CN108588177B - 具有碱基配对的寡聚体的扩增报告子 - Google Patents

具有碱基配对的寡聚体的扩增报告子 Download PDF

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Abstract

本申请提供了具有碱基配对的寡聚体的扩增报告子。包括方法、设备和组合物的系统，用于用扩增报告子进行扩增测定，所述扩增报告子包含能够在低于报告子的解链温度相互碱基配对的第一寡聚体和第二寡聚体。报告子可以具有可检测的光致发光，该光致发光受第一和第二寡聚体彼此的碱基配对影响，如被降低。靶标，诸如核酸靶标序列，可以在高于解链温度在至少一个体积，诸如多个分区，中被扩增，且报告子的光致发光可以在低于解链温度从至少一个体积中检测。靶标的性质，诸如靶标的浓度，可以基于检测到的光致发光来确定。

Description

具有碱基配对的寡聚体的扩增报告子
本申请是申请日为2014年8月12日，申请号为201480035444.7，发明名称为“具有碱基配对的寡聚体的扩增报告子”的申请的分案申请。
在先申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年8月12日提交的美国临时专利申请系列号61/864,788的优先权，该美国临时专利申请为了所有目的通过引用整体并入本文。
其他材料的交叉引用
本申请为了所有目的通过引用整体并入以下材料：美国专利号7,041,481，2006年5月9日授权；美国专利申请公开号2010/0173394A1，公开于2010年7月8日；美国专利申请公开号2011/0217712A1，公开于2011年9月8日；美国专利申请公开号2012/0152369A1，公开于2012年6月21日；美国专利申请公开号2012/0194805A1，公开于2012年8月2日；美国专利申请系列号14/171,754，提交于2014年2月3日；和Joseph R.Lakowicz，PRINCIPLES OFFLUORESCEENCE SPECTROSCOPY(第二版，1999)。
技术领域
本申请涉及但不限于具有碱基配对的寡聚体的扩增报告子。
介绍
数字测定通常依赖于检测样品中单个拷贝的分析物的存在或活性的能力。在一个示例性数字测定中，将样品分成一组一般具有相等体积的分区，每个平均含有少于约一个拷贝的分析物。如果分析物的拷贝在分区中随机分布，一些分区应不含有拷贝，其他仅含一个拷贝，并且如果分区的数目足够大，还有其他分区应含有两个拷贝、三个拷贝和甚至更高数目的拷贝。基于在分区中分析物的给定平均浓度，在分区中准确发现0、1、2、3或更多个拷贝的可能性，可以通过泊松分布描述。反之，在分区中(及由此在样品中)的分析物的浓度可以从在分区中发现给定数目的拷贝的可能性来估计。
没有发现拷贝和发现一个或更多个拷贝的可能性的估计可以在数字测定中测量。能够测试每个分区以确定分区是含有至少一个拷贝的分析物的阳性分区，还是不含有分析物拷贝的阴性分区。在分区中没有发现拷贝的可能性可以通过测试的阴性的分区比例(“阴性比例”)来估计，且发现至少一个拷贝的可能性通过测试的阳性的分区比例(“阳性比例”)估计。阳性比例或，同等地，阴性比例随后可以被用于通过泊松统计确定在分区中分析物的浓度。
数字测定常常依赖于分区中的核酸靶标的扩增以能够检测单个拷贝的分析物。靶标的扩增可以经由聚合酶链式反应(PCR)进行，以实现数字PCR测定。靶标的扩增可以从被包含在反应中的探针光学地检测。该探针可以包括缀合到荧光团和猝灭剂的寡核苷酸。寡核苷酸可以在靶标被扩增时被切割，以将荧光团与猝灭剂分离。作为结果，在靶标扩增不存在时(阴性分区)，来自荧光团的光发射可以比在靶标扩增存在时(阳性分区)更有效地被猝灭剂猝灭。然而，阴性分区和阳性分区之间荧光的不同可能随测定配置(configuration)而变化，这常减弱可靠地区分两种类型的分区的能力。
需要简单且经济有效的方法以最小化在基于探针的扩增测定诸如在数字PCR测定中的噪音。
概述
本公开内容提供了一种包括方法、设备和组合物的系统，用于使用扩增报告子进行扩增测定，该扩增报告子包含能够在低于报告子的解链温度彼此碱基配对的第一寡聚体和第二寡聚体。报告子可以具有可检测的光致发光，该光致发光受第一寡聚体和第二寡聚体彼此的碱基配对影响，如被降低。可以在高于解链温度在至少一个体积内诸如多个分区内扩增靶标诸如核酸靶序列，并且可以在低于解链温度从至少一个体积内检测报告子的光致发光。靶标的性质，诸如靶标的浓度，可以基于检测到的光致发光确定。
本申请提供了以下内容：
项目1.一种分析的方法，所述方法包括：
形成包含报告子的至少一个体积，所述报告子包含第一寡聚体和第二寡聚体，所述第一寡聚体和第二寡聚体能够在低于所述报告子的解链温度彼此碱基配对以影响从所述报告子可检测的光致发光；
在所述至少一个体积中扩增靶标，所述扩增至少部分通过在高于所述报告子的所述解链温度的温度延伸一种或更多种引物进行；
在所述至少一个体积在低于所述报告子的所述解链温度的温度时，检测来自所述至少一个体积的所述报告子的所述光致发光；及
基于检测到的光致发光确定所述靶标的性质。
项目2.根据项目1所述的方法，其中扩增步骤使用所述第一寡聚体作为引物。
项目3.根据项目2所述的方法，其中所述第一寡聚体包含光致发光团，所述光致发光从所述光致发光团检测。
项目4.根据项目3所述的方法，其中所述第一寡聚体与所述靶标完全互补。
项目5.根据项目2所述的方法，其中所述第二寡聚体包含光致发光团，所述光致发光从所述光致发光团检测，且其中所述第一寡聚体包含所述光致发光团的能量传递伴侣。
项目6.根据项目5所述的方法，其中所述能量传递伴侣是猝灭剂。
项目7.根据项目2所述的方法，所述第一寡聚体具有比所述第二寡聚体更长的碱基包含单元的链。
项目8.根据项目2所述的方法，其中所述第一寡聚体与靶标形成杂合体，所述杂合体具有比所述报告子的所述解链温度更高的解链温度。
项目9.根据项目8所述的方法，其中所述更高的解链温度比所述报告子的所述解链温度高至少10度。
项目10.根据项目1所述的方法，其中所述第一寡聚体包含光致发光团，所述光致发光从所述光致发光团检测，并且还包含所述光致发光团的能量传递伴侣，且其中所述第二寡聚体不包含所述光致发光团的能量传递伴侣。
项目11.根据项目1所述的方法，其中当所述第一寡聚体和所述第二寡聚体彼此碱基配对时，所述报告子的光致发光降低。
项目12.根据项目1所述的方法，其中所述第一寡聚体包含光致发光团，所述光致发光从所述光致发光团检测，且其中将所述光致发光团的能量传递伴侣包含在所述第二寡聚体中。
项目13.根据项目12所述的方法，其中所述能量传递伴侣是猝灭剂。
项目14.根据项目12所述的方法，其中所述光致发光团的能量传递伴侣还包含在所述第一寡聚体中。
项目15.根据项目1所述的方法，其中所述性质是所述靶标的水平。
项目16.根据项目1所述的方法，其中扩增的步骤引起所述第一寡聚体、所述第二寡聚体或所述第一寡聚体和所述第二寡聚体两者的切割，且其中所述切割影响所述检测到的光致发光。
项目17.根据项目1所述的方法，其中形成至少一个体积的步骤包括形成包含部分占据的靶标的多个分区的步骤。
项目18.根据项目17所述的方法，其中扩增的步骤包括暴露所述多个分区于多个热循环的步骤，且其中在整个多个热循环中将所述分区持续地保持在高于所述报告子的所述解链温度。
项目19.根据项目1所述的方法，其中所述第一寡聚体具有(a)专用于与所述靶标碱基配对的区域，如此以使所述第一寡聚体发挥引物功能，所述引物被包含在所述一种或更多种引物中，及(b)专用于与所述第二寡聚体且非所述靶标碱基配对的另一个区域。
项目20.根据项目1所述的方法，其中所述第一寡聚体包含碱基包含单元的链，且其中光致发光团被附连到所述链的5’端。
项目21.根据项目1所述的方法，其中所述第一寡聚体包含光致发光团，所述光致发光从所述光致发光团检测，且其中所述第二寡聚体与所述靶标完全互补。
项目22.根据项目1所述的方法，其中所述报告子的所述解链温度低于约45摄氏度。
项目23.根据项目1所述的方法，其中所述第一寡聚体包含光致发光团，其中所述第二寡聚体包含碱基包含单元的链，且其中所述第二寡聚体包含所述光致发光团的能量传递伴侣。
项目24.根据项目23所述的方法，其中所述能量传递伴侣附连到所述链的3’端。
项目25.根据项目23所述的方法，其中所述能量传递伴侣附连到所述链的非末端单元。
项目26.根据项目23所述的方法，其中所述能量传递伴侣附连到所述链的5’端。
项目27.根据项目1所述的方法，其中当所述第一寡聚体和所述第二寡聚体彼此碱基配对时，所述第二寡聚体具有与所述第一寡聚体的一个或更多个错配。
项目28.根据项目1所述的方法，其中所述第一寡聚体和所述第二寡聚体的每个与所述靶标至少部分互补。
项目29.根据项目28所述的方法，其中所述第二寡聚体具有与所述靶标的一个或更多个错配。
项目30.根据项目1所述的方法，其中当所述寡聚体彼此碱基配对时，所述第一寡聚体的3’端与所述第二寡聚体的5’端对齐。
项目31.根据项目1所述的方法，其中当所述寡聚体彼此碱基配对时，所述第一寡聚体的5’端与所述第二寡聚体的3’端对齐。
项目32.根据项目1所述的方法，其中当所述寡聚体彼此碱基配对时，所述第一寡聚体的3’端与所述第二寡聚体的内部碱基包含单元对齐。
项目33.根据项目1所述的方法，其中当所述寡聚体彼此碱基配对时，所述第一寡聚体的5’端与所述第二寡聚体的内部碱基包含单元对齐。
项目34.根据项目1所述的方法，其中当所述寡聚体彼此碱基配对时，所述第二寡聚体的3’端与所述第一寡聚体的内部碱基包含单元对齐。
项目35.根据项目1所述的方法，其中当所述寡聚体彼此碱基配对时，所述第二寡聚体的5’端与所述第一寡聚体的内部碱基包含单元对齐。
项目36.一种分析的方法，所述方法包括：
形成分区，所述分区每个包含报告子，所述报告子包含第一寡聚体且还包含第二寡聚体，所述第一寡聚体具有光致发光团，所述第二寡聚体能够与所述第一寡聚体在低于所述报告子的解链温度碱基配对，以通过能量传递减少从所述光致发光团可检测的光致发光；
暴露所述分区到多个热循环，以扩增靶标序列，所述扩增至少部分通过在高于所述报告子的所述解链温度的温度延伸一种或更多种引物进行，其中所述靶标序列仅存在于所述分区的子集中；
在所述分区在低于所述报告子的所述解链温度的温度时，检测多个所述分区的每个分区的所述光致发光团的所述光致发光；及
基于检测到的所述光致发光确定所述靶标的性质。
项目37.根据项目36所述的方法，其中在整个所述多个热循环中将所述分区持续地保持在高于所述报告子的所述解链温度。
项目38.根据项目36所述的方法，其中所述第一寡聚体是包含在所述一种或更多种引物中的引物。
项目39.根据项目38所述的方法，其中所述光致发光团包含在所述第一寡聚体中。
项目40.根据项目39所述的方法，其中所述光致发光团的猝灭剂被包含在所述第二寡聚体中。
项目41.根据项目39所述的方法，其中所述光致发光团的猝灭剂包含在所述第一寡聚体中。
项目42.一种组合物，包含：
多个分区，所述分区包含部分占据的靶标和扩增所述靶标的扩增试剂且还包含检测靶标扩增的报告子，所述报告子包含第一寡聚体和第二寡聚体，所述第一寡聚体具有光致发光团，所述第二寡聚体与所述第一寡聚体碱基配对以影响从所述光致发光团可检测的光致发光。
附图概述
图1是根据本公开内容的方面的示例性报告子的示意图，该报告子包含碱基配对的寡聚体(“探针”和“接纳体(sink)”)，他们共同提供光致发光团和光致发光团的能量传递伴侣，诸如猝灭剂。
图2是根据本公开内容的方面，比较由在碱基配对形式时的图1的报告子、从接纳体分离的图1的报告子的探针、和由靶标扩增产生的降解(切割)形式的探针产生的荧光水平示意图。
图3是说明根据本公开内容的方面，用图1的报告子进行的示例性测定的选择的步骤和构造的流程示意图。
图4是根据本公开内容的方面，用包含碱基配对的寡聚体的报告子进行的示例性测定的流程示意图。
图5是根据本公开内容的方面，用于进行图4的测定的示例性系统的示意图。
图6是根据本公开内容的方面，比较来自以下的荧光的水平的示意图：(a)包含与探针碱基配对的接纳体的示例性报告子，所述探针被配置成被标记光致发光团的引物，和(b)通过引物延伸并入扩增子的探针，所述扩增子将接纳体排除在与探针碱基配对相互作用之外。
图7是图示根据本公开内容的方面，用图6的报告子进行示例性测定的选择的步骤和构造的流程示意图。
图7A是显示根据本公开内容的方面，图6和7的测定的阶段的示例性热曲线，以及在每个阶段的至少一部分期间报告子的示例性状态的图。
图8是根据本公开内容的方面，比较由以下产生的荧光的水平的示意图：(a)又另一个示例性报告子，其包含彼此碱基配对的探针和接纳体，和(b)报告子的因靶标扩增而被降解的探针。
