para as duas amostras - resultados das emissões de Cy5.

Exemplo 2. Sondas desactivadas tolerantes a emparelhamentos incorrectos.

Uma sonda marcada foi concebida para possuir uma sequência consenso complementar do gene do ARN ribossómico 16S de Mycobacterium. A estrutura secundária foi prevista de acordo com os programas Mfold (Zucker, M (2003), "Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction", Nucleic Acids Res 31: 3406-3415) com a concentração de sódio definida em 70 mM e a concentração de magnésio definida em 3 mM. A sequência da sonda foi Cy5-AATACTGGATAGGACC ACG AGG (SEQ. ID No. 1), com uma estrutura secundária prevista formada por hibridação das regiões sublinhadas. A Tm prevista da estrutura secundária da sonda foi de 37°C. Esta sonda foi testada em amostras sem alvo e contendo M. gordonae ou M. asiaticum, em misturas compreendendo o corante SYBR Green I, em que o corante foi directamente excitado e o fluoróforo, pelo seu lado, foi indirectamente excitado. Os resultados da fluorescência de Cy5 em função da temperatura estão apresentados na FIG. 3, Painel A. A curva 31 (ausência de alvo) mostra uma fluorescência de fundo elevada, mas a curva 32 (M. gordonae) e a curva 33 (M. asiaticum) mostram sinais distinguíveis acima do fundo. Para desactivar a fluorescência de fundo, adicionou-se um desactivador não fluorescente (um desactivador Black Hole™ II) ao nucleótido terminal 3' da sonda. A sonda modificada foi testada de modo similar, e os resultados estão apresentados no Painel B da FIG. 3. Como se pode ver, a fluorescência de fundo (curva 34, sem alvo) caiu marcadamente, e os sinais de M. gordonae (curva 35) e M. asiaticum (curva 36) foram muito superiores ao fundo. 47 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ

Outra técnica de desactivação de uma sonda consiste em construir a sonda de forma a ter uma estrutura em gancho de cabelo, terminalmente marcada com um fluoróforo apropriado numa extremidade e um desactivador na outra. Construímos uma sonda com a sequência Cy5-CTGGATAGGACCACGAGGCCAG-BHQII (SEQ. ID. No. 2), em que as sequências sublinhadas são complementares e formam uma haste em gancho de cabelo. Adicionámos os três nucleótidos terminais 3' com o objectivo de criar a haste. A temperatura de fusão prevista para esta sonda com um alvo perfeitamente complementar é de 60°C. A Tm prevista da haste é de cerca de 48°C (com base na Tm prevista de 40°C da haste de nucleótidos não modificados, não considerando a maior afinidade da interacção fluoróforo-desactivador). Esta sonda também foi testada da forma descrita acima, e os resultados estão apresentados no Painel C da FIG. 3. A fluorescência de fundo (curva 37, sem alvo), foi bastante baixa, e os sinais de M. gordonae (curva 38) e M. asiaticum (curva 39) foram elevados acima do fundo.

Exemplo 3. Genotipagem em tempo real e em ponto final utilizando sondas tolerantes a emparelhamentos incorrectos.

Este exemplo ilustra a identificação de amostras homozigóticas e amostras heterozigóticas para o alelo G269 do gene da hexosaminidase A (Hex A) humana responsável pela doença de Tay-Sachs, utilizando uma amplificação por LATE-PCR em tempo real e uma sonda linear, tolerante a emparelhamentos incorrectos, de baixa Tm, marcada com Cy5 e indirectamente excitada pela emissão proveniente de um corante SYBR. A hibridação da sonda foi monitorizada duas vezes durante cada ciclo de amplificação, no espaço da temperatura de detecção do ensaio de LATE-PCR, primeiro a 55°C, uma temperatura à qual a sonda é discriminatória de alelos neste ensaio e se liga exclusivamente ao seu alvo perfeitamente complementar, e depois a 40°C, uma temperatura à qual a sonda é tolerante a emparelhamentos incorrectos e liga-se à totalidade de alelos da sua sequência-alvo presentes na reacção de amplificação. A detecção dos alelos específicos e dos alelos totais com a sonda tolerante a emparelhamentos incorrectos permite a correcção das variações estocásticas tubo a tubo do rendimento dos amplicões, entre as amostras replicadas. A razão de alelos específicos para alelos totais na reacção 48 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ (Cy5 a 55°C/Cy5 a 40°C) permite a normalização da amostra replicada para genotipagem em ponto final. A informação genotipica é derivada dos valores das razões. No caso de amostras homozigóticas, os sinais da sonda detectados em condições discriminatórias de alelos são os mesmos que os sinais da sonda detectados em condições tolerantes a emparelhamentos incorrectos, uma vez que em ambos os casos a sonda se está a ligar a 100% dos alelos da sequência-alvo. Em contraste, no caso de amostras heterozigóticas, os sinais da sonda detectados em condições discriminatórias de alelos têm metade da intensidade dos sinais da sonda detectados em condições tolerantes a emparelhamentos incorrectos, uma vez que a sonda se está a ligar a apenas 50% dos alelos da sequência-alvo em condições discriminatórias de alelos, mas a 100% dos alelos em condições tolerantes a emparelhamentos incorrectos. Dai as amostras homozigóticas possuírem razões Cy5 a 55°C/Cy5 a 40°C mais elevadas que as amostras heterozigóticas. Este método de genotipagem assenta apenas na detecção de um único alelo.

As sequências e a temperatura de fusão ajustada à concentração, Tm[0], dos iniciadores e da sonda de LATE-PCR são as seguintes. O iniciador limitante tem a sequência 5'-CGAGGTCATTGAATACGCACGGCTCC-3' (SEQ. ID No. 3). Possui uma Tm[o] ajustada à concentração de 63,2°C a 25 nM. O iniciador em excesso tem a sequência 5'-TAACAAGCAGAGTCCCTCTGGT-3' (SEQ. ID No. 4). Possui uma Tm[0] ajustada à concentração de 61,8°C a 1 μΜ. A sonda tem a sequência 5'-Cy5-GGGACCAGGTAAGAA-3' (SEQ. ID No. 5). Possui uma Tm de 56,3°C. É uma sonda de baixa Tm e, quando utilizada com uma temperatura de hibridação de 65 °C, também é uma sonda de super baixa Tm.

Prepararam-se ensaios de LATE-PCR replicados (n=15) para cada genótipo diferente (G269 homozigótico e G269 heterozigótico) em tampão de PCR lx, MgCl2 3 mM, dNTP 250 μΜ, iniciador limitante 25 nM, iniciador em excesso 1.000 nM; 1,25 unidades de ADN-polimerase Taq, sonda marcada com Cy5 0,6 μΜ; e uma diluição de 1:40.000 de SYBR Gold I. Os parâmetros dos ciclos de PCR foram 95°C durante 3 minutos, depois 25 ciclos a 95°C durante 10 s, 65°C durante 20 s e 72°C durante 20 s, seguidos de 30 ciclos a 95°C durante 10 s, 65°C durante 20 s, 72°C durante 20 s, 55°C durante 20 s e 49 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ 40°C durante 20 s com aquisição da fluorescência a 55°C e a 40°C no canal Cy5. A FIG. 7 ilustra a análise das razões dos sinais de Cy5 a 55°C para os sinais de Cy5 a 40°C e demonstra que estas razões são adequadas para a genotipagem em ponto final, para qualquer ciclo de amplificação após o limiar de detecção da sonda. Nesta figura, as amostras homozigóticas (circulo 91) possuem razões aproximadamente duplas da razão das amostras heterozigóticas (circulo 92).

Exemplo 4. Análise de múltiplos alvos utilizando sondas específicas para os alvos com diferentes temperaturas de fusão.

Sondas múltiplas, cada uma delas marcada com o mesmo fluoróforo, podem ser utilizadas em conjunto para detectar e quantificar diferentes sequências ao longo de um único oligonucleótido mais comprido (por exemplo, um produto de PCR assimétrico, LATE-PCR ou amplificação por circulo rolante) ou em diferentes oligonucleótidos. A utilização de sondas de baixa Tm aumenta a especificidade para estes alvos, reduzindo grandemente ou eliminando os sinais gerados a partir de alvos com correspondências incorrectas. Uma aplicação possível desta tecnologia é a genotipagem do ADN humano para identificar alelos conhecidos que causam doença genética. Este exemplo descreve análises de temperatura para a concepção de sondas e para a detecção de produtos.

