CN101076607A - 用于核酸扩增的引物、探针和方法 - Google Patents

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Abstract

在PCR扩增，优选地LATE－PCR期间或之后利用荧光DNA染料和间接可激发标记引物和探针进行的同质检测改进了再现性和量化。非对称PCR扩增，优选地LATE－PCR期间或之后利用荧光DNA染料和间接可激发的经标记的容许错配的探针进行的低温同质检测允许对复杂目标进行分析。LATE－PCR扩增之后进行的定序样本制备方法降低了复杂性并允许“单管”处理。

Description

用于核酸扩增的引物、探针和方法
技术领域
本发明涉及核酸扩增反应，包括利用聚合酶链式反应的扩增，以及利用此类反应与定序和杂交探针检测方法结合的化验。
背景技术
核酸扩增技术和化验是众所周知的。某些扩增反应是等温的，例如基于核酸序列的扩增(NASBA)。其它扩增反应使用热循环，例如聚合酶链式反应(PCR)。优选的使用经扩增产物的荧光检测的扩增化验是同质的，即，它们不需要对试剂进行物理分离以允许检测(例如，使结合探针与未结合探针分离)且可在单个密闭器皿中执行。此类化验可为终点式(end-point)，其中在扩增之后检测产物，或此类化验可为实时式(real-time)，其中随着扩增进行而检测产物。
举例来说，在美国专利第4,683,202号、第4,683,195号和第4,965,188号以及通常Innis等人编辑的PCR PROTOCOLS，a guide to Methods and Applications，Academic Press(圣地亚哥，CA(美国)1990)中描述了使用PCR的核酸扩增和化验。举例来说，在美国专利第5,994,056号、第5,487,972号、第5,925,517号和第6,150,097号中描述了同质PCR化验，包括实时式化验，在实时式化验中随着反应进行，在PCR循环中的某些PCR循环或所有PCR循环期间检测经扩增的产物。
通常将PCR扩增反应设计成对称的，即通过以等克分子浓度和相等熔解温度(Tm)利用正向引物和反向引物来按指数规律制作双链扩增子。一种已经有限地用于在PCR反应中直接制作单链DNA的技术为“不对称PCR”。Gyllensten和Erlich，“Generation ofSingle-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and Its Application to DirectSequencing of the HLA-DQA Locus”国家科学院院报(美国)85：7652-7656(1988)；和美国专利第5,066,584号。不对称PCR为非对称PCR扩增方法，其与对称PCR的不同之处在于，引物中的一者被稀释五倍到一百倍，以便以另一引物的浓度的1-20％的限制量存在。因此，扩增由以下部分组成：指数生长期，其中两个引物均延伸，从而产生双链产物，或扩增子；之后是线性扩增，其中仅一个引物保留，从而产生单链扩增子。
新近，已经开发出一种非对称PCR扩增方法，被称为“指数后线性(Linear-After-The-Exponential)”PCR，或简称为“LATE-PCR”。LATE-PCR为非对称PCR扩增，其由以下部分组成：指数生长期，其中两个引物均被退火并延伸；之后是限制引物耗尽之后的线性生长期，此时仅过量引物被退火并延伸。见Sanchez等人(2004)国家科学院院报(美国)101：1933-1938，公开的国际专利申请案WO 03/054233(2003年7月3日)和Pierce等人(2005)国家科学院院报(美国)102：8609-8614，上述所有文献全文以引用的方式并入本文中。
一种用于监视PCR扩增中的双链扩增子产量的便利且廉价的方法是使用一种染料(例如，SYBR Green I或SYBR Gold)，其在添入双链DNA或以其它方式与双链DNA相互作用时发出荧光。见(例如)美国专利第5,994,056号。在PCR扩增期间以实时方式执行或在扩增之后执行的对扩增子的溶解温度分析用于产物识别。利用这种溶解温度分析的一个问题在于，染料荧光是扩增子尺寸的函数。另一问题在于，在分析期间，染料从具有低溶解温度的扩增产物或扩增子再分配到具有较高溶解温度的扩增子，从而使结果失真。已经提出解决这些问题的两种途径。一种途径(G淬火)对引物设计强加了严格的限制，并导致较大的背景荧光(Crockett AO、Wittwer CT，“Fluorescein-LabeledOligonucleotides for Real-Time PCR：Using the Inherent Quenching of DeoxyguanosineNucleotides”，分析生物化学，290：89-97(2001))。另一途径(其用LC Green染料代替SYBR染料)对未充足存在的序列产生非常小百分比的信号，且需要高度专用的软件和硬件(Wittwer等人，“High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis UsingLCGreen”，临床化学49：853-860(2003))。
在同质核酸扩增化验(包括PCR化验)中使用荧光标记探针，以便以实时方式或通过终点分析来测量所需扩增子的累积。与线性单链探针相比，若干可用类型的探针有显著的等位基因辨别力。实时探针包括：双重标记线性探针，其在PCR循环的延伸步骤期间由DNA聚合酶的5′到3′核酸外切酶活性分解(见美国专利第5,210,015号、第5,487,972号和第5,538,848号)；分子信标探针(见美国专利第5,925,517号、第6,103,476号和第6,365,729号)；小沟区结合探针(minor groove binding probe)(见Afonina等人“MinorGroove Binder-Conjugated DNA Probes for Quantitative DNA Detection byHybridization-Triggered Fluorescence”，生物技术32：946-949(2002))；线性探针对，其在目标链上邻近地杂交时FRET；经淬火的双链线性探针，目标对所述经淬火的双链线性探针进行争夺以杂交至标记探针链(见Li，Q等人(2002)，核酸研究30：e5)；和所谓的“点火”探针，其为链接到不对称花青染料的肽核酸(PNA)寡聚物，所述不对称花青染料在探针结合到目标以形成双链区域时发出荧光。对于LATE-PCR，已利用低温等位基因辨别探针，例如低温分子信标探针(见WO 03/045233)。标记寡核苷酸探针可通过接头(linker)附接到引物，使得在扩增期间，探针不被复制，而是能够自由杂交到由引物的延伸引起的目标序列。实例为：Scorpions，其引物为附接的分子信标探针；和Anglers，其引物为附接的荧光团标记线性探针。Lee，M.A.等人(2002)，分析临床学报457：61：70；Whitcombe，D.等人(1999)，自然生物技术17：804-807。此类复合结构的探针部分(其携带荧光标记)独立于引物部分而杂交。因此，它们为标记探针和未标记引物(因本文使用那些术语)。然而，目标特定探针缺乏监视双链产物的总产量的能力。
某些探针是容许错配的。在化验过程中，在检测温度下，容许错配的探针与一个以上目标序列杂交并为所述一个以上目标序列产生可检测信号，且如此形成的各种杂交物将具有不同的溶点。线性或随机卷曲单链探针通常容许错配。此类探针的实例为：具有内部荧光部分(internal fluorescent moiety)的线性探针，其荧光等级在杂交至一个或另一目标链时增加；荧光标记线性探针，其与SYBR Gold和SYBR Green I染料结合使用，使得当探针杂交到一个或另一目标时，标记的荧光通过FRET从染料发生(见美国专利公开案US 2002/0119450，2002年8月28日)；所谓的“松散信标(sloppy beacon)”以及FRET的线性探针对的变化(见美国专利第6,472,156号)。
利用每一者仅结合至在扩增反应中产生的一个可能目标扩增子的多个探针产生分析复杂的反应混合物或从大量可能目标中检测一个或几个目标的问题。可用的荧光检测允许分辨有限数目的荧光团，通常不超过八个。有限的多路复用是可能的，例如通过为每一目标设计不同的等位基因辨别分子信标探针且有差别地对每一探针进行标记。(例如，见Tyagi等人(2000)自然生物技术18：1191-1196)。各包含多个颜色的等分试样的等位基因辨别探针的混合物扩大探针签名的数目，且在很多(至少多达56个)目标中仅一个实际上存在时较好地起作用，但如果存在一个以上目标，那么其将遭遇含糊的结果。
存在很多涉及复杂目标或很多可能目标中的一个目标的情形。对于此类情形已开发或提出了若干方案，但所有的方案均具有严重的缺点和限制。Tyagi等人在公开的国际专利申请案WO 01/31062中已经描述了一种有时被称为“松散信标”的技术，所述“松散信标”为具有较长环序列(loop sequence)的分子信标探针，使得分子信标探针容许错配且能够在PCR扩增反应的退火温度下在某种程度上结合到多个目标。此类探针抵抗错配目标的反应动力学较弱，且在PCR扩增的延伸温度下，可能保持杂交到完全匹配的目标，且由Taq DNA聚合酶分解。另外，仅获得对于化验条件下探针-目标杂交物的溶解温度的间接指示，且这表明已经达到平衡。已描述了在对称PCR扩增中使用FRET探针进行实时多路复用。为了不干扰扩增，所有探针-目标杂交物的溶解温度均被迫处于引物退火温度与引物延伸温度之间的较窄温度范围内。同样，所述方案并非量化的。Wittwer等人的“Real-Time Multiplex PCR Assays，Methods”25：430-442(2001)已经揭示了使用不同颜色的FRET探针的扩增后多探针化验。对称PCR扩增之后的反应混合物快速冷却，接着缓慢地加热以确定所存在的各种荧光团的溶解曲线。此途径并非量化的。另外，由于重复的对称PCR扩增中的较大扩散，终点化验通常趋向于仅仅为定性的。
定序反应产物提供探针技术的替代方法。传统的双脱氧定序可利用扩增反应(例如，对称PCR或LATE-PCR)的产物，作为循环定序的初始材料。利用乙醇沉淀或亲和层析柱来纯化经扩增的产物，以去除剩余的dNTP和引物，利用一个定序引物和荧光标记双脱氧核苷酸使经扩增的产物经受循环定序反应，且经扩增的产物经受毛细管凝胶电泳。“焦磷酸测序”是此项技术中已知的实时等温序列及合成方法(sequence-by-synthesismethod)。如果在用于焦磷酸测序的初始材料的制备中使用指数扩增方法(例如，PCR)，那么必须通过隔离单链产物以及将dNTP、焦磷酸盐和未合并的引物从扩增反应中去除来清除经扩增的产物。LATE-PCR简化了样本制备，因为LATA-PCR主要产生单链产物，但其不会实质上且自行消除对清除所述产物的需要。
本发明的一方面是利用对来自通过激发DNA荧光染料(例如，SYBR Green I或优选地SYBR Gold)而间接地受激发的荧光团标记线性寡核苷酸引物的荧光的检测，对温度循环或等温的扩增反应的反应产物进行同质检测的方法。此类染料在与双链DNA关联时会发出荧光，据报导此类染料添入所述双链DNA中。通过在检测温度(终点检测)下读取荧光或通过借助扩增后溶解分析而查明荧光随着温度发生的变化，可实时地或在扩增反应之后执行前述方法。在通过各种反应产物的溶解温度加热反应混合物时，当含有特定含荧光团引物的各种扩增子达到其溶解温度且变成单链时，荧光逐渐减少。优选方法包括计算引物信号与染料信号的比率。
本发明的另一方面是试剂盒，其包括DNA荧光染料和至少一个如此标记的引物(优选地作为引物对的一部分)两者，和(视情况)扩增试剂。
本发明的其它方面是使用低温检测步骤来检测LATE-PCR反应的反应产物的同质方法。某些实施例包含将根据本发明的至少一个等位基因辨别探针包括在反应混合物中，所述至少一个等位基因辨别探针即通常为由Li，Q.等人(2002)核酸研究30：e5描述的类型的经淬火双链探针，只是其为低温(低Tm或超低Tm)目标特定探针且其通过激发添入到探针-目标杂交物中的DNA荧光染料(例如，优选地SYBR Gold)而被间接激发。其它实施例包含将根据本发明的至少一个可间接激发的容许错配的探针包括在反应混合物中，所述至少一个可间接激发的容许错配的探针即通常为由Lee和Furst的公开号为US 2002/0119450的美国公开专利申请案描述的类型的经淬火单链探针，只是其为经淬火低温探针。这些各种方法包括：在LATE-PCR扩增的低温检测步骤期间激发染料；和在这些条件下检测来自探针的荧光，以提供目标单链序列的测量值。特定实施例可进一步包括优选地在反应混合物的温度高于探针的溶解温度时在PCR循环的延伸步骤期间或结束时，通过检测染料荧光来测量反应混合物中双链产物的总量。某些优选方法包括计算探针信号与染料信号的比率。在重复样本的情况下，所述比率校正已知在PCR扩增中发生的扩增产量(amplification yield)中的重复样本中的差异。
本发明的其它方面是此类低温等位基因辨别和经淬火的容许错配的探针；LATE-PCR试剂盒，其包括至少一个此类低温目标特定探针连同扩增试剂以及(优选地包括)荧光DNA染料；和寡核苷酸组，其包含LATE-PCR引物和至少一个此类探针。
本发明的其它方面是在存在或可能存在多个扩增子时使用的同质检测方法，此类方法包含将一或多个低温容许错配的检测探针包括在LATE-PCR扩增反应混合物中，所述一或多个低温容许错配的检测探针由于其低Tm的缘故而不会干扰扩增，且不会由具有5′-3′核酸外切酶活性的DNA聚合酶水解(切断)，且所述一或多个低温容许错配的检测探针在被杂交且直接由合适的激发源或间接地通过由合适的激发源激发的荧光DNA染料激发时发出荧光信号。此类方法包括用于例如基因分型的应用的单探针化验和多探针化验。可用同一荧光团标记一个以上探针，其中事件辨别依靠荧光随温度的变化，就像使用单个探针时那样。可用不同荧光团来标记探针，其中事件颜色差异也用于辨别。用于识别和量化的目的的目标中的辨别可包括相同或不同温度下荧光团之间的荧光比率，以及荧光团与染料的比率。检测优选地在扩增期间(实时)执行，且更优选地在包括在LATE-PCR扩增协议中的低温检测步骤期间执行，且检测步骤可包括在多个温度下的检测。本发明的又一方面是在此类检测方法中有用的单链线性探针，此类探针为美国专利申请公开案U.S.2002/0119450(2002年8月29日)中描述的类型，即，由来自荧光DNA染料的荧光发射激发的探针，只是其为低温(低Tm或超低Tm)探针，容许错配，且包括对原本由低温下的二级结构产生的荧光进行淬火的淬火部分。
本发明的另一方面是扩增-通过-定序(amplification-through-sequencing)方法，其允许在扩增反应腔室、器皿、井、载玻片或容器中为焦磷酸测序制备LATE-PCR扩增的产物，这是“单管”操作，其可与以较小体积(优选地为17μl或更小)执行的LATE-PCR扩增一起利用。
本发明的另一方面是一种用于仅利用扩增反应混合物的扩增后含水稀释物来为双脱氧定序制备LATE-PCR产物的方法，其可执行为“单管”操作。
发明内容
在本申请案中，参考核酸引物、探针和扩增子的溶解温度Tm。Tm表示受检材料(subject material)的一半以双链形式存在且其余部分为单链时的温度。一般来说(除LATE-PCR之外)，引物的Tm是在引物和含盐浓度的标准条件下，使用“％GC”方法(Wetmar，J.G.(1991)“DNA Probes：Applications of the Principles of Nucleic AcidHybridization”，生物化学与分子生物评论26：227-259)或“2(A+T)加上4(G+C)”方法(两者均是众所周知的)计算出的值。然而，LATE-PCR考虑特定反应中实际的引物溶解温度，从而考虑扩增开始时的引物浓度。见Sanchez等人(2004)PNAS(美国)101：1933-1938，和Pierce等人(2005)国家科学院院报(美国)102：8609-8614。
在本申请案中，将扩增开始时经浓度调节的溶解温度称为Tm[0]，其可如使用非天然核苷酸时所必需的那样凭经验来确定，或使用含盐浓度调节，根据“最近邻”方法(SantaLucia，J.(1998)，PNAS(美国)95：1460-1465；和Allawi，H.T.与Santa Lucia，J.(1997)，生物化学36：10581-10594)来计算，所述含盐浓度在下文的实例中为0.07M单价阳离子浓度。LATE-PCR还可考虑扩增子的溶解温度，其是利用公式Tm＝81.5+0.41(％G+％C)-500/L+16.6log[M]/(1+0.7[M])计算出的，其中L是核苷酸中的长度，且[M]是单价阳离子的摩尔浓度。就引物而论，计算线性或随机卷曲探针的溶解温度。可凭经验来确定结构探针(例如，分子信标探针)的溶解温度。
如本申请案中所使用，“LATE-PCR”表示使用聚合酶链式反应(PCR)制程的非对称DNA扩增，其以超过另一引物(“限制引物”)至少五倍的量而利用一种寡核苷酸引物(“过量引物”)，所述限制引物本身以低浓度(至多达200nM)被利用，以便在大致充足的PCR循环中耗尽，以产生荧光可检测双链扩增子，其中扩增开始时限制引物的经浓度调节的溶解温度Tm[0] L不会比扩增开始时过量引物的经浓度调节的溶解温度Tm[0] X低多于5℃，优选地至少同样高，且更优选地高出3-10℃；且其中在限制引物耗尽之后，热循环持续多个循环，以产生单链产物，即过量引物的延伸产物，有时称为“过量引物链”。