图9是根据本公开内容的方面，比较来自以下的荧光的水平的示意图：(a)图6的较高解链温度形式的报告子，和(b)聚合酶延伸形式的来自报告子的探针，所述探针形成扩增子的一部分且报告子的接纳体因靶标扩增而被切割。
图9A是根据本公开内容的方面的示例性报告子的示意图，所述示例性报告子包含具有猝灭剂且与探针碱基配对的接纳体，所述接纳体被配置成作为用于扩增的聚合酶可延伸引物发挥作用。
图10是根据本公开内容的方面的示例性报告子的示意图，所述示例性报告子包含与探针碱基配对的接纳体，所述探针被布置为因与接纳体结合而分子内猝灭光致发光团。
图11是根据本公开内容的方面的示例性报告子的示意图，所述示例性报告子包含与探针结合的接纳体，所述探针被布置为因与接纳体结合而分子间猝灭光致发光团。
图12是根据本公开内容的方面的示例性报告子的示意图，所述报告子包含与探针结合的接纳体，所述探针的光致发光团和所述接纳体的猝灭剂各自被置于探针或接纳体的相对的末端中间。
图13是图示根据本公开内容的方面，使用至少两种不同的探针测定靶标区域的策略的流程示意图，所述探针的至少一种是在室温下被接纳体结合的引物，且所述探针的另一种是分子内自猝灭的。
图14是图示根据本公开内容的方面，使用至少两种不同的探针测定靶标区域的另一个策略的另一个流程示意图，所述探针的每个是在室温下被不同的接纳体结合的引物。
图14A是图示根据本公开内容的方面，使用至少两种不同的探针测定靶标区域的又另一个策略的又另一个流程示意图，所述探针的每个是在室温下被不同的接纳体结合的正向引物或反向引物。
图15是图示根据本公开内容的方面，在用标记光致发光团的引物作为探针所进行的扩增测定中，相对于期望的扩增子，选择性地猝灭从引物二聚体发射的光的策略的流程示意图。
图16是对于多种靶标且具有不同水平的测定多重化，在微滴中进行的一系列测定所测量的荧光幅度的图，并且该图显示了阴性微滴的基础荧光的变化，以及在阴性微滴和阳性微滴之间荧光幅度的差异。
图17是对于多种测定组合、不同水平的测定多重化、和/或从测定去除不同的引物对，在微滴中进行的一系列测定所测量的荧光幅度的图，并且该图显示了阴性微滴的基础荧光的变化。
图18是根据本公开内容的方面，理想的单重测定中的探针与不理想的单重或多重测定中的探针的示意视图，其示出了在两种测定中探针的光致发光团和猝灭剂之间的平均间隔的可能的变化。
图19是根据本公开内容的方面，在接纳体的存在和不存在下在分别具有五种探针或一种探针的微滴中进行的一系列测定所测量的荧光幅度的图，所述接纳体被设计为使一种探针的拷贝位于彼此邻近处，以使得一个探针拷贝的光致发光团被另一个探针拷贝的猝灭剂猝灭。
图20是图示根据本公开内容的方面，用于测定分区(例如，微滴)中的重叠的靶标序列的一对不同的策略的流程示意图，左侧的策略利用充当引物且在室温下被接纳体结合的探针，且右侧的策略利用位于一对引物中间的自猝灭的探针。
图21是根据本公开内容的方面，从微滴收集的荧光数据以及比较在用于对微滴热循环的不同退火温度下图19的两种策略的图。
图22是根据本公开内容的方面，对于每种测定策略的每个微滴组，从图21的数据确定的靶标浓度的图。
图23是根据本公开内容的方面，在微滴中进行K-Ras靶标的野生型和突变型等位基因的多重测定的策略的示意图，其中探针、扩增引物和接纳体与野生型(WT)和突变型(MUT)模板中的它们的预期结合位点对齐。
图24是根据本公开内容的方面，从根据图23的策略在微滴中进行的K-Ras靶标的多重测定收集的荧光数据的一系列散点图，在所述微滴中存在不同的量的接纳体。
图25是根据本公开内容的方面，用于在微滴中进行K-Ras基因的野生型和突变型等位基因的多重测定的另一个策略的示意图，其中探针、扩增引物和接纳体与野生型(WT)和突变型(MUT)模板中的它们各自的结合位点对齐。
图26是根据本公开内容的方面，由根据图25的策略在微滴中进行的K-Ras靶标的多重测定收集的荧光数据的一系列散点图，在所述微滴中存在两种不同的量的接纳体。
图27是根据本公开内容的方面，用于进行靶标序列的双重的、等位基因特异的测定的策略的示意图。
图28是各自包含碱基配对的寡聚体(“探针”和“引物”)的一对示例性报告子的示意图，所述碱基配对的寡聚体共同地提供光致发光团和光致发光团的能量传递伴侣，诸如猝灭剂。
图29是根据本公开内容的方面，在图28的报告子的存在下通过靶标的扩增所产生的示例性构造的示意图。
图30A-30B是从使用两种报告子的多重测定收集的荧光数据的一对散点图，所述两种报告子诸如图28的报告子，一种报告子具有用FAM荧光团标记的探针，并且另一种报告子具有用HEX报告子标记的探针。图30A显示了来自包含靶标DNA的“阳性”样品的结果。图30B显示了来自“阴性”样品或无靶标样品的结果。
图31是荧光数据的散点图，通过允许来自阳性微滴的信号(空白簇)占据环绕阴性样品的信号360度的空间示出图28的报告子可如何被用于设计多重测定。
详细描述
本公开内容提供了一种包括方法、设备和组合物的系统，用于使用扩增报告子进行扩增测定，所述扩增报告子包含能在低于报告子的解链温度彼此碱基配对的第一寡聚体和第二寡聚体。报告子可以具有可检测的光致发光，该光致发光受第一和第二寡聚体彼此的碱基配对影响，诸如被降低。可以在高于解链温度在至少一个体积诸如多个分区内扩增靶标诸如核酸靶序列，并且可以在低于解链温度从所述至少一个体积检测报告子的光致发光。靶标的性质，诸如靶标的浓度，可以基于检测到的光致发光来确定。
本公开内容使能够降低不包含感兴趣的产物的分区(阴性分区)的光致发光背景，以增加阴性和阳性分区在信号的量级上的差异。可以将包含碱基配对寡聚体对的报告子包含在分区内。该报告子可以包含形成邻近依赖的能量传递对(proximity-dependentenergy transfer pair)的能量供体和能量受体。可以使该能量供体包含在寡聚体的一个中，且使能量受体包含在另一个中，或可使两者包含在同一个寡聚体中。寡聚体的一个，第一(或第二)寡聚体，可以是发射待检测的光的“探针”。寡聚体的另一个，第二(或第一)寡聚体，可以被描述为“接纳体”。当探针和接纳体彼此碱基配对时，相对于当探针不与接纳体碱基配对时，该接纳体影响(例如，除其他之外，减少、增加和/或光谱移动)从探针/报告子可检测的光致发光。例如，探针可以包含充当能量供体的光致发光团，且接纳体可以包含充当光致发光团的能量受体的猝灭剂，以减少在分区中的探针的基础光致发光。
接纳体可以包含至少部分地或完全地与探针互补的寡核苷酸，允许所述接纳体与所述探针结合。例如，寡核苷酸可以与探针结合以促进光致发光团被猝灭剂分子内和/或分子间猝灭。在一些实例中，探针可以或可以不包含猝灭剂，且接纳体可以包含这样的猝灭剂：当接纳体结合探针时减少光致发光团的光致发光发射。在任何事件中，在一些情况下，探针和/或接纳体的猝灭剂可通过接触猝灭(可互换地称为静态猝灭)来猝灭探针的光致发光团。
在一些实施方案中，接纳体可基于测定的热曲线被配置为仅在测定的一部分期间结合探针。接纳体可在较低的检测温度下结合完整形式的探针，但在一个或更多个较高的扩增温度下基本上不结合完整形式的探针。所述检测温度(也被称为读取温度)可以低于，除其他之外，约50、45、40、35或30摄氏度，或不高于约室温(约20-25摄氏度)。接纳体可在一个或更多个(或每个)扩增温度(例如，退火温度和/或延伸温度)下基本上不与探针结合和/或可在用于扩增/热循环的最小温度下基本不与探针结合。因此，接纳体可在检测期间增加光致发光团的猝灭，而基本上不干扰扩增，从而降低检测到的阴性分区的光致发光幅度。接纳体能够被容易地设计并能够被方便地添加到测定混合物中。在其他的实例中，所述接纳体可被配置为在每个扩增循环期间和/或之后与探针结合，以允许在至少一个液体体积中动态分析(例如，实时测定)扩增。
本公开内容可提供一种通过在读取温度下检测光来区分成功的PCR反应和不成功的PCR反应的方法。可以在热循环之前将探针和互补的寡聚体(接纳体)与扩增试剂混合。接纳体可在读取温度下影响探针的光致发光，但无论扩增是否发生，在热循环期间可不影响探针的光致发光。接纳体可以具有在低于标准热循环条件、但大于读取温度的与探针碱基配对的解链温度。探针和接纳体可以在读取温度下相互作用以在扩增不存在下提供猝灭。在扩增存在下，由于与扩增子竞争结合探针，而并非由于在扩增期间接纳体与探针的错配，接纳体可与探针较少相互作用。
本公开内容的另外的方面呈现为以下部分：(I)包含碱基配对寡聚体的报告子的概述、(II)测定、(III)组合物，和(IV)实施例。
I.包含碱基配对寡聚体的报告子的概述
该部分提供了包含碱基配对寡聚体的报告子的概述，并例证了在扩增测定中使用示例性报告子以降低背景信号；参见图1-3。
图1示出了示例性报告子50，其具有通过探针52与接纳体54经由一系列碱基对56结合而形成的碱基配对构造。该碱基对意图是示意性的，并且可以不(或可以)代表在本公开内容的此处或其它处形成的碱基对的实际数目。报告子可被可互换地描述为报告系统，并且可具有在图1中显示的碱基配对形式和至少一种分开的形式。分开的形式可以通过使碱基配对形式解链(也被称为变性)来产生。其他的分开的形式可以通过修饰探针和/或接纳体，诸如通过延伸或降解来至少部分地产生。
探针和接纳体各自可以是不同的寡聚体。寡聚体可以具有由缀合的各自包含碱基(例如，核碱基)的单元的链(例如，寡核苷酸)形成的主体，所述单元诸如核苷酸或核苷酸类似物。每个寡聚体的主体可以被附连至如下所描述的能量传递对的至少一个能量供体和/或至少一个能量受体。
探针52可以包含由寡核苷酸58(或寡核苷酸类似物)形成的主体、至少一个能量供体诸如光致发光团60、和可选地至少一个能量受体诸如猝灭剂(例如，猝灭剂62a)。(在一些实例中，可以将猝灭剂从探针省略(例如，参见部分IV)。)光致发光团和猝灭剂各自可沿着寡核苷酸在任何合适的位置与寡核苷酸58连接(例如，缀合，被可互换地称为共价连接)，诸如在寡核苷酸各自的彼此相反的末端。例如，在描述的实施方案中，光致发光团60被附连到寡核苷酸58的5’端，且猝灭剂62a被附连到寡核苷酸58的3’端。在其他的情况中，至少一个猝灭剂可被内部放置在寡核苷酸的5’端和3’端之间(例如，如在来自Integrated DNATechnologies的ZENTM探针形式中)。
探针52可以或可以不充当用于靶标扩增的引物。如果该探针充当引物，则可以将该探针配置成在扩增期间通过聚合酶(和/或连接酶)的作用被延伸，且可以限定由靶标扩增得到的扩增子的末端之一。例如，探针可以是用于靶标扩增的引物对的正向引物或反向引物。(除非另行说明，用于引物的术语“正向”和“反向”是任意的、可互换的设计物。)如果不意图使探针充当引物，则探针可以被修饰以阻断其延伸和/或可以在或接近其3’端处具有与模板的一个或更多个错配，以阻止被聚合酶(或连接酶)延伸。相应地，探针可以与靶标/扩增子的末端结合，或可以在用于靶标扩增的正向引物和反向引物的结合位点中间的位置处结合。
光致发光团60可以是能够对用激发光照射响应而发射光(光致发光)的任何部分。光致发光的示例性形式包括，除其他之外，荧光和磷光。因此，光致发光团可以是例如荧光团或磷光团。合适的光致发光团可以包括染料，诸如FAM、VIC、HEX、ROX、TAMRA或JOE染料等。在一些实例中，光致发光团可以被能够化学发光或任何其它形式的发光的发光团代替。
接纳体54可以包括由接纳体寡核苷酸64(或寡核苷酸类似物)形成的主体，所述接纳体寡核苷酸64至少基本上与探针寡核苷酸58互补并与探针52特异性地结合，这至少部分经由碱基对56进行。所述接纳体可以(或可以不)包括彼此形成能量传递对的至少一个能量供体和/或至少一个能量受体。例如，所述接纳体可以包括沿着寡核苷酸在任何合适的位置处与接纳体寡核苷酸64连接(例如，缀合)的至少一个猝灭剂(例如，猝灭剂62b)。接纳体54的每个供体/受体可以在寡核苷酸64的3’端(如所示的)、在5’端、或在3端’和5’端中间被连接。在报告子50中，猝灭剂62b可以位于非常靠近光致发光团60处，诸如以允许接触猝灭。例如，可以将猝灭剂62b和光致发光团60缀合到各自的核苷酸，所述核苷酸彼此碱基配对(即，所述核苷酸彼此对齐)，或沿着碱基配对的报告子偏移不多于两个核苷酸或不多于一个核苷酸。