Como ponto de partida, escolhemos os seguintes alvos que poderiam estar eventualmente presentes num produto de amplificação: a sequência normal do gene do regulador transmembranar da fibrose cística (CFTR) na região que codifica o aminoácido 542 da proteína; a sequência da mutação Delta F508, a mutação CFTR mais comum; e a sequência normal correspondente à mutação Delta F508.

Concebemos sondas discriminatórias de alelos de baixa Tm para cada uma das três sequências-alvo. As sondas eram sondas do tipo faróis moleculares de baixa temperatura, cada uma delas marcada com o fluoróforo FAM e um desactivador. As três sondas foram concebidas para possuir diferentes Tm versus os seus alvos, em misturas contendo Tris-HCl 70 mM e MgCl2 3 mM. A "sonda 542" tinha uma Tm de 40°C (valor previsto de 41°C 50 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ pelo cálculo do vizinho mais próximo); a "sonda normal 508" tinha uma Tm de 47°C (valor previsto de 46°C pelo cálculo do vizinho mais próximo); e a "sonda Delta F508" tinha uma Tm de 54°C (valor previsto de 53°C pelo cálculo do vizinho mais próximo). A FIG. 8 apresenta as curvas de fusão a partir das quais foram obtidos os valores Tm. A FIG. 8 ilustra a primeira derivada negativa das leituras da fluorescência em função da temperatura para a sonda 542 (curva 96), a sonda DF508 (curva 97) e a sonda normal 508 (curva 98), para amostras em duplicado. Obtiveram-se alturas de picos aproximadamente iguais, mediante a utilização de concentrações de alvo de 1 μΜ e uma concentração da sonda 542 de 2 μΜ. Testámos cada sonda contra um alvo contendo correspondências incorrectas para verificar a discriminação de alelos, e verificámos que a fluorescência contra o alvo perfeitamente complementar era 5-10 vezes a fluorescência contra o alvo contendo correspondências incorrectas. É possível ver a partir da FIG. 8 que mesmo pequenas diferenças de Tm teriam sido facilmente resolvidas. A partir de um gráfico como a FIG. 8, diferenças de 4-5°C seriam resolúveis. A desconvolução utilizando software fornecido juntamente com termocicladores de PCR em tempo real poderia permitir a resolução de Tm diferindo em metade dessa quantidade. A análise da primeira derivada negativa da fluorescência é um método para determinar quais os alvos oligonucleotídicos que estão presentes numa dada amostra. A FIG. 9 ilustra uma análise destas, utilizando a fluorescência acima do fundo. As amostras contendo o alvo 508 normal, mas nenhum alvo Delta F508 (circulo 101) possuem um pico de fusão a 54°C, indicativo desse híbrido farol molecular-alvo. As amostras contendo o alvo Delta F508, mas nenhum alvo normal (circulo 102) têm um pico de fusão a cerca de 47°C, indicativo da hibridação do farol com a sequência mutante. As amostras contendo ambos esses alvos (circulo 103) apresentam um pico largo ao longo desse intervalo de temperaturas, indicando fluorescência de ambos os híbridos farol molecular-alvo. A presença e concentração relativa da sequência normal no aminoácido 542 é indicada pela presença e altura relativa do pico de fusão a cerca de 40°C. As amostras com o alvo normal 51 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ 542 (linha a cheio para cada grupo numerado) possuem um pico grande a essa temperatura, as amostras com o alvo mutante 542 contendo uma única alteração nucleotidica nesta região, idêntica à segunda mutação CFTR mais comum (linha pontilhada para cada grupo numerado) não possuem qualquer pico a essa temperatura, e as amostras com ambos os alvos 542 (linha tracejada para cada grupo numerado) possuem picos de altura intermédia. A altura do pico nas amostras com ambos os alvos 542 é afectada pela presença do pico de fusão Delta F508 vizinho.

Poderá nem sempre ser possível ou desejável obter um perfil de fusão completo no decurso de uma reacção de amplificação. Uma análise subsequente das amostras descritas acima mostra que um número limitado de etapas de detecção poderia fornecer a informação necessária para identificar os oligonucleótidos específicos numa mistura. A diminuição, em vez do aumento, da temperatura pode ser utilizada. As amostras foram aquecidas a 70 °C e depois arrefecidas em decrementos de 5°C para 30°C, com uma detecção de 30 segundos em cada etapa. As amostras contendo o alvo 508 normal, mas não o alvo Delta F508, ou contendo o alvo Delta F508, mas não o alvo normal, puderam ser diferenciadas com base em variações da fluorescência entre 60°C e 50°C. Cada combinação de oligonucleótidos-alvo produziu um padrão singular de variação da fluorescência. Um diagrama de dispersão da percentagem de variação do aumento da fluorescência a 55°C versus a percentagem de variação do aumento da fluorescência a 45°C está apresentado na FIG. 10. Esta análise distingue a combinação de alvos que estão presentes em cada amostra. Ao utilizar as variações da fluorescência em vez da intensidade da fluorescência em si, é possível fazer uma avaliação correcta, mesmo quando as amostras diferem consideravelmente na concentração total dos alvos, como poderia ser o caso em amostras de amplificação replicadas. A FIG. 10 inclui amostras em duplicado para cada combinação de alvos 508 normal mais 542 normal (marcas delimitadas 111), alvos 508 normal mais ambos 542 (112), alvos 508 normal mais 542 mutante (113), ambos os alvos 508 mais 542 normal (114), ambos os alvos 508 mais ambos os alvos 542 (115), ambos os alvos 508 mais 542 mutante (116), alvos Delta 508 mais 542 normal (117), alvos Delta 508 mais ambos 542 (118) e alvos 52 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ

Delta 508 mais 542 mutante (119) . Uma análise similar podia ser efectuada utilizando este perfil de temperaturas durante cada ciclo ou durante ciclos seleccionados de uma reacção de amplificação. Várias amostras com ADN de genótipos conhecidos poderiam ser amplificadas, e os resultados de detecção utilizados para estabelecer um intervalo esperado de valores. Isto proporcionaria um método para a determinação rápida dos genótipos de amostras desconhecidas.

Embora apenas tenham sido usadas 3 sondas neste exemplo, é possível a utilização combinada de um número muito mais elevado de sondas. As limitações principais ao número total de sondas são o intervalo de temperatura para a detecção e a diferença minima de Tm entre os híbridos sonda-alvo. Estas são, pelo seu lado, dependentes da natureza da reacção de amplificação e das capacidades do equipamento e do software de desconvolução. Por exemplo, 10 combinações diferentes de sonda-alvo poderiam ser diferenciadas ao longo de um intervalo de temperatura de 30 graus se a diferença minima de Tm para a desconvolução for de 3 graus. Este número pode ser aumentado várias vezes através da utilização de múltiplos fluoróforos.

Exemplo 5. Normalização a duas temperaturas com e sem correcção do fundo. A genotipagem por LATE-PCR QE do SNP rs858521 foi efectuada com amostras de adn desconhecido, controlo homozigótico rs858521 (alelos CC) e controlo heterozigótico (alelos CG), utilizando uma sonda única tolerante a emparelhamentos incorrectos e marcada com Cy5. A amplificação e a detecção foram efectuadas utilizando um equipamento ABI Prism Sequence Detector 7700 (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, E.U.A.), que normalmente gera sinais fluorescentes corrigidos em termos de linha de base. Para a nossa análise utilizando razões, contudo, as razões dos sinais fluorescentes foram obtidas tanto a partir de sinais de fluorescência corrigidos em termos de linha base (FIG. 11) como a partir de sinais fluorescentes em bruto (FIG. 12) . A FIG. 11 apresenta a razão da fluorescência da sonda a 50°C para a sua fluorescência a 25°C em função do número de ciclos da reacção de amplificação, utilizando os sinais 53 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ fluorescentes corrigidos em termos de linha de base do instrumento. Na FIG. 11, o círculo 113 consiste em réplicas do controlo homozigótico, o circulo 114 consiste em réplicas do controlo heterozigótico, enquanto os círculos 111 e 112 são os desconhecidos. A FIG. 12 apresenta os mesmos resultados utilizando sinais de fluorescência em bruto. Na FIG. 12, o círculo 116 consiste em réplicas do controlo homozigótico, o circulo 117 representa réplicas do controlo heterozigótico e o círculo 115 consiste nos desconhecidos. A utilização de sinais de fluorescência corrigidos em termos de linha de base para a normalização resultou em genotipagem ambígua para uma amostra, FIG 11, circulo 112. Em contraste, a utilização de sinais de fluorescência em bruto para a normalização forneceu a genotipagem correcta para todas as amostras. Este resultado demonstra que a correcção da linha de base no software do instrumento ABI Prism 7700 Sequence Detector pode introduzir artefactos que afectam a normalização do sinal e, preferencialmente, não deve ser utilizada.