本发明的或在本发明的方法和试剂盒中有用的引物和探针广义上是寡核苷酸，意思是它们可以是DNA、RNA、DNA与RNA的混合物，且它们可包括非天然核苷酸(例如，2′o-甲基核糖核苷酸)和非天然核苷酸间键合(例如，硫代磷酸酯键合)。引物和探针两者部分地通过杂交到反应混合物中所关心的序列而起作用。一种引物为单链寡核苷酸，其可在扩增反应的引物退火温度下杂交到其互补序列，且在其3′端处由DNA聚合酶延伸。本发明的引物是一种借助可间接激发的荧光团来用信号通知其引发序列(primingsequence)的杂交的引物。本发明的或在本发明的方法和试剂盒中有用的探针为单链寡核苷酸或包括单链寡核苷酸，其可在扩增反应中或之后，在检测温度(或多个温度)下，杂交到其期望的目标序列(或多个序列)，且借助可间接激发的荧光团来以荧光用信号通知所述杂交事件。如本文所使用，“探针”不在扩增反应中由DNA聚合酶延伸。对完全互补目标序列来说非常特定且强烈排斥具有一个或几个错配基点的密切相关序列的探针是“具有等位基因辨别力的”。在至少一个适用的检测条件下不仅杂交到完全互补序列而且杂交到具有一个或一个以上错配基点的部分互补序列的探针是“容许错配的”探针。
如本文所使用的“荧光DNA染料”表示一种成分，例如SYBR Green I或SYBR Gold，其在与双链DNA关联时变为可用荧光激发的。据报导，荧光DNA染料添入双链DNA中，但我们不希望受任何操作理论束缚。
本发明的引物结合荧光DNA染料而使用，且为用可间接激发的荧光团标记的线性单链寡核苷酸，即当引物杂交到反应混合物中的模板链以形成双链DNA区域，且激发DNA荧光染料而不是荧光团或由DNA荧光染料而非荧光团吸收的一种波长的光(通常但不一定是可见光)在样本上发光时，荧光团发光。据报导，能量通过荧光共振能量转移(FRET)从荧光DNA染料转移到附近的荧光团，但我们不希望受任何操作理论束缚。将在此情况下发光的荧光团称为“被间接激发”的荧光团。本发明的探针同样结合荧光染料而使用，所述荧光染料结合到双链DNA(“荧光DNA染料”)且用此种可间接激发的荧光团来标记，使得当探针杂交到反应混合物中的目标链且染料被激发时，荧光团发光。
如本文所使用，“试剂盒”表示用于执行扩增或化验的试剂的集合。试剂盒可为“完整的”，即包括扩增或扩增-检测的所有步骤所需要的所有试剂。或者，试剂盒可为“部分的”，省略那些操作所需要的某些试剂。本发明的完整和部分试剂盒两者均可另外包括用于样本制备(例如，核酸隔离和反转录)的试剂。定序可涉及两种试剂盒，例如完整的LATE-PCR扩增试剂盒和完整的循环定序试剂盒，或所述两者可组合成单个试剂盒。
如本文所使用，“寡核苷酸组”表示用于执行扩增或化验的引物或引物与探针的集合。对于定序来说，寡核苷酸组可包括(例如)(对于LATE-PCR扩增来说)限制引物和过量引物，和(对于循环定序来说)一个或一个以上额外定序引物。对于杂交探针化验来说，寡核苷酸组可包括(例如)(对于LATE-PCR扩增来说)限制引物和过量引物，和至少一个荧光团标记的杂交探针。
如本文所使用，“单管”方法表示一系列至少两个操作(例如，样本制备、扩增或定序)，其可在不将样本从一个容器(其为试管、反应井、微流体装置中的腔室、载玻片或能够容纳反应混合物的任何其它设备)转移到另一容器的情况下执行。
具有低溶解温度的探针(即，形成具有低溶解温度的探针-目标杂交物的探针)可在扩增开始之前添加到扩增反应混合物，且仅在需要时加以利用。
通过在整个扩增反应期间或扩增反应的部分时间期间，使温度保持高于探针的溶解温度，来阻止探针杂交到其目标，且可能降低反应的效率。LATE-PCR化验的某些实施例利用低温探针。如本文所使用，“低Tm探针”表示杂交探针，其在扩增开始时具有经浓度调节的溶解温度Tm[0]，所述Tm[0]比LATE-PCR化验中限制引物的Tm[0]低至少5℃；且“超低Tm探针”表示杂交探针，其具有的Tm[0]比LATE-PCR反应的指数生长期的平均引物退火温度低至少5℃。频繁地将探针以1微摩尔(μM)浓度添加到LATE-PCR反应。因此，在设计探针时，有时利用如先前所述计算出的标称Tm[0]，而不利用1μM的标称浓度。大多数低Tm和超低Tm探针具有在30-55℃的范围内的在1μM浓度下计算出的Tm[0]。
利用低温探针的检测需要低温检测，其中充分降低探针-目标混合物的温度，以使荧光标记的探针杂交且用信号发出通知。这可在扩增结束(终点)时或在扩增后溶解分析过程中完成。或者，可将低温检测步骤包括在LATE-PCR扩增的线性生长期的一些或所有循环中以用于实时化验。优选地，此步骤在引物延伸之后且在高温链溶解(或“变性”)之前发生，但其可包括在引物退火步骤中。LATE-PCR化验中的低温检测步骤预示比引物退火温度低至少5℃的温度降低量。
根据本发明的某些方法利用荧光团标记的引物或杂交探针与结合到双链DNA的荧光染料组合，且包括以激发染料但不激发荧光团的波长来刺激所述染料，和检测由通过此程序间接刺激的荧光团发射的荧光。根据本发明的方法的一些实施例还包括检测来自染料的荧光发射。某些优选的方法进一步包括计算荧光团发射与染料发射的比率。
本发明的一个实施例包括：将荧光DNA染料(例如，SYBR Green I或优选地SYBRGold)和至少一个根据本发明的扩增引物添加到核酸扩增混合物，所述至少一个扩增引物即线性单链寡核苷酸，其可由DNA聚合酶延伸且用如上文所述可间接激发以用信号通知引发的荧光团来标记；执行扩增反应，优选地执行PCR反应(包括LATE-PCR)，其包括对所述经标记的引物进行退火和延伸；和在扩增期间(实时检测)或在扩增完成之后(在扩增反应结束时进行终点检测，或在随后的热分析(溶解曲线)期间检测)，激发染料并单独地或结合检测来自染料的荧光发射而检测来自荧光团的荧光发射。通过适当的扩增协议设计，可在扩增反应的所需点处包括双链产物的溶解分析。在此实施例中，仅并入到双链DNA中的引物将发出荧光。未并入的引物将不发出荧光，因此不需要物理上分离未结合的引物。所述方法是同质的。同样，荧光团发射仅来自包括经标记的引物的产物的双链区域，而不是来自所有双链产物。下文的实例1例示了这些改进之处。实例1展示在经设计以产生各种长度的混合延伸产物的单延伸循环中，基于对来自引物的荧光团发射的检测的溶解曲线展示所有产物，而基于对来自染料的发射检测的溶解曲线并不展示所有产物。实例1还例示此实施例的方法在等温反应中的使用。
如所属领域的技术人员将了解，一般来说，当荧光DNA染料(例如，SYBR Green I)与由来自所添入染料的FRET激发的荧光标记引物或探针结合使用时，校正荧光重叠很重要。情况如此是因为荧光DNA染料通常在较宽频谱范围上发光，所述较宽频谱范围可包括用于测量由引物或探针发射的荧光的光的波长。可通过以下步骤来实现所需的校正：1)单独建立染料的发射频谱；2)以比引物或探针的发射波长短的波长来测量每一样本中染料发射的强度；3)基于对步骤1和2的了解，以引物或探针的发射波长来计算染料发射的强度；和4)从以引物或探针的发射波长测量到的总强度中减去计算出的染料强度。很多市售机器(例如，ABI 7700和Cepheid Smart Cycler)均提供用于执行此校正的软件。或者，可对染料频谱、单独染料发射和总染料/探针发射进行测量，且可手动地应用符合要求的校正公式。举例来说，Lee和Fuerst的公开号为US 2002/0119450的美国公开专利申请案描述了用于测量和手动校正Light Cycler上的SYBR Green I荧光重叠的此类公式。
本申请案中所述的所有实例均在ABI 7700上执行，且机器软件用于校正荧光DNA染料与间接激发的荧光引物或探针结合使用的所有情况下的荧光重叠，而不管是否单独记录了染料的荧光。
对于利用单个引物对的PCR扩增来说，其中如上文所述，至少一个引物为间接激发而被荧光团标记，根据此实施例的溶解曲线分析可区分期望的产物与非特定产物。对于利用多个引物对的多路复用PCR扩增来说，其中每一对中的至少一个成员被荧光团标记，且对每一对利用不同的荧光团，可通过颜色且通过与不同荧光团相关的溶解温度来辨别不同的期望产物。通常对于PCR扩增来说，可在反应期间监视荧光团发射和染料发射，以分别跟踪特定产物的积聚且跟踪所有双链产物的积聚。
扩增反应的分析可利用荧光团发射(其为对经杂交引物或探针来说特定的信号)与染料发射信号(其并非如此特定)的比率。此比率(例如)校正重复反应中的变化。同样，分析可利用引物模板溶解峰值，其量值随着经标记的引物并入到延伸产物中而减小。
本发明包括扩增试剂盒和部分试剂盒，所述试剂盒包括：荧光DNA染料；至少一个引物对，其包括用在激发染料时被间接激发的荧光团来标记的引物；和试剂，其优选地通过LATE-PCR来扩增由引物界定的区域。
根据本发明的方法的另一实施例包括将荧光DNA染料(例如，SYBR Green I或优选地SYBR Gold)和至少一个可间接激发的、经淬火的、具有等位基因辨别力的低Tm或超低Tm杂交探针(其可为本发明的探针)添加到核酸扩增混合物。本发明的具有等位基因辨别力的探针为由Li，Q.等人(2002)的“A New Class of Homogeneous Nucleic AcidProbes Based on Specific Displacement Hybridization”，核酸研究30：(2)e5描述的类型的双链探针(与目标互补的荧光团标记线性寡核苷酸探针链，和比所述探针链短通常2-10个核苷酸的淬火剂标记的互补链)，只是它们用通过激发染料而间接激发的荧光团来标记，且它们具有低溶解温度，以适合在LATE-PCR扩增中用作低Tm或超低Tm探针。如Li等人已描述，如可调节背景荧光的等级那样，可调节双链探针的等位基因辨别能力，另外，可通过在邻近于荧光部分处包括胍残余物(所谓的“G淬火”)来减少背景荧光。
此实施例的方法包括利用此混合物进行扩增，和在探针以等位基因辨别方式杂交时所处的温度下进行检测。优选实施例包括：在LATE-PCR反应的线性扩增生长期期间使用低温检测步骤，其中前述探针杂交到被合成的单链扩增子；以不直接激发荧光团或多个荧光团的波长来激发荧光DNA染料；和读取来自探针的荧光团或多个探针的多个荧光团的荧光，所述荧光团以此方式被间接激发。其它实施例包括扩增，之后进行低温检测作为终点确定。一些实施例进一步包括检测来自染料的发射，且某些优选实施例包括计算探针发射与染料发射的比率。当反应混合物的温度高于存在的所有探针的溶解温度时，染料发射的检测最优选在检测步骤最初开始时执行。来正累积或已累积的双链分子的数据(染料信号)和来自正累积或已累积的单链分子的数据(来自每一探针的信号)可用于以所述方式构造比率。如果荧光团标记由来自染料的发射而非由用于激发染料的波长来刺激，那么此实施例的方法还包括使用低温分子信标探针(如公开申请案WO03/054233中所述)。
本发明还包括LATE-PCR化验试剂盒和部分试剂盒，所述试剂盒包括用于用低温检测步骤(终点或实时)来执行非对称扩增(优选地为LATE-PCR扩增)的试剂，且所述试剂盒包括：荧光DNA染料；至少一个引物对，其优选地为包括过量引物和限制引物的LATE-PCR引物对；和至少一个用于扩增反应的单链产物(过量存在的引物的延伸产物)的荧光团标记的低Tm或超低Tm杂交探针，其中所述探针并非容许错配，而是在预期的检测温度下具有等位基因辨别力，且其中探针的荧光团通过染料的激发而被间接地激发。在优选的试剂盒和部分试剂盒中，至少一个探针为本发明的具有等位基因辨别力的探针。本发明还包括寡核苷酸组，所述寡核苷酸组包括：至少一对引物，其用于非对称扩增，优选地用于LATE-PCR扩增；和至少一个经低Tm或超低Tm淬火的具有等位基因辨别力的双链探针，其用荧光团标记以便如上文所述可优选地由SYBR染料以及此类双链探针本身间接激发。
根据本发明的方法的又一实施例包括将检测试剂添加到非对称扩增反应混合物，优选地添加到LATE-PCR反应混合物，所述检测试剂包含：荧光DNA染料，例如SYBR Gold；和至少一个容许错配的单链线性杂交探针，其与一个可能或可能不为反应中的扩增而存在的可能的单链扩增子目标序列完全互补，且与可能存在的至少一个其它可能的单链扩增子目标序列不完全互补。在此实施例中有用的探针为用可由来自染料的荧光发射间接激发的荧光团标记的单链。相对于所述探针的可能存在的最互补的可能目标(通常表示完全匹配的目标)来说，所述探针为低Tm或优选地超低Tm探针。优选的情况是，相对于完全互补目标其具有Tm[0]，所述Tm[0]在扩增反应的指数扩增生长期期间，不会比引物退火温度高几度，且优选地低于引物退火温度，更优选地比引物退火温度低至少5℃。所述探针可为线性(或随机卷曲)探针，或根据本发明的随机卷曲探针，即所述探针经淬火以消除由于低温下二级结构的形成而导致的信号。根据本发明的经淬火的线性探针优选地一端具有荧光团且另一端具有非荧光淬火部分，代替磷酸盐盖的探针的3′端上的一者被另外添加以防止探针延伸，即充当引物。
此实施例包含使前述混合物经受非对称(优选地LATE-PCR)扩增以产生单链扩增子分子，且利用在杂交时用信号发出通知的至少一个容许错配的探针使扩增反应混合物经受热分析。热分析不仅可在扩增反应完成后执行，而且可在产生单链产物的热循环期间，在LATE-PCR低温检测步骤期间执行，即在限制引物耗尽后执行。热分析分别根据在温度降低或升高时形成或变得不稳定的探针-目标杂交物的溶解温度而显示每一探针的目标。当温度降低时，探针将首先杂交到其完全匹配的目标(如果存在)并发射荧光信号。当温度进一步降低时，探针将相继杂交到逐渐“更错配的”目标并在每一情况下发射增加的荧光信号。如结合前述实施例所阐释，还可优选地在探针不杂交时(即在高于探针的Tm的温度下)，检测来自荧光DNA染料的发射，以允许监视反应中双链分子的累积，且允许使用比率来减少重复样本中的扩散。
本发明包括试剂盒，其含有用于非对称扩增(优选地为LATE-PCR扩增)的试剂，所述试剂盒包括：荧光DNA染料；至少一个引物对，其优选地为包括过量引物和限制引物的LATE-PCR引物对；和根据需要为单链扩增产物而淬火的至少一个容许错配的低Tm或超低Tm随机卷曲探针，且本发明包括部分试剂盒和含有此类引物和探针的寡核苷酸组，以及此类探针本身。
根据本发明的方法利用LATE-PCR化验的低温检测步骤，优选地为引物延伸之后和链溶解之前的低温检测步骤，所述方法包括：多路复用探针化验，其含有一个以上引物对，且产生一个或一个以上单链扩增子(一个探针用于一个目标)；以及多探针化验，其含有至少一个用于多个目标的探针。具有低温检测步骤的某些优选方法包括引物延伸之后和链溶解之前的低温检测步骤。在此类化验中的检测步骤期间，温度可下降为比引物退火温度低多达30℃或甚至40℃，从而为检测提供大温度窗口。具有等位基因辨别力的探针除可由颜色(荧光团发射波长)来区分外，还可由溶解温度的差异来区分。举例来说，四个相对于目标而分别具有30℃、35℃、40℃和45℃的Tm的不同的经FAM标记的具有等位基因辨别力的探针可在反应温度降低或升高时，不仅仅通过扩增后溶解分析，而被实时地或在扩增之后作为终点确定而区分。此增加的自由度显著增加了可在相同反应中使用的不同探针的数目。容许错配的探针的相对于错配目标的Tm将低于相对于完全匹配目标的Tm。在杂交时用信号发出通知的不同颜色的低温容许错配的探针的组合在低温检测期间产生取决于温度的荧光发射曲线的图案。根据本发明的方法包括使用此类发射曲线、导数曲线和它们中任一者在一个温度或不同温度下的比率，来用扩增后溶解分析且同时实时地通过监视在LATE-PCR低温检测步骤的窗口内若干温度下的荧光，来识别混合目标的成分。比率可包括相同探针/探针、不同探针/探针比率、探针/染料比率和其组合。
LATE-PCR试剂盒、部分试剂盒和寡核苷酸组可包括：可通过Tm辨别的具有相同颜色的至少两个具有等位基因辨别力的探针，或至少两个容许错配的探针(可通过Tm来辨别其与不同目标的杂交)，其优选地为通过激发荧光DNA染料而被间接激发的经淬火随机卷曲探针。
本发明包括用于为定序反应(双脱氧定序或例如焦磷酸测序的定序及合成方法)制备LATE-PCR扩增的扩增产物的改进方法。具体来说，已例示此类初始材料在单个反应容器(例如，微量离心管)中的产生和制备。优选实施例在LATE-PCR反应混合物中包括用于抑制误引发(mispriming)的试剂，最优选地为在我们的题为“Reagents and Methodsfor Improving Reproducibility and Reducing Mispriming in PCR Amplification”的美国临时专利申请案第60/619,620号中揭示的试剂，所述申请案全文以引用的方式并入本文中。对于双脱氧定序来说，已例示了通过样本稀释(我们称为“稀释并去除(dilute and go)”的方法)的单个步骤来为定序制备LATE-PCR扩增产物。已例示了仅需在引物退火之前将焦磷酸测序酶/基质试剂添加到LATE-PCR产物混合物的方法。