寡核苷酸58和64的每个可以具有任何合适的性质。寡核苷酸可以具有任何合适的长度，诸如，除其他之外，至少6、8、10、15或20个核苷酸，和/或少于约200、100或50个核苷酸。寡核苷酸可以是常规寡核苷酸或其类似物或衍生物。示例性类似物/衍生物包括肽核酸、锁核酸、硫代磷酸等。寡核苷酸58和64可具有相同长度或不同长度。如果寡核苷酸具有不同长度，寡核苷酸64可以比寡核苷酸58短(或长)。在一些情况中，接纳体寡核苷酸64比探针寡核苷酸58短的报告子可以是优选的，因为探针随后可以被设计为在用于扩增的退火/延伸温度下与靶标/扩增子结合，而不是接纳体。同样或可选地，可以将探针配置成以比与接纳体结合高的解链温度与模板/扩增子结合。可以将寡核苷酸配置成彼此形成任何合适数目的碱基对，诸如，除其他之外，至少5、10或15个。在测定中，由寡核苷酸彼此碱基配对得到的碱基配对形式的报告子可具有低于用于扩增的平均、最大或最小温度的解链温度(例如，低于用于热循环的退火/延伸温度)，诸如，除其他之外，低于约70、60或50度。在一些情况中，探针可以在用于扩增的温度下是未被猝灭的，以使得如果在扩增温度下从分区检测到光致发光，则所有分区表现出扩增阳性。可以将寡核苷酸64(和接纳体54)构造成在扩增期间不可由聚合酶延伸(或可由其延伸)和不可由聚合酶切割(或可由其切割)。例如，3’磷酸化或另一种修饰能被用于阻止探针(和/或接纳体)免于在扩增期间被聚合酶(或连接酶)延伸。
猝灭剂62a和62b，可互换地被称为猝灭剂部分，可以具有任何合适的性质。每个猝灭剂可被构造成降低光致发光团60在被激发时(例如，在被合适的激发光照射时)发射光的能力。如果在报告子、探针和/或接纳体中存在多于一个猝灭剂，则猝灭剂可以是彼此的拷贝或可以是结构上不同的。猝灭剂可以是能够猝灭来自光致发光团的光的发射而自身基本上不发射光的非光致发光物或“暗猝灭剂”，或可以是作为从光致发光团能量传递(例如，荧光共振能量传递)的结果而发射光的光致发光猝灭剂。可能合适的示例性猝灭剂包括Black
Figure BDA0001638874480000153
猝灭剂(BHQ)、Iowa
Figure BDA0001638874480000152
暗猝灭剂(IB)、TAMRA染料和/或类似物。
图2显示了比较在测定中可由碱基配对形式的报告子50、与接纳体54分开的探针52、和探针52的切割形式70(可互换的称为降解的或切割的探针/报告子)产生的荧光的水平的示意图。切割探针70可以例如通过靶标的扩增，经过聚合酶(例如，Taq DNA聚合酶)催化的探针切割形成。示意图中的最低的荧光水平由报告子50产生，因为光致发光团60被探针的猝灭剂62a和/或接纳体54的猝灭剂62b猝灭。如果将接纳体54从测定中略去，则来自完整探针52的荧光水平高于接纳体存在时。因此，背景荧光水平较高。最高的荧光水平由降解的探针70产生，因为光致发光团60不再与探针猝灭剂62a(和/或接近的接纳体猝灭剂62b)连接。更特别地，因为探针寡核苷酸58被降解，光致发光团60和猝灭剂62a不再彼此共价地连接，且接纳体54(如果在测定中存在)不能稳定地与降解的探针结合。
图3显示了在具有报告子50(即，探针52和接纳体54)的分区中进行的示例性测定的选择的步骤和构造的示意性流程图。在此示出的构造可以在包含模板80的至少一个拷贝的分区中产生，所述模板80包含靶标82。模板可以是双链的，如所示的具有链84和86，或者是单链的。在图3的顶部示出了正向引物88(“F”)、反向引物90(“R”)和探针52，与各自能够结合(在模板/靶标变性后)的模板80/靶标82的相应区域对齐。探针52的第二、未结合的拷贝被显示为虚线，因为接纳体54可以相对于探针摩尔过量，由在91处的未结合的接纳体拷贝指示，以使得在扩增开始前在室温下基本上所有的探针与接纳体结合。
靶标扩增的第一个循环可以通过加热模板80到高于其变性温度来启动。然后可以在允许正向引物和探针52以及反向引物与模板的单链86和84特异性地结合的较低的温度下进行退火。如果在高于报告子的解链温度进行扩增，则报告子50的探针52和接纳体54可以贯穿扩增保持彼此分开(即，未碱基配对)。因此，接纳体54可以不与探针52结合直到扩增已经完成之后。
在第一个循环期间正向引物和反向引物的每个随后可以被延伸以产生与模板80的链86和84分别结合的引物延伸产物92、94。在正向引物的延伸期间，聚合酶遭遇与链86结合的探针52，并催化探针寡核苷酸58的切割，以形成降解的探针70。
可以进行另外的扩增循环以产生扩增子96(可互换地称为扩增的靶标)，直到达到扩增的终点。如果例如进行巢式扩增，则扩增子96的每个拷贝可以具有由引物88和90或其它引物限定的边界。在任何事件中，在扩增期间降解的探针70积聚，而完整的探针52被消耗。因此，在扩增之前如果在分区中存在至少一个拷贝的模板80/靶标82，则自光致发光团可检测(和/或取决于其)的光致发光的幅度(可互换地称为量级或水平)较高。在阴性分区和阳性分区之间的光致发光幅度的差异被增加，因为如果探针未被降解，则在检测期间接纳体54与探针52结合。
II.测定
该部分描述了可用接纳体进行的示例性扩增测定和用于用接纳体进行数字测定的示例性系统；参见图4和5。
图4示出了进行测定或分析的示例性方法110的流程图。对于方法110所展示的步骤可以以任何合适的顺序和以任何合适的组合来进行。此外，所述步骤可以与本公开内容的任何其他合适的步骤、方面和/或特征组合和/或通过其改变。
体积形成。可制备至少一个体积用于靶标的测定，在112中指示。所述至少一个体积可以包含与靶标对应的模板、探针和接纳体。所述体积还可以包含用于靶标扩增的试剂，诸如一种或更多种引物、扩增酶(例如，聚合酶或连接酶)、dNTP/NTP等。在以下部分III中描述了组成所述至少一个体积的反应混合物的成分的另外的方面。
反应混合物的制备可以包括或被描述为样品的制备。样品的制备可以包括样品的任何合适的操作，诸如，除其他之外，收集、稀释、浓缩、纯化、冻干、冷冻、提取、与一种或更多种测定试剂组合、进行至少一个初步反应以制备用于测定中的一个或更多个反应的样品、或其任何组合。样品的制备可以包括使样品适合于随后进行一个或更多个反应，诸如一个或更多个酶催化的反应和/或结合反应。
在一些实施方案中，样品的制备可以包括合并样品与用于扩增和用于报告的试剂，无论扩增是否发生。用于扩增的试剂可以包含以下的任何组合：用于合成与靶标对应的扩增子的一种或更多种引物、dNTP和/或NTP、至少一种酶(例如，聚合酶、连接酶、逆转录酶、限制性酶或其组合，其每个可以是或可以不是热稳定的)或类似物。因此，样品的制备可以使样品(或其分区)能够扩增在样品(或其分区)中的一个或更多个靶标(如果存在)的每一个。用于报告的试剂可以包含针对每个感兴趣的靶标的不同的报告子。因此，用于报告的样品的制备可以使样品能够报告或基于靶标到靶标和任选地任何如此扩增的程度被分析，无论扩增是否发生。
反应混合物的形成可以包括形成包含靶标扩增所必需的所有成分的连续相或主体相(bulk phase)。可选地，或另外，反应混合物的形成可以包括融合分区，诸如微滴(参见以下)。
术语“发光(luminescence)”意指不能够仅被归因于发射体的温度的光的发射。发光的示例性形式包括光致发光、化学发光、电发光等。“发光团”是能够发光的任何原子、相关的原子组、部分、分子、或相关的分子组。光致发光是对用激发光照射响应而产生的任何发光，并包括荧光、磷光等。因此，发光团可以是，除其他之外，光致发光团，诸如荧光团或磷光团。
可以将靶标可互换地称为分析物、物类(species)、或在一些情况中模板。
分区形成。可以形成这样的分区：每个包含相同的反应混合物和/或样品的一部分，和/或每个包含反应混合物的不完全前体的一部分(如果所述分区待被补充一种或更多种另外的反应组分)。每个靶标可以从模板、诸如从模板的单个拷贝(如果存在于给定的分区)来扩增。
当分区被提供时(例如，当被形成时)，其可以包含“部分占据”的靶标，其意指一个或更多个分区不包含至少一个拷贝的靶标。换言之，仅分区的子集包含靶标的至少一个拷贝。因此，由于部分占据，分区的一个或更多个(例如，多个)不包含靶标的拷贝、分区的一个或更多个(例如，多个)可以包含靶标的单个拷贝(仅一个拷贝)、并且可选地分区的仍然一个或更多个(例如，剩余的分区)可以包含靶标的两个或更多个拷贝。
术语“部分占据”不限制于这样的情况：其中在任何分区中有不多于一个拷贝的感兴趣的特定模板/靶标。当分区被提供或被形成时，包含部分占据的模板和/或靶标的分区可以，例如，除其他之外，每分区包含多于、或少于约一个拷贝、两个拷贝、或三个拷贝的平均值的模板/靶标。模板(和/或靶标)的拷贝可以在分区间具有随机分布，所述随机分布可以被描述为泊松分布。
分区形成可以包括将任何合适的部分分布至分区，所述任何合适的部分包括多达所有的样品/反应混合物。每个分区可以是和/或包含液体体积，所述液体体积与其他分区的液体体积分离。分区可以通过，除其他之外，流体相/液相诸如乳液的连续相、通过固相诸如容器的至少一个壁、或其组合来彼此分离。在一些实施方案中，分区可以是被置于连续相中的微滴，以使得微滴和连续相共同地形成乳液。
分区可以通过任何合适的程序、以任何合适的方式来形成，并具有任何合适的性质。例如，分区可以如下来形成：用液体分配器，诸如移液管，用至少一个液滴生成器，所述至少一个液滴生成器具有孔口和/或通道交叉点，在所述孔口和/或通道交叉点处形成液滴，通过搅动样品/反应混合物(例如，摇动、搅拌、超声等)等。因此，分区可以连续地、平行或批量地形成。分区可以具有任何合适的一个体积或多个体积。分区可以是基本上均一的体积或可以具有不同的体积。具有基本上相同的体积的示例性分区是单分散的微滴。分区的示例性体积包括，除其他之外，少于约100μL、10μL或1μL，少于约100nL、10nL或1nL，或少于约100pL、10pL或1pL的平均体积。
适于扩增每个靶标的分区可以从包含模板的主体相直接地形成，或可以多步骤形成。在一些情况中，形成分区的步骤可以包括将主相分成独立的流体体积(诸如微滴)，所述独立的流体体积包含部分占据的模板。所述流体体积可以是分区自身或可以对分区做出贡献。例如，流体体积可以是第一组流体体积，且形成分区的步骤可以包括将第一组的个体流体体积与第二组的个体流体体积合并。第二组可以包含用于扩增一个或更多个靶标的一种或更多种试剂，诸如用于扩增至少一个靶标的至少一个引物、探针、接纳体等。合并的步骤可以包括使第一组的流体体积与第二组的流体体积分别地融合，诸如使包含模板的微滴与包含用于从所述模板扩增一种或更多种靶标的引物的微滴融合。
靶标扩增。每个靶标可被扩增，在114中指示。可以在分区(分散相)中或在连续相诸如在未形成分区的反应混合物中进行扩增。如果在分区中进行，则每个靶标的扩增可以选择性地(和/或基本上)仅在分区的子集中发生，分区的所述子集诸如，除其他之外，少于分区的约四分之三、二分之一、四分之一或十分之一。每个靶标的扩增可以选择性地或排除性地在包含靶标的至少一个拷贝(即，包含相应于靶标的模板的至少一个拷贝)的分区中发生。
扩增可以或可以不等温地进行。在一些情况中，分区(和/或至少一个体积)中的扩增可以通过加热所述分区(和/或体积)和/或在高于室温的温度孵育所述分区(和/或体积)持续一个或多个循环来促进，所述在高于室温的温度下诸如在变性温度(例如，高于约90摄氏度)、退火温度(例如，约50-75摄氏度)、和/或延伸温度(例如，约60到80摄氏度)下。在一些实例中，可以对所述分区(和/或体积)热循环以促进通过尤其聚合酶链式反应和/或连接酶链式反应的扩增。可能合适的示例性等温扩增方法包括：除其他之外，基于核酸序列的扩增、转录介导的扩增、多重置换扩增、链置换扩增、滚环扩增、环介导的DNA扩增、解旋酶依赖的扩增和单引物扩增。
光检测。报告子的光致发光可被检测，任选地在低于报告子解链温度，在116中指示。检测到的光可以是，除了其他的以外，由报告子的光致发光团直接地发射的或可以是由光致发光团的能量传递伴侣发射的。光的检测可被描述为扩增数据的收集。可以通过检测从个体分区或从至少一个体积发射出的光来收集数据。光可以是响应于用光致发光团的激发光照射分区或体积而发射的。可以针对在一个波长/波段(一个光学通道)、一对波长/波段(两个光学通道)的来自分区或体积的光发射收集数据。
光学通道可以代表所发射的光得以生成并检测的特定检测方案。检测方案可以通过用于检测所发射的光的波长/波段(即，波长方案)来表征。如果在检测方案中使用脉冲激发光来诱发光发射，则检测方案可以通过用于激发光光照的波长或波段和/或在其期间对于每次光脉冲检测光发射的时间间隔来表征。因此，彼此不同的光学通道可能根据以下而不同：除其他之外，激发光的波长/波段、检测到的发射光的波长/波段、和/或在其期间相对于每次激发光的脉冲检测发射光的时间间隔。
数据收集可以包括产生代表从个体分区或反应混合物检测到的光的一个或更多个信号。信号可以代表光的一方面，诸如，除其他之外，强度、极性或光的寿命。信号可选地可以包括在两个或更多个不同的光学通道中(例如，在不同波长/波长范围(波段)和/或颜色方案)从针对相同和/或不同的靶标的探针/报告子收集的数据。从每个探针/报告子检测到的光可以是由光致发光团(例如，荧光团)发射的光。可以检测在给定的通道中检测的光，以使得来自不同探针/报告子的光被加和/或积累，而不归因于特定的探针/报告子。因此，给定的通道的信号可以是复合信号，其代表两个、三个、四个或更多个测定并且因此代表两个、三个、四个或更多个靶标。在其他情况中，可以在不同的光学通道中检测靶标的信号。