Exemplo 6. Normalização a três temperaturas.

Efectuaram-se reacções de amplificação por LATE-PCR replicadas contendo os iniciadores de SNP rs858521 e uma única sonda ResonSense tolerante a emparelhamentos incorrectos, utilizando ADN genómico purificado para cada genótipo do gene SNP rs858521 (equivalente a 1.800 genomas, 18 reacções replicadas de cada genótipo CC homozigótico, CG heterozigótico e GG homozigótico). Os produtos amplificados foram analisados por curvas de fusão, apresentadas na FIG. 13, painel A, e por normalização dos resultados, como ilustrado no painel B e painel C. A FIG. 13A ilustra uma representação dos sinais de fluorescência em bruto recolhidos durante a análise de curvas de fusão após a amplificação por LATE-PCR. A sonda que foi utilizada mostrou-se discriminatória de alelos a temperaturas mais elevadas, mas tornou-se progressivamente mais tolerante a emparelhamentos incorrectos à medida que a temperatura foi reduzida. A variabilidade intrínseca do rendimento do produto entre as amostras replicadas impede uma discriminação destes genótipos por meio dos sinais de fluorescência em bruto (círculo 113) dentro da janela de temperaturas de discriminação dos alelos 54 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ para esta sonda (40°C-60°C, previamente determinada com alvos oligonucleotídicos sintéticos, dados não apresentados). A FIG. 13B apresenta os sinais provenientes de cada amostra, normalizados a cada temperatura contra o sinal recolhido a uma temperatura totalmente tolerante a emparelhamentos incorrectos (25°C) para essa amostra. Na FIG. 13B, os sinais normalizados para os alelos CC homozigóticos são o circulo 132, os sinais normalizados para os alelos CG heterozigóticos são o circulo 133 e os sinais normalizados para os alelos GG homozigóticos são o circulo 134. Como a figura ilustra, a normalização reduz a dispersão do sinal e permite a identificação de cada genótipo dentro da janela de discriminação dos alelos. A separação máxima foi observada a 52 °C, que corresponde à Tm da sonda ResonSense que foi utilizada. Embora a dispersão do sinal seja significativamente reduzida na FIG. 13B em comparação com a FIG. 13A, ainda se verificou alguma variabilidade da intensidade do sinal entre as amostras replicadas, a julgar pela amplitude nas representações cinéticas. A FIG. 13C mostra que o melhor método para eliminar esta dispersão residual do sinal foi através da normalização dos sinais fluorescentes a cada temperatura em relação aos sinais fluorescentes recolhidos às temperaturas de topo e de base da janela de discriminação de alelos observada na FIG. 13B, onde as curvas de fusão começam a divergir (isto é, 40°C e 60°C, respectivamente). Na FIG. 13C, os sinais normalizados para os alelos CC homozigóticos são o circulo 135, os sinais normalizados para os alelos CG heterozigóticos são o circulo 136 e os sinais normalizados para os alelos GG homozigóticos são o circulo 137. Se Fb e Ft forem as leituras de fluorescência na direcção da base e do topo da janela de temperaturas de discriminação dos alelos, respectivamente, e Fs for a leitura de fluorescência a uma qualquer dada temperatura durante a análise de fusão, então as razões fluorescentes normalizadas são calculadas como:

Razão de fluorescência normalizada a três temperaturas = (Fs-Ft)/(Fb-Ft) A normalização simultânea dos sinais fluorescentes a cada temperatura em relação aos sinais fluorescentes a 40°C e 60°C, numa qualquer amostra, reduziu adicionalmente a 55 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ dispersão do sinal fluorescente e fez com que as réplicas das curvas de fusão de cada genótipo ficassem muito juntas (ver FIG. 13C) . As razões fluorescentes calculadas a uma temperatura única, nomeadamente, a Tm da sonda (52°C), normalizadas utilizando os sinais fluorescentes na direcção das temperaturas de topo e de base da janela de discriminação de alelos (isto é, a 60°C, 40°C), definem de forma única cada genótipo com uma certeza superior a 99,7% (isto é, as caixas de erro consistindo em três desvios padrão englobando 99,7% de todas as razões fluorescentes possíveis para cada genótipo estão bem separadas umas das outras, resultados não apresentados). Obtiveram-se resultados identicamente melhorados para o local SNP rs2270517 quando os sinais fluorescentes foram calculados à Tm da sonda (57°C) e normalizados em relação às correspondentes temperaturas de topo e de base da janela de discriminação de alelos (isto é, a 71°C, 45°C) .

Misturas reaccionais para amplificação (concentrações final)

Volume: 25 μΐ

Tampão de PCR lx (Invitrogen, Carlsbad, CA, E.U.A.)

MgCl2 3 mM dNTP 10 μΜ

Sonda 0,6 μΜ (apenas LATE-PCR)

Corante SYBR Gold diluição 1:41.666 (Molecular Probes, Eugene, OR, E.U.A) ADN-polimerase Taq Platinum 1,25 unidades (Invitrogen) ADN genómico humano 6 ng (equivalente a 1.000 genomas) Iniciadores: para LATE-PCR, iniciador limitante 25 nM e iniciador em excesso 1.000 nM; (para o controlo, 300 nM de cada um dos mesmos iniciadores).

Sequências oligonucleotídicas

Iniciador limitante: 5'-CGAGGTCATTGAATACGCACGGCTCC-3' (SEQ. ID. No. 17)

Iniciador em excesso: 5'-TAACAAGCAGAGTCCCTCTGGT-3' (SEQ. ID. No. 18)

Sonda: 5'-Cy5-GGGACCAGGTAAGAA-Fosfato-3' (SEQ. ID No. 19) 56 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ

Mistura reaccional para sequenciação cíclica Volume: 20 μΐ 100 femtomoles (fmoles) de produto que serão sequenciadas 5 picomoles (pmoles) de iniciador de sequenciação (o iniciador limitante ou o iniciador em excesso) DTC5 Quick Start Master Mix lx (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, E.U.A.) [inclui os dNTP, ddNTP, tampão, MqCl2] .

Sequenciação de Sanqer

As misturas reaccionais para sequenciação foram submetidas a sequenciação cíclica e electroforese capilar num instrumento CEQ 2000XL DNA Sequence (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, E.U.A.), utilizando o kit CEQ 2000 Due Termination Cycle Sequencing (Beckman Coulter) de acordo com as instruções do fabricante.

Amplificação por late-pcr e preparação para sequenciação A mistura reaccional para amplificação por LATE-PCR foi submetida a ciclos térmicos da forma que se segue: 95°C durante 3 min; 20 ciclos de 95°C durante 10 s, 65°C durante 20 s e 72°C durante 20 s e 70 ciclos de 95°C durante 10 s, 65°C durante 20 s, 72°C durante 20 s, 55°C durante 20 s e 40°C durante 20 s. A síntese do amplicão de cadeia dupla foi monitorizada através da excitação do corante SYBR e leitura da sua fluorescência durante a etapa de extensão dos iniciadores a 72°C. A síntese do produto de cadeia simples, após o esgotamento do iniciador limitante, foi monitorizada através da excitação do corante SYBR e leitura da fluorescência proveniente do fluoróforo Cy5 da sonda de baixa Tm, durante a etapa de detecção a baixa temperatura de 40°C.