根据本发明的方法还包括同一容器(例如，同一反应管或微流体装置的同一腔室)中为焦磷酸测序而进行的LATE-PCR扩增和样本制备，所有这些方法均简称为“单管”方法，在传统焦磷酸测序过程中，DNA由对称PCR扩增，其中一个引物用生物素分子来进行5′标记。在扩增之后，使用抗生蛋白链菌素包覆的小珠与真空或磁性设备结合来隔离单链DNA(ssDNA)，并冲走PCR反应的干扰焦磷酸测序的残余成分，所述残余成分包括焦磷酸盐(PPi)、dNTP和PCR引物。由于LATE-PCR的产生ssDNA的能力，LATE-PCR不需要链分离，且在与用于消除从PCR剩余的四个干扰成分的同一容器方法组合时，简化了样本制备。在一个此类方法中，通过在LATE-PCR扩增反应混合物中使用限制量的dNTP，使对去除扩增结束时剩余的dNTP的需要最小化，应注意利用充足的量以为焦磷酸测序产生足够的ssDNA。将具有焦磷酸酶活性的酶(例如，诸如酵母焦磷酸酶的焦磷酸酶)添加到扩增产物以去除PPi，且加热混合物以在进行焦磷酸测序之前使所述酶变性。因为限制引物在LATE-PCR扩增之后不剩余，且残余的过量引物在扩增期间不能引发从过量引物延伸的链(过量引物链)，所以在很多情况下，不需要去除剩余引物。然而，可通过在LATE-PCR反应混合物中包括在低于过量引物的Tm的温度(包括用于焦磷酸测序的温度)下杂交到过量引物的寡核苷酸来避免可能的误引发。或者，可在LATE-PCR扩增之后但在焦磷酸测序之前添加被阻塞以在3′端处延伸且与过量引物完全互补的寡核苷酸，以避免在用于焦磷酸测序的温度下由过量引物导致的可能的误引发。避免由在扩增期间从限制引物延伸的链(限制引物链)的3′端处的过量引物导致的误引发的第三策略涉及使用含有与过量引物相同序列的足够浓度的3′阻塞的寡核苷酸，在与过量引物争夺结合位置的过程中取胜。
“单管”样本制备的更优选方法不需要确定用于特定扩增的适当限制性dNTP浓度。在此方法中，首先将焦磷酸测序酶/基质试剂添加到LATE-PCR产物，这移除了dNTP和PPi。接着，使用所添加的定序引物进行引物退火，且接着添加个别dNTP来进行焦磷酸测序。或者，可通过添加具有dNTP酶活性的纯化酶(例如，马铃薯腺苷三磷酸双磷酸酶(potato apyrase))，接着加热以使酶失活，来消除dNTP，且可通过添加具有焦磷酸酶活性的纯化酶(例如，酵母焦磷酸酶)，接着加热以使酶失活，来消除焦磷酸盐。如果使用两种酶，那么可同时添加所述两种酶。
根据本发明的化验(明确地说，LATE-PCR化验)优选地包括避免误引发的方法，误引发可导致反应的后期阶段中探针信号减少。我们已通过在反应混合物中包括上文所述的我们的美国临时专利申请案中所揭示的误引发抑制试剂而成功地避免了此“钩状效应”。我们也已通过调节添加到反应中的聚合酶的浓度来避免所述效应。可使用ssDNA的探针根据LATE-PCR反应的动力学，以及通过由此项技术中已知的各种方法所揭示的最终产物的成分，来观察通过调节聚合酶而减少误引发。
以下附图和描述内容中陈述了本发明的一个或一个以上实施例的细节。从描述内容和附图，以及从权利要求书中将了解本发明的其它特征、目的和优点。
附图说明
图1展示根据本发明的方法使用荧光标记引物来进行溶解曲线分析。
图2展示根据本发明的方法，通过使用单链产物与双链产物的比率来减少信号扩散。
图3展示经由用根据本发明的方法设计的相对于16S核蛋白体RNA基因的常规的容许错配的探针或相对于同一目标的两种不同型式的经淬火的容许错配的探针而获得的溶解曲线分析进行的五种分枝杆菌的识别的比较。
图4展示根据本发明的方法，仅使用相对于16S核蛋白体RNA基因的两个容许错配的探针进行的五种分枝杆菌的识别。
图5展示经由图3所示的使用根据本发明的方法设计的相对于16S核蛋白体RNA基因的两个容许错配的探针的溶解曲线的第一导数分析进行的五种分枝杆菌的识别。
图6展示根据本发明的方法，使用在不同温度下从相对于16S核蛋白体RNA基因的两个容许错配的探针收集到的荧光信号的比率进行的五种分枝杆菌的识别。
图7展示根据本发明的方法，使用LATE-PCR和相对于野生型等位基因(wild-typeallele)的单个低Tm容许错配的探针进行的对人类HexA基因的G269突变的纯合和杂合样本的终点基因分型。
图8展示使用LATE-PCR、用相同颜色标记的具有等位基因辨别力的低Tm探针，和溶解曲线的第一导数分析进行的对人类囊性纤维化跨膜调节(cystic fibrosistransmembrane regulator，CFTR)基因的三个不同等位基因的单独识别。
图9展示使用用相同颜色标记的具有等位基因辨别力的低Tm探针和溶解曲线的第一导数分析进行的对人类囊性纤维化跨膜调节(CFTR)基因的各个等位基因的不同组合的同时识别。
图10展示通过描绘根据本发明的方法收集的两个温度下荧光的变化而进行的对人类囊性纤维化跨膜调节(CFTR)基因的不同等位基因组合的识别。
图11展示两温度规格化化验(具有背景校正)。
图12展示两温度规格化化验(不具有背景校正)。
图13展示三温度规格化化验。
图14展示根据本发明的方法为焦磷酸测序制备LATE-PCR样本的“稀释并去除”方法与为同一化验制备LATE-PCR样本的常规方法的比较。
图15是从由单管LATE-PCR方法制备的单细胞获得的热解色谱图，箭头指示a)纯合野生型，b)杂合和c)纯合突变细胞的β球蛋白IVS 110位置。
图16是来自对五十个以上碱基对执行的焦磷酸测序反应的热解色谱图。每一峰值下列出了核苷酸分配次序，且上方注释了预期序列。
图17是由根据本发明的方法为双脱氧定序制备LATE-PCR样本的“稀释并去除”方法产生的和由为同一化验制备LATE-PCR样本的常规方法产生的双脱氧定序色谱。
图18是来自来源于同一反应中的同一DNA模板的一个以上产物的LATE-PCR扩增的电泳凝胶。
图19是对图18的LATE-PCR扩增的产物进行稀释并去除双脱氧定序获得的色谱。
图20展示可独立地测量由LATE-PCR扩增产生的ssDNA和dsDNA的量，且所述量可用于计算比率ssDNA/dsDNA，所述比率又可用于确定至此累积的ssDNA的量是否足够用于随后经由“稀释并去除”方法进行的定序。
图21是由针对具有两个紧密相关但不同的序列的LATE-PCR扩增子的50∶50混合物使用的“稀释并去除”方法产生的双脱氧定序色谱。
图22展示具有可经由“稀释并去除”方法辨别的紧密相关但不同的序列的混合LATE-PCR扩增子的感光性范围。
图23展示LATE-PCR连同至少单一一个容许错配的探针一起可用于产生终点溶解曲线，所述终点溶解曲线又可用于量化具有紧密相关但不同的序列的两个或两个以上混合LATE-PCR扩增子的相对量。
图24展示使用各具有三种不同量的基因组DNA的两种不同浓度的Taq聚合酶执行的若干LATE-PCR化验的动力学。
各图中的相同参考符号指示相同元件。
具体实施方式
本发明包括核酸扩增化验(例如，PCR化验)，其包括检测来自至少一个荧光团标记引物的荧光发射，所述至少一个荧光团标记引物不是通过施加由荧光团强烈吸收的波长的光(可见或不可见)来直接激发的，而是通过施加激发附近的荧光DNA染料(例如，SYBR Green或优选地SYBR Gold)，以及含有所有或一些扩增试剂的完整和部分试剂盒和含有如此标记的引物的寡核苷酸组，以及引物本身的波长的光来间接激发的。
扩增引物是众所周知的。根据本发明的引物为短寡核苷酸，通常长度小于五十个碱基，其杂交到目标链，且由适当的聚合酶延伸。引物可由天然存在的核苷酸组成，或引物可包括非天然核苷酸和非天然核苷酸间键合。尽管引物通常为线性寡核苷酸，但它们可包括二级结构。(例如，参见Nazarenko LA、Bhatnagar SK、Hohman RJ(1997)，“AClosed Tube Format for Amplification and Detection of DNA Based on Energy Transfer”，核酸研究25：2516-2521)。扩增通常包括使用一个或一个以上引物对，每一引物对均由一正向引物和一反相引物组成。在根据本发明的方法、试剂盒和寡核苷酸组中，一对中的一个引物或所述对中的两个引物均可用共价结合的荧光团来标记，所述共价结合的荧光团在附近的荧光DNA染料被刺激时发出荧光。当经标记的引物杂交(或退火)到其在模板链中的互补序列时，形成双链区域。荧光DNA染料通过添入所述区域中或以另外的方式与所述区域关联，且在所述区域中变为发出荧光，所述荧光DNA染料在引物的荧光团附近，使得当以不直接激发荧光团的波长刺激染料时，荧光团以其特性波长发光。这些引物可用于监视由DNA聚合酶的延伸导致的产物的合成，例如那些由实时或通过终点检测进行的PCR和引物延伸化验导致的产物的合成，且/或通过溶解曲线分析来评定产物特性。
根据本发明的用作供DNA聚合酶进行延伸的基质的引物(包括用于PCR扩增(对称或非对称，尤其包括LATE-PCR)的引物)在任一核苷酸位置处用共价结合荧光团来标记，使得寡核苷酸引物的3′端保持可用于延伸。引物可具有Li，Q.等人(2002)(“A NewClass of Homogeneous Nucleic Acid Probes Based on Specific Displacement Hybridization”，核酸研究30：(2)e5)描述的双链探针的设计。对引物的寡核苷酸的唯一序列限制在于，寡核苷酸不得具有本身导致间接荧光团激发的任何二级结构，意味着通常不存在大于2个碱基对的二级结构。荧光团部分不应由所使用的激发源波长直接在相当程度上激发，但染料必须由所使用的激发源波长直接激发；在荧光DNA染料在其即刻出现的情况下被激发时荧光团必须发光，所述即刻出现位置通常不大于荧光团经历荧光共振能量转移(FRET)发生的距离；且选定荧光团的发射频谱必须可通过使用滤波器或频谱解褶积(spectral deconvolution)而与荧光DNA染料的发射频谱区分。在这些情况下，在引物退火(包括由DNA聚合酶进行的延伸)之后，荧光团在并入到双链产物中时发出荧光。当达到含有荧光团的特定段双链DNA的溶解温度(Tm)时，在加热期间发生荧光损失。
根据本发明的引物与荧光DNA染料结合使用的条件(引物和DNA染料浓度，DNA染料激发波长)与此项技术中已知的用于监视反应过程中引物延伸反应(包括PCR)的产物的合成和用于通过仅使用荧光DNA染料(以对应于引物荧光团的发射波长代替染料的发射波长或除染料的发射波长之外以对应于引物荧光团的发射波长来收集荧光的情况除外)的溶解曲线分析来评定延伸产物特性的那些条件相同。在这些条件下，荧光信号源自含有引物的双链序列，而不是反应中的所有双链序列。
通过下文在实例1及在图1中报告的实验来按照根据本发明的方法和系统执行DNA染料性能的比较。在存在SYBR Green染料的情况下，且在存在杂交到引物延伸的区域附近的模板链的相对较长非可延伸寡核苷酸的情况下，荧光团标记引物由DNA聚合酶延伸。这导致具有模板链未延伸的引物杂交物、短引物延伸产物与非可延伸寡核苷酸的产物混合物，使得具有模板的杂交物具有范围从60℃(荧光团(Cy5)标记的引物)到79℃(非可延伸寡核苷酸)的Tm，其中引物延伸产物落在那两个Tm之间。
使用来自染料的荧光读数和来自荧光团的荧光读数两者对最终反应混合物(重复样本)执行标准溶解曲线分析。图1中呈现溶解曲线。画面A是利用染料发射获得的溶解曲线1。唯一峰值(sole peak)为79℃，即非可延伸寡核苷酸的溶解温度。看不到其它峰值，甚至看不到未延伸引物的峰值。画面A例示在产生溶解曲线期间，SYBR Green染料迁移到较高Tm杂交物，其遮蔽了较低Tm杂交物的存在。画面B是利用荧光团发射获得的溶解曲线2。其展示60℃处的峰值，即未延伸引物-模板杂交物的Tm；和处于69℃与79℃之间的温度的额外峰值，即指示引物延伸产物的峰值。如由溶解曲线1所示，不管染料的迁移趋势如何，均可看到较低Tm。根据本发明监视荧光团发射会以每一杂交物种的正确浓度揭示了混合物中以荧光团标记的所述每一杂交物种。
在利用单个引物对的PCR扩增的情况下，其中所述对中的至少一个成员是根据本发明的引物，溶解曲线分析可使用单个荧光来区分特定和非特定产物，因为特定产物具有预期的溶解温度，且非特定产物具有非预期的溶解温度。在利用一个以上引物对的多路复用PCR扩增的情况下(其中每一引物对中的至少一个成员是根据本发明的引物)，两个不同的特定产物可彼此区分，因为它们具有不同的但预期的Tm值，且/或因为所使用的两个不同引物以不同荧光团标记。此外，可在正在进行的扩增反应期间或在反应结束时执行使用根据本发明的引物的溶解曲线分析。
反应过程期间根据本发明的一个或一个以上引物的并入还可用于定量地测量PCR过程期间一个或一个以上目标的扩增程度，或等温延伸反应过程期间一段或一段以上双链DNA的合成。在任一情况下，可通过对不断增加的荧光进行重复检测来随时间过去而跟踪全长度双链产物分子的量，或可在反应结束时测量全长度双链产物分子的量。另外，等温反应或热循环反应的过程期间根据本发明的一个或一个以上引物的并入可用于测量部分产物的存在和/或累积，所述部分产物即那些已开始沿模板链延伸但尚未达到其最大可能长度的产物。在此类情况下，部分产物的溶解温度低于全长度产物的溶解温度，但高于衍生它们的标记引物的溶解温度。另外，伴随着标记引物并入到部分或全长度产物链中，从引物/模板DNA-DNA杂交物产生的溶解温度峰值的量值减小，且可用作DNA合成的额外测量值。
如上文所陈述，当间接地通过FRET或来自结合的SYBR染料的其它机制被刺激时，通过根据本发明的引物的并入而合成的每一段双链DNA或扩增子均以引物的共价结合荧光团的发射波长产生荧光信号，即“引物特定信号”。同一双链DNA还以SYBR染料的发射波长产生荧光信号，即“总SYBR信号”，反应中存在的所有双链序列的总和，因为所有双链序列均发出荧光，不管它们是否具有并入的标记引物。因此，根据本发明的引物可用于根据以下比率来分析荧光信号：(引物特定信号/总SYBR信号)，下文称为(PSS/TSS)值。根据(PSS/TSS)值的数据分析校正重复反应中荧光DNA染料信号(TSS)的变化。这在LATE-PCR扩增的情况下尤其有用，因为单链扩增子合成的速率与在反应的指数生长期结束时累积的双链扩增子的量成比例。因此，重复反应中双链DNA的等级的较小差异改变单链扩增子累积的速率。
也可能利用一个以上以相同荧光团标记的引物，只要可通过扩增后溶解曲线分析来区分扩增子。参见图1，画面B，其用于示范此原理。在延伸步骤(其可为最终延伸步骤(终点)或中间延伸步骤)结束时，来自共同荧光团的信号给出并入有荧光团的总扩增子的指示。溶解曲线分析区分产物并提供产物浓度的量化测量值。
LATE-PCR为非对称PCR扩增，其尤其提供较大“温度空间”的优点，在所述温度空间中可采取若干行动。参见上文所引用的WO 03/054233和Sanchez等人(2004)。LATE-PCR允许使用“低Tm”和“超低Tm”杂交探针来检测单链的扩增产物(“扩增子”)。在特定化验中特定针对单目标的各种类型的探针(包括能够辨别单个碱基对错配的具有等位基因辨别力的探针，例如具有等位基因辨别力的分子信标探针)可被LATE-PCR用作低Tm和超低Tm探针，如容许错配的探针(例如，容许错配的分子信标探针或具有可由来自SYBR染料的发射间接激发的荧光团的线性(随机卷曲)探针)可以的那样。我们已设计出一种可用作LATE-PCR化验中的低Tm和超低Tm探针的新类型的具有等位基因辨别力的探针，其允许确定反应内的单链/双链比率，如以此类荧光团标记的具有等位基因辨别力的分子信标探针可以的那样。
根据本发明的具有等位基因辨别力的探针是根据Li，Q.等人(2002)，核酸研究30：(2)e5，的经修改的双链、具有等位基因辨别力的、经淬火的探针。所述探针具有以下修改：其以可通过激发例如SYBR Green或SBYR Gold的双链DNA荧光染料而间接激发的而不是可由用于刺激染料的波长直接激发的荧光团来标记(在这一点上类似于上文所论述的引物)，且其被构造成低Tm或超低Tm探针。当此类探针不结合到其目标序列时，此类探针结合到较短的互补寡核苷酸。建议互补寡核苷酸包括例如Dabcyl或BlackHoleTM淬火剂的淬火剂，以减少来自探针的背景荧光。或者或另外，可通过在邻近于荧光团处包括胍残余物(G淬火)来减少背景荧光。在存在完全互补的目标链的情况下，较短互补链被取代，较长荧光团标记链杂交到目标，且荧光团未经淬火且致使能够接收来自染料的能量，以便以其特征波长发出荧光。以不同荧光团标记的针对不同目标的这些探针中的若干者可用于多路复用化验。
将此类具有等位基因辨别力的探针设计成具有经浓度调节的溶解温度Tm[0](在使其成为低Tm或超低Tm的化验中)。便利地确定且凭经验来调节探针-目标杂交物的Tm[0]，但计算出的值可至少用作使调节最小化的良好的起点。凭经验来调节互补探针链相对于荧光团标记链的长度和浓度，以进行最大程度的等位基因辨别。以比荧光团标记链短1-3个核苷酸的长度和是荧光团标记链的浓度的1-1.2倍的浓度开始。
在LATE-PCR化验中，在低温检测步骤中，优选地在限制引物耗尽之后循环中的引物延伸步骤之后，利用这些具有等位基因辨别力的探针。为了获得多个循环期间的实时读数，激发SYBR染料，且从染料和荧光团(或多个荧光团)两者读取荧光。建议当温度高于探针(或多个探针)的Tm时，在PCR延伸步骤期间或PCR延伸步骤结束时，读取染料信号，且当探针(根据本发明的具有等位基因辨别力的探针或适当标记的分子信标探针)被杂交时，在低检测步骤温度期间，读取荧光团发射。接着，确定每一探针的荧光与总SYBR信号的比率。此比率使由于产物积聚的差异而导致的重复化验的差异最小化。因为差异被最小化，所以此比率也可用于终点分析。