信号可以基于分区中所检测到的从一个或更多个探针/报告子发射的光来产生。所述一个或更多个探针/报告子可以报告由信号代表的两个或更多个特定扩增反应中至少一个是否已经在分区中发生，并由此报告相应于两个或更多个特定的扩增反应的两个或更多个特定的靶标中的至少一个的至少一个拷贝是否存在于分区中。可以分析与报告子对应的信号的水平或幅度以确定特定的扩增反应的至少一个是否已经发生，以及特定靶标中的一个的至少一个拷贝是否存在。信号的水平或幅度可以根据在每个分区中特定的扩增反应中的至少一个是发生还是未发生，以及特定的靶标中的至少一个是存在还是不存在，而在分区之间变化。例如，仅对于特定的靶标测定为阳性的分区可以产生高于给定的阈值和/或在给定范围内的信号值。可以在任何合适的时间分析分区，并产生信号。示例性时间包括在测定的反应阶段结束(终点测定)，当反应已经完成且数据不再改变时，或在一些较早的时间，只要数据是充分且可靠地分离的。
报告子可以具有任何合适的结构和特征。每个报告子可以是这样的探针：包含寡核苷酸和与寡核苷酸缔合(例如，带有与寡核苷酸共价地附连的光致发光团)以标记所述寡核苷酸的光致发光团。探针还可以或可以不包含光致发光团的能量传递伴侣，诸如猝灭剂或另一个光致发光团。探针可以是能够与由靶标的扩增而产生的扩增子(例如，其链)特异地结合的。探针还可以或可以不作为在测定中形成扩增子的一部分的扩增引物发挥作用。示例性的标记的探针包括
Figure BDA0001638874480000211
探针、
Figure BDA0001638874480000212
探针/引物、
Figure BDA0001638874480000213
探针、
Figure BDA0001638874480000214
探针、分子信标探针、
Figure BDA0001638874480000215
引物、当在扩增子上彼此邻近结合时表现出FRET的邻近依赖的杂交探针对、
Figure BDA0001638874480000216
引物等。
在一些情况中，报告子的至少一个可以是通用报告子，诸如染料，其相对非特异性地结合核酸。例如，染料可以不共价附连至赋予实质上的序列结合特异性的寡核苷酸。染料可以是，除其他之外，大沟结合物、小沟结合物、嵌入物或外部结合物。染料可以相对于单链核酸优选地与双链核酸结合，和/或相对于单链核酸当与双链核酸结合时在光致发光特征(例如，强度)上表现出较大的变化。可以是合适的示例性染料包括发光花青素、菲啶、吖啶、吲哚、咪唑等，诸如DAPI、
Figure BDA0001638874480000217
33258染料、吖啶橙等。可以合适的示例性嵌入染料包括：除其他之外，溴化乙锭、碘化丙啶、
Figure BDA0001638874480000218
染料、
Figure BDA0001638874480000219
Green染料、
Figure BDA00016388744800002110
Gold染料和7-氨基放线菌素D(7-AAD)。可以在具有两种或更多种不同的靶标特异性探针和/或至少一种靶标特异性探针以及通用报告子的相同的分区中进行两种或更多种靶标的多重测定。
群体鉴定。可以从数据鉴定出对于一个或更多个靶标测试为阴性或阳性的分区群体(可互换地称为簇或带)。鉴定可以由使用算法(例如，鉴定数据中的模式(例如，分区簇)的算法)的数据处理器、由使用者、或其组合来进行。在一些情况中，数据处理器可以产生并输出(例如，显示)所收集的数据的图(例如，曲线图、2D散点图、柱状图等)。使用者随后可以基于图来限定每个群体的边界，例如，经由图形用户界面限定群体边界、或通过输入值(例如，代表幅度阈值/范围)来限定每个群体的边界。每个群体边界可以通过值的一个或更多个范围、围绕群体的几何形状(例如，多边形、椭圆形等)、算法等来限定。因此，群体边界可以由使用者确定、由处理器通过算法自动地确定或其组合确定。
分区群体的鉴定可以包括将每个分区分配到多个预限定的箱(bin)中的一个，所述多个预限定的箱各自对应于不同的分区群体。预限定的箱可以代表靶标阴性和阳性的所有组合。
获得分区计数。对于每个分区群体可以获得分区计数。分区计数可以是代表组成特定分区群体的分区的数目的值。
确认靶标性质。至少一个靶标的性质可以基于检测到的光致发光(即，基于所收集的数据)来确认，在118中指示。该性质可以是水平(例如，浓度)、活性、构造、位置等。水平可以代表在扩增之前存在的靶标/模板的水平。靶标水平的确认可以(或可以不)基于在分区之间具有泊松分布的各个靶标。例如，每个水平可以是，除其他之外，代表靶标/模板/扩增子阳性(或阴性)的分区的总数目、或浓度值，所述浓度值诸如代表每分区或单位体积的靶标/模板的平均拷贝数目的值。分区数据还可(例如，直接地和/或作为浓度数据)被用来利用任何合适的算法评估拷贝数目(CN)和拷贝数目变化(CNV)、或样品的任何其他性质。
每个靶标的水平(例如，浓度)可以用泊松统计来确定。可以针对分区(或反应混合物)和/或针对提供靶标的样品表示浓度。可以通过假定(在扩增之前)靶标的拷贝在分区之间具有泊松分布，从阳性分区的比例(或，等效地，阴性分区的比例)计算分区中的靶标的浓度。就该假定而言，具有k个拷贝的模板的分区的比例f(k)通过以下方程给出：
Figure BDA0001638874480000231
其中，λ是分区中的靶标的浓度，被表示为每分区靶标拷贝的平均数目(扩增前)。简化的泊松方程可以由以上更通用的方程推导出，并且可被用于从阳性分区的比例确定靶标浓度。可使用的示例性泊松方程如下：
Figure BDA0001638874480000232
其中N+是对于给定的靶标为阳性的分区的数目(即，分区计数)，且其中Ntot是对于靶标为阳性或阴性的分区的总数。Ntot等于(a)靶标的N+和(b)对于靶标为阴性或N–的分区的数目的和。N+/Ntot(或N+/(N++N–))等于f+，其为对于模板为阳性的分区的比例(即，f+＝f(1)+f(2)+f(3)+…)(参见方程1)，且其是分区具有至少一个拷贝的模板的可能性的测量评估值。可使用的另一个示例性泊松方程如下：
Figure BDA0001638874480000233
其中N–和Ntot为如以上所定义的。N–/Ntot等于f–，阴性分区的比例(或1–f+)，且是分区不具有模板的拷贝的可能性的测量评估值，且λ是如以上所描述的靶标浓度。
可以重新整理以上方程2和3以产生以下：
λ＝ln(Ntot)-ln(Ntot-N+) (4)
λ＝ln(Ntot)-ln(N-) (5)
在测定中每个靶标的浓度可以例如用方程2到5中的任一个，使用针对每个靶标获得的Ntot和N–或等效地N+的值(即，分区计数)来确定。在一些情况中，对于每个靶标所使用的Ntot的值(总的分区计数)可以是相同的。在其他情况中，所使用的Ntot的值可以变化，诸如如果由于群体重叠而使群体的一些被从总计数中排除。在一些实施方案中，Ntot可以等同于所有群体的联合，即，经鉴定的所有群体的分区计数的和。
在一些实施方案中，靶标(和/或模板)的水平的评估可以从阳性比例直接地获得，而不使用泊松统计。特别地，阳性的比例和浓度(每分区的拷贝)随浓度降低而更一致。例如，就0.1的阳性比例而言，用方程2确定的浓度为约0.105，仅5％的差；就0.01的阳性比例而言，确定的浓度将约0.01005，仅0.5％的小十倍的差。但是，使用泊松统计能够提供浓度的更精确的评估，特别是就相对较高的阳性比例而言，因为泊松统计将在同一分区中存在相同的靶标/模板的多个拷贝计算在内。
可以是适用于本公开内容的系统的尤其是样品制备、分区形成、数据收集、群体鉴定、获得分区计数和靶标水平确定的另外的方面被描述于本公开内容中的其他位置、和以上在交叉引用中标识的参考文献中，其通过引用将其并入本文。
图5示出了用于进行图4的测定的示例性系统120。系统120可以包括，除其他之外，分区装置诸如微滴生成器122(“DG”)、热孵育装置诸如热循环器124(“TC”)、检测装置(检测器)126(“DET”)、及数据处理装置(数据处理器)128(“PROC”)、或其任何组合。数据处理装置可以是、或可以被包括在控制器中，所述控制器与装置的任何合适的组合通讯并控制其操作。装置之间的箭头指示材料在装置之间的运动或传递，所述材料诸如流体(例如，乳液的连续相)和/或分区(例如，微滴)或信号/数据。装置的任何合适的组合可以被可操作地连接至彼此，和/或装置的一个或更多个可以不被连接至其他装置，以使得例如材料/数据被手动地传递。
检测器126可以提供在其中收集数据的单个通道或多个光学通道。检测器可以针对每个光学通道具有不同的传感器或检测单元。可以将检测器与光源可操作地关联，所述光源被配置成激发测定的一个或更多个光致发光团。
系统120可以如下操作。微滴生成器122可以形成分散在连续相中的微滴。可以用热循环器124使微滴热循环以促进微滴中的一个或更多个靶标的扩增。可以用检测器126从微滴检测信号。信号可以由处理器128来处理以除其他之外确定一个或更多个微滴计数和/或靶标水平。
III.组合物
该部分提供了本公开内容的示例性组合物。每个组合物可以或可以不包含对于核酸靶标的扩增所必需的所有试剂。
组合物可以是连续相(可互换地称为主体相)或可以包含彼此分离的分区。如果包含分区，则分区可以是被(除其他之外)固相(例如，至少一个容器的至少一个壁)和/或被液相彼此分隔开的水性分区。液相可以是围绕分区的每一个的非水性连续相。连续相可以包含至少一种表面活性剂。
非水性相可以充当形成不与水混溶的连续相的载体流体。非水性相可以是包含至少一种油的油相，但可以包含可与水混溶的任何液体(或可液化的)化合物或液体化合物的混合物。油可以是合成的或天然地存在的。油可以或可以不包含碳和/或硅，且可以或可以不包含氢和/或氟。油是疏水的，且可以是亲脂或疏脂的。换言之，油可以是通常可与有机溶剂混溶或不与其混溶的。示例性油可以包括，除其他之外，至少一种硅油、矿物油、氟碳油、植物油或其组合。
在示例性实施方案中，油是氟化油，诸如氟碳油，其可以是全氟化的有机溶剂。氟化油可以是，除其他之外，基础(初级)油或基础油添加剂。可以是合适的示例性氟化油以商标名FLUORINERT(3M)出售，特别地包括FLUORINERT Electronic Liquid FC-3283、FC-40、FC-43和FC-70。合适的氟化油的另一个实例以商标名NOVEC(3M)出售，包括NOVEC HFE7500Engineered Fluid。
组合物可以包含以下的任何合适的组合：除其他之外，模板、至少一种探针、至少一种接纳体、一种或更多种引物(其的至少一种还可以是探针或接纳体)、dNTP和/或NTP、聚合酶(例如，热稳定的聚合酶)、连接酶、逆转录酶、水、缓冲液和不与水混溶的载体流体。
模板可以是核酸，诸如DNA和/或RNA，且可以是至少主要是，除其他之外，单链的或双链的。模板可以被片段化为任何合适的大小或大小范围。
探针可以包含寡核苷酸、至少一个光致发光团和光致发光团的至少一个猝灭剂的任何组合。寡核苷酸可以与扩增子的区域互补以使得寡核苷酸能够在生成扩增子的靶标扩增期间与扩增子结合。扩增子的区域可以或可以不存在于从其生成扩增子的模板/靶标中。光致发光团和猝灭剂的每个可被偶联至寡核苷酸。可以放置猝灭剂(在接纳体不存在下)用于动态猝灭和/或接触猝灭。
接纳体可以结合探针以影响探针的至少一个光致发光团发射光的能力。例如，接纳体可以发挥作用将能量传递伴侣带至较靠近探针的光致发光团。接纳体可以包含与探针互补的寡核苷酸，且还可以包含光致发光团的至少一个能量传递伴侣(诸如猝灭剂)。因此，接纳体可以结合探针以使接纳体的能量传递伴侣位于较靠近探针的光致发光团处，和/或以使探针的能量传递伴侣位于较靠近探针的光致发光团处。如果接纳体缺少能量传递伴侣，则接纳体可以具有结合探针的5’部分的5’部分和结合探针的3’部分的3’部分(例如，参见实施例5)。
可以将一种或更多种引物配置成引发至少一种扩增子链和/或互补的扩增子链的合成。一种或更多种引物因此可以与模板和/或扩增子结合并可以限定扩增子的末端。在示例性实施方案中，一种或更多种引物是正义引物和不同的反义引物，其共同限定扩增子的末端。
IV.实施例
本部分描述本公开内容涉及用包括接纳体的报告子的测定的选择的方面和实施方案。在本部分中公开的测定和报告子构造的任何适当的方面可以互相和/或与在本公开内容其它地方公开的测定和报告子构造的方面组合。这些实施例仅意图用于说明，而不应限制或限定本公开内容的完整范围。
实施例1.用于引物的接纳体
本实施例描述用能够结合探针的接纳体进行的示例性测定，所述探针作用为标记的扩增引物；参见图6、7和7A。