Para obter 100 fmoles do produto de extensão do iniciador em excesso, foi necessário efectuar a diluição do produto de amplificação. Estimámos a quantidade de produto no volume de 25 μΐ do produto de reacção da forma que se segue. Primeiro, a quantidade desse produto contida no produto de cadeia dupla produzido durante os ciclos de amplificação inicial é ditada pela quantidade de iniciador limitante. 57 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ

Neste exemplo, isso foi 25 nM, que se traduz em 25 fmoles/μΐ. A concentração do produto de extensão de cadeia simples produzido durante a fase linear da amplificação por LATE-PCR, isto é, após o esgotamento do iniciador limitante, foi estimada por divisão dessa fase em duas partes determinadas através de inspecção da curva de fluorescência de Cy5: uma primeira parte em que a amplificação decorre aritmeticamente e uma segunda parte em que a acumulação do produto abrandou. Para a primeira parte, que neste exemplo consistiu em seis ciclos, assumimos uma eficiência de amplificação de 50% com base em Gyllensten, U.B.H. e Erlich, A. (1988), "Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA LOCUS", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 7652-7656. A produção de cadeias simples durante os seis ciclos foi calculada como a concentração de partida (25 fmoles/μΐ) vezes o número de

ciclos (6) vezes a eficiência (0,5). A produção subsequente foi estimada como sendo o aumento percentual do sinal de Cy5 durante o resto da reacção, que neste caso foi 233,3%. A produção total durante a fase linear foi, assim, de 175 fmoles/μΐ (25 x 6 x 0,5 x 2,333), e a concentração total desse produto, incluindo 25 fmoles/μΐ em amplicão de cadeia dupla, foi estimada em 200 fmoles/μΐ. Para obter 100 fmoles na mistura reaccional para sequenciação ciclica, diluímos o produto de amplificação de 1:8 com água e utilizámos 4 μΐ do produto diluído na mistura reaccional de 20 μΐ. Como se compreenderá, isto significou que o produto de amplificação foi diluído, no final, de 1:40.

Para obter 100 fmoles do produto de extensão do iniciador limitante, o nosso ponto de partida foi que o produto da reacção de amplificação continha uma concentração de 25 nM desse produto, ou 25 fmoles/μΐ. Utilizámos simplesmente 4 μΐ do produto de amplificação nos 20 μΐ da mistura reaccional para sequenciação cíclica, para obter a quantidade inicial desejada de 100 fmoles.

Amplificação de controlo e preparação para sequenciação A mistura reaccional para amplificação foi submetida ao mesmo perfil de ciclos térmicos, com a excepção de se terem 58 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ executado apenas 18 (em vez de 70) dos ciclos de cinco temperaturas, porque uma representação gráfica em tempo real do sinal do corante de intercalação indicou que a amplificação atingiu um patamar neste ponto e que apenas o produto de amplificação desejado era produzido nesse ponto. Os produtos de amplificação presentes na mistura de amplificação no final da reacção foram purificados de modo convencional, utilizando o kit de purificação QUIA Quick PCR (Qiagen, Valência, CA, E.U.A.) de acordo com as instruções do fabricante. Os amplicões purificados foram quantificados por electroforese em gel, num gel de agarose a 3% em TBE 0,5x contra diferentes quantidades conhecidas de marcadores de ADN ΦΧ174 Hind III, seguida de visualização por coloração com brometo de etidio (0,5 μρ/ιηΐ) . Um volume contendo 100 fmoles foi utilizado na mistura reaccional para sequenciação cíclica com cada iniciador de sequenciação.

Resultados

Os métodos de LATE-PCR e de controlo produziram ambos sequências correspondentes a informações de sequência constantes do GenBank (número de acesso M16417). A FIG. 17 inclui quatro cromatogramas obtidos a partir da sequenciação de Sanger. O painel A é do método de LATE-PCR, com a sequenciação cíclica utilizando o iniciador limitante como iniciador de sequenciação. O painel B é do método de LATE-PCR, com a sequenciação cíclica utilizando o iniciador em excesso como iniciador de sequenciação. O painel C é o método de controlo utilizando o iniciador em excesso como iniciador de sequenciação. O painel D é o método de controlo utilizando o iniciador limitante como iniciador de sequenciação. Cada cromatograma inclui as curvas de fluorescência obtidas a partir dos didesoxinucleótidos marcados e a sequência nucleotídica determinada.

Exemplo 11. Estratégias para a amplificação por LATE-PCR de mais de um produto a partir do mesmo molde de ADN, na mesma reacção.

Efectuaram-se amplificações por PCR utilizando um ABI Prism Sequence Detector 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, E.U.A.), para amplificar, na mesma reacção duplex, 59 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ dois amplicões de 549 e 464 bases designados por cadeias HV1 e HV2 H e L, contidas na região de volta d do ADN mitocondrial humano, com base no qual as sequências foram amplificadas utilizando um iniciador em excesso.

Misturas reaccionais para amplificação (concentrações finais)

Volume: 25 μΐ

Tampão de PCR lx (Invitrogen, Carlsbad, CA, E.U.A.)

MgCl2 3 mM (Invitrogen) dNTP 250 μΜ (Promega)

Sonda 1,0 μΜ (apenas late-pcr)

Corante SYBR Green diluição lOx (FMC Bioproducts, Rockland ME, E.U.A) ADN-polimerase Taq Platinum 1,25 unidades (Invitrogen) ADN genómico de linfócitos do sangue humano (equivalente a 100 genomas de ADNmt)

Iniciadores: para LATE-PCR, iniciador limitante 50 nM e iniciador em excesso 1.000 nM.

Sequências oliqonucleotídicas

Sonda: 5'-Cy5-TGCTAATGGTGGAG-FosfatO-3' (SEQ. IDNo. 20)

HVl-H

Iniciador limitante: 5'-GCCCGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTTG-3'(SEQ. ID. No. 21) iniciador em excesso: 5'-CACCAGTCTTGTAAACCGGAGATGAA-3' (SEQ. ID. No. 22)

HV2-H

Iniciador limitante: 5'-GTATGGGAGTGGGAGGGGAAAATAATGTGTTAG-3' (SEQ. ID. No. 23)

Iniciador em excesso: 5'-AGGTCTATCACCCTATTAACCACTCA-3' (SEQ. ID. No. 24)

HVl-L

Iniciador limitante: 5'-CACCAGTCTTGTAAACCGGAGATGAAAACC-3' (SEQ. ID. No. 25)

Iniciador em excesso: 5'-CGAGGAGAGTAGCACTCTT-3' (SEQ. ID. No. 26) 60 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ

HV2-L

Iniciador limitante: 5'-AGGTCTATCACCCTATTAACCACTCACGGG-3' (SEQ. ID. No. 27)

Iniciador em excesso: 5'-GGAGGGGAAAATAATGTGTTAGT-3' (SEQ. ID. No. 28)

Mistura reaccional para sequenciação cíclica

Volume: 25 μΐ 100 fmoles de produto que serão sequenciadas 5 pmoles de iniciador de sequenciação (o iniciador limitante ou o iniciador em excesso) DTC5 Quick Start Master Mix lx (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, E.U.A.) [inclui os dNTP, ddNTP, tampão, MqCl2] .

Sequenciação de Sanger

As misturas reaccionais para sequenciação foram submetidas a sequenciação cíclica e electroforese capilar num instrumento CEQ 2000XL DNA Sequence (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, E.U.A.), utilizando o kit CEQ 2000 Dye Termination Cycle Sequencing (Beckman Coulter) de acordo com as instruções do fabricante.