如已陈述，使用根据本发明的引物和探针所允许的单链产物与双链产物的比率是一种用于减少重复化验中的扩散的技术。对于不揭示反应动力学的终点化验来说，这尤其重要。一个实例是利用根据本发明的一个用于两个等位基因的引物对和一具有等位基因辨别力的探针来区分纯合样本与杂合样本的LATE-PCR化验。图2说明当应用于具有用SYBR染料(在此情况下为SYBR Gold)、用于以Cy5标记的一个等位基因的具有等位基因辨别力的探针、染料的激发和来自染料(72℃下，延伸温度)和荧光团(55℃下，引物延伸之后的低温检测)的信号的读数来执行的低温检测步骤的LATE-PCR扩增时，所达到的扩散减少。画面A呈现来自用于重复纯合样本(圆圈21)和重复杂合样本(圆圈22)的荧光团的实时读数。显然，重复品中的扩散使差异模糊。然而，画面B描绘纯合样本(圆圈23)和杂合样本(圆圈24)的Cy5信号与SYBR信号的比率。扩散减少量足以允许进行终点化验。
本发明还包括容许错配的低Tm或超低Tm线性单链探针，其以可由来自荧光DNA染料(例如，SYBR Green I或SYBR Gold)的发射激发的荧光团来标记(优选在终端标记)，且其经淬火以减少背景荧光。这些探针携带淬火部分，所述淬火部分在无目标的情况下抑制荧光。在温度降低时，容许错配的线性探针具有折叠并形成短双链区域的趋势。使用低温LATE-PCR检测步骤使此趋势加剧。当探针序列杂交到目标序列时，这种情况不会发生。如果探针包括由来自存在于反应混合物中的SBYR染料的发射激发的荧光团，那么所述染料插入到未结合探针分子的非既定双链区域中或以另外的方式与所述非既定双链区域关联，且因此通过FRET来激发探针的荧光团。结果是在低温下背景荧光增加。
通过将淬火部分(例如，DABCYL或Black HoleTM淬火剂(BHQ))在其对由未结合探针内的非既定二级结构引起的荧光团荧光进行淬火的位置处添加到探针，来实现对根据本发明的容许错配的探针的淬火。只要有可能，建议在与荧光团相反的端部添加淬火剂。下文的实例2示范两种可能的技术，简单地添加淬火剂或构造经淬火的发夹，即一种使淬火剂紧密接近荧光团、接近二级结构或两者的特别设计的二级结构。优选地，经构造的二级结构的Tm比任一替代二级结构的Tm高至少5℃，使得在无目标的情况下，大多数探针分子均处于发夹配置中，且背景荧光较低。所构造茎(stem)的Tm低于杂交到完全匹配的目标的探针的Tm，且类似于杂交到其错配目标的探针的Tm，使得茎的形成不会阻止向茎内序列的目标的杂交。
可通过利用在杂交时用信号发出通知的一个或多个低温容许错配的探针(包括容许错配的分子信标探针、通过激发荧光DNA染料而被间接激发的线性单链探针，和根据本发明的经淬火的线性探针)来实现对核酸目标的检测和识别。对于某些实施例来说，探针混合物还可包括至少一个根据本发明的等位基因特定探针。一种有用的技术是利用两个探针的荧光随着温度形成的比率，在相对于所述探针中的至少一者而具有类似Tm的目标中进行区分。我们有时将此比率的曲线称为目标的“荧光签名(fluorescence signature)”。
利用包括低温检测步骤的LATE-PCR，有可能将检测温度的效应与荧光签名的效应相结合。一种已与多个容许错配的探针(包括(但不限于)根据本发明的经淬火单链可间接激发的探针)一起使用的化验是LATE-PCR扩增，其由以下步骤组成：使双链DNA变性的高温步骤(95℃，持续2分钟)；之后是利用限制引物和过量引物两者的指数生长期扩增(95℃持续10秒、60℃持续15秒且78℃持续40秒的30个循环)；之后是指数生长期的完成和随后的线性生长期，在线性生长期期间，包括探针检测步骤(95℃持续10秒、60℃持续15秒、78℃持续40秒、55℃持续20秒、50℃持续20秒、45℃持续20秒且40℃持续20秒的40个循环)。这提供了四个低于引物退火温度60℃的检测温度。可在引物延伸温度78℃(其高于任一探针的Tm)下，通过来自SYBR染料的发射来监视双链产量。可在从55℃到40℃的每一低温下，监视荧光团发射。在最后一个循环之后，温度可下降到较低值，例如30℃，且缓慢地增加以便进行溶解分析。除检测到的荧光等级之外，荧光团荧光与染料荧光的比率和荧光团荧光的比率可用于产生扩增子区分信息。
附图中的某些图说明利用前述可能性的技术。图4展示相对于若干种分枝杆菌的16s核蛋白体RNA基因的两个容许错配的探针的溶解行为。使用两个探针：实例2中所述的形成发夹的经淬火探针，其具有序列5′-Cy5-CTG GAT AGG ACC ACG AGG CCA G-BHQ II-3′(SEQ.ID第2号)；和TAMRA标记的探针，其具有序列5′-G CAT GTC TTG TGGTGG-TAMRA-3′(SEQ.ID第3号)。已发现，未经淬火的后一种探针在若干物种的背景上方给出可辨别信号。图4的画面A呈现不具有目标的发夹探针(线41)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)(线42)、戈氏分枝杆菌(M.gordonae)(线43)、heidelburgense分枝杆菌(M.heidelburgense)(线44)、mahnoense分枝杆菌(M.mahnoense)(线45)，和海分枝杆菌(M.marinum)(线46)的溶解曲线。画面B呈现不具有目标的TAMRA标记的探针(线47)、亚洲分枝杆菌(线48)、戈氏分枝杆菌(线49)、heidelburgense分枝杆菌(线50)、malmoense分枝杆菌(线51)，和海分枝杆菌(线52)的溶解曲线。图4的画面C描绘TAMRA荧光与Cy5荧光的比率、亚洲分枝杆菌(线53)、戈氏分枝杆菌(线54)、heidelburgense分枝杆菌(线55)、malmoense分枝杆菌(线56)，和海分枝杆菌(线57)。
另一分析技术是描绘来自荧光团的荧光随着温度发生的变化的速率。图5呈现前述根据本发明的Cy5标记的经淬火发夹探针和TAMRA标记的未经淬火的探针(上文描述两者)的此类曲线图。画面A为经淬火的发夹探针，且画面B为TAMRA标记的探针。所述曲线图展示亚洲分枝杆菌(线61、71)、戈氏分枝杆菌(线62、72)、heidelburgense分枝杆菌(线63、73)、malmoense分枝杆菌(线64、74)和海分枝杆菌(线65、75)的溶解峰值。使用两个探针，有可能通过溶解峰值来区分五个目标。Cy5标记的探针单独能够将戈氏分枝杆菌(线62)与其它分枝杆菌区分。TAMRA标记的探针单独可将亚洲分枝杆菌(线71)、戈氏分枝杆菌(线72)和海分枝杆菌(线75)中的每一者彼此区分。总之，探针可区分heidelburgense分枝杆菌与亚洲分枝杆菌，因为heidelburgense分枝杆菌对于Cy5探针产生高峰值且对于TAMRA探针产生低峰值，而亚洲分枝杆菌产生相反的峰值。在每一扩增子具有单个探针的情况下，相对峰值高度可反映产物浓度的差异。然而，此处，两个探针检测同一扩增子，因此相对峰值高度反映探针-目标溶解特性的差异。
上文所述的另一分析手段是使用一个或一个以上荧光比率(例如，在此处所论述的特定实施例中，在PCR期间在相同温度下或在不同温度下TAMRA荧光与Cy5荧光的比率)。用于探针设计的一种有用策略包括将一个探针设计成结合到多个物种所共用的保留区域以充当参考，或包括(根据需要)利用限制引物序列的一部分作为保留区域。这对于LATE-PCR来说是可选方法，因为探针Tm充分低于限制引物的Tm和退火温度，所以具有共用序列的探针不会干扰扩增。图6使用荧光比率的组合来展示结果。在此实施例中，将每一者均在40℃检测温度下收集的TAMRA/Cy5荧光值用作一个比率，且将分别在45℃和55℃(检测温度)下收集的TAMRA/Cy5荧光信号的比率用作另一比率。图6描绘特定循环(在此情况下为循环50)时的两个比率。六个重复品为各个物种亚洲分枝杆菌(圆圈81)、戈氏分枝杆菌(圆圈82)、heidelburgense分枝杆菌(圆圈83)、malmoense分枝杆菌(圆圈84)和海分枝杆菌(圆圈85)产生非重叠数据。
在PCR期间在不同温度下测量探针荧光与限制对PCR后溶解物进行分析相比具有优势。一个优势是，在达到阈值循环(CT值)之后比较特定数目的循环时的荧光值的能力。这使得能够使用与SYBR染料(或其它添入染料)的比率，如上文所述。另一优势在于，每一样本均具有在扩增子检测之前的循环期间在每一温度下测量到的背景荧光。因此，可对背景荧光的样本间的变化作出准确调节。有可能在PCR期间在许多温度下测量荧光，从而在探针在杂交到不同目标过程中展示差异的温度范围内提供几乎完整的溶解分析。这些步骤的数目和持续时间部分地取决于检测设备的能力。利用一些热循环仪，可能在温度增加或减小期间进行连续荧光检测。直到预期在荧光的初始升高之前不久的某一点才需要开始多个温度下的检测。每一循环，或以某一其它时间间隔(例如，每第五循环)可完成多个温度下的检测。消除初始循环期间的多个检测步骤并减小那些步骤的频率，这样做减少了完成扩增反应所需的总时间。当利用探针荧光与染料荧光的比率时，优选地在探针杂交到其目标的温度下测量探针荧光，且在探针未结合的温度下测量SYBR荧光。最优选地，在延伸温度下测量SYBR荧光。由于探针荧光在充分超过SYBR荧光处于平稳状态时的阈值循环(CT)值的循环时增加，所以这些比率在扩增反应期间将改变。因此，在每一样本的CT值过后的特定数目的循环时比较个别样本的比率很重要。
也可使用单个容许错配的探针来实现单链DNA产物的分析，在一个以上(例如，两个或三个)不同温度下测量所述单个容许错配的探针的信号。接着，可在两个或两个以上温度下，使用荧光值将所得数据处理为比率。所述比率显著减小重复样本之间的信号差异，并提供所询问等位基因的量化测量值。图11展示两个温度下的探针荧光等级。如图11所说明，在高温下(其中探针具有等位基因辨别力，且仅结合到完全互补的等位基因)以及在较低温度下(其中探针完全容许错配且结合到目标序列的所有可能的等位基因变体)收集由于探针向过量引物链杂交而导致的探针信号。高温和低温下的荧光测量和所得比率的计算也可执行为终点化验。我们将这些化验称为“两温度规格化化验(不具有背景校正)”。如图11所说明，它们容易区分纯合基因型与杂合基因型。这种类型的化验可执行为终点同质LATE-PCR化验，QE-LATE-PCR化验。
图11报告经基线校正的荧光信号。如实例5中所论述，我们建议使用原始荧光信号而不是来自ABI 7700的经基线校正的荧光信号(如图12所示)。基线校正可能将矫作物引入个别样本的规格化荧光比率中，因为校正因数对用于界定基线的背景荧光信号中的假波动敏感。原始荧光读数不受此矫作物影响。对原始荧光信号的依赖使得化验可应用于具有荧光计能力的任何PCR热循环仪，或可应用于与温度调整的荧光计结合使用以获得终点荧光读数的常规热循环仪。
可通过构造在两个以上温度下检测到的信号的比率来进一步改进QE-LATE-PCR基因分型。用于使终点数据规格化的三温度方法由以下公式给出：规格化荧光值＝(Fs-Ft)/(Fb-Ft)，其中(Ft＝最高温度下的荧光)，(Fb＝最低温度下的荧光)，(Fs＝任何给定第三温度下的荧光)。实例6中描述且图13中说明了应用于人类p53基因内的SNP位置的纯合和杂合基因型的三温度方法。
焦磷酸测序是此项技术中已知的实时、等温、定序及合成方法。其由四种动力学平衡的酶催化：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶。所述方法包括退火到单链DNA的定序引物。根据模板DNA的序列针对每一核苷酸进入定序引物的3′端的并入来个别地分配并测试每一核苷酸。通过以与并入的核苷酸的量等摩尔的量释放焦磷酸盐(PPi)来实现成功的并入事件。在存在腺苷5′磷酸硫酸的情况下，ATP硫酸化酶定量地将所释放的PPi转化成ATP。接着，ATP接着驱动虫萤光素至氧合虫荧光素的以虫萤光素酶作为媒介的转化，所述转化以与ATP的量成比例的量产生可见光。所述光由电荷耦合装置(CCD)相机检测，且在热解色谱图中显示为峰值。未并入的dNTP和过量ATP由腺苷三磷双磷酸酶连续地降级。根据核苷酸分配的次序和热解色谱图中的峰值高度(其与并入的核苷酸的量成比例)来确定核苷酸序列。
LATE-PCR有效地产生单链DNA，且因此不需要从传统的双链PCR产物产生单链模板所需的常规焦磷酸测序样本制备方法。然而，将LATE-PCR产物用于焦磷酸测序需要有效地去除从扩增反应剩余的试剂(dNTP、焦磷酸盐和将干扰焦磷酸测序化学的过量引物)。可通过柱纯化、乙醇沉淀或用于将dNTP、焦磷酸盐和过量引物从扩增反应去除的任何已知的PCR产物纯化途径来实现剩余试剂的去除。在清除之后，将来自LATE-PCR的单链DNA直接退火到定序引物，且根据制造商的指令为焦磷酸测序而处理单链DNA。重要的是，不应将LATE-PCR样本加热到使在反应中产生的双链产物变性的温度，以保证唯一可用于定序引物的模板是单链DNA产物。事实上，可能根本不需要加热LATE-PCR样本以用于引物退火，因为模板DNA已经是单链的。
已使LATE-PCR扩增与简化的清除方法组合以为定序操作制备样本。见实例7和图14。已设计了两种用于焦磷酸测序的LATE-PCR样本制备方法，其不涉及物理PCR产物纯化且可在单个管中执行。在第一种方法中，通过在扩增期间使用限制量的所有dNTP，使得dNTP在反应过程中耗尽(但不是过早地耗尽，以便导致单链DNA(即过量引物链)的产量不足)(这可通过常规试验来确定)，来解决来自LATE-PCR扩增的剩余dNTP的问题。通过用具有焦磷酸酶活性的酶(例如，焦磷酸酶(诸如酵母焦磷酸酶))处理LATE-PCR样本，之后进行热失活，来解决来自LATE-PCR的剩余焦磷酸盐的问题。从LATE-PCR扩增剩余的过量引物不应干扰焦磷酸测序，因为在限制引物的延伸产物(限制引物链)的3′端上的这些引物的匹配目标序列：A)以双链形式结合起来，且因此不轻易可用，且B)视LATE-PCR引物比率而定，比过量引物链少5-20倍。然而，为了排除在用于焦磷酸测序的温度下过量引物在PCR产物上误引发的任何可能性，可视情况在LATE-PCR扩增开始时，添加与过量引物互补的寡核苷酸。此互补寡核苷酸必须(例如)通过比其3′端处的过量引物短几个核苷酸而具有比过量引物Tm低至少5-10℃的Tm，且必须通过所属领域的技术人员已知的任何方法阻塞在3′端处，以防止寡核苷酸由DNA聚合酶延伸(例如，通过包括磷酸基团)。当以此方式设计时，互补寡核苷酸不干扰LATE-PCR扩增，而是在用于焦磷酸测序的温度下形成具有过量引物的稳定双链杂交物，从而防止过量引物误引发经扩增材料上的其它互补位置。或者，如果在LATE-PCR反应之后添加互补寡核苷酸，那么互补寡核苷酸可具有与过量引物的长度相同的长度，或比过量引物的Tm低小于5-10℃的Tm，或两者。另外，可在LATE-PCR反应之后，以足以在与过量引物争夺限制引物链的3′端上的互补位置的过程中取胜的浓度添加与过量引物含有相同序列的3′阻塞的寡核苷酸(具有或不具有其它增加其Tm的修改(例如，3′端处的额外碱基或使用LNA类似物等))。
第二种方法包括用同一种酶和用于焦磷酸测序的基质混合物对LATE-PCR样本进行预处理，之后进行引物退火和添加个别dNTP以用于焦磷酸测序。在此方法中，制造商推荐的协议的次序被颠倒(即，正常协议要求进行引物退火，之后添加焦磷酸测序反应混合物)。在此方法中，焦磷酸测序混合物中存在的腺苷三磷双磷酸酶使dNTP降级，而ATP硫酸化酶和虫萤光素酶使焦磷酸盐转化成ATP和光。这些解决方案中所含有的虫萤光素酶和虫萤光素提供一种用于监视PPi以及dNTP的分解的有用系统。ATP和dATP两者均充当虫萤光素酶的基质，因此如由焦磷酸测序机器中的CCD相机检测到的样本光输出的停止充当对清除的良好近似。如果为特定制备所需，尤其如果扩增子长于约100个碱基对或约二十个以上碱基对将要被定序，那么在DNA定序开始之前，补充由这些反应耗尽的基质(腺苷5′磷酸硫酸和荧光素)。在一些情况下，初始处理将比制造商的协议需要更多基质混合物。在随后的引物退火需要加热和冷却的情况下，这些试剂将受到破坏且需要在焦磷酸测序之前被替换。
第二种方法的一种变化是：添加具有dNTP酶活性的经纯化的酶(例如，腺苷三磷双磷酸酶(诸如马铃薯腺苷三磷双磷酸酶))和具有焦磷酸酶活性的经纯化的酶(例如，焦磷酸酶(诸如酵母焦磷酸酶))；之后对这些酶进行热失活；进行引物退火和接着进行常规焦磷酸测序。再次，来自LATE-PCR的剩余的过量引物通常不会干扰焦磷酸测序，但在它们确实干扰焦磷酸测序的情况下，可使用上文所述的互补寡核苷酸策略来处理这些引物。此第二种方法不需要为不同LATE-PCR扩增调节dNTP浓度，且因此节约了可观的时间。
视所使用的焦磷酸测序设备而定，LATE-PCR产物的直接焦磷酸测序需要0.5-4pmole，有时2-4pmole的经制备单链产物，其退火到3-15pmole，有时10-15pmole的定序引物。在第二和第三种样本制备方法中，重要的是，所添加的LATE-PCR样本的体积小于总焦磷酸测序反应物的二分之一，有时小于三分之一，以保持焦磷酸测序混合物的最佳pH(与PCR的pH8.0或更高(例如pH8.3)相比，为pH7.5)。或者，如果相应地调节缓冲液浓度和pH，那么LATE-PCR产物可组成反应体积的一半多。用于监视LATE-PCR扩增的各个生长期的试剂(例如，荧光DNA染料和杂交探针)与焦磷酸测序兼容且不需要去除，杂交探针被设计成结合到待定序的区域或焦磷酸测序引物结合的地方时的情况除外。在此情况下，可使用上文所述的用于阻塞过量引物的策略中的一种来阻塞杂交探针。我们已确定，当焦磷酸测序反应中这些化合物的最终浓度为300nM或更低，优选地200nM或更低，且使用焦磷酸测序的标准DNA聚合酶(核酸外切酶不足的Klenow DNA聚合酶片段)时，在我们同时申请的题为“Reagents and Methods forImproving Reproducibility and Reducing Mispriming in PCR Amplification”的美国临时专利申请案中所揭示的用于抑制扩增期间的误引发的试剂与焦磷酸测序兼容。通过利用允许在同一腔室或容器中制备和扩增的PCR样本制备技术(见(例如)美国专利公开案US-2003-022231-A1)与以较小体积(优选地小于或等于10μl，例如2-10μl)执行的LATE-PCR扩增结合，有可能以单管形式从小细胞群组(1到10,000个细胞)获得焦磷酸测序信息。根据此“细胞至序列”化验，根据例如Pierce等人(2002)生物技术32(5)：1106-1111中所述的那些技术的PCR样本制备技术(见美国专利公开案US-2003-022231-A1)来为扩增制备小细胞群组(1到10,000个细胞)，所述小细胞群组经受LATE-PCR扩增，且在如上文所述的单个容器、井、管或反应腔室中直接为焦磷酸测序而处理所述小细胞群组。如以下实例8中所论证且图15中所示，单管方法允许甚至以单细胞、单分子等级实现精确且准确的基因分型。