图6示出比较测定中的荧光水平的示意图，所述测定用包含结合接纳体54的标记的引物(探针52)的示例性报告子130进行。引物寡核苷酸58可以(或可以不)具有3’引发区域132，其专为结合靶标且不具有与接纳体54的寡核苷酸64的互补性。引发区域132(和/或引物寡核苷酸58)能够在退火温度结合到模板/靶标以允许在扩增期间的聚合酶介导的引物延伸。引发区域可以，例如，具有，除其它以外，至少约10、15或20个核苷酸的长度。寡核苷酸58还可以具有5’接纳体结合区域134，其专为结合接纳体54并在用于检测的更低的温度与在接纳体结合区域134的光致发光团60靠近猝灭剂62的位置形成氢键。因此，从报告子130的光致发光团测量的荧光的背景水平可以是低的。接纳体结合区域134可以，例如，具有，除其它以外，至少约5、10或15个核苷酸的长度。在一些实施例中，区域132和134可以基本上或完全地重叠。接纳体结合区域134可以或可以不与包含待扩增的靶标的模板互补。
使用探针52作为引物(和任选地至少一个其它引物)扩增靶标可以产生扩增子140。扩增子140的链142结合到延伸的探针并防止接纳体54在可以被用于检测的更低的温度结合到延伸的探针52，在144指示。因为在检测期间猝灭剂62不保持靠近光致发光团60，从并入扩增子140的光致发光团测量到的荧光水平可以比报告子的背景荧光水平相对地高。
换言之，由于产生的报告子的更高的解链温度，该延伸的探针可以优先地结合到更长的、互补的扩增子链，且不是到接纳体。在不发生扩增的分区中，该未延伸探针可以在检测温度被接纳体结合，这可以猝灭来自探针的光发射。基于这种方法的测定可以称为扩增子介导的探针测定(AMP测定)。
图7示出可以在分区中用图6的报告子130进行的示例性测定的选择的步骤和构造。在此示出的该构造可以在包含至少一个拷贝的模板80的分区中产生，所述模板80包含靶标82。该模板可以是双链的，如所示的具有链84和86，，或单链的。在图7的顶部示出正向引物(“F”)(即，来自报告子130的探针52)，和反向引物(“R”)，其同各自可结合(在模板/靶标变性后)的模板80/靶标82的相应区域对齐。接纳体54可以相对探针52摩尔过量，如此以使在扩增之前在室温下基本上所有探针结合到接纳体(且在分区中可以存在接纳体54的未结合的拷贝)。
靶标扩增的第一个循环可以通过加热模板80到其变性温度以上启动。随后可以在允许探针52(且尤其是引发区域132)特异性结合到模板的单链86的温度进行退火。反向引物到链84的结合还发生在第一个循环期间，但不在此图示以简化附图。
每个正向和反向引物随后可以在第一个循环期间被延伸以产生与模板80的链分别结合的引物延伸产物。描述的延伸产物92可以通过使用链86作为模板延长正向引物(探针52)产生。
可以使用延伸产物92作为模板进行靶标扩增的第二个循环以生成扩增子140的完整拷贝。变性之后，反向引物结合到延伸产物92并可以被延长。因此，掺入反向引物的延伸产物146可以延长到同产物92的5’端对齐的位置，使得当降低温度时，产物92的接纳体结合区域134不可用于在以后结合到接纳体54。可以进行额外的扩增循环以增加扩增子140的拷贝数目直到达到扩增的终点。成功的扩增引起在检测期间存在的猝灭的报告子130的量的减少，通常与产生的光致发光团标记的扩增子140的量直接相关。
图7A示出用于图6和7中测定的阶段的示例性热曲线，及在每个阶段期间报告子130的状态(如退火的、变性的和/或共价地修饰的)。图横坐标上标识的状态是体积形成、热循环(和/或扩增)及检测。在此和以下描述的热特性可以适用于本公开内容的任何报告子和测定构造。
体积形成通常包括在扩增阶段和/或检测阶段使用的一个或更多个体积的形成。至少一个体积的形成可以包括混合扩增试剂和样品和/或将包含扩增试剂和/或样品的主体体积划分成分区(如，微滴)。可以(或可以不)在低于报告子的解链温度、在一种或更多种的不同温度进行体积形成。例如，可以通过在低于室温(诸如在冰上)混合样品和试剂形成主体体积。随后，除其它以外，可以(或可以不)在低于室温(如，约20到25摄氏度)或室温将该主体体积划分到分区。在任何事件中，分区可以在低于报告子的解链温度形成，以使报告子在分区形成(和/或主体体积形成)期间保持在碱基配对形式150。
可以通过在高于报告子的解链温度的单个温度或两个或更多个不同温度孵育该至少一个体积进行扩增。因此，孵育可以是等温的或可以包括通过多个热循环(也称为扩增循环)热地循环处理(即热循环处理)该至少一个体积，所述热循环诸如，除其它以外，至少5、10或15个循环。该至少一个体积可以在每个扩增循环的退火部分和/或引物延伸部分期间保持在高于报告子的解链温度。该报告子在每个扩增循环(诸如贯穿多个扩增循环的每个)的任何适当部分期间可以是分离的形式152。报告子、探针和/或接纳体的至少一部分可以通过扩增被共价地修饰，诸如被延伸形成延伸产物92和/或被切割形成降解产物。
可以在低于报告子的解链温度进行对来自报告子130的光的检测。在扩增期间未被修饰的报告子的部分可以碱基配对形式150存在。报告子的另一个部分可以分离形式存在，所述分离形式产生自延伸产物92同扩增子40的互补延伸产物146的碱基配对，接纳体54未配对。
实施例2.具有单个猝灭剂的报告子
本实施例描述示例性报告子，其中探针不包含猝灭剂，该探针在靶标扩增期间被降解；参见图8。
图8示出比较在用具有包含探针52的报告子160进行的测定中的荧光的水平示意图，该探针不具有共价连接的猝灭剂(与图1比较)。接纳体54提供猝灭剂62，其可以作为报告子中仅有的猝灭剂部分提供足够的猝灭，以给出低荧光背景信号。作为扩增副产物生成的降解的探针70，产生相对高的荧光信号，因为接纳体54的猝灭剂62不再保持靠近光致发光团60。
实施例3.接纳体降解的报告子
本实施例描述示例性报告子，其中探针是扩增引物且不包含猝灭剂，该报告子的接纳体在靶标扩增期间被降解；参见图9。
图9示出比较在用图6的报告子130的更稳定形式和在靶标扩增期间能够催化接纳体54切割的聚合酶进行的测定中的荧光水平的示意图。报告子130可以，例如，比图6中的更稳定，因为接纳体54可以更长(图6和9相比较)。该报告子可以足够稳定以在扩增循环的退火步骤期间形成并在循环的延伸步骤期间保持碱基配对。缺少靶标拷贝的分区表现出低的背景荧光水平，因为报告子130的接纳体54保持完整。具有至少一拷贝靶标的分区表现出相对高的荧光水平；扩增子140的形成产生接纳体54的降解的形式170，其不能有效地猝灭光致发光团60。
实施例4.作为接纳体的扩增引物
本实施例描述示例性报告子180，其中接纳体54被构造作为扩增引物；参见图9A。
通常可以将报告子180按以上对图6的报告子130所描述的构造，除了光致发光团60和猝灭剂62的位置相反。具体地，可以将猝灭剂62缀合至引物寡核苷酸182。寡核苷酸182可以具有引发区域184和探针结合区域186，可将其各自按以上对图6的寡核苷酸58的对应区域所描述的构造。(例如，可以将探针结合区域186完全包含在引发区域184中。)可以将猝灭剂62附连到任一区域和沿该区域的任何适当位置。报告子的探针52可以结合寡核苷酸182的区域186。探针提供光致发光团60并可以或可以不与通过扩增产生的扩增子互补。如果探针在扩增期间被降解(如果报告子180足够稳定以在扩增期间存在)和/或如果通过扩增子形成将探针从在检测温度与延伸的接纳体54的结合中排除，光致发光团60的猝灭可以被减弱。
实施例5.不具有猝灭剂的接纳体
本实施例描述示例性报告子200、202，其中探针52被放置在通过不包含猝灭剂的接纳体54猝灭的构造中；参见图10和11。
可以将接纳体54构造成不与猝灭剂(或光致发光团)缀合的寡核苷酸。该寡核苷酸可以包括5’部分206和3’部分208，其各自与探针52的5’部分210和3’部分212互补并结合。作为结果，探针的光致发光团60和猝灭剂62被保持在报告子中彼此接近的位置，通过诸如接触猝灭减少探针的基础发光。接纳体54可以具有3’磷酸化或防止该接纳体的延伸的其它修饰或结构，延伸能够引起探针切割。还或可选地可以将该接纳体构造成耐受聚合酶介导的切割。
探针52的长度可以决定该探针是优先地环化以形成报告子的环杂合体200，其被分子内地猝灭，还是通常端到端的串联排列以形成报告子的链杂合体202(可替换地称为线形杂合体)，其被分子间地猝灭。环杂合体200使用探针52的同一拷贝以提供光致发光团60的拷贝和猝灭该光致发光团拷贝的猝灭剂62的拷贝。链杂合体202使用探针52的拷贝对以提供猝灭光致发光团60的拷贝的猝灭剂62的拷贝。探针52从端区域210延伸至端区域212的间隔区域214的长度能够决定该探针是优先地形成杂合体200还是杂合体202。例如，如果该间隔区域足够长，如在图10中，该探针的同一拷贝能够结合到接纳体54的同一拷贝的不同区域。如果该间隔区域不长到足以使探针环化，可以替代的形成图11的链杂合体。在一些情况中，间隔区域214可以是短的，诸如不多于四、三、二或一个核苷酸，以优化通过猝灭剂的光致发光团猝灭(例如，如此以使接触猝灭发生)。接纳体54还可以具有间隔区域216，其连接到端部分206和208。可保持间隔区域214是短的，诸如不多于四、三、二或一个核苷酸，以优化通过猝灭剂的光致发光团猝灭(例如，如此以使接触猝灭发生)。
实施例6.具有非末端光致发光团和猝灭剂的报告子
本实施例描述示例性报告子220，其通过探针52和接纳体54形成，在沿探针和接纳体的各自的寡核苷酸的非末端位置提供光致发光团60和猝灭剂62；参见图12。在其它实施方案中，能量传递对的一个成员可以位于末端位置(缀合到寡聚体链的5’端或3’端)，且可以将该能量传递对的另一个成员布置在同一寡聚体链的非末端位置或至少部分互补的寡聚体链的非末端位置。
实施例7.用至少两个探针的靶标区域的测定
本实施例描述用于使用至少两个不同探针和至少一个接纳体测定靶标区域的示例性策略；参见图13和14。
图13是说明用于使用至少两种不同探针52a和52b测定靶标或靶标区域的策略的示意性流程图。可将该策略在分区，诸如微滴中进行，或可在主体相中进行。
探针52a可以是用光致发光团60a标记的引物。该探针可以与接纳体54互补以在检测温度但不在用于扩增的退火温度形成报告子130。可以将探针52a构造成结合到提供靶标82的模板80上。
探针52b可以是具有光致发光团60b和光致发光团的猝灭剂62b的自猝灭探针。光致发光团60a和60b可以是光学地可辨别的，诸如具有不同的发射光谱。可以或可以不存在能够结合到探针52b的接纳体。
使用探针52a和反向引物90(R)的靶标82的扩增产生扩增子140的拷贝，每个扩增子140的拷贝被光致发光团60a标记。扩增还可以产生来自探针52b的降解的探针70b，如此以使光致发光团60b不再被猝灭剂62b猝灭。在检测温度，在扩增之后，阳性分区可以包含标记的扩增子140、降解的探针70b和接纳体54，及任选地可以包含完整的探针52b(在扩增期间没有被降解的剩余的量)和/或报告子130(包括没有用于扩增的探针52a的拷贝)。阳性分区可以具有由通过光致发光团60a和60b发射的光产生的不同的发光信号。阴性分区可以比阳性分区包含基本上更多的报告子130和完整的探针52b。在一些情况中，可以在同样的分区中使用仅光致发光团60a或仅光致发光团60b标记的探针测定其它靶标。
图14示出用于使用至少两种不同探针52a和52b测定靶标或靶标区域的另一种策略的另一个示意性流程图。可将该策略在分区，诸如微滴中进行，或可在主体相中进行。
探针52a和52b的每一个可以是使用不同光致发光团60a或60b标记的正向引物(F1和F2)。探针52a和52b的每一个可以至少部分与各自的接纳体54a和54b互补，以在检测温度但不在用于扩增的退火温度形成报告子130a、130b的碱基配对形式。接纳体54a和54b可以包含猝灭剂62a和62b，其可以互为拷贝或结构上不同(如在此所示)。探针52a和探针52b的每一个可以被构造成结合到提供靶标82的模板80上，并可以被聚合酶延伸。探针可以结合到模板的同一链或分别结合互补链。在一些情况中，探针可以分别作用为限定相应扩增子的末端的正义和反义引物。
使用探针52a和反向引物90(R)扩增靶标82产生扩增子140的拷贝，每个扩增子140的拷贝被光致发光团60a标记。扩增还可以产生来自探针52b的降解的探针70b，如此以使光致发光团60b不再被猝灭剂62b猝灭。报告子130a和130b的碱基配对的构造可以在扩增后在检测温度存在，其存在量与靶标扩增程度成反比。