Amplificação por LATE-PCR e preparação para sequenciação A mistura reaccional para amplificação por LATE-PCR foi submetida a ciclos térmicos da forma que se segue: 95°C durante 3 min; 15 ciclos de 95°C durante 15 s, 64°C durante 10 s e 72°C durante 45 s e 50 ciclos de 95°C durante 15 s, 64°C durante 10 s, 72°C durante 45 s, e apenas para HVl-H 50°C durante 20 s. A síntese do amplicão de cadeia dupla foi monitorizada através da excitação do corante SYBR Green e leitura da sua fluorescência durante a etapa de extensão dos iniciadores a 72°C. A síntese do produto de cadeia simples, após o esgotamento do iniciador limitante, foi monitorizada através da excitação do corante SYBR e leitura da fluorescência proveniente do fluoróforo Cy5 da sonda de baixa Tm, durante a etapa de detecção a baixa temperatura de 50°C apenas para a região HVl-H. 61 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ

Para obter 100 fmoles do produto de extensão do iniciador em excesso, foi necessário efectuar a diluição do produto de amplificação. Estimámos a quantidade de produto no volume de 25 μΐ do produto de reacção da forma que se segue. Primeiro, a quantidade desse produto contida no produto de cadeia dupla produzido durante os ciclos de amplificação inicial é ditada pela quantidade de iniciador limitante. Neste exemplo, isso foi 50 nM, que se traduz em 50 fmoles/μΐ. A concentração do produto de extensão de cadeia simples produzida durante a fase linear da amplificação por LATE-PCR, isto é, após o esgotamento do iniciador limitante, foi estimada por divisão dessa fase em duas partes determinadas através de inspecção da curva de fluorescência de Cy5: uma primeira parte em que a amplificação decorre aritmeticamente e uma segunda parte em que a acumulação do produto abrandou. Para a primeira parte, que neste exemplo consistiu em onze ciclos, assumimos uma eficiência de amplificação de 50% com base em Gyllensten, U.B.H. e Erlich, A. (1988), "Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA LOCUS", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 7652-7656. A produção de cadeias simples durante os onze ciclos foi calculada como a concentração de partida (50 fmoles/μΐ) vezes o número de ciclos (11) vezes a eficiência (0,5). A produção subsequente foi estimada como sendo o aumento percentual do sinal de Cy5 durante o resto da reacção, que neste caso foi 100%. A produção total durante a fase linear foi, assim, de 275 fmoles/μΐ (50 x 11 x 0,5 x 1,0), e a concentração total desse produto, incluindo 50 fmoles/μΐ em amplicão de cadeia dupla, foi estimada em 325 fmoles/μΐ. Para obter 100 fmoles na mistura reaccional para sequenciação cíclica, diluímos o produto de amplificação de 1:13 com água e utilizámos 4 μΐ do produto diluído na mistura reaccional de 25 μΐ.

Resultados Há quatro combinações possíveis que são: 1) HVl-H com HV2-H, 2) HVl-L com HV2-L, 3) HVl-H com HV2-L, 4) HVl-L com HV2-H. A FIG. 18 apresenta um gel de agarose a 4% resultante da electroforese de controlos sem molde (CSM), três pistas da esquerda; amplicões de reacções iniciadas com 100 cópias de 62 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ ADN genómico, três pistas seguintes; e na pista mais à direita, um padrão de pesos moleculares de 100 pb. A FIG. 18 ilustra a formação dos amplicões de ADN de cadeia dupla HVl-H e HV2-H de 549 e 464 pares de bases, utilizando 100 cópias de ADN genómico no inicio da reacção. Os controlos sem molde, CSM, não sofreram amplificação.

Como um perito na arte compreenderá, ao amplificar dois amplicões de cadeia simples na mesma reacção a partir de um único molde, as duas cadeias do iniciador em excesso podem ser geradas a partir da mesma cadeia de ADN ou a partir de cadeias complementares de ADN. Empregámos ambas as abordagens com êxito. Nas combinações HVl-H com HV2-H e HVl-L com HV2-L, ambos os amplicões são gerados a partir da mesma cadeia do molde de ADN. Nas combinações HVl-H com HV2-L e HVl-L com HV2-H, os dois amplicões são gerados a partir de cadeias complementares de ADN. A FIG. 19A apresenta informações de sequência para o amplicão HVl-H no duplex HVl-H com HV2-H na região de bases 16209-16169. A FIG. 19B mostra informações de sequência para o amplicão HV2-H no duplex HVl-H com HV2-H na região de bases 289-326. A FIG. 19C apresenta informações de sequência para o amplicão HVl-H no duplex HVl-H com HV2-L na região de bases 16209-16169. A FIG. 19D mostra informações de sequência para o amplicão HV2-L no duplex HVl-H com HV2-L na região de bases 289-326. A reacção de LATE-PCR produziu sequências correspondentes a informações de sequência constantes do GenBank.

Exemplo 12. Determinação da necessidade de ADN de cadeia simples. A quantidade de ADN de cadeia simples e ADN de cadeia dupla gerada por uma amplificação por late-pcr pode ser utilizada para determinar a quantidade de ADN de cadeia simples que é necessária para a sequenciação de Sanger do tipo "diluir e seguir". Efectuaram-se amplificações por PCR utilizando um instrumento ABI Prism Sequence Detector 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, E.U.A.), para amplificar o amplicão de 549 pares de bases designado por HVl-H compreendido na região de volta d do ADN mitocondrial humano. O ADNmt foi extraído em condições de lise (conforme descrito em Peirce et al. (2002) Biotechniques 32(5), 1106- 63 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ 1111; com a inclusão de 4 μΐ DTT em 100 μΐ da mistura de reacção de lise) a partir de um fio de cabelo humano. Todas as amplificações foram amplificações por LATE-PCR, e o produto foi directamente submetido a sequenciação de Sanger.

Misturas reaccionais para amplificação (concentrações finais)

Volume: 25 μΐ

Tampão de PCR lx (Invitrogen, Carlsbad, CA, E.U.A.)

MgCl2 3 mM (Invitrogen) dNTP 250 μΜ (Promega)

Sonda 1,0 μΜ (apenas LATE-PCR)

Corante SYBR Green diluição lOx (FMC Bioproducts, Rockland ME, E.U.A) ADN-polimerase Taq Platinum 1,25 unidades (Invitrogen)

Solução de lise de ADN 1 μΐ (equivalente a ~10 genomas de ADNmt)

Iniciadores: para LATE-PCR, iniciador limitante 50 nM e iniciador em excesso 1.000 nM.

Sequências oligonucleotídicas HVlH: iniciador limitante, iniciador em excesso e sonda como no Exemplo 11.

Mistura reaccional para sequenciação cíclica Como no Exemplo 11.

Sequenciação de Sanger

Como no Exemplo 11.

Amplificação por LATE-PCR e preparação para sequenciação

Como no Exemplo 11. Os resultados de fluorescência em bruto de ambas as espécies Cy5 e SYBR Green foram utilizados para determinar a quantidade de produto disponível para uma reacção de sequenciação. A razão Cy5/SYBR Green foi utilizada para normalizar todas as flutuações existentes nos resultados em bruto. 64 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ

Resultados

Os resultados de fluorescência provenientes das amplificações por LATE-PCR estão apresentados na FIG. 20, painéis A e B. A FIG. 20A, por exemplo, a linha 201, mostra todos os resultados do fio de cabelo representados em função dos números de ciclos de amplificação como a razão ADN cadeia simples/ADN cadeia dupla (sinal da sonda para o sinal do corante). Este método de análise minimiza a variação devido ao momento em que a amplificação exponencial tem inicio, ou ao nivel em que atinge a plataforma, e demonstra que a eficiência da amplificação do ADN de cadeia simples é virtualmente a mesma em todas as amostras, excepto naquela que começou muito tarde. A FIG. 20B ilustra um método para monitorizar um conjunto de ensaios de LATE-PCR de modo a estabelecer a sua prontidão para a sequenciação "diluir e seguir". O gráfico mostra as razões ADN cadeia simples/ADN cadeia dupla calculadas (sinal da sonda para sinal do corante em função do sinal do corante) para todas as amostras amplificadas ao ciclo 45 (quadrados) e ao ciclo 65 (losangos). Somente as amostras que possuem razões entre 0,06 e 0,10 e valores de SYBR entre 300 e 600 (aqueles na caixa) estão prontos para sequenciação. A FIG. 20B estende a utilização da análise em ponto final quantitativa (LATE-PCR QE) para demonstrar que, após 65 ciclos, todas as amostras, com excepção de uma, tinham acumulado ADN de cadeia simples suficiente para utilizar na sequenciação "diluir e seguir".

Exemplo 13. Amplicões possuindo múltiplos SNP A sensibilidade do LATE-PCR e do método de sequenciação "diluir e seguir" pode diferenciar uma mistura de amplicões possuindo múltiplos SNP a um nivel de resolução de 10%. As amplificações por PCR foram de um fio de cabelo humano de 2 mm ou de uma única impressão digital do polegar numa lâmina de vidro. Todas as amplificações foram amplificações por LATE-PCR, e o produto foi directamente submetido a sequenciação de Sanger. As misturas reaccionais finais para amplificação, as sequências oligonucleotidicas (HVl-H), a mistura reaccional para sequenciação ciclica, a sequenciação 65 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ de Sanger, a amplificação por LATE-PCR e a preparação para sequenciação foram todas como no Exemplo 11.