对用于焦磷酸测序的基于酶的PCR清除途径的一般顾虑是分解副产物的生产过剩，其可在稍后的定序期间导致酶的反馈抑制并缩短读取长度。这些分解副产物包括SO4 2-、氧合虫荧光素、无机磷酸盐(Pi)、dNMP和AMP。一种限制Pi和dNMP的联合(pool)的方法是降低PCR期间所使用的dNTP的浓度(但不一定达到如上文在方法一中所论述的它们在反应期间完全消耗的点)。通过对多达六百个碱基那样长的LATE-PCR扩增子进行定量PCR观察，已发现可在不影响扩增效率的情况下，常规地将dNTP浓度降低到100nM。在这些条件下，如实例9、图16中所论证，可为五十个以上连续碱基实现对酶催制备的LATE-PCR反应的焦磷酸测序。
在双脱氧定序的情况下，我们已开发出一种协议，其包括稀释，作为对经LATE-PCR扩增的产物的唯一必要处理。通过循环定序对来自LATE-PCR扩增的单链扩增子进行常规双脱氧定序需要50fmole的所述产物和已知量的产物，因为毛细管电泳对产物的量敏感。利用SYBR Green I荧光DNA结合染料来监视双链DNA与用Cy5标记的线性探针的合成以监视单链扩增子的合成，可监视LATE-PCR扩增，其优选包括在我们的题为“Reagents and Methods for Improving Reproducibility and Reducing Mispriming in PCRAmplification”的美国临时专利中所揭示的误引发抑制试剂。这三种添加剂都不干扰随后的定序反应，在LATE-PCR反应中，双链产物的指数扩增和合成的程度由限制引物的量来界定，且与初始模板的量无关。根据需要，可通过限制至少一个dNTP的量或通过限制扩增循环的数目来限制单链产量的程度。
我们已确定，为了对过量引物链(即，由LATE-PCR中的过量引物制成的链)进行定序，用总量为至少20倍或更多的水来稀释LATE-PCR扩增会使过量引物链产物适合作为用于双脱氧定序的初始材料。为了确保毛细管定序器所利用的量在稀释之后含有所需的最小量50fmole的待定序的材料，当限制引物的浓度为25毫微摩尔(nM)(25fmole/μl)且因此需要约过量8倍的单链DNA时，LATE-PCR反应的线性生长期必须产生至少200毫微微摩尔(fmole)的单链DNA/微升(μl)。为了估计由LATE-PCR扩增产生的单链DNA的浓度，我们将在反应结束时双链DNA中存在的链(其参与循环定序，且其浓度由限制引物的浓度来界定)的浓度，加上每一循环所制得的单链DNA的浓度(我们估计，一般来说，线性合成的每一循环产生理论产物的约50％，理论产物等于反应中双链DNA的量乘以反应保持线性持续的循环的数目)。如果产物累积在反应过程中停止呈线性(如通过荧光团的实时荧光曲线变平来展示)，那么从当反应为线性时的最后一个循环与扩增反应的最终循环之间的荧光信号的倍数增加推断非线性生长期期间所制得的单链DNA的量。通常，如果在LATE-PCR扩增中所产生的单链产物的浓度为200fmole/μl，那么将过量引物链1∶8稀释为25fmole/μl，且将2μl经稀释的产物(50fmole)直接用于20μl双脱氧定序反应中。在这些条件下，LATE-PCR产物到定序反应中的总稀释因数为80倍。可将多达8μl的经稀释的LATE-PCR产物(200fmole)用于定序反应中(总稀释度为20倍)，且仍获得可解释的序列色谱图。
必须进行样本纯化，因为来自PCR扩增的剩余试剂(例如，dNTP和引物)将干扰双脱氧定序。LATE-PCR使用简单的用水的稀释步骤来代替通过乙醇沉淀或亲和层析柱进行的样本制备。为双脱氧定序制备LATE-PCR仅需要将过量单链DNA产物用水稀释至少8-10倍达到25fmole/μl的浓度，之后将50-200fmole单链DNA产物添加到含有10pmole定序引物的双脱氧循环定序反应。最终双脱氧定序混合物中的总稀释因数至少为20倍。在这些条件下，来自LATE-PCR的剩余dNTP被过分稀释以致不能干扰双脱氧定序。来自LATE-PCR的遗留的过量引物也不是问题，因为这些引物结合到的模板(限制引物链)在稀释步骤之后以非常低的浓度存在，且完全杂交到过量引物链。出于这两个原因，过量引物不充当定序引物。实例10和图17说明我们的“稀释并去除”方法的有效性。图17呈现使用对称PCR和传统的样本制备方法(使用Qiagen柱来使DNA产物纯化，之后通过凝胶电泳进行量化；总制备时间：1小时)而获得的序列色谱图，和使用LATE-PCR和用水的稀释(总制备时间：30秒)获得的序列色谱图。所述序列色谱图几乎相同。
实例11和图18-19说明用于来自同一反应中的同一DNA模板的一个以上产物的LATE-PCR扩增的策略。因此，这些反应含有两对引物(每一对均由过量引物和限制引物组成)，其扩增连续模板内的两个单独序列。可将所述两对引物配置成使得过量引物两者和限制引物两者均杂交到模板的同一链，或杂交到模板的相对链。如所属领域的技术人员将了解，当类似引物杂交到模板的相对链时，两个过量引物可在其各自的模板链上“向内”或“向外”延伸。图19还展示可经由“稀释并去除”方法从同一反应混合物获得的过量引物链两者的序列。
实例12和图20展示可独立地测量由LATE-PCR扩增产生的ssDNA和dsDNA的量，且所述量可用于计算比率ssDNA/dsDNA，所述比率又可用于确定至此累积的ssDNA的量是否足够用于随后经由“稀释并去除”方法进行定序。
实例13和图21展示对具有紧密相关但不同的序列的LATE-PCR扩增子的50∶50混合物所使用的“稀释并去除”方法。图22展示由90∶10和10∶90比率的两种具有紧密相关但不同的序列的LATE-PCR扩增子组成的混合物可经由“稀释并去除”方法与纯的100∶0和0∶100混合物以及30∶70和70∶30混合物区分。为了实现此类型的分析，有必要根据每一异原生质位置(heterplasmic position)处的等效“纯”核苷酸的预期振幅来校正观察到的所述位置处的每一核苷酸峰值的振幅。一旦这样做，便可计算每一序列的相对量作为振幅的比率(经校正的核苷酸1)÷(经校正的核苷酸1+经校正的核苷酸2)。因此，如在不同的线粒体DNA序列的情况下，本文所述的LATE-PCR和双脱氧“稀释并去除”方法可用于检测异原生质。用于测量异原生质的双脱氧方法尤其有利，因为其可用于在单个分析中检查数百个核苷酸。尽管不希望受任何理论束缚，但相信本文所述的方法与基于对称PCR和双脱氧定序的前述试图所起的作用形成对比，因为LATE-PCR产生单链扩增子的高度同质总体。相比之下，对称PCR趋向于产生全长度分子连同一些部分扩增子和一些误引发扩增子的总体。
实例14和图23展示LATE-PCR连同至少一个单一容许错配的探针可用于产生终点溶解曲线，所述终点溶解曲线又可用于量化具有紧密相关但不同的序列的两个或两个以上混合LATE-PCR扩增子的相对量。由于LATE-PCR产生单链产物的事实，使相关扩增子的混合物的定量终点溶解分析(QE)LATE-PCR成为可能。因此，当反应中存在一个或一个以上经标记的容许错配的探针时，所述探针首先杂交到最互补的目标序列，且接着如果温度充分降低，那么杂交到所有相关目标序列。因此组中的每一探针/目标杂交物均具有其自身的溶解温度，且从每一探针/目标杂交物导出的溶解峰值的量值准确地反映每一累积的目标序列的量。每一溶解曲线的振幅或二维面积的定量测量接着可用于计算每一目标序列的相对丰度。图23中所示的数据说明可以99.7％的置信度使用此方法来区分相差单个核苷酸的两个序列的0∶100-10∶90-50∶50-90∶10-100∶0混合物。
根据本发明的化验，不管是在存在还是不存在我们的美国临时专利申请案60/619,620中所述的试剂的情况下执行，均可独立地优化以通过调节添加到反应的DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)的浓度来避免误引发或使误引发最小化。可使用ssDNA的探针根据LATE-PCR反应的动力学，以及通过由此项技术中已知的各种手段揭示的最终产物的成分，来观察通过调节聚合酶而减少误引发。已发现，用典型过量浓度的Taq聚合酶来开始且接着在若干步骤中减小此浓度在试验上是便利的。虽然过分少的聚合酶可导致反应变得效率低下(表现为产物扩增的速率或程度的显著减小)，但最佳等级的聚合酶导致在许多循环内具有有效dsDNA扩增和稳定的ssDNA合成的LATE-PCR扩增化验。实例15说明可由使用例如SYBR Green的双链染料加上dsDNA产物的溶解曲线来观察的，还使用SYBR Green来观察的dsDNA信号来判断聚合酶的最佳等级。实例16和图24展示何时针对由不同量的初始材料产生的特定ssDNA产物而探测此类化验，所得曲线在ssDNA产生的许多循环内是线性且平行的。
实例
实例1.结合染料与结合染料加上经标记的引物
为了将添入染料的性能与结合包括相互作用荧光团的引物而使用的染料的性能进行比较，执行延伸化验。所利用的染料是稀释度为1∶40,000的SYBR Green I。
包括三种核苷酸链。DNA模板、可延伸DNA引物(5′以Cy5标记，与所述模板互补，且具有60℃的Tm)、和非可延伸DNA寡核苷酸(3′端以磷酸基团阻塞)，其也与目标互补，在位置3′处与引物互补，也以Cy5荧光团标记，且具有79℃的较高Tm。选择引物与非可延伸核苷酸之间的间距，使得由非可延伸寡核苷酸决定的引物延伸产物都将具有低于79℃的Tm。
引物延伸化验的反应混合物包括0.5微摩尔(μM)模板DNA、1.5μM引物和0.5μM的非可延伸寡核苷酸。所述混合物还包括1X PCR缓冲液、3毫摩尔(mM)MgCl2、250毫微摩尔(nM)的dNTP、250毫微摩尔的1∶40,000X SYBR Green I和250毫微摩尔的Taq DNA聚合酶。将反应混合物加热到50℃，持续2分钟，以便使引物与非可延伸寡核苷酸结合，且产生不足以达到非可延伸寡核苷酸的引物延伸产物。使用重复样本。
在引物延伸反应之后，产物经受溶解分析，其中当温度改变时，SYBR Green染料被激发。当温度增加穿过包含未延伸引物和非可延伸寡核苷酸的溶解温度的范围时，在染料的发射的波长下且在荧光团的发射的波长下取得荧光读数。图1中呈现溶解曲线，其为相对于温度而描绘的荧光关于温度的第一导数，其中画面A呈现两个样本的曲线1，来自染料发射的数据，且画面B呈现两个样本的曲线2，来自Cy5发射的数据。
实例2.经淬火的容许错配的探针。
将经标记的探针设计为具有与分枝杆菌属的16S核蛋白体RNA基因互补的一致序列。根据Mfold程序(Zucker，M(2003)，“Mfold web server for nucleic acid folding andhybridization prediction”，核酸研究31：3406-3415)来预测二级结构，其中将钠浓度设定为70毫摩尔(mM)，且将镁浓度设定为3mM。探针的序列为Cy5-AATACTGGATAGGACCACGAGG(SEQ.ID第1号)，其中通过下划线区域的杂交来形成预测的二级结构。探针的二级结构的预测Tm为37℃。在不含有目标的样本(含有SYBR Green I染料的混合物中的戈氏分枝杆菌或亚洲分枝杆菌)中测试此探针，其中直接激发染料，且进而间接地激发荧光团。图3，画面A中呈现Cy5荧光与温度的结果。线31(无目标)展示高背景荧光，但线32(戈氏分枝杆菌)和线33(亚洲分枝杆菌)展示背景上方的可辨别信号。为了对背景荧光进行淬火，将非荧光淬火剂(Black HoleTM淬火剂)添加到探针的3′终端核苷酸。类似地测试经修改的探针，且图3的画面B中展示结果。可以看到，背景荧光(线34，无目标)显著降低，且来自戈氏分枝杆菌(线35)和亚洲分枝杆菌(线36)的信号在背景上方更加高。
另一种淬火探针的技术是将探针构造成具有发夹结构，其在一端上用适当的荧光团进行终端标记，且在另一端上用淬火剂进行终端标记。我们构造出一种探针，其具有序列Cy5- CTGGATAGGACCACGAGG CCAG-BHQII(SEQ.ID.第2号)，其中下划线序列是互补的且形成发夹茎。出于实现所述茎的目的，添加三个3′终端核苷酸。此具有完全匹配目标的探针的预测溶解温度为60℃。茎的预测Tm约为48℃(基于40℃的预测未修改核苷酸茎Tm，不考虑荧光团-淬火剂相互作用的增加的亲和性)。也如上文所述测试此探针，且图3的画面C中呈现结果。背景荧光(线37，无目标)相当低，且来自戈氏分枝杆菌(线38)和亚洲分枝杆菌(线39)的信号在背景上方较高。
实例3.使用容许错配的探针的实时和终点基因分型。
此实例说明使用实时LATE-PCR扩增和由来自SYBR染料的发射间接激发的Cy5标记的低Tm容许错配的线性探针对造成泰氏-萨氏病(Tay-Sachs disease)的人类氨基己糖苷酶A(Hex A)基因的G269等位基因的纯合样本和杂合样本进行识别。在LATE-PCR的检测温度空间内，首先在55℃(探针在此化验中具有等位基因辨别力且排外地结合到其完全匹配的目标时所处的温度)下，且接着在40℃(探针容许错配且在扩增反应中结合到其目标序列的等位基因的总体时所处的温度)下，在每个扩增循环期间，对探针杂交监视两次。用容许错配的探针对特定等位基因和总等位基因进行检测允许校正重复样本中的扩增子产量的随机的管之间的变化。反应中的特定等位基因与总等位基因的比率(55℃下Cy5/40℃下Cy5)允许重复样本的规格化以用于终点基因分型。从比率值导出基因类型信息。在纯合样本的情况下，在等位基因辨别条件下检测到的探针信号与在容许错配条件下检测到的探针信号相同，因为在两种情况下，探针均结合到100％的目标序列等位基因。相比之下，在杂合样本的情况下，在等位基因辨别条件下检测到的探针信号的强度是在容许错配条件下检测到的探针信号的强度的一半，因为探针在等位基因辨别条件下仅结合到50％的目标序列等位基因，但在容许错配条件下结合到100％的等位基因。因此，与杂合样本相比，纯合样本具有较高的55℃下Cy5/40℃下Cy5比率。此基因分型方法仅依赖单个等位基因的检测。
LATE-PCR引物和探针的序列和浓度经调节的溶解温度Tm【0】如下。限制引物具有序列5′CGAGGTCATTGAATACGCACGGCTCC 3′(SEQ.ID第3号)。其在25nM下具有63.2℃的浓度经调节的Tm【0】。过量引物具有序列5′TAACAAGCAGAGTCCCTCTGGT 3′(SEQ.ID第4号)。其在1μM下具有61.8℃的浓度经调节的Tm【0】。探针具有序列5′Cy5-GGGACCAGGTAAGAA 3′(SEQ.ID第5号)。其具有56.3℃的Tm。其为低Tm探针，且当以65℃退火温度使用时，还为超低Tm探针。
在1XPCR缓冲液、3mM MgCl2、250微摩尔(μM)dNTP、25nM限制引物、1000nM过量引物、1.25单位Taq DNA聚合酶、0.6μM Cy5标记的探针和1∶40,000稀释SYBRGold I中为每一不同基因类型(纯合G269和杂合G269)设置重复LATE-PCR化验(n＝15)。PCR循环参数为95℃持续3分钟，接着在95℃持续10秒、65℃持续20秒且72℃持续20秒的25个循环，之后是95℃持续10秒、65℃持续20秒、72℃持续20秒、55℃持续20秒和40℃持续20秒的30个循环，其中在Cy5通道中在55℃和40℃下获得荧光。图7展示55℃下的Cy5信号与40℃下的Cy5信号的比率的分析，且表示这些比率适合于终点基因分型，持续探针检测阈值过后的任一扩增循环。在此图中，纯合样本(圆圈91)的比率约为杂合样本(圆圈92)的比率的两倍。
实例4.使用具有不同溶解温度的目标特定探针对多个目标进行分析。
各用相同荧光团标记的多个探针可组合使用，以沿单个较长寡核苷酸(例如，不对称PCR、LATE-PCR和滚环扩增的产物)或在不同寡核苷酸上检测并量化不同序列。使用低Tm探针增加了此类目标的特定性，从而大大减少或消除从错配目标产生的信号。此技术的一种可能应用是对人类DNA进行基因分型，以识别导致遗传病的已知等位基因。此实例描述用于探针设计且用于检测产物的温度分析。
作为起点，我们选择以下可能存在于扩增产物中的目标：区域中的编码蛋白质的氨基酸542的囊性纤维化跨膜调节(CFTR)基因的正常序列；ΔF508突变(最常见的CFTR突变)的序列；和对应于ΔF508突变的正常序列。