图14A示出用于使用至少两种不同探针52a和52b(各自是报告子130a、130b的)测定靶标的又另一个策略。图14A的策略相似于图14的策略，除了探针52a、52b分别被构造为正向引物(F)和反向引物(R)，而不作为两个不同的正向引物。每个探针可以被接纳体54a或54b结合，接纳体54a或54b分别影响不同的光致发光团60a或60b的光致发光。靶标的扩增作为在来自两个报告子130a和130b的光致发光团中的变化(如，来自两个光致发光团60a和60b)是可检测的。这种策略可用于完成多重化以检测多个不同靶标序列，诸如在同一组分区中完成。作为实例，可以使用四种不同光致发光团(FAM、HEX、NED和ALEXA 568)如下标记五个不同靶标的引物，并且每个引物在高于检测温度可同各自的接纳体碱基配对：
靶标号 标记(正向引物) 标记(反向引物)
1 FAM 无
2 无 HEX
3 FAM HEX
4 FAM NED
5 FAM ALEXA568
可以一个或更多个波长条件检测来自不同光致发光团的光致发光，诸如在表示不同波长的一对检测通道中，以允许光致发光数据的二维图的生成。光致发光团的每一个不同的组合在图中可以对每个不同靶标产生可区分的靶标阳性簇。
实施例8.选择性猝灭引物二聚体
本实施例描述用于使用包含猝灭剂的引物进行的靶标测定的示例性策略，以便相对于期望的扩增子140选择性地猝灭来自引物二聚体240的光发射；参见图15。
通常作为不希望的副反应产物在扩增测定中形成的引物二聚体，能够增加噪音和减少测定的准确性。图15示出用于减少由在分区(或主体体积)中的引物二聚体产生的信号的策略。靶标82的扩增可以用作为正向引物(F)的探针52，和接纳体54b进行，且接纳体54b被构造成作为反向引物(R)并包含探针的光致发光团60的猝灭剂62b。可以生成用光致发光团60标记的两种示例性产物，即，扩增子140和引物二聚体240。每个产物还包含猝灭剂62b。然而，光致发光团和猝灭剂之间的各自的平均距离d1和d2，可以在扩增子140中比在引物二聚体240中实质上更大。因此，相比来自引物二聚体240的光发射，来自扩增子140的光发射被猝灭的少得多。作为结果，较少可能地将仅包含引物二聚体的靶标阴性分区错误地分配成靶标阳性的，这可以改善测定的准确度。
本概念是故意降低引物二聚体的发光，以使它们不具有影响靶标定量的能力。换言之，如果由于引物二聚体发光而略微阳性的微滴被归类成阳性微滴，这是不期望的，因为它影响定量。在此描述的策略可减少包含引物二聚体的微滴的发光并允许更准确的靶标定量。
反向引物在其上具有猝灭剂。对于普通大小的扩增子，在其它引物上的猝灭剂和光致发光团之间的距离太大以致非常少或没有猝灭发生。反之，如果引物产生引物二聚体，则距离短的足以使猝灭发生，且微滴具有降低的发光并被正确地归类成靶标阴性的。
实施例9.在单重和多重测定中的背景信号比较
本实施例描述在用引物和模板的不同组合进行的单重和多重测定中收集的示例性数据；参见图16-18。
在多重测定中保持良好的信噪比可以是挑战性的。图16示出从移动穿过检测区域的微滴检测到的荧光强度信号(荧光(fl.)幅度)的一对图。检测的每个微滴可以产生称为“事件”的特征性荧光谱(profile)，其在图16(及图17和19)中根据检测的事件顺序被绘制。换言之，将检测到的第一个事件绘制为一号事件、第二个事件绘制为二号事件，并依次类推，在图16中绘制的荧光幅度超过4x 105个事件(微滴)。对于每个微滴，绘制在两个检测通道通道1和通道2的每个中测量的荧光幅度。通道1(“FAM通道”)代表检测自包含FAM染料的一个(1重)或五个(五重)探针的信号，且通道2(“HEX通道”)代表在单个靶标测定中从包含HEX染料的单个探针检测的信号。在HEX通道中收集的数据作为对照。
在上部图中示出的数据使用单重测定(每个测定被设计为扩增并检测仅一个靶标)和多重测定(每个测定是被设计为扩增并检测多个靶标的测定的组合)获得。测定的两种类型在上部图上方标记为“N重”的行中标识，其中“1”指示单重测定且“5”指示用于5个靶标的多重测定。为每个单重靶标测定和相应模板分配1到5的数字。被添加到每个测定以产生阳性微滴扩增的特定的单个模板在标记为“模板”的行中标识。因此，将模板“1”到“5”的每个单独添加到相应靶标的单重测定中，且其是添加到对于1到5的所有靶标的五重测定的唯一模板。换言之，模板1到5的每个的扩增在单重和五重测定中比较，以测试多重技术对背景信号和信噪比的作用。在每个阴性微滴带的右侧紧接着以空的矩形标识对被测试的特定模板阴性的微滴的带，模板的阳性微滴以填充的矩形标识。
每个单重测定表现出良好的信噪比，阳性微滴的带(填充的矩形)很好地同阴性微滴的带(空矩形)分辨。然而，当在仅存在相应模板的五重测定中测试同样的靶标时，信噪比变得相当的不好。当在多重测定中测试时，在五分之三的多重测定中(模板1、2和4)难于将阳性微滴(信号)与阴性微滴(噪音)分离，这使得准确的定量困难或不可能。多重技术可以引起高背景，因为不同测定的组分能够各自互相作用以升高噪音超过从来自每个测定的标准加性噪音所预计的。
图17示出大体如在图16中自微滴收集的数据，，所述微滴来自：一组每个用于不同靶标的五个单重测定、用于五个靶标的一个五重测定和用于四个靶标的多个4-重测定。模板存在于上图中呈现的不同测定的仅一种条件中(“P+T+”)，且模板存在于下部图中的条件的子集中(即，HEX通道对照)。阳性和阴性的微滴的带如图16中用填充的和空的矩形标识。
五个单重测定的每一个(1到5，用于不同靶标)表现出低的背景信号。与之相比，当将五个测定组合成一个五重测定时，背景水平显著增加。在没有聚合酶或模板(“P-T-”)、有聚合酶和没有模板(“P+T-”)、及有聚合酶和模板(“P+T+”)观察到高的五重背景。从五重测定单独地移除五个测定的每个的引物和探针以创建五种不同的四重测定，每个缺少测定之一，示出每个测定促进高背景水平。
五个单重测定的加性噪音是2598.6，而观察到的五重测定的噪音是6863.0。组合这些测定产生额外的4264.4的噪音，这使系统中的噪音比加性噪声的双倍还高。
图18示出在理想单重测定和非理想单重或多重测定中探针52的可能的构造。该探针在理想单重测定中可以具有与在非理想单重或多重测定中相比较小的光致发光团60和猝灭剂62之间的平均间隔。例如，在测定中，引物260可以具有结合到探针的趋势，这可以增加探针的刚性，以保持光致发光团60和猝灭剂62的间隔更远。被定量的靶标数目越大，来自一个测定的探针被另一个测定的组分结合的机会就越大。可以在远低于用于扩增的温(诸如室温)度进行检测，由此允许错配的报告子262的形成。因此，在观察到的大于加性噪音背后的示例性理论是，来自不同测定的组分互相彼此作用以增加探针刚性，这减少猝灭并抬高噪音。
实施例10.促进分子间猝灭的接纳体的测试
本实施例描述收集自被形成为包含根据实施例5(图11)的报告子的微滴的示例性数据；参见图19。
图19的图示出收集自微滴的数据，每个微滴包含如在图16和17中的五重测定或单重测定。未添加模板，所以在图中的每条带代表阴性微滴，如通过在每条带右侧的未填充矩形所示出的。在多重测定中，每个测定靶向不同基因。每个测定的引物和探针浓度分别是900nM和250nM。在标明之处，接纳体以500nM的浓度包含在微滴中。接纳体如图11设计并且其结合仅用于一种靶标测定的探针。接纳体的使用在单重测定和多重测定二者中都减少阴性微滴的荧光(尽管该接纳体仅结合到在多重测定中使用的五个探针中的一个)。因此，该接纳体可以在多重和单重微滴PCR分析中减少阴性微滴(噪音)的幅度。结合到五个探针的其它探针的接纳体的添加能够进一步减少背景。
实施例11.在基于微滴的测定中的不同探针的比较
本实施例比较用于微滴中的靶标区域的测定的不同策略；参见图20-22。
图20示出说明分别用于分区(如，微滴)中的重叠的靶标区域82a和82b的测定的一对不同策略的流程示意图。
左侧的策略，策略280，涉及标记的引物(探针52a)和接纳体54。策略280能够定量模板80的靶标区域82a并利用探针52a作为正向引物以产生未被猝灭的标记的扩增子140a。没有被并入的未使用的探针可以在检测温度被接纳体54结合以形成猝灭的报告子130。
右侧的策略，策略290，涉及自猝灭的探针52b，探针52b不是扩增引物。该探针可以，例如，是
Figure BDA0001638874480000371
探针。策略290能够定量模板80的靶标区域82b并利用结合在扩增引物对(F和R)中间的探针52b。扩增引物限定包含策略280的扩增子的扩增子。扩增期间探针52b被切割以形成降解的探针70b，降解的探针70b没有被猝灭剂62猝灭。残余的未使用的探针也可能存在，尤其在靶标阴性的分区中。
当使用基于PCR的方法时，DNA的片段化可能人为地减少浓度测量值。DNA的很多来源，诸如FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)或环境样品是高度片段化的。减轻由片段化引起的错误的一种可能的方法是创建尽可能短的测定。在这方面，策略280具有高于策略290的优势。例如，使用作为扩增引物的探针允许将正向引物和反向引物放置在与当探针结合到扩增引物对中间时相比更靠近彼此的位置。因此，更短的靶标区域(如，少于约75、60或50个核苷酸)能够用左侧的策略定量，其减少由于在提供靶标的核酸的分离/制备期间的随机断裂而遗漏的靶标拷贝的数量。
图21示出收集自根据图20的策略280(“标记的引物+接纳体”)或策略290(“自猝灭的探针”)测定的微滴组的荧光数据的图，引物针对CCND1靶标。用于策略280的寡核苷酸如下：5'-FAM-TATCTGAGGGGCGGGAGAG-3'，探针/正向引物(SEQ ID NO：1)；5'-GAGGTCACGACATTTTAGCG-3'，反向引物(SEQ ID NO：2)；和5'-CGCCCCTCAGATA-IB-3’，接纳体，其中IB是Iowa
Figure BDA0001638874480000372
暗猝灭剂(SEQ ID NO：3)。用于策略290的引物如下：5'-ACATTGATTCAGCCTGTTTGG-3'，正向引物(SEQ ID NO：4)；5'-GAATTCATCGGAACCGAACTT-3'，反向引物(SEQ ID NO：5)；和5'-FAM-TCCTTGCACCCATGCCTGTCCA-IB-3’，探针(SEQ ID NO：6)。
根据每个策略处理八组微滴(用数字1-8标识)，扩增由对每组微滴在不同退火温度的热循环来促进。更具体地，组1在65℃退火、组8在55℃退火，且组2-7在组1和8的退火温度之间递增的温度退火。将每组中的微滴连续地通过检测器，并基于从每个微滴测量的荧光幅度作为单独“事件”检测。检测的微滴或“事件”在图中按顺序标号并绘制成单独的点。组的靶标阴性的微滴产生较低的荧光幅度，用未填充的矩形标识，且组的靶标阳性微滴产生较高的荧光幅度，用填充的矩形标识。具有中间荧光幅度(“雨区(rain)”)的微滴的存在通过降低退火温度实质上减少，如在每个策略的组5-8中所见的。
图22示出从图21的数据确定的每组微滴的靶标浓度的图。每个测定策略的组5-8产生基本上相同的靶标浓度。在本实施例中呈现的实验示出，对于同一基因CCND1，具有接纳体的AMP测定产生与
Figure BDA0001638874480000381
测定相当的浓度测量值。AMP测定不需要用于额外探针的空间，且能够扩增比
Figure BDA0001638874480000382
测定显著更短的产物。进一步讲，AMP测定利用了接触猝灭并可以简单地用于多重技术。
实施例12.结合自猝灭探针对的接纳体的测试
本实施例描述收集自被形成为包含各自对野生型靶标82a和突变型靶标82b特异的自猝灭探针52a和52b的微滴的示例性数据。探针52a和52b的每一个可以在检测温度被同一接纳体54结合以分别形成猝灭的报告子130a和130b。测定策略通常如在部分I(如，参见图1-3)中和在本公开内容的其它地方所描述；参见图23和24。
图23示出用于在微滴中进行K-Ras基因的野生型和突变型等位基因的多重测定(A146T测定)的策略的示意图。探针52a和52b和引物(F和R)与它们分别在野生型和突变型模板80a和80b上的预期的结合位点对齐。靶标82a和82b可以在单个核苷酸(或多于一个核苷酸)上不同，在突变型模板中300处标识。
用用于从野生型和突变型模板扩增K-Ras的同一区域的一个引物对形成微滴。引物序列如下：5’-AGAAGCAATGCCCTCTCAAG-3’，正向引物(SEQ ID NO：7)；和5’-AAACAGGCTCAGGACTTAGC-3’，反向引物(SEQ ID NO：8)。测定使用分别用不同荧光团即HEX染料(60a)和FAM染料(60b)标记的野生型探针52a和突变型探针52b，且野生型探针52a和突变型探针52b各自缀合到同一猝灭剂IOWA
Figure BDA0001638874480000391