Misturas entre 10:90 e 90:10 dos produtos de cadeia simples de LATE-PCR de cada uma das três reacções foram sequenciados utilizando o protocolo de Sanger "diluir e seguir" previamente descrito. Os resultados estão apresentados na FIG. 21 e FIG. 22. A FIG. 21 representa um segmento de 10 bases à volta das bases 16320 e 16311 da mistura 50:50 de linfócitos de sangue humano e impressão digital de polegar humano. As alturas dos picos reflectem as alturas 100% efectivas na sequência didesoxi, e não as alturas iguais esperadas de uma mistura 50:50. A linha 211 mostra o pico para a base G nesta sequência, e a linha 212 ilustra o pico para a base A na mesma posição na sequência. O pico 212 é mais alto que o pico 211 numa mistura 50:50 de linfócito de sangue humano e fio de cabelo humano possuindo diferentes sequências genéticas, devido às caracteristicas fluorimétricas da sequenciação de Sanger como se pode demonstrar por análise das sequências puras para a mesma região. A FIG. 22 mostra as percentagens recíprocas (90:10, 70:30, 50:50, 30:70 e 10:90) de duas amostras em cada um dos cinco locais SNP. A amostra 1 proveio de um fio de cabelo humano e a amostra 2 proveio de uma impressão digital de polegar humano de outro indivíduo. As alturas de cada pico em cada posição foram medidas a partir das impressões das sequências didesoxi e foram depois traçadas baseadas na mesma base de um controlo de 100% de amostra 1 ou 100% de amostra 2. Na FIG. 22, a linha 222 é a percentagem pretendida da amostra 1 na mistura representada em função da percentagem pretendida da amostra 2 na mistura. A linha 221 é uma linha ajustada aos resultados efectivos, isto é, a percentagem observada de amostra 1 na mistura representada em função da percentagem pretendida de amostra 2. A percentagem observada para cada percentagem pretendida da amostra 2 é de cinco pontos, um para cada base. Os resultados demonstram que há muito pouca dispersão entre as diferentes bases a cada percentagem, mas também mostram que a linha 221 dos valores observados não cai em cima da linha dos valores previstos 66 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ (linha 222), provavelmente porque a quantidade de amostra 1 e amostra 2 na mistura não eram exactamente iguais.

Exemplo 14. Distinção de misturas

Para distinguir amostras que consistem em 100% de ADN genómico heterozigótico de amostras que consistem em 90% de ADN heterozigótico e 10% de ADN genómico homozigótico para uma única alteração nucleotidica, criámos primeiro uma mistura de ADN consistindo em 90% de ADN heterozigótico para 0 local SNP rs858521 localizado no cromossoma 17 humano (alelos C/G) mais 10% de ADN homozigótico para o mesmo local SNP (alelos C/C). O local SNP consta da base de dados dbSNP do NCBI acessível através de http://www.ncbi.nlm.nih.qov/ entrez/quely.fcgi?DB=SNP. Esta mistura de ADN foi preparada misturando concentrações equivalentes dos correspondentes ADN heterozigóticos e homozigóticos fornecidos pelo Laboratório Reid, na Universidade de Washington em Seattle. As concentrações de ADN para cada ADN genómico, para efeitos de mistura, foram estimadas com base nos valores Ct da fluorescência de SYBR derivados da análise em tempo real de amostras de LATE-PCR semelhante aquela descrita abaixo. Uma vez a mistura de ADN preparada, preparámos reacções de LATE-PCR replicadas contendo 100% ADN heterozigótico ou 90% ADN heterozigótico + 10% ADN homozigótico. Cada amostra de LATE-PCR consistiu em tampão Taq Platinum lx (Invitrogen, Carlsbad, CA), MgCl2 3 mM, mistura de dNTP 250 μΜ, Syber Gold 1 0,24x (invitrogen, Carlsbad, CA), reagente de prevenção da iniciação errónea que designamos por composto Elixir 9-3ÍDD 200 nM, polimerase Taq Platinum 1,25 unidades (Invitrogen, Carlsbad, CA), iniciador em excesso para rs858521 1 μΜ, iniciador limitante para rs858521 50 nM, sonda ResonSense contra o alelo G de SNP rs858521 2, 4 pM e o equivalente a 1800 genomas do ADN genómico apropriado, num volume final de 25 pl. A sequência do iniciador em excesso rs858521 é 5'-CAATCCCTTGACCTGTTGTGGAGAGAA-3' (SEQ. ID. No. 29) A sequência do iniciador limitante rs858521 é 5'-TCCCCAGAGCCCAGCCGGTGTCATTTTC-3'(SEQ. ID. No. 30) A sequência da sonda ResonSense contra o alelo G de SNP rs858521 é 67

ΕΡ 1 805 199/PT 5'-[Cy5]-CTTCAGCTCAAACAATA-[Fos] (SEQ. ID. No. 31) A sequência do reagente de prevenção da iniciação errónea é 5'-Dabcyl-CGCTATAATGAAATTATAGCG-Dabcyl (SEQ. ID. No. 32).

Estas amostras foram submetidas a amplificação num equipamento ABI 7700, utilizando um perfil de ciclos térmicos que consistiu em um ciclo de 95°C durante 3 min, seguido de 45 ciclos de 95°C durante 10 s, 66°C durante 10 s e 72°C durante 20 s. No final da reacção, a reacção foi fundida desde 95°C até 25°C a intervalos de 1°C, durante 1 min a cada temperatura, com aquisição da fluorescência no canal Cy5. Os sinais de fluorescência de Cy5 cortados, sem correcção da linha de base, foram exportados para o programa de computador Excel. O cálculo da primeira derivada dos sinais de fluorescência foi efectuado mediante subtracção dos sinais de fluorescência de uma temperatura dos sinais de fluorescência da temperatura seguinte durante a fusão. Os resultados estão apresentados na FIG. 23, painéis A e B. A FIG. 23A ilustra o gráfico da primeira derivada dos sinais de fluorescência em função da temperatura, ou seja, as curvas de fusão. As curvas de fusão na FIG. 23A foram atenuadas utilizando a função "moving average" do Excel para eliminar o ruído devido a flutuações térmicas no equipamento ABI 7700. A FIG. 23A revelou os picos de fusão correspondentes à ligação da sonda ao seu alvo alelo G complementar a temperaturas mais elevadas e ao alvo alelo C com correspondência incorrectas a temperaturas mais baixas. A fig. 23a mostra que as amostras 90% heterozigóticas + 10% homozigóticas, circulo 231, exibem um pico do alelo G mais baixo e um pico de fusão do alelo C mais elevado em relação às alturas dos picos de fusão do alelo C e do alelo G nas amostras 100% heterozigóticas, circulo 232. Estas diferenças estão de acordo com a proporção superior esperada do alelo C na amostra 90% heterozigótica + 10% homozigótica (55% alelo C: 45% alelo G) em comparação com a amostra 100% heterozigótica (50% alelo G: 50% alelo C) . A razão da altura do pico do alelo C para a altura do pico do alelo G está apresentada como um gráfico de barras na FIG. 23B. O conjunto de barras à direita é para as amostras 90% heterozigóticas + 10% homozigóticas, correspondendo ao círculo 231. As barras mais escuras à esquerda são para as amostras 100% heterozigóticas. As caixas de erro 68 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ convencionais 233 e 234 são apresentadas para os conjuntos de barras, respectivamente. Esta razão distingue as amostras 100% heterozigóticas das amostras 90% heterozigóticas + 10% homozigóticas com uma certeza de 99,7%, com base na ausência de sobreposição das caixas de erro que reflectem três desvios padrão do erro da média.

Exemplo 15. Sensibilidade das reacções de LATE-PCR à concentração inicial de polimerase

Efectuaram-se amplificações por PCR utilizando um instrumento ABI 7700, para amplificar o amplicão de 549 bases designado por HVI-H contido na região de volta d do ADN mitocondrial humano. As misturas reaccionais para o ADN genómico humano, as sequências oligonucleotidicas (HVI-H) e as amplificações por LATE-PCR foram como descrito no Exemplo 11, exceptuando o facto de as unidades de ADN-polimerase Taq Platinum terem variado entre as amostras da seguinte forma: 0,125; 0,250; 0,375; 0,50; 0,625 e 1,25 unidades.