我们为所述三个目标序列中的每一者设计低Tm具有等位基因辨别力的探针。所述探针为低温分子信标探针，其每一者均用荧光团FAM和淬火剂标记。将三个探针设计成在含有70mM 3HCl和3mM MgCl2的混合物中与它们的目标具有不同Tm。“542探针”具有40℃(通过最近邻计算得出的预测值41℃)的Tm；“508正常探针”具有47℃(通过最近邻计算得出的预测值46℃)的Tm；且“ΔF508探针”具有54℃(通过最近邻计算得出的预测值53℃)的Tm。图8呈现可提供Tm值的溶解曲线。图8展示随着重复样本的542探针(线96)、DF508探针(线97)和508正常探针(线98)的温度的变化而变化的荧光读数的负第一导数。通过使用1μM的目标浓度和2μM的542探针浓度来获得粗略相等的峰值高度。我们相对于错配目标而测试每一探针以检查等位基因辨别，且发现相对于完全匹配目标的荧光是相对于错配目标的荧光的5-10倍。
从图8可看到，即使较小的Tm差异也将容易被分辨。根据例如图8的曲线图，4-5℃的差异将是可分辨的。利用以实时PCR热循环仪供应的软件的解褶积可能允许分辨与所述量相差一半的Tm。
检验荧光的负第一导数是一种确定给定样本中存在哪些寡核苷酸目标的方法。图9展示利用背景上方的荧光进行此类分析。含有正常508目标但不含有ΔF508目标的样本(圆圈101)在54℃下具有溶解峰值，指示所述分子信标-目标杂交物。含有ΔF508目标但不含有正常目标的样本(圆圈102)在约47℃下具有溶解峰值，指示杂交到具有突变序列的信标。含有那两种目标的样本(圆圈103)在所述温度范围上具有较广峰值，指示来自两个分子信标-目标杂交物的荧光。542氨基酸处的正常序列的存在和相对浓度由约40℃下的溶解峰值的存在和相对高度来指示。具有542正常目标的样本(对于每一编号组为实线)在所述温度下具有较大峰值，具有在此区域中含有与第二最常见CFTR突变相同的单个核苷酸变化的542突变目标的样本(对于每一编号组为点刻线)在所述温度下不具有峰值，且具有两种542目标的样本(对于每一编号组为虚线)具有中间高度的峰值。具有两种542目标的样本中的峰值的高度受邻近的ΔF508溶解峰值的存在影响。
在扩增反应的过程期间获得完整的溶解曲线可能不总是可能或合乎需要的。上文所述的对样本的进一步分析展示，有限数目的检测步骤可提供识别混合物中的特定寡核苷酸所需的信息。可使用减小的温度而不是增加的温度。将样本加热到70℃，且接着在每一步骤处用30秒检测以5℃的递减量降低到30℃。可基于荧光在60℃与50℃之间的变化来区分含有正常508目标但不含有ΔF508目标，或含有ΔF508目标但不含有正常目标的样本。目标寡核苷酸的每一组合均产生荧光变化的独特图案。图10中展示55℃下荧光增加量的百分比变化与45℃下荧光增加量的百分比变化的扩散曲线图。此分析区分存在于每一样本中的目标的组合。通过使用荧光的变化而不是荧光强度本身，即使当样本在目标的总浓度方面显著不同(如可能发生在重复扩增样本中)时，也可作出准确的估计。图10包括正常508加上正常542目标(圆圈标志111)、正常508加上两种542目标(112)、正常508加上突变542目标(113)、两种508加上正常542目标(114)、两种508加上两种542目标(115)、两种508加上突变542目标(116)、Δ508加上正常542目标(117)、Δ508加上两种542目标(118)和Δ508加上突变542目标(119)的每一组合的重复样本。可在扩增反应的每一循环或选定循环期间，使用此温度轮廓来完成类似的分析。具有已知基因类型的DNA的若干样本可扩增，且检测数据用于建立值的预期范围。这将提供一种用于从未知样本快速确定基因类型的方法。
尽管此实例中仅使用3个探针，但更高数目的探针的组合使用是可能的。对探针的总数目的主要限制是检测的温度范围和探针-目标杂交物之间的最小Tm差异。这些又取决于扩增反应的性质和设备与解褶积软件的能力。举例来说，如果解褶积的最小Tm差异为3度，那么可在30度温度范围上区分10个不同的探针-目标组合。可通过使用多个荧光团来使此数目增加若干倍。
实例5.进行和不进行背景校正的两温度规格化。
使用单个Cy5标记的容许错配的探针，用未知DNA样本和纯合控制rs858521(CC等位基因)及杂合控制(CG等位基因)来执行rs858521 SNP的QE LATE-PCR基因分型。使用ABI棱镜序列检测器(ABI Prism Sequence Detector)7700(美国，CA，Foster城，Applied Biosystems)(其通常产生基线校正的荧光信号)来执行扩增和检测。然而，对于利用比率进行的分析，从基线校正的荧光信号(图11)且从原始荧光信号(图12)两者获得荧光信号比率。图11利用仪器的基线校正的荧光信号来呈现随着扩增反应的循环数目的变化而变化的50℃下探针的荧光与25℃下探针的荧光的比率。在图11中，圆圈113是纯合控制的重复，圆圈114是杂合控制的重复，而圆圈111和112是未知项。图12利用原始荧光信号来呈现相同结果。在图12中，圆圈116是纯合控制的重复，圆圈117是杂合控制的重复，且圆圈115是未知项。使用基线校正的荧光信号进行规格化导致对一个样本(图11，圆圈112)的含糊基因分型。相比之下，使用原始荧光信号进行规格化为所有样本提供正确的基因分型。此结果显示ABI棱镜7700序列检测器软件中的基线校正可能引入影响信号规格化的假象，且优选地不应使用。
实例6.三温度规格化。
用rs858521基因SNP的每一基因类型的纯化基因组DNA执行含有rs858521 SNP引物和单个容许错配的resonsense探针的重复LATE-PCR扩增反应(1800个基因组当量，每一纯合CC、杂合CG和纯合GG基因类型的18个重复反应)。通过图13画面A中所示的溶解曲线且通过如画面B和画面C中所示使数据规格化来分析经扩增的产物。图13A展示在LATE-PCR扩增之后的溶解曲线分析期间收集到的原始荧光信号的曲线图。所利用的探针在较高温度下具有等位基因辨别力，但在温度降低时逐渐变得更加容许错配。重复样本中的产物产量的固有可变性妨碍在此探针的等位基因辨别的温度窗口(40℃-60℃，预先用合成寡核苷酸目标来确定，数据未图示)内通过原始荧光信号(圆圈131)来辨别这些基因类型。图13B展示来自在每一温度下规格化的每一样本的信号相对于所述样本的在完全容许错配的温度(25℃)下收集到的信号。在图13B中，纯合CC等位基因的规格化信号为圆圈132，杂合CG等位基因的规格化信号为圆圈133，且纯合GG等位基因的规格化信号为圆圈134。如图所示，规格化减小了信号扩散且允许在等位基因辨别窗口内识别每一基因类型。在52℃下观察到最大间隔，所述温度对应于所使用的resonsense探针的Tm。尽管与图13A相比，在图13B中，信号扩散显著减少，但从动力学曲线图中的散布判断，重复样本中的信号强度仍存在一些可变性。图13C展示消除此残余信号扩散的最好方法是，在每一温度下将荧光信号规格化为在图13B中观察到的等位基因辨别窗口的最高和最低温度(溶解曲线在此处开始分开)(即，分别为40℃和60℃)下收集到的荧光信号。在图13C中，纯合CC等位基因的规格化信号为圆圈135，杂合CG等位基因的规格化信号为圆圈136，且纯合GG等位基因的规格化信号为圆圈137。如果Fb和Ft分别为朝向等位基因辨别的温度窗口的底部和顶部的荧光读数，且Fs为在溶解分析期间在任一给定温度下的荧光读数，那么如下计算规格化荧光比率：
三温度规格化荧光比率＝(Fs-Ft)/(Fb-Ft)
在任一给定样本内将每一温度下的荧光信号同时规格化为40℃和60℃下的荧光信号进一步减少了荧光信号扩散，并导致来自每一基因类型的重复溶解曲线变得非常紧密(见图13C)。在单个温度，即使用朝向等位基因辨别窗口的最高和最低温度(即，在60℃、40℃下)的荧光信号规格化的探针的Tm(52℃)下计算出的荧光比率以大于99.7％的确定性唯一地界定每一基因类型(即，由包含每一基因类型的所有可能荧光比率的99.7％的三标准偏差组成的误差框(error box)彼此充分分离，数据未展示)。当在标准化为等位基因辨别窗口的相应最高和最低温度(即，在71℃、45℃下)的探针的Tm(57℃)下计算荧光信号时，针对rs2270517 SNP位置获得类似改进的结果。
实例7.LATE-PCR产物的直接焦磷酸测序。
在由1X PCR缓冲液、3mM MgCl2、20毫微摩尔(nM)dNTP、25nM限制引物、1000nM过量引物、1.25单位铂Taq DNA聚合酶和100基因组人类DNA组成的25μl体积中执行重复LATE-PCR扩增。限制引物的序列为5′CCGCCCTTCTCTCTGCCCCCTGGT 3′(SEQ.ID第6号)，且过量引物的序列为5′GCCAGGGGTTCCACTACGTAGA 3′(SEQ.ID第7号)。这些序列扩增来自人类氨基己糖苷酶A基因的外显子11的94碱基对片段。对于LATE-PCR扩增来说，热循环曲线为95℃持续3分钟，之后是95℃持续10秒和72℃持续20秒的10个循环，之后是95℃持续10秒、67℃持续20秒和72℃持续20秒的55个循环。在反应之后，16.6μl(如凭经验从先前焦磷酸测序实验估计的3pmol的单链DNA(ssDNA)的等效物)与20微升(μl)10mM三Cl pH8.5混合，且放置在用于进行焦磷酸测序的微量滴定板的井中。为了从经LATE-PCR扩增的产物去除遗留下来的dNTP和焦磷酸盐，由核酸外切酶不足的Klenow DNA聚合酶、腺苷三磷双磷酸酶、虫萤光素酶、ATP硫酸化酶组成的标准焦磷酸测序酶混合物以及由虫萤光素和腺苷5′磷酸硫酸组成的标准焦磷酸测序基质混合物(如在PSQ 96 SNP试剂盒中提供)(MA，Westboro，Pyrosequencing，Inc)根据制造商的说明通过使用PSQ 96仪器(MA，Westboro，Pyrosequencing，Inc)而被循序地施配到含有LATE-PCR样本的井中，且在37℃下培养60秒。使用在仪器中编程的默认体积，用10mM三Cl pH7.5的单次添加来代替通常由PSQ 96仪器自动执行的随后的dNTP添加。在此步骤之后，含有LATE-PCR样本的井容纳2.5μl 10μm定序引物(5′CTGGTACCTGAACCGTAT 3′)(SEQ.ID第8号)。考虑到添加到LATE-PCR样本的焦磷酸测序酶和基质混合物的体积，估计定序引物的最终浓度为0.5μm且最终体积为50μl。具有所述定序引物的样本再次返回到PSQ 96仪器，且根据制造商的说明来进行处理，只是用类似体积的10mM三Cl pH7.5的添加之后是dNTP的添加来代替通常由所述仪器执行的焦磷酸测序酶和基质添加。图14，画面A中展示所得的热解色谱图，其展示由特定核苷酸的并入产生的光信号。峰值的高度对应于每次添加期间所并入的核苷酸的数目。参看图14的画面C，看到最初两个核苷酸(A，T)中的每一者之一并入到模板中，之后两个后续核苷酸(C，C)并入到模板中，等等。基于峰值的高度和核苷酸添加的次序，导出以下序列：5′ATCCTATGGCCC3′(SEQ.ID第9号)，且随后使用人类氨基己糖苷酶A基因的GenBank序列(GenBank入藏登记号：S62068)来证实。这些结果显示用用于焦磷酸测序的酶和基质混合物来对LATE-PCR样本进行预处理允许在引物退火和反复dNTP添加之后对经LATE-PCR扩增的产物进行直接焦磷酸测序。改变上述协议以遵循制造商的说明(即，执行引物退火，之后添加焦磷酸测序酶和基质混合物)在添加不应该并入在模板上的dNTP时导致80％的假正峰值。这些假正峰值是由于定序引物在焦磷酸测序之前从来自LATE-PCR扩增的剩余dNTP部分延伸而导致的。
在分离实验中，上文所述的同一LATE-PCR样本根据制造商的说明通过使用QIAquick PCR纯化试剂盒(CA，Valencia，Qiagen)而经受纯化，且以10mM三Cl pH7.5以0.375pmol/μl被回收。8微升(μl)的此溶液(总共3pmol)与上文所述的定序引物混合达到0.5μm的定序引物的最终浓度(10mM三Cl pH7.5，最终体积50μl)。根据制造商的说明使用PSQ 96仪器使样本经受焦磷酸测序。图14，画面B中展示所得的热解色谱图。与我们的产生画面A的方法相比，传统制备法在费时且昂贵的同时，还不会给出优良的数据。
实例8.LATE-PCR产物的直接焦磷酸测序。
为了对单细胞进行基因分型，在由1X PCR缓冲液、3mM MgCl2、100μm dNTP、100nM限制引物、1000nM过量引物、1.25单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶(美国，AppliedBiosystems)组成的25μL体积中执行重复LATE-PCR扩增。每一反应均以如在Pierce等人(2002)生物技术32(5)：1106-1111(见美国专利公开案US-2003-022231-A1)中所述而制备的单个人类淋巴母细胞开始，所述人类淋巴母细胞具有(对于IVS-110突变)三个可能的基因类型中的一者。限制引物的序列为5′GGCCATCACTAAAGGCACCGAGCACT 3′(SEQ.ID第10号)，且过量引物的序列为5′GGGTTTCTGATACGCACTGACTCTCTC 3′(SEQ.ID第11号)。这些序列扩增来自人类染色体11p上的B-Globin基因的191碱基对片段。对于LATE-PCR扩增，热循环曲线为95℃持续10分钟，之后是95℃持续10秒、66℃持续15秒和72℃持续20秒的65个循环。在扩增之后，5μl与6.64μl 20mM三醋酸根pH7.6混合，且放置在用于进行焦磷酸测序的光学板的井中。为了从LATE-PCR扩增的产物中去除遗留下来的dNTP和PPi，通过使用PSQ HS 96A仪器(瑞典，Uppsala，Biotage AB)将标准体积的焦磷酸测序酶混合物(由核酸外切酶不足的Klenow DNA聚合酶、腺苷三磷双磷酸酶、虫萤光素酶、ATP硫酸化酶组成)和近似两倍标准体积的基质混合物(由虫萤光素和腺苷5′磷酸硫酸组成)(如高温Gold试剂盒(瑞典，Uppsala，Biotage AB)中所提供)循序地施配到含有LATE-PCR样本的井中，PSQ HS 96A仪器使用以下仪器设定：酶混合物脉冲时间：23.5ms；基质混合物脉冲时间：44.0ms；试剂施配压力：400毫巴。样本在28℃下培养60秒，直到光输出下降到背景下方为止。在此之后，将0.36μL的10μM定序引物：5′GACCACCAGCAGCCTAAG 3′(SEQ.ID第12号)添加到总反应体积为12μl的每一样本，且接着在80℃下退火2分钟，之后冷却到室温，持续10分钟。另外，此时还添加900μM浓度的LATE-PCR限制引物(SEQ.ID第7号)的3′磷酸化型式，以防止模板链的3′端自身折叠并延伸。接着，具有定序引物的样本再次返回到PSQ HS 96A仪器，且根据制造商的说明进行处理(包括正常酶和基质混合物添加)。图15，画面A-C中分别展示从具有纯合野生型、杂合和纯合突变基因类型的细胞产生的热解色谱图。光单位和峰值高度如实例7中所阐释。峰值的相对高度对应于并入在每一位置处的核苷酸的数目。参看图15的画面A，看到，第二峰值(T)的高度是第一峰值(G)的高度的一半，是第三峰值(G)的高度的三分之一，是第四峰值(A)的高度的四分之一，且与峰值5-8(TAGA)的高度相同。因此，最初8个峰值的序列读取为：GGTGGGAAAATAGA(SEQ.ID第13号)。基于峰值的高度和核苷酸添加的次序，导出图15画面A中的野生型B-Globin序列，且随后使用人类B-Globin基因的GenBank序列来证实。在IVS-110位置(由箭头指示)处证实杂合(画面B)或纯合(画面C)突变。在画面B中应注意，1.5单位“C”峰值之后是0.5单位“T”峰值指示两个等位基因中的“C”碱基，之后是一个等位基因中的“C”和另一等位基因中的“T”。这些结果显示，对具有用于焦磷酸测序的酶和基质混合物的LATE-PCR样本进行预处理允许在引物退火和反复dNTP添加之后对LATE-PCR进行直接焦磷酸测序。改变上述协议以遵循制造商的说明(即，执行引物退火，之后添加焦磷酸测序酶和基质混合物)在添加不应该并入在模板上的dNTP时导致80％的假正峰值。这些假正峰值是由于具有剩余dNTP的定序引物的部分延伸而导致的。
实例9.长序列的LATE-PCR产物的焦磷酸测序。