暗猝灭剂(“IB”)。探针52a和52b的各自的序列如下：5’-HEX-ATTGAAACATCAGCAAAGACAAGACA-IB-3’(SEQ ID NO：9)；和5’-FAM-TTGAAACATCAACAAAGACAAGACAGG-IB-3’(SEQ ID NO：10)。探针具有允许探针选择性地结合到野生型或突变型模板/扩增子的单个核苷酸差异。形成不同组的微滴以不包含接纳体54或以两种不同的探针接纳体比率(1：1和1：2)包含接纳体。接纳体与突变型探针完全互补(无错配)。然而，探针在使用的检测温度(室温)实质上结合到两种探针，并因此对于突变型探针是非选择性地。接纳体的序列是5’-GTTGATGTTTCAA-IB-3’(SEQ ID NO：11)。
图24A-C示出收集自形成的无接纳体(A)和具有不同量的接纳体(B和C)的微滴的荧光数据的散点图。每个微滴在图中产生点，点的位置由微滴在X轴上的通道1荧光幅度(HEX染料、野生型探针)和同一微滴在Y轴上的通道2荧光幅度(FAM染料，突变型探针)确定。微滴形成四个簇或群体，将其颜色编码并置于四个象限：黑色(-/-)用于双阴性(两个靶标都不存在)、蓝色(+/-)用于仅具有突变型靶标存在的单阳性、绿色(-/+)用于仅具有野生型靶标存在的单阳性，和棕色(+/+)用于双阳性(存在突变型和野生型靶标)。在图24A中，无接纳体，阴性微滴的基础荧光相对地高-在每个靶标的阴性和阳性微滴之间的荧光幅度差异仅约2倍。在图24B和24C中，接纳体在对任一或两个靶标阴性的微滴的背景荧光中产生实质上的降低。接纳体在对任一或两个靶标阳性的微滴的荧光幅度中产生相对地非实质上的降低。
实施例13.用于不包含猝灭剂的探针的接纳体的测试
本实施例描述收集自被形成为包含探针和接纳体并随后通常根据实施例2(如，参见图8)被处理以促进扩增的微滴的示例性数据；参见图25和26。
图25示出用于在微滴中进行K-Ras基因的野生型和突变型等位基因的多重测定(A146T测定)的另一个策略的示意图。该策略与在图23中的大致上相同，除了每个探针52a和52b用光致发光团而不是猝灭剂标记。探针52a和52b的序列是5’-HEX-ATTGAAACATCAGCAAAGACAAGACA-3’(SEQ ID NO：12)；和5’-FAM-TTGAAACATCAACAAAGACAAGACAGG-3’(SEQ ID NO：13)。前一实施例的接纳体(SEQ ID NO：11)也被在此使用。
图26呈现收集自根据图25的策略形成的微滴的荧光数据。如在以上对图24描述的绘制数据，且数据示出，探针与接纳体的分子间猝灭，而无探针自猝灭，将靶标群体分辨为不同的簇。
实施例14.等位基因特异性扩增
本实施例描述在结合作为引物的等位基因特异性探针的接纳体存在下，用于等位基因特异性扩增的示例性策略；参见图27。
图27示出用于进行基因的野生型和突变型等位基因的双重测定的基于分区的策略的示意图。等位基因可以相差任何适当数量的核苷酸，诸如在此所示的单核苷酸多态性300。可以从野生型模板80a用第一引物对即正向引物(Fa)(探针52a)和反向引物(Ra)扩增野生型靶标82a，每个引物相对于突变型模板特异地在野生型模板上引发。可以从突变型模板80b用不同的引物对即正向引物(Fb)(探针52b)和反向引物(Rb)扩增突变型靶标82b，每个引物相对于野生型模板特异地在突变型模板上引发。如所示，每个正向引物和每个反向引物可以在不同核苷酸位置终止，如此以使引物重叠至少一个核苷酸。探针52a和52b可以用各自的光致发光团60a和60b标记，光致发光团60a和60b是光学地可区分的。探针通过结合与每个探针互补的同一接纳体54的拷贝可以在室温被分子间猝灭，如报告子130a和130b。在其它实施方案中，可以在单重测定中定量任一等位基因。
在其它实施方案中，可以将未标记的引物用于等位基因特异性扩增，且可以将通用报告子(如，嵌入染料)用于标记由一个或两个靶标的扩增产生的一个或更多个扩增子。通过调整一种或更多种引物浓度和/或引物解链温度以使得对靶标之一阳性的分区的信号幅度可与对其它靶标阳性的分区的信号幅度区分开(且，任选地，可与对两个靶标都阳性的分区的信号幅度区分开)，可以在多重测定中一同测定两个靶标。
实施例15.无探针降解的探针取代测定
本实施例描述用于靶标测定的示例性策略，在所述靶标测定中由于引物被并入扩增子中，探针被转移但不降解；参见图28-31。
图28示出在测定中使用的示例性报告子350a、b。报告子各自包含探针352a、b和引物354a、b。该探针继而各自包含至少探针寡聚体358a、b、一个或更多个发光团360a、b，及一个或更多个猝灭剂362a、b。该引物继而各自包含至少引物寡聚体364a、b。每个报告子的探针寡聚体和引物寡聚体可以是部分或完全互补的，且在低于报告子的解链温度能够彼此碱基配对。将发光团和猝灭剂放置在每个探针上如此使得当探针结合到各自引物时比当探针未结合时探针更加发光(即，产生更多的光致发光)。具体地，当探针结合到引物时，将发光团和猝灭剂(一个保持分离，减少了猝灭剂对发光团的发光的影响。与之相比，当探针未结合时，因为如下原因没有将发光团和猝灭剂保持分离(尽管仍结合到同一寡核苷酸上)，且可以来到靠近得足以使得猝灭剂减少或消除来自发光团的发光的距离：因为系统高于探针和引物对的解链点，或因为至少某个引物不可用于结合探针，这是因为该引物已经在扩增期间被并入扩增子。可以将发光团和猝灭剂，以各自任何的适当数量，放置在能够产生以上描述的作用的探针上的任何适当位置。
图28和29示出由扩增产生的示例性构造。通常在扩增反应完成时且对于基于微滴的测定，在扩增前已经分隔成微滴的样品中检测荧光。图28示出在不存在靶标下产生的构造，所述靶标诸如靶标DNA或靶标RNA。在此，该探针保持与引物双链化如此以使相关的发光团和猝灭剂被固定在距彼此一定的距离，产生更高荧光。在微滴测定中，这些构造将对应于无靶标微滴或无DNA/无RNA的对照微滴。与之相比，图29示出在靶标存在下产生的构造。在此，引物已经被并入扩增子，留下过量探针自由漂浮并自猝灭。换言之，在具有靶标DNA或靶标RNA的样品诸如微滴中，探针将被从引物取代，因为引物成为(PCR-)扩增产物的一部分。一旦探针被从引物中取代，猝灭剂和发光团将自由的直接彼此互相作用，允许猝灭剂猝灭发光团的荧光并减少荧光。因此，阳性信号(即，来自其中发生扩增的对于靶标阳性的样品的信号)将比阴性信号(即，来自其中没有发生扩增的对于靶标阴性的样品的信号)更低。总的测定信号，包括阳性信号和阴性信号，能够通过对两种引物-探针对(如，正向引物和反向引物)都使用同样的荧光团而被增加。相反地，总的测定信号能够通过从引物-探针对之一省略荧光团(或荧光团和猝灭剂二者)而被降低。
图30示出以二维绘制的来自诸如图28和29的测定的测定的代表性数据，该测定利用部分互补于一个引物的FAM标记的探针和部分互补于另一引物的HEX标记的探针获得。图A示出来自包含靶标DNA的样品的结果。结果包括来自对于靶标DNA阴性(“阴性簇”)和阳性(“阳性簇”)的分区的数据簇。阴性簇(在其中探针和引物保持结合)的荧光高于阳性簇(在其中探针未结合或游离在溶液中)的荧光。图B示出来自不包含DNA的对照孔的结果。阴性样品或无靶标样品仅具有微滴的更高荧光的簇。
图31说明如何可将取代探针测定与传统
Figure BDA0001638874480000422
测定组合使用以创建用于阳性360度围绕中心阴性簇的空间。可以通过在每个探针及测定类型上混合不同荧光团或染料达成信号的转换。换言之，信号可以被有目的地改变和/或混合，所述改变通过添加弱或强的猝灭剂，所述混合通过对一个引物-探针对使用一个荧光团并对另一引物-探针-对使用不同荧光团。这继而应增加多重化。
在本实施例描述的测定可以具有几种优势。第一，因为探针和引物彼此结合，允许探针和引物使用相同的序列空间，可以将该探针用于对于传统
Figure BDA0001638874480000421
测定太短的核酸的检测(图28)。第二，该方法通过允许阳性微滴占据阴性微滴周围360度的空间(图31)提供多重技术的可能性。可以将这些探针取代测定用于任何适当的应用；然而，它们对于以下特别有用：(1)检测仅仅对于将在每一侧使用的约15-40个核苷酸长的引物足够长的靶标，(2)增加片段化或被破坏的样品中的DNA或RNA的可扩增的拷贝数目，及(3)15-25个核苷酸长度的微RNA。
可以通过用荧光增强物替代荧光猝灭剂调整本实施例(及其它实施例)中的测定，所述荧光增强物诸如传递能量到荧光团，而不是从中吸收能量的天线。(这可以通过，例如，使用供体和受体对，随后激发供体和受体两者，并最终检测受体荧光完成。)在这个实施例中，这将具有逆转阳性和阴性信号的相对强度的影响，因为扩增导致未结合的探针将使荧光团和增强物靠近，增加而不是降低荧光。
实施例16.选择的实施方案I
本实施例描述测定方法和组合物的选择的实施方案，以一系列标号的段呈现。
1.一种进行测定的方法，所述方法包括：(A)提供分区，所述分区包含：部分占据的靶标、探针和接纳体，所述探针包含光致发光团，所述接纳体结合所述探针以降低所述光致发光团发射光的能力；(B)在所述分区中扩增所述靶标；(C)检测光，所述光至少部分取决于所述光致发光团在所述分区中的存在；及(D)基于检测到的光，确定所述分区中存在的所述靶标的水平。
2.根据段1所述的方法，其中扩增的步骤用一种或更多种引物进行，且其中所述探针充当用于扩增的步骤的一种或更多种引物之一。
3.根据段2所述的方法，其中扩增的步骤用第一引物和第二引物进行，所述第一引物和第二引物界定由扩增的步骤产生的扩增子的相反末端，其中所述探针是所述第一引物，且其中所述第二引物与所述光致发光团的猝灭剂缀合。
4.根据段3所述的方法，其中所述接纳体包含寡核苷酸，所述寡核苷酸与所述第一引物互补。
5.根据段4所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述光致发光团的猝灭剂缀合。
6.根据段1到5中任一项所述的方法，其中提供分区的步骤包括提供包含探针对的分区的步骤，其中扩增的步骤用探针对实行,所述探针对的每个探针包含不同光致发光团并充当不同靶标的引物，且其中确定的步骤包括确定每个不同靶标水平的步骤。
7.根据段1所述的方法，其中所述探针是包含第一光致发光团的第一探针，还包含第二探针，所述第二探针包含不同的第二光致发光团且被构造为在与第一探针不同的位置结合到靶标。
8.根据段7所述的方法，其中所述第二探针不被所述接纳体结合。
9.根据段8所述的方法，其中所述第二探针与猝灭剂缀合。
10.根据段7到9中任一项所述的方法，其中所述第二探针是引物，所述引物在扩增的步骤期间被延伸。
11.根据段10所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针的每个是在扩增的步骤期间被延伸的不同的引物。
12.根据段7到11中的任一项所述的方法，其中确定所述靶标的水平的步骤是基于从所述第一探针的所述第一光致发光团和所述第二探针的所述第二光致发光团检测到的光进行。
13.根据段7所述的方法，其中仅所述第一探针和所述第二探针之一是在扩增步骤期间被延伸的引物扩增的步骤。
14.根据段13所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针都不是在扩增的步骤期间被延伸的引物。
15.根据段1到14中任一项所述的方法，其中所述分区是微滴。
16.根据段1或15的任一项所述的方法，其中所述探针包含探针寡核苷酸，其中所述接纳体包含接纳体寡核苷酸，且其中所述探针寡核苷酸比所述接纳体寡核苷酸更长和/或所述探针寡核苷酸被构造成与所述靶标形成比与所述接纳体寡核苷酸更多数目的碱基对。
17.根据段1到16中任一项所述的方法，其中多个所述分区不包含相应于所述靶标的模板的拷贝。
18.根据段1到17中任一项所述的方法，其中多个所述分区仅包含一个拷贝的相应于所述靶标的双链或单链模板。
19.根据段1到18中任一项所述的方法，其中提供分区的步骤包括提供在其中通过互补链对形成所述靶标的分区的步骤。
20.根据段1到19中任一项所述的方法，其中所述接纳体包含寡核苷酸，且其中所述寡核苷酸特异性地结合所述探针。
21.根据段1到20中任一项所述的方法，其中所述接纳体包含所述光致发光团的猝灭剂。
22.根据段21所述的方法，其中所述猝灭剂基本上不光致发光。
23.根据段21所述的方法，其中所述猝灭剂是光致发光的，且其中所述检测光的步骤包括检测由所述猝灭剂发射的光的步骤。
24.根据段20到23中任一项所述的方法，其中所述猝灭剂与所述寡核苷酸的3’端缀合。
25.根据段20到23中任一项所述的方法，其中所述猝灭剂在所述寡核苷酸的5’端和3’段之间的内部位置。
26.根据段1到25中任一项所述的方法，其中至少两种不同的靶标在所述分区中被扩增，其中所述分区的一个或更多个包含所述靶标的每个，且其中每个靶标的水平被确定。