Efectuou-se a análise das curvas de fusão (fluorescência de SYBR Green em função da temperatura) . As curvas de fusão mostraram a forma como a concentração de Taq influenciou a especificidade do produto de ADN de cadeia dupla para esta reacção de LATE-PCR. À medida que a concentração de Taq Platinum diminuiu de 1,25 unidades para 0,375 unidades, a especificidade da reacção aumentou, como reflectido nos picos de fusão das réplicas. A redução adicional da concentração, para 0,250 unidades, diminuiu a especificidade. A 0,125 unidades, a reacção não teve lugar. A maior especificidade ocorreu com uma concentração de Taq de 0,375 unidades.

Exemplo 16. Variação do declive como função da concentração de Taq numa reacção de LATE-PCR em tempo real e numa reacção de LATE-PCR duplex em tempo real.

Concebemos um ensaio de LATE-PCR duplex em tempo real para a amplificação simultânea de sequências contidas nos exões dos genes Oct4 e Xist murinos (número de acesso no GenBank NM 013633 e L04961, respectivamente). Cada reacção foi corrida num volume final de 50 μΐ e continha os seguintes reagentes: tampão de PCR lx (Invitrogen, Carlsbad, CA) 69 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ constituído por Tris-HCl 20 mM, pH 8,4 e KC1 50 mM; MgCl2 3mM, cada dNTP 0,4 mM, iniciador limitante de Oct4 50 nM, possuindo a sequência 5'-TGGCTGGACACCTGGCTTCAGACT-3' (SEQ ID NO. 33), iniciador em excesso de Oct4 2 μΜ, possuindo a sequência 5'-CAACTTGGGGGACTAGGC-3' (SEQ ID NO: 34), iniciador limitante de Xist 100 nM, possuindo a sequência 5'-GGTCGTACAGGAAAAGATGGCGGCTCAA-3' (SEQ ID NO: 35), iniciador em excesso de Xist 2 μΜ, possuindo a sequência 5'-TGAAAGAAACCACTAGAGGGCA-3' (SEQ ID NO:36), sonda do tipo farol molecular de baixo ponto de fusão para Oct4 1 μΜ, possuindo a sequência 5'-TET-CCG CCT GGG ATG GCA TAC TGT GGA AGG CGG-Dabcyl-3' (SEQ ID NO: 37), e reagente de prevenção da iniciação errónea 300 nM (que designamos por composto 9-3bDD), possuindo a sequência 5'-Dabcyl-CGTTATAATGAAATTATAACG-Dabcyl-3' (SEQ. ID. No. 38). Incluiu-se também na mistura de PCR ADN-polimerase Taq Platinum® complexada com anticorpo (Invitrogen, Carlsbad, CA), às concentrações de 1, 2 ou 3 unidades por ensaio. Não se adicionou uma sonda do tipo farol molecular para a detecção dos amplicões de Xist neste exemplo.

Em paralelo com estas reacções de LATE-PCR duplex, corremos também uma série de ensaios para a amplificação por LATE-PCR apenas do amplicão Oct4. Estes ensaios tiveram uma composição idêntica aos ensaios duplex acima referidos, com excepção da omissão do iniciador limitante de Xist e do iniciador em excesso de Xist. O ADN genómico de ratinho (Sigma, St Louis, MO) foi adicionado a todos os ensaios e forneceu os moldes para a amplificação por PCR. O número de genomas adicionados a cada tubo foi calculado como sendo igual a 1.000, baseado num tamanho de 6 pg/genoma (ver Vendrely & Vendrely (1949) Experientia 5: 327-329).

Todos os ensaios foram corridos em duplicado. A amplificação foi efectuada num instrumento ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, CA) com um perfil de ciclos térmicos constituído por 1 ciclo a 95°C durante 5 minutos; 6 ciclos a 95°C durante 10 s, 63°C durante 20 s e 72°C durante 30 s; e 54 ciclos a 95°C durante 15 s, 55°C 70 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ durante 25 s, 72°C durante 35 s e 45°C durante 30 s, com uma aquisição de fluorescência a 45°C no canal TET.

Os resultados desta experiência estão apresentados na FIG. 24, que representa os sinais fluorescentes gerados pela acumulação dos amplicões de Oct4 através de hibridação com a sonda do tipo farol molecular TET-Oct4. Quando apenas estava presente um par de iniciadores, o aumento da concentração da polimerase Taq de 1 unidade/ensaio (circulo 241) para 2 unidades/ensaio (círculos 242) ou 3 unidades/ensaio (círculos 243) teve o efeito de tornar o declive dos sinais mais íngreme devido à maior eficiência da amplificação. Os sinais identificados pelos círculos 242 e 243 (2 e 3 unidades/ensaio, respectivamente) foram interpolados, sugerindo que a eficiência máxima havia sido atingida a aproximadamente estes níveis. Como esperado, os declives das linhas geradas pelas reacções duplex (círculos 244, 245 e 246) foram, em todos os casos, mais baixos que aqueles gerados pela amplificação de um único amplicão, porque a polimerase Taq foi utilizada ao dobro dessa velocidade. Como no caso do LATE-PCR de amplicão único, o aumento da concentração de Taq na reacção duplex de 1 unidade/ensaio (circulo 244) para 2 unidades/ensaio (circulo 245) ou 3 unidades/ensaio (circulo 246) resultou num aumento do declive do sinal. Não houve qualquer aumento adicional do declive inicial das 3 unidades/ensaio (circulo 246) em comparação com o declive inicial das 2 unidades/ensaio (circulo 245), sugerindo novamente que a eficiência máxima havia sido atingida. Contudo, as amostras de 3 unidades/ensaio (circulo 246) atingiram rapidamente uma plataforma e o declive começou a diminuir, ao contrário daquele das amostras de 2 unidades/ensaio (circulo 245), indicando a ocorrência provável de iniciação errónea na presença da concentração mais elevada de Taq testada, que não foi o caso para as amostras 243, também contendo 3 unidades Taq/ensaio, mas apenas um par de iniciadores. Apesar da quantidade mais elevada de Taq disponível nos ensaios de amplicão único em comparação com os duplexes (em que são usadas 3 unidades para gerar um amplicão em vez de dois amplicões ao mesmo tempo), ocorreu mais iniciação errónea nos duplexes devido à adição dos iniciadores Xist. De forma a obter uma eficiência máxima sem iniciação errónea, a concentração de polimerase Taq 71 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ necessita, pois, de ser optimizada tendo em consideração o número e as sequências dos iniciadores adicionados à reacção.

Lisboa, 2011-04-04

Claims (5)