如我们申请的题为“Reagents and Methods for Improving Reproducibility and ReducingMispriming in PCR Amplification”的美国临时专利申请案中所揭示，在由1X PCR缓冲液、3mM MgCl2、100μm dNTP、100nM限制引物、1000nM过量引物、1.25单位AmpliTaqGold DNA聚合酶(美国，Applied Biosystems)和50nM的误引发减少试剂9-22DD组成的25μL体积中执行LATE-PCR扩增。试剂9-22DD是具有9个核苷酸那样长的茎和22个核苷酸那样长的单链循环(single-stranded loop)的发夹寡核苷酸。通过添加5′终端和3′终端Dabcyl部分来修改所述寡核苷酸。其核苷酸序列为5′CGCGGCGTCAGGCATATAGGATACCGGGACAGACGCCGCG 3′(SEQ.ID第14号)。所述反应以人类DNA的20个基因组当量开始。限制引物的序列为5′GGTCAGCGCCGGGCTGCAAGTGTAGA 3′(SEQ.ID第15号)，且过量引物的序列为5′GATGGGTGGAGCTTGTCTTGAGG 3′(SEQ.ID第16号)。这些序列扩增人类染色体17p上的p53基因附近的78碱基对片段。对于LATE-PCR扩增，热循环曲线为95℃持续10分钟，之后是95℃持续10秒、66℃持续10秒和72℃持续20秒的60个循环。在扩增之后，7.5μl的产物与9.96μl 20mM三醋酸根pH7.6混合，且放置在用于进行焦磷酸测序的光学板的井中。为了从LATE-PCR中去除遗留下来的dNTP和PPi，使用PSQ HS96A仪器(瑞典，Uppsala，Biotage AB)将标准体积的焦磷酸测序酶混合物(由核酸外切酶不足的Klenow DNA聚合酶、腺苷三磷双磷酸酶、虫萤光素酶、ATP硫酸化酶组成)和近似两倍标准体积的基质混合物(由虫萤光素和腺苷5′磷酸硫酸组成)(如高温Gold试剂盒(瑞典，Uppsala，Biotage AB)中所提供)循序地施配到含有LATE-PCR样本的井中，PSQ HS 96A仪器使用以下仪器设定：酶混合物脉冲时间：23.5ms；基质混合物脉冲时间：44.0ms；试剂施配压力：400毫巴。样本在28℃下培养60秒，直到光输出下降到背景下方为止。在此扩增子中，将限制LATE-PCR引物(SEQ.ID第10号)用作焦磷酸测序引物，且将此焦磷酸测序引物的0.54μl的10μM溶液添加到总反应体积为18μl的每一样本，且接着在80℃下退火2分钟，之后冷却到室温，持续10分钟。接着，具有定序引物的样本再次返回到PSQ HS 96A仪器，且根据制造商的说明进行处理(包括正常酶和基质混合物添加)。图16中展示所得的热解色谱图。如实例8中所述，峰值的相对高度对应于并入在每一位置处的核苷酸的数目。如从GenBand数据库确定的正确匹配的预期序列注释在峰值上方，其中下标指示一行中给定碱基的数目(即，G1C1A1G2＝GCAGG)。这些结果显示，对具有用于焦磷酸测序的酶和基质混合物的LATE-PCR样本进行预处理允许读取50个以上碱基对那样长。
实例10.LATE-PCR产物的直接双脱氧定序
利用ABI棱镜序列检测器7700(美国，CA，Foster城，Applied Biosystems)来执行PCR扩增，以扩增含有G269突变(其是造成泰氏-萨氏病的原因)的人类氨基己糖苷酶A基因的外显子7的片段。序列对应于GenBank入藏登记号M16417。一种扩增为LATE-PCR扩增，且产物直接经受双脱氧定序。作为控制，将引物浓度改变为克分子数相等的，执行常规对称PCR扩增，且使经扩增的产物在双脱氧定序之前经受常规纯化。
扩增反应混合物(最终浓度)
体积：25μl
1x PCR缓冲液(美国，CA，Carlsbad，Invitrogen)
3mM MgCl2
10μm dNTP
0.6μm探针(仅LATE-PCR)
1∶41,666稀释SYBR Gold染料(美国，OR，Eugene，Molecular Probes)
1.25单位铂Taq DNA聚合酶(Invitrogen)
6ng人类基因组DNA(相当于1000个基因组)
引物：对于LATE-PCR，25nM限制引物和1000nM过量引物；(对于控制，300nM的所述相同引物中的每一者)。
寡核苷酸序列
限制引物：5′CGAGGTCATTGAATACGCACGGCTCC 3′(SEQ.ID第17号)
过量引物：5′TAACAAGCAGAGTCCCTCTGGT 3′(SEQ.ID第18号)
探针：5′Cy5GGGACCAGGTAAGAA-磷酸盐3′(SEQ.ID第19号)
循环定序反应混合物
体积：20μl
100毫微微摩尔(fmole)被定序的产物
5微微摩尔(pmole)定序引物(限制引物或过量引物)
1x DTC5 Quick Start Master Mix(美国，CA，Fullerton，Beckman Coulter，Inc.)[包括dNTP、ddNTP、缓冲液、MgCl2]。
双脱氧定序
定序反应混合物根据制造商的说明，使用CEQ 2000 Due Termination循环定序试剂盒(Beckman Coulter)，在CEQ 2000XL DNA序列(美国，CA，Fullerton，Beckman Coulter，Inc.)中经受循环定序和毛细管电泳。
LATE-PCR扩增和定序制备
LATE-PCR扩增反应混合物经受热循环，如下：95℃持续3分钟；95℃持续10秒、65℃持续20秒和72℃持续20秒的20个循环；和95℃持续10秒、65℃持续20秒、72℃持续20秒、55℃持续20秒和40℃持续20秒的70个循环。通过在72℃引物延伸步骤期间激发SYBR染料并读取其荧光来监视双链扩增子的合成。通过在40℃低温检测步骤期间激发SYBR染料并从低Tm探针的Cy5荧光团读取荧光来监视限制引物耗尽之后单链产物的合成。
为了获得100fmole的过量引物的延伸产物，有必要稀释扩增产物。我们以以下方式估计25μl的反应产物中产物的量。首先，在初始扩增循环期间制得的双链产物中所述产物的量由限制引物的量来指示。在此实例中，所述量为25nM，其转换成25fmole/μl。通过将LATE-PCR扩增的线性生长期分成通过检查Cy5荧光曲线而确定的两个部分(第一部分中扩增在算术上进行，且第二部分中产物累积已减慢)，来估计在所述生长期期间(即，在限制引物耗尽之后)制得的单链延伸产物的浓度。对于第一部分来说(在此实例中，其为6个循环)，基于Gyllensten，U.B.H.和Erlich，A.(1988)，“Generation ofSingle-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and its Application to DirectSequencing of the HLA-DQA LOCUS”，美国国家科学院院报85：7652-7656，假定扩增效率为50％。将所述6个循环期间单链的产量计算为开始浓度(25fmole/μl)乘以循环的数目(6)乘以效率(0.5)。将进一步产量估计为反应的剩余部分期间Cy5信号的百分比增加量，其在此情况下为233.3％。因此，线性生长期期间的总产量为175fmole/μl(25×6×0.5×233.3)，且估计所述产物的总浓度(双链扩增子中包括25fmole/μl)为200fmole/μl。为了在循环定序反应混合物中获得100fmole，用水将扩增产物1∶8稀释且在20μl反应混合物中使用4μl经稀释的产物。将了解，这意味着扩增产物最终以1∶40稀释。
为了获得100fmole的限制引物的延伸产物，我们的起点是扩增反应的产物含有25nM的所述产物，或25fmole/μl。我们仅在20μl循环定序反应混合物中使用4μl的扩增产物以获得100fmole的所需启始量。
控制扩增和定序制备
扩增反应混合物经受相同热循环曲线，只是仅实行五温度循环中的18个(非70个)循环，因为添入染料信号的实时曲线图指示扩增此时处于平稳状态且到此时为止仅制得所需的扩增产物。根据制造商的说明使用QUIA快速PCR纯化试剂盒(美国，CA，Valencia，Qiagen)以常规方式使扩增结束时扩增混合物中的扩增产物纯化。通过溴化乙锭着色(0.5μg/ml)进行目视观察之后，对不同的已知量的ΦX174 Hind III DNA标记物进行0.5次TBE，通过3％琼胶糖凝胶中的凝胶电泳来量化经纯化的扩增子。含有100fmole的体积与每一定序引物一起用于循环定序反应混合物中。
结果
LATE-PCR和控制方法两者均产生对应于GenBank序列信息(入藏登记号M16417)的序列。图17包含从双脱氧定序获得的四个色谱。画面A来自LATE-PCR方法，其中循环定序利用限制引物作为定序引物。画面B来自LATE-PCR方法，其中循环定序利用过量引物作为定序引物。画面C是控制方法，其利用过量引物作为定序引物。画面D是控制方法，其利用限制引物作为定序引物。每一色谱包含从经标记的双脱氧核苷酸和所确定的核苷酸序列获得的荧光曲线。
实例11.来自同一反应中同一DNA模板的一种以上产物的LATE-PCR扩增的策略
利用ABI棱镜序列检测器7700(美国，CA，Foster城，Applied Biosystems)来执行PCR扩增，以扩增在人类线粒体DNA的d环区域(基于所述d环区域使用过量引物来扩增序列)内同一双反应中指定为HV1和HV2 H及L链的549和464碱基的两个扩增子。
扩增反应混合物(最终浓度)
体积：25μl
1x PCR缓冲液(美国，CA，Carlsbad，Invitrogen)
3mM MgCl2(Invitrogen)
250μM dNTP(Promega)
1.0μM探针(仅LATE-PCR)
10x稀释SYBR Green染料(美国，Rockland ME，FMC Byproducts)
1.25单位铂Taq DNA聚合酶(Invitrogen)
人类血液淋巴细胞基因组DNA(相当于100个mtDNA基因组)
引物：对于LATE-PCR，50nM限制引物和1000nM过量引物。
寡核苷酸序列
探针：5′Cy5-TGCTAATGGTGGAG-磷酸盐3′(SEQ.ID第20号)
HV1-H
限制引物：5′GCCCGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTTG3′(SEQ.ID第21号)
过量引物：5′CACCAGTCTTGTAAACCGGAGATGAA3′(SEQ.ID第22号)
HV2-H
限制引物：5′GTATGGGAGTGGGAGGGGAAAATAATGTGTTAG 3′(SEQ.ID第23号)
过量引物：5′AGGTCTATCACCCTATTAACCACTCA3′(SEQ.ID第24号)
HV1-L
限制引物：5′CACCAGTCTTGTAAACCGGAGATGAAAACC 3′(SEQ.ID第25号)
过量引物：5′CGAGGAGAGTAGCACTCTT3′(SEQ.ID第26号)
HV2-L
限制引物：5′AGGTCTATCACCCTATTAACCACTCACGGG3′(SEQ.ID第27号)
过量引物：5′GGAGGGGAAAATAATGTGTTAGT 3′(SEQ.ID第28号)
循环定序反应混合物
体积：25μl
100fmole被定序的产物
5pmole定序引物(限制引物或过量引物)
1x DTC5 Quick Start Master Mix(美国，CA，Fullerton，Beckman Coulter，Inc.)[包括dNTP、ddNTP、缓冲液、MgCl2]。
双脱氧定序
定序反应混合物根据制造商的说明，使用CEQ 2000 Dye Termination循环定序试剂盒(Beckman Coulter)，在CEQ 2000XL DNA序列(美国，CA，Fullerton，Beckman Coulter，Inc.)中经受循环定序和毛细管电泳。
LATE-PCR扩增和定序制备
LATE-PCR扩增反应混合物经受热循环，如下：95℃持续3分钟；95℃持续15秒、64℃持续10秒和72℃持续45秒的15个循环；和95℃持续15秒、64℃持续10秒、72℃持续45秒和仅对于HV1-H 50℃持续20秒的50个循环。通过在72℃引物延伸步骤期间激发SYBR Green染料并读取其荧光来监视双链扩增子的合成。通过在仅对于HV1-H区的50℃低温检测步骤期间激发SYBR染料并从低Tm探针的Cy5荧光团读取荧光来监视限制引物耗尽之后单链产物的合成。
为了获得100fmole的过量引物的延伸产物，有必要稀释扩增产物。我们以以下方式估计25μl的反应产物中产物的量。首先，在初始扩增循环期间制得的双链产物中所述产物的量由限制引物的量来指示。在此实例中，所述量为50nM，其转换成50fmole/μ。通过将LATE-PCR扩增的线性生长期分成通过检查Cy5荧光曲线而确定的两个部分(第一部分中扩增在算术上进行，且第二部分中产物累积已减慢)，来估计在所述生长期期间(即，在限制引物耗尽之后)制得的单链延伸产物的浓度。对于第一部分来说(在此实例中，其为11个循环)，基于Gyllensten，U.B.H.和Erlich，A.(1988)，“Generation ofSingle-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and its Application to DirectSequencing of the HLA-DQA LOCUS”，美国国家科学院院报85：7652-7656，假定扩增效率为50％。将所述11个循环期间单链的产量计算为开始浓度(50fmole/μl)乘以循环的数目(11)乘以效率(0.5)。将进一步产量估计为反应的剩余部分期间Cy5信号的百分比增加量，其在此情况下为100％。因此，线性生长期期间的总产量为275fmole/μl(50×11×0.5×1.0)，且估计所述产物的总浓度(双链扩增子中包括50fmole/μl)为325fmole/μl。为了在循环定序反应混合物中获得100fmole，用水将扩增产物1∶13稀释且在25μl反应混合物中使用4μl经稀释的产物。
结果
存在四个可能的组合为：1)HV1-H与HV2-H，2)HV1-L与HV2-L，3)HV1-H与HV2-L，4)HV1-L与HV2-H。图18展示来自无模板控制(no-template control，NTC)的电泳的4％琼胶糖凝胶，左边三个路线；来自反应的扩增子以基因组DNA的100个拷贝开始，接下来的三个路线；且在最右边的路线中，展示100碱基对阶梯。图18展示在反应开始时，使用基因组DNA的100个拷贝，形成549和464碱基对的HV1-H和HV2-HdsDNA扩增子。无模板控制(NTC)不会扩增。
如所属领域的技术人员将了解，在同一反应中从单个模板扩增两个单链扩增子的过程中，可从DNA的同一链或从DNA的互补链产生两个过量引物链。我们已成功地使用两种途径。在HV1-H与HV2-H以及HV1-L与HV2-L的组合中，可从同一DNA模板链产生两个扩增子。在HV1-H与HV2-L以及HV1-L与HV2-H的组合中，从DNA的互补链产生两个扩增子。图19A显示碱基区域16209-16169中双HV1-H与HV2-H中的扩增子HV1-H的序列信息。图19B显示碱基区域289-326中双HV1-H与HV2-H中的扩增子HV2-H的序列信息。图19C显示碱基区域16209-16169中双HV1-H与HV2-L中的HV1-H扩增子的序列信息。图19D显示碱基区域289-326中双HV1-H与HV2-L中的HV2-L扩增子的序列信息。LATE-PCR产生对应于GenBank序列信息的序列。
实例12.确定ssDNA需求。
由LATE-PCR扩增产生的单链DNA和双链DNA的量可用于确定“稀释并去除”双脱氧定序所需要的ssDNA的量。利用ABI棱镜序列检测器7700(美国，CA，Foster城，Applied Biosystems)来执行PCR扩增，以扩增在人类线粒体DNA的d环区域内指定为HV1 H的549碱基扩增子。在裂解条件(如在Peirce等人(2002)生物技术32(5)；1106-1111中所述，其中100μl的裂解反应混合物中包括4μl DTT)下，从人类毛干中提取MtDNA。所有扩增均为LATE-PCR扩增，且产物直接经受双脱氧定序。
扩增反应混合物(最终浓度)
体积：25μl
1x PCR缓冲液(美国，CA，Carlsbad，Invitrogen)
3mM MgCl2(Invitrogen)
250μM dNTP(Promega)
1.0μM探针(仅LATE-PCR)
10x稀释SYBR Green染料(美国，Rockland ME，FMC Byproducts)
1.25单位铂Taq DNA聚合酶(Invitrogen)
1μl DNA裂解溶液(相当于～10个mtDNA基因组)
引物：对于LATE-PCR，50nM限制引物和1000nM过量引物。
寡核苷酸序列
HV1H：限制引物、过量引物和探针(如实例11中)。
循环定序反应混合物
如实例11中。
双脱氧定序
如实例11中。
LATE-PCR扩增和定序制备
如实例11中。CY5和SYBR Green两者的原始荧光数据用于确定可用于定序反应的产物的量。CY5/SYBR Green比率用于使原始数据中的所有波动规格化。
结果
图20，画面A和B中呈现来自LATE-PCR扩增的荧光数据。图20A(例如，线201)展示相对于扩增循环数目而描绘的所有毛干数据，作为比率ss-DNA/ds-DNA(探针信号与染料信号)。此分析方法使由于指数扩增何时开始或其处于平稳状态的等级而导致的变化最小化，且显示ss-DNA扩增的效率在所有样本中(除非常晚开始的一个样本之外)几乎相同。
图20B展示一种用于监视一组LATE-PCR化验以便建立其对稀释并去除定序的准备状态(readiness)的方法。曲线图展示在循环45(正方形)和循环65(菱形)时所有经扩增样本的计算出的比率ssDNA/dsDNA(探针信号与染料信号比染料信号)。仅具有0.06与0.10之间的比率和300与600之间的SYBR值的样本(在框中的那些样本)已准备好进行定序。图20B延伸了定量终点分析(QE LATE-PCR)的使用以显示在65个循环之后，除一个样本之外的所有样本均具有经累积的足够ss-DNA，以用于“稀释并去除”定序中。
实例13.具有多个SNP的扩增子。
LATE-PCR和“稀释并去除”定序方法的敏感性可将具有多个SNP的扩增子的混合物区分到10％分辨率等级。PCR扩增来自2mm人类毛干或附着到载玻片的单个人类拇指纹。所有扩增均为LATE-PCR扩增，且产物直接经受双脱氧定序。最终扩增反应混合物、寡核苷酸序列(HV1-H)、循环定序反应混合物，以及双脱氧定序，以及LATE-PCR扩增和定序制备均如实例11中。
使用先前所述的“稀释并去除”双脱氧协议对来自三个反应中的每一者的10∶90到90∶10的单链LATE-PCR产物的混合物进行定序。图21和图22中展示结果。
图21展示围绕人类血液淋巴细胞和人类拇指纹的50∶50混合物的碱基16320和16311的10碱基片段。峰值高度反映双脱氧序列中的实际100％高度，而不是50∶50混合物的预期相等高度。线211展示此序列处的G碱基的峰值，且线202展示序列中相同位置处的A碱基的峰值。在具有不同基因序列的人类血液淋巴细胞和人类毛干的50∶50混合物中，峰值212高于峰值211，因为双脱氧定序的荧光特性可通过同一区域的纯序列的分析来表示。
图22展示五个SNP位置中的每一者处的两个样本的反向百分比(90∶10、70∶30、50∶50、30∶70和10∶90)。样本1来自人类毛干，且样本2来自一来自另一个体的人类拇指纹。从双脱氧序列的印出(printout)测量每一位置处的每一峰值的高度，且接着基于100％样本1或100％样片2控制的同一碱基而按比例决定所述高度。在图22中，线222是相对于混合物中的样本2的期望百分比而描绘的混合物中的样本1的期望百分比。线221是配合至实际结果的线，即相对于样本2的期望百分比而描绘的混合物中的样本1的观察到的百分比。对于样本2的每一期望百分比来说观察到的百分比为5个点，一个点对应一个碱基。数据显示，在每一百分比处，不同碱基中存在非常少的扩散，但所述数据也显示，观察到的值的线221不会落在预测值的线(线222)之上，可能因为混合物中样本1和样本2的量不是完全相等。
实例14.混合物的区别。
为了将由100％杂合基因组DNA组成的样本与由90％杂合DNA和10％纯合基因组DNA组成的样本(单个核苷酸改变)区分开，我们首先创建由位于人类染色体17中的SNP位置rs858521(C/G等位基因)的90％杂合DNA加上同一SNP位置(C/C等位基因)的10％纯合DNA组成的DNA混合物。通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=SNP)可进入的NCBI dbSNP数据库中列出了SNP位置。通过将由Seattle华盛顿大学的Reid实验室提供的匹配浓度的相应杂合DNA与纯合DNA混合来制备此DNA混合物。基于从类似于下文所述的实时分析的对LATE-PCR样本的实时分析导出的SYBR荧光的Ct值而估计用于混合目的的每一基因组DNA的DNA浓度。一旦制备了DNA混合物，我们设置含有100％杂合DNA或90％杂合DNA+10％纯合DNA的重复的LATE-PCR反应。每一LATE-PCR样本均由以下物质组成：1X铂Taq缓冲液(CA，Carlsbad，Invitrogen)、3mM MgCl2、250μM dNTP混合物、0.24X SyberGold I(CA，Carlsbad，Invitrogen)、200nM的称为Elixir化合物9-3iDD的误引发防止试剂、1.25单位铂Taq聚合酶(CA，Carlsbad，Invitrogen)、1μM rs858521过量引物、50nM rs858521限制引物，和2.4μM的相对于rs858521 SNP G等位基因的resonsense探针，和最终体积为25μl的适当基因组DNA的1800基因组当量。rs858521过量引物的序列为5′CAATCCCTTGACCTGTTGTGGAGAGAA 3′(SEQ.ID第29号)。rs858521限制引物的序列为5′TCCCCAGAGCCCAGCCGGTGTCATTTTC 3′(SEQ.ID第30号)。相对于rs858521 SNP G等位基因的resonsense探针的序列为5′[Cy5]CTTCAGCTCAAACAATA[Phos](SEQ.ID第31号)。误引发防止试剂的序列为5′Dabcyl-CGCTATAATGAAATTATAGCG-Dabcyl(SEQ.ID第32号)。
这些样本通过使用由95℃持续3分钟的一个循环，之后是95℃持续10秒、66℃持续10秒和72℃持续20秒的45个循环组成的热循环曲线而在ABI 7700中经受扩增。在反应结束时，所述反应以1℃的间隔从95℃溶解到25℃，持续1分钟，在每一温度下在Cy5通道中获得荧光。将不进行基线校正的经剪辑的Cy5荧光信号输出到Excel计算机程序中。通过从溶解期间下一温度的荧光信号中减去来自一个温度的荧光信号来执行荧光信号的第一导数的计算。图23，画面A和B中展示结果。图23A展示荧光信号的第一导数与温度的曲线图，即溶解曲线。使用Excel的移动平均函数使图23A中的溶解曲线平滑，以消除由于ABI 7700中的热波动而导致的噪声。图23A揭示对应于探针在较高温度下结合到其匹配G等位基因目标且在较低温度下结合到错配C等位基因目标的溶解峰值。图23A展示：相对于100％杂合样本(圆圈232)中的C等位基因和G等位基因溶解峰值的高度，90％杂合+10％纯合样本(圆圈231)显示出较低的G等位基因峰值和较高的C等位基因溶解峰值。这些差异符合90％杂合+10％纯合样本(55％C等位基因∶45％G等位基因)中的C等位基因与100％杂合样本(50％G等位基因∶50％C等位基因)中的C等位基因相比的预期较高比例。C等位基因峰值的高度与G等位基因峰值的高度的比率展示为图23B中的条形图。右侧的条形组针对90％杂合+10％纯合样本，对应于圆圈231。左侧的较暗条形针对100％杂合样本。分别为条形组展示常规误差框233和234。此比率基于反映平均值的误差的三个标准偏差的误差框的重叠的缺乏，以99.7％的确定性将100％杂合样本与90％杂合+10％纯合样本区分开。
实例15.LATE-PCR反应对初始聚合酶浓度的敏感性。
利用ABI 7700执行PCR扩增，以扩增在人类线粒体DNA的d环区域内指定为HV1-H的549碱基扩增子。基因组人类DNA的反应混合物、寡核苷酸序列(HVI-H)和LATE-PCR扩增如实例11中所述，只是铂Taq DNA聚合酶的单位对于不同样本是不同的，如下：0.125、0.250、0.375、0.50、0.625和1.25单位。
执行溶解曲线分析(SYBR绿荧光与温度)。溶解曲线展示对于此LATE-PCR反应来说，Taq的浓度如何影响dsDNA产物的特异性。如重复物的溶解峰值中所反映，随着铂Taq浓度从1.25单位减小到0.375单位，反应的特异性增加。进一步将浓度降低到0.250单位，特异性减小。在0.0125单位处，反应不会发生。0.0375单位的Taq浓度时，发生最大特异性。
实例16.斜率随着实时LATE-PCR中和实时双LATE-PCR中的Taq浓度的变化而变化。
我们已为鼠Oct4和Xist基因的外显子内的序列(GenBank入藏登记号分别为NM013633和L04961)的同时扩增设计了双实时LATE-PCR化验。每一反应均以50μl的最终体积进行，且含有以下试剂：由20mM三HCl，pH8.4和50mM KCl组成的1X PCR缓冲液(CA，Carlsbad，Invitrogen)、3Mm MgCl2、0.4mM的每一dNTP、50nM具有序列5′TGGCTGGACACCTGGCTTCAGACT 3′(SEQ ID第33号)的Oct4限制引物、2μM具有序列5′CAACTTGGGGGACTAGGC 3′(SEQ ID第34号)的Oct4过量引物、100nM具有序列5′GGTCGTACAGGAAAAGATGGCGGCTCAA 3′(SEQ ID第35号)的Xist限制引物、2μM具有序列5′TGAAAGAAACCACTAGAGGGCA 3′(SEQ ID第36号)的Xist过量引物、1μμM的具有序列5′TET-CCG CCT GGG ATG GCA TAC TGT GGAAGG CGG-Dabcyl 3′(SEQ ID第37号)的低溶解点Oct4分子信标探针，和300nM的具有序列5′Dabcyl-CGTTATAATGAAATTATAACG-Dabcyl 3′(SEQ.ID第38号)的误引发防止试剂(称为化合物9-3bDD)。Antibody-complexed PlatinumTaq DNA聚合酶(CA，Carlsbad，Invitrogen)也以每化验1、2或3单位的浓度包括在PCR混合物中。在此实例中，不添加用于检测Xist扩增子的分子信标探针。
与这些双LATE-PCR同时，我们还进行一系列仅用于Oct4扩增子的LATE-PCR扩增的化验。这些化验与前述双LATE-PCR具有相同的成分，只是省略了Xist限制引物和Xist过量引物。
鼠基因组DNA(MO，St Louis，Sigma)添加到所有化验，且为PCR扩增提供模板。基于6pg/基因组尺寸(见Vendrely和Vendrely(1949)经验(Experientia)5：327-329)，将添加到每一管的基因组的数目计算为1000。
所有化验均以重复形式进行。以由95℃持续5分钟的1个循环；95℃持续10秒、63℃持续20秒和72℃持续30秒的6个循环；以及95℃持续15秒、55℃持续25秒、72℃持续35秒和45℃持续30秒的54个循环组成的热循环曲线，在ABI棱镜7700序列检测器(CA，Applied Biosystems)中执行扩增，其中在45℃下在TET通道中获得荧光。
图24中展示此实验的结果，图24描绘借助通过与TET-Oct4分子信标探针杂交而累积Oct4扩增子而产生的荧光信号。当仅存在一对引物时，使Taq聚合酶浓度从1单位/化验(圆圈241)增加到2单位/化验(圆圈242)或3单位/化验(圆圈243)具有使信号的斜率更陡峭的效应，这是由于扩增效率增加的缘故。由圆圈242和243(分别为2单位/化验和3单位/化验)识别的信号散布，表示在近似这些等级处已达到最大效率。如所预期，由双反应(圆圈244、245和246)产生的线的斜率在所有情况下均低于由单个扩增子的扩增产生的那些线的斜率，因为以所述速率两倍的速率使用Taq聚合酶。如在单扩增子LATE-PCR的情况下，双反应中，Taq浓度从1单位/化验(圆圈244)增加到2单位/化验(圆圈245)或3单位/化验(圆圈246)导致信号斜率增加。当与2单位/化验(圆圈245)的初始斜率相比时，3单位/化验(圆圈246)的初始斜率不进一步增加，从而再次表示已达到最大效率。然而，3单位/化验样本(圆圈246)快速达到平稳状态，且斜率开始下降，与2单位/化验样本(圆圈245)的斜率不同，从而指示在存在测试到的最高Taq浓度的情况下，可能发生误引发(对于也含有3Taq单位/化验但仅含有一对引物的样本243情况并非如此)。尽管当与双反应(3个单位用于产生一个扩增子而不是同时产生两个扩增子)相比时，单扩增子化验中可用的Taq的量更高，但由于添加了Xist引物的缘故，双反应中发生更多误引发。为了在无误引发的情况下获得最大效率，因此需要考虑到添加到反应中的引物的数目和序列而优化Taq聚合酶浓度。

Claims (24)

1.一种用于分析非对称核酸扩增过程的至少一个单链扩增产物的方法，所述非对称核酸扩增过程通过由DNA聚合酶延伸寡核苷酸引物而产生双链和单链扩增子两者且包括至少一个引物退火温度，所述方法包含
通过同质荧光检测来检测双链扩增子，
在低于所述至少一个引物退火温度的温度下，通过序列特定同质荧光检测来检测所述至少一个单链扩增产物，和
计算所述单链产物的荧光与所述双链扩增子的荧光的比率。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述核酸扩增过程开始时添加检测试剂。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中对所述双链扩增子的检测是借助荧光DNA染料进行的。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其中对所述至少一个单链产物的检测包括荧光团标记的杂交探针，所述杂交探针在所述低温检测步骤期间而不是在所述至少一个引物退火温度下结合到所述单链产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述用于所述至少一个单链扩增产物的杂交探针为具有等位基因辨别力的经淬火双链探针。
6.根据权利要求5所述的方法，其包含用于不同单链扩增产物的至少两个探针，所述至少两个探针以相同荧光团标记，但相对于它们的目标具有不同的溶解温度，其中所述低温检测步骤包括在仅一个探针结合到其目标的温度下及在其中至少两个探针结合到其各自目标的温度下检测来自所述荧光团的发射。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述延伸产生单链扩增子的引物以荧光团标记，所述荧光团由来自所述染料的荧光发射间接刺激，且其中对所述至少一个单链产物的检测包括刺激所述染料和检测由所述引物发射的荧光。
8.根据权利要求3所述的方法，其包含至少一个容许错配的杂交探针，所述至少一个容许错配的杂交探针结合到至少两个可能的单链扩增产物，以形成具有低于用于在所述扩增中对引物进行退火的温度的不同溶解温度的杂交物，且所述至少一个容许错配的杂交探针用荧光团来标记，所述荧光团由来自所述染料的荧光发射间接刺激，其中对单链产物的检测包括在由所述不同溶解温度确定的多个温度下进行的低温检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述容许错配的杂交探针是线性杂交探针，其在所述低温检测期间形成包含长度为1-4个核苷酸的双链区域的二级结构，其中由所述二级结构导致的荧光是在内部淬火。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述容许错配的杂交探针为分子信标探针。
11.根据权利要求8所述的方法，其包含多个以不同荧光标记的低温杂交探针，所述低温杂交探针的每一者相对于任一目标具有低于所述引物退火温度的溶解温度，且所述多个以不同荧光标记的低温杂交探针组合杂交到多个可能的目标序列，至少两个探针是在不同温度下杂交到多个可能目标且具有由来自所述染料的荧光发射激发的荧光团的容许错配的探针，其中对单链扩增子的检测包括：在低于所述引物退火温度的至少三个温度下，用激发所述染料而不是所述容许错配的探针的荧光团的光来刺激所述反应混合物；和检测来自所述探针的发射。
12.根据权利要求1-11中任一权利要求所述的方法，其中所述扩增过程为指数后线性PCR(LATE-PCR)扩增过程。
13.根据权利要求1-12中任一权利要求所述的方法，其中所述检测为所述扩增过程完成之后的终点检测。
14.一种用于执行根据权利要求1-13中任一权利要求所述的方法的试剂盒，其包含至少在所述方法中利用的所有引物和探针。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其进一步包括所有扩增试剂。
16.一种用于预选核酸目标序列的双链核酸杂交探针，其包含
a)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含第一序列，所述第一序列与所述目标序列完全互补，且相对于所述目标序列而具有30-55℃的计算出的溶解温度(Tm)；
b)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含第二序列，所述第二序列与所述第一序列互补，但比所述第一序列短多达10个核苷酸；
c)荧光团标记，所述荧光团标记附接到所述第一序列，所述荧光团标记可由来自荧光DNA染料的荧光发射激发，但不可以所述染料的最大吸收波长激发；和
d)非荧光淬火剂，所述非荧光淬火剂附接到所述第二序列。
17.一种寡核苷酸组，其包含用于扩增预选目标序列的一对LATE-PCR引物和权利要求16所述的探针。
18.一种低温、容许错配的单链寡核苷酸杂交探针，其相对于其完全互补物而具有不大于60℃，优选不大于50℃的第一计算出的溶解温度，所述探针包括茎-环发夹(stem-loop hairpin)，所述茎环发夹具有茎，所述茎的计算出的溶解温度比所述第一溶解温度低至少10℃，但不低于30℃，所述探针包括能够吸收由荧光DNA染料发射的荧光能量的荧光团，和对由于使所述探针暴露于所述染料且在所述探针不存在目标的情况下激发所述染料将产生的荧光进行淬火的构件。
19.一种低温线性寡核苷酸杂交探针
a)其在30-60℃的范围中的温度下容许错配；
b)其在30℃到50℃的温度范围中形成二级结构；及
c)其用以下物质来双重标记
(i)荧光团，所述荧光团可由来自至少一个荧光DNA染料的荧光发射激发，但不可以适合激发所述染料的波长激发；和
(ii)非荧光淬火剂，所述非荧光淬火剂经定位以便对与所述二级结构相关联的荧光而不是与探针-目标杂交物相关联的荧光进行大体淬火。
20.根据权利要求19所述的探针，其中所述二级结构是由互补终端核苷酸形成的茎，所述茎的Tm大于所述探针在不存在所述茎的情况下将形成的任一其它二级结构的Tm。
21.一种循序扩增-焦磷酸测序(Pyrosequencing)方法，其包含：
a)通过LATE-PCR扩增反应来扩增DNA基质，以制备单链DNA产物；
b)去除焦磷酸盐且当存在剩余dNTP时去除剩余dNTP；
c)如果有必要，添加寡核苷酸以阻塞过量引物
d)如果尚未如上文b)中那样去除焦磷酸盐和dNTP，那么在添加定序引物之前添加焦磷酸测序试剂；
e)添加定序引物；和
f)执行焦磷酸测序。
22.根据权利要求21所述的方法，其中步骤b)包含添加焦磷酸测序试剂，而步骤d)包含补充所述试剂。
23.根据权利要求21所述的方法，其中通过添加具有焦磷酸酶活性的酶来去除焦磷酸盐。
24.根据权利要求21所述的方法，其中通过添加具有dNTP酶活性的酶来去除dNTP。
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