1. ΕΡ 1 805 199/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Método de amplificação e de detecção por LATE-PCR assimétrico homogéneo que reduz a dispersão entre os ensaios replicados, compreendendo: (i) efectuar uma reacção de amplificação por LATE-PCR que inclui uma temperatura de hibridação dos iniciadores permitindo gerar pelo menos um produto de amplificação de cadeia simples em presença de: (a) um molde, (b) um par de iniciadores de LATE-PCR compreendendo um iniciador limitante e um iniciador em excesso que hibridam com as suas sequências-alvo à temperatura de hibridação dos iniciadores, (c) um corante de ADN fluorescente que passa a ser possível excitar por fluorescência quando se associa a um ADN de cadeia dupla a uma temperatura igual ou superior à temperatura de hibridação dos iniciadores, (d) pelo menos uma sonda de hibridação de baixa temperatura, marcada por fluorescência, que híbrida com o referido pelo menos um produto de amplificação de cadeia simples a uma temperatura inferior à temperatura de hibridação dos iniciadores, mas não à temperatura de hibridação dos iniciadores; (ii) detectar os amplicões de cadeia dupla por meio do sinal fluorescente proveniente do corante de ADN, a uma temperatura à qual a pelo menos uma sonda não híbrida com o pelo menos um produto de amplificação; (iii) detectar os produtos de amplificação de cadeia simples por meio do sinal ou dos sinais fluorescentes específicos da sequência provenientes da pelo menos uma sonda hibridada com o pelo menos um amplicão de cadeia simples, a uma temperatura ou a temperaturas inferiores à temperatura de hibridação dos iniciadores e (iv) normalizar os sinais através do cálculo de uma razão entre a fluorescência do produto ou produtos de amplificação de cadeia simples e a fluorescência dos amplicões de cadeia dupla, por meio da qual a dispersão entre as réplicas é reduzida.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a sonda de hibridação para o referido pelo menos um produto de amplificação de cadeia simples é uma sonda de cadeia dupla, desactivada e discriminatória de alelos, opcionalmente em que ΕΡ 1 805 199/ΡΤ 2/3 ο método compreende pelo menos duas sondas para diferentes produtos de amplificação de cadeia simples que estão marcadas com o mesmo fluoróforo, mas que possuem diferentes temperaturas de fusão em relação aos seus alvos, em que a referida etapa de detecção a baixa temperatura consiste em detectar uma emissão do referido fluoróforo a uma temperatura à qual apenas uma sonda se liga ao seu alvo e a uma temperatura em que pelo menos duas sondas se ligam aos seus respectivos alvos.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que (i) a sonda que híbrida com o pelo menos um produto de amplificação de cadeia simples está marcada com um fluoróforo que é indirectamente estimulado por uma emissão de fluorescência proveniente do referido corante de ADN fluorescente e em que a detecção do referido pelo menos um produto de amplificação de cadeia simples compreende uma estimulação do corante de ADN fluorescente e a detecção da fluorescência emitida pela referida sonda; ou (ii) o método compreende pelo menos uma sonda de hibridação tolerante a emparelhamentos incorrectos, que se liga a pelo menos dois produtos de amplificação de cadeia simples possíveis para formar híbridos possuindo diferentes temperaturas de fusão que são inferiores à temperatura utilizada para hibridar os iniciadores na referida amplificação, e que está marcada com um fluoróforo que é indirectamente estimulado por uma emissão de fluorescência proveniente do referido corante de ADN fluorescente, em que a detecção do produto de cadeia simples compreende uma detecção a baixa temperatura a múltiplas temperaturas, que são determinadas pelas referidas diferentes temperaturas de fusão.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3(ii), em que a referida sonda de hibridação tolerante a emparelhamentos incorrectos é uma sonda de hibridação linear que forma uma estrutura secundária compreendendo uma região de cadeia dupla com um comprimento de 1-4 nucleótidos durante a referida detecção a baixa temperatura, em que a fluorescência resultante da referida estrutura secundária é desactivada internamente; e/ou em que a referida sonda de hibridação tolerante a emparelhamentos incorrectos é uma sonda do tipo farol molecular. ΕΡ 1 805 199/ΡΤ 3/3
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 3(ii), compreendendo uma pluralidade de sondas de hibridação de baixa temperatura, diferentemente marcadas por fluorescência, cada uma delas possuindo uma temperatura de fusão em relação a um qualquer alvo que é inferior à temperatura de hibridação dos iniciadores e que, em combinação, hibridam com múltiplas sequências-alvo possíveis, em que pelo menos duas sondas são sondas tolerantes a emparelhamentos incorrectos que hibridam com uma pluralidade de alvos possíveis a diferentes temperaturas e que compreendem fluoróforos que são excitados por uma emissão de fluorescência proveniente do referido corante, em que a detecção dos produtos de amplificação de cadeia simples compreende estimular a referida mistura reaccional de amplificação a pelo menos três temperaturas inferiores à referida temperatura de hibridação dos iniciadores com uma luz que excita o corante, mas não os fluoróforos das referidas sondas tolerantes a emparelhamentos incorrectos, e detectar as emissões das sondas tolerantes a emparelhamentos incorrectos. Lisboa, 2011-04-04 EP 1 805 199/PT 1/24 FIGURA 1 -dF/dT

   Temperatura Μ D Razões de fluorescência Cy5 55eC/Sybr Gold 12°-C Unidades de fluorescência Cy5 FIGURA r ? MNWfcVia μ μ OOOOOO N ftOOOOOOO

   K) to \ to D Η Fluorescência de Cy5 Fluorescência de Cy5 Fluorescência de Cy5 μ u w μ w w 9\ oo 0 0 0 0 0 o 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 FIGXJRA.

   00 W to Μ D FIGURA TAMRA/Cy5 Fluorescência de TAMRA Fluorescência de Cy5

   \ to H Velocidade de variação da fluorescência de TAMRA Velocidade de variação da fluorescência de Cy5 μ m n w ί- tt N A O fe 0\ 00 Bccnq.Bccedui©i

   EP 1 805 199/PT 6/24 FIGURA 6 402C/Cy5 a 40fiC

   TAMRA a 45SC/Cy5 a 5520 FIGURA 7

   1.00 0.90 Cy5 a 552C/Cy5 a 402C 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Número de ciclos EP 1 805 199/PT 8/24 FIGURA 8 Derivada da fluorescência (-dF/dT)

   Temperatura 30 35 40 55 60 65 EP 1 805 199/PT 9/24 FIGURA 9 Derivada da fluorescência (-dF/dT)

   Temperatura ΕΡ 1 805 199/ΡΤ 10/24 FIGURA 10

   Percentagem de variação do declive a 552C ΕΡ 1 805 199/ΡΤ 11/24 ίο >ι α ή υ οι (I) Ο Ό ΙΟ <η π) Φ ΙΟ ιο Ν >, Π) U ώ

   FIGURA 11 (0 η υ Ο οι G ιο «D cg υ <η 0) ο ΰ Número de ciclos ΕΡ 1 805 199/ΡΤ 12/24 FIGURA 12

   Número de ciclos \Α *ή φ VA 0 ΰ\ ft Ϋ' ^Μ,οΐ65' C6tiC^

   V*

   ΜD μ Xd/66T SOS μ \to ΕΡ 1 805 199/PT 15/24 FIGURA 15

   ΕΡ 1 805 199/PT 16/24 FIGURA 16 A1 G, C| Aj Tj GgT, A,Gg giC,A,T2G, C,T, 0,6,0, τ,β,ο,τ,ο.

   ΕΡ 1 805 199/ΡΤ 17/24 FIGURA 17 A

   Β TOT«<*CCA<fCl AQ Τβ TCA A AC TCTfl CAAftÍAí;Acoa atacCCCA <* AO O C <* T

   c lACftOT fSQTQ Q O CACA C.T T TO T C «T «αο Ο ΛΟ flA« O TA A®! * *T* At * T' C·*1 ô

   ΕΡ 1 805 199/ΡΤ 18/24 FIGURA 18 CSM ...........100C-- Padrão PM 100

   549 bp 464 bp ΕΡ 1 805 199/ΡΤ 19/24 FIGURA 19 CTTG TAAGCATGGGG AGGGGGTTTTGA TGT GGAT CG

   TA AN NAGACA. GA G NASAN C GAG G NA GAGAAG GGG GNGNGNN GATATA AGAGAT AATN NAATATA

   c CTTG TA A GCA T GGG GA GGGGGTT TCT GATG TGGATT G C

   AAATC TCCA CCAAA CCCCCCCC NAC C C C C CG C T TGCNNAG G C C A

   EP 1 805 199/PT 20/24 FIGURA 20 A

   0.25 0.15 0.05 -0.05 -0.15 -0.25 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 B Razão Cy5/SYBR 0.16 0.14 0.12 0.1 0.0S 0.06 0.04 0.02

   iaa .mu >nn (1(10 0 100 700 Fluorescência de SYBR Green 0 ΕΡ 1 805 199/ΡΤ 21/24 FIGURA 21 ΑΑ TGA/GCTT ΤΑ

   EP 1 805 199/PT 22/24 FIGURA 22 o

   cd 3 +J W H Cd C cd +j 01 H 0) α <#> (VI flj U V 01 o % observada de amostra 1 na mistura l1 derivada corrigida dos sinais de fluorescência em relação à temperatura Razão de magnitude do pico de fusão alelo C/alelo G

   H u 01 (t (Λ c *!, * (A B

   H Q α (0LO U \to HDμ 03 o aiμ \ rçH EP 1 805 199/PT 24/24 FIGURA 24 Fluorescência de TET (AR*,)

   Número de ciclos