27.根据段1到26中任一项所述的方法，其中所述接纳体不包括所述光致发光团的猝灭剂。
28.根据段1到27中任一项所述的方法，其中所述光致发光团是荧光团，且其中所述检测光的步骤包括检测所述荧光团的荧光的步骤。
29.根据段1到28中任一项所述的方法，其中所述探针能够特异性结合所述靶标的区域。
30.根据段1到29中任一项所述的方法，其中所述探针包含寡核苷酸，且其中所述猝灭剂和所述光致发光团各自连接到所述寡核苷酸的相反端。
31.根据段1到30中任一项所述的方法，其中提供分区的步骤包括提供被连续液相环绕的分区的步骤。
32.根据段31所述的方法，其中所述连续液相与所述分区不混溶。
33.根据段31或32所述的方法，其中所述连续液相至少主要包括油。
34.根据段1到33中任一项所述的方法，其中提供分区的步骤包括提供在其中所述接纳体以较所述探针更高的浓度存在的分区的步骤。
35.根据段1到34中任一项所述的方法，其中将所述接纳体被构造成促进所述探针的分子内猝灭。
36.根据段35所述的方法，其中单个拷贝的所述接纳体被构造成环化单个拷贝的所述探针。
37.根据段35所述的方法，其中单个拷贝的所述接纳体被构造成结合两个拷贝的所述探针，且其中单个拷贝的所述探针被构造成结合两个拷贝的所述接纳体。
38.根据段1到37中任一项所述的方法，其中提供分区的步骤包括提供包含比所述探针更多拷贝的所述接纳体的分区的步骤。
39.根据段1到38中任一项所述的方法，其中提供分区的步骤包括提供分区的步骤，所述分区包含足够基本上结合在每个分区中的所有所述探针的量的所述接纳体。
40.根据段1到39中任一项所述的方法，其中扩增的步骤包括热循环所述分区的步骤。
41.根据段40所述的方法，其中扩增的步骤包括进行聚合酶链式反应的步骤。
42.根据段1到41中任一项所述的方法，其中扩增的步骤包括产生相应于所述靶标的扩增子，且其中所述探针结合到所述扩增子的区域的步骤。
43.根据段1到42中任一项所述的方法，其中检测光的步骤在所述靶标的扩增已经达到终点之后进行。
44.根据段1到43中任一项所述的方法，其中所检测到的光至少部分由所述光致发光团发射。
45.根据段1到43中任一项所述的方法，其中所检测到的光至少部分由所述光致发光团的能量传递伴侣发射。
46.根据段1到45中任一项所述的方法，还包括用激发所述光致发光团的光照射所述分区的步骤。
47.根据段1到46中任一项所述的方法，还包括确定对于所述靶标的扩增是阳性或阴性的分区的比例的步骤，且其中确定水平的所述步骤是基于所述比例。
48.根据段1到47中任一项所述的方法，其中确定水平的所述步骤包括确定所述靶标浓度的步骤。
49.根据段1到48中任一项所述的方法，其中所述接纳体结合到所述探针以形成具有解链温度的报告子，且其中扩增的步骤用保持在高于所述报告子的所述解链温度的所述分区进行。
50.根据段49所述的方法，其中所述解链温度低于50摄氏度。
51.根据段49或50所述的方法，其中所述检测光的步骤用在低于所述报告子的所述解链温度的所述分区进行。
52.根据段1所述的方法，其中所述分区包含所述靶标的第一等位基因和/或第二等位基因的模板拷贝，其中扩增的步骤用正向引物和反向引物进行，所述正向引物和反向引物当相对于所述第二等位基因的模板结合到所述第一等位基因的模板时各自选择性的可延伸，且其中所述探针是所述正向引物或所述反向引物。
53.根据段52所述的方法，其中所述正向引物和所述反向引物重叠至少一个核苷酸。
54.根据段52所述的方法，其中所述正向引物和所述反向引物在所述第一等位基因和第二等位基因之间的核苷酸变异的位点重叠。
55.根据段54所述的方法，其中所述正向引物和所述反向引物的每个在所述核苷酸变异位点终止。
56.根据段52到55中任一项所述的方法，其中所述接纳体包括所述光致发光团的猝灭剂。
57.根据段52到56中任一项所述的方法，其中所述探针是第一探针，还包括第二探针，所述第二探针当相对于所述第一等位基因的模板结合到所述第二等位基因的模板时作为引物选择性地可延伸。
58.根据段57所述的方法，其中所述接纳体结合到所述第二探针。
59.进行测定的方法，所述方法包括：(A)提供微滴，所述微滴包含：部分占据的靶标、探针、和寡核苷酸所述探针具有光致发光团和所述光致发光团的猝灭剂，所述寡核苷酸结合所述探针以减少所述光致发光团发射光的能力；(B)在所述微滴中扩增所述靶标；(C)检测至少部分由所述光致发光团发射的光；及(D)基于检测到的光，确定所述靶标的水平。
60.进行测定的方法，所述方法包括：(A)形成反应混合物，所述反应混合物包含：靶标、探针、和第一寡核苷酸，所述探针具有光致发光团和所述光致发光团的猝灭剂，所述第一寡核苷酸结合所述探针以减少所述光致发光团发射光的能力，其中所述探针包括第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸被构造为结合扩增子的区域；(B)扩增所述靶标以产生所述扩增子；及(C)检测至少部分由所述光致发光团发射的光。
61.根据段60所述的方法，还包括形成分区的步骤，所述分区包含所述反应混合物的部分，其中扩增的步骤在多个分区中进行，且其中检测光的步骤包括检测来自多个所述分区的光的步骤。
62.根据段60或61所述的方法，其中所述形成分区的步骤包括融合微滴的步骤。
63.根据段60到62中任一项所述的方法，其中所述形成分区的步骤包括形成微滴的步骤。
64.根据段60到63中任一项所述的方法，其中所述反应混合物是乳液的分散相。
65.一种进行测定的方法，所述方法包括：(A)形成反应混合物，所述反应混合物包含：靶标的模板、探针和接纳体，所述探针包括光致发光团，所述接纳体结合所述探针以减少所述光致发光团发射光的能力；(B)在所述反应混合物中扩增所述靶标，所述扩增至少部分通过延伸所述探针进行；(C)检测光，所述光至少部分依赖于所述光致发光团在所述反应混合物中的存在；及(D)基于检测到的光，确定所述靶标的水平。
66.根据段65所述的方法，其中扩增的步骤产生扩增子并用第一引物和第二引物进行，所述第一引物和第二引物界定所述扩增子的各自末端，其中所述探针是所述第一引物，且其中所述第二引物与所述光致发光团的猝灭剂缀合。
67.根据段65或66所述的方法，其中所述接纳体包含所述光致发光团的猝灭剂。
68.一种组合物，包含：(A)模板；(B)探针，所述探针具有光致发光团；及(C)接纳体，所述接纳体与所述探针互补并结合以减少所述光致发光团发射光的能力。
69.根据段68所述的组合物，所述组合物还包含一种或更多种引物以从所述模板扩增靶标。
70.根据段68所述的组合物，其中所述探针是用于靶标扩增的引物。
71.根据段68到70中任一项所述的组合物，所述组合物还包含聚合酶。
72.根据段71所述的组合物，其中所述聚合酶是热稳定的。
73.根据段68到72中任一项所述的组合物，所述组合物还包含连接酶。
74.根据段68到73中任一项所述的组合物，所述组合物还包含dNTP、NTP或两者。
75.根据段68到74中任一项所述的组合物，其中所述探针包含所述光致发光团的猝灭剂。
76.根据段75所述的组合物，其中所述猝灭剂是第一猝灭剂，且其中所述接纳体包含所述光致发光团的第二猝灭剂。
77.根据段68到76中任一项所述的组合物，其中所述模板、所述探针和所述接纳体被布置在分区中，所述组合物还包含围绕每个所述分区的同样的液体连续相。
实施例17.选择的实施方案II
本实施例描述测定方法和组合物的选择的实施方案，以一系列标号的段呈现。
1.一种分析的方法，所述方法包括：(A)形成包含报告子的至少一个体积，所述报告子包含第一寡聚体和第二寡聚体，所述第一寡聚体和第二寡聚体能够在低于所述报告子的解链温度彼此碱基配对，以影响从所述报告子可检测的光致发光；(B)在所述至少一个体积中扩增靶标，所述扩增至少部分通过在高于所述报告子的所述解链温度的温度延伸一种或更多种引物；(C)检测来自所述至少一个体积的报告子的光致发光，任选地当所述至少一个体积在低于所述报告子的所述解链温度的温度时进行；及(D)基于检测到的光致发光，确定所述靶标的性质。
2.根据段1所述的方法，其中扩增的步骤使用所述第一寡聚体作为引物。
3.根据段2或段3所述的方法，其中所述第一寡聚体包含光致发光团，所述光致发光从所述光致发光团检测。
4.根据段1到3中任一项所述的方法，其中所述第一寡聚体与所述靶标完全互补。
5.根据段1到4中任一项所述的方法，其中所述第二寡聚体包含光致发光团，所述光致发光从所述光致发光团检测，且其中所述第一寡聚体包含所述光致发光团的能量传递伴侣。
6.根据段5所述的方法，其中所述能量传递伴侣是猝灭剂。
7.根据段1到6中任一项所述的方法，其中所述第一寡聚体具有比所述第二寡聚体更长的碱基包含单元的链。
8.根据段1到7中任一项所述的方法，其中所述第一寡聚体与靶标形成杂合体，所述杂合体具有比所述报告子的所述解链温度更高的解链温度的。
9.根据段8所述的方法，其中所述更高的解链温度比所述报告子的所述解链温度高至少10度。
10.根据段1到4和7到9中任一项所述的方法，其中所述第一寡聚体包含光致发光团，所述光致发光从所述光致发光团检测，且还包含所述光致发光团的能量传递伴侣，且其中所述第二寡聚体不包含所述光致发光团的能量传递伴侣。
11.根据段1到10中任一项所述的方法，其中当所述第一寡聚体和所述第二寡聚体彼此碱基配对时，所述报告子的光致发光减少。
12.根据段1到4和7到11中任一项所述的方法，其中所述第一寡聚体包含光致发光团，所述光致发光从所述光致发光团检测，且其中将所述光致发光团的能量传递伴侣包含在所述第二寡聚体中。
13.根据段12所述的方法，其中所述能量传递伴侣是猝灭剂。
14.根据段12或段13所述的方法，其中所述光致发光团的能量传递伴侣包含在所述第一寡聚体中。
15.根据段1至14中任一项所述的方法，其中所述性质是所述靶标的水平。
16.根据段1到15中任一项所述的方法，其中扩增的步骤引起所述第一寡聚体、所述第二寡聚体或所述第一寡聚体和所述第二寡聚体两者的切割，且其中所述切割影响所述检测到的光致发光。
17.根据段1到16中任一项所述的方法，其中形成至少一个体积的步骤包括形成包含部分占据的靶标的多个分区的步骤。
18.根据段17所述的方法，其中扩增的步骤包括暴露所述多个分区于多个热循环的步骤，且其中在整个多个热循环期间将所述分区持续地保持在高于所述报告子的所述解链温度。
19.根据段1到3和5到18中任一项所述的方法，其中所述第一寡聚体具有(a)专用于与所述靶标碱基配对的区域，如此以使所述第一寡聚体作为所述一种或更多种引物中包含的引物发挥功能，及(b)专用于与所述第二寡聚体且不与所述靶标碱基配对的另一个区域。
20.根据段1到19中任一项所述的方法，其中所述第一寡聚体或所述第二寡聚体包含碱基包含单元的链，且其中光致发光团被附连到所述链的5’端。
21.根据段1到4和7到20中任一项所述的方法，其中所述第一寡聚体包含光致发光团，所述光致发光从所述光致发光团检测，且其中所述第二寡聚体与所述靶标完全互补。
22.根据段1到21中任一项所述的方法，其中所述报告子的所述解链温度低于约45摄氏度。
23.根据段1到4和6到22中任一项所述的方法，其中所述第一寡聚体包含光致发光团，其中所述第二寡聚体包含碱基包含单元的链，且其中所述第二寡聚体包含所述光致发光团的能量传递伴侣。
24.根据段23所述的方法，其中所述能量传递伴侣附连到所述链的3’端。
25.根据段23所述的方法，其中所述能量传递伴侣附连到所述链的非末端单元。
26.根据段23所述的方法，其中所述能量传递伴侣附连到所述链的5’端。
27.根据段1到26中任一项所述的方法，其中当所述第一寡聚体和所述第二寡聚体彼此碱基配对时，所述第二寡聚体具有与所述第一寡聚体的一个或更多个错配。
28.根据段1到27中任一项所述的方法，其中所述第一寡聚体和所述第二寡聚体的每个与所述靶标至少部分互补。
29.根据段28所述的方法，其中所述第二寡聚体具有与所述靶标的一个或更多个错配。
30.根据段1到29中任一项所述的方法，其中当所述寡聚体彼此碱基配对时，所述第一寡聚体的3’端与所述第二寡聚体的5’端对齐。
31.根据段1到30中任一项所述的方法，其中当所述寡聚体彼此碱基配对时，所述第一寡聚体的5’端与所述第二寡聚体的3’端对齐。
32.根据段1到29和31中任一项所述的方法，其中当所述寡聚体彼此碱基配对时，所述第一寡聚体的3’端与所述第二寡聚体的内部碱基包含单元对齐。
33.根据段1到30和32中任一项所述的方法，其中当所述寡聚体彼此碱基配对时，所述第一寡聚体的5’端与所述第二寡聚体的内部碱基包含单元对齐。
34.根据段1到30、32和33中任一项所述的方法，其中当所述寡聚体彼此碱基配对时，所述第二寡聚体的3’端与所述第一寡聚体的内部碱基包含单元对齐。
35.根据段1到29和31到34中任一项所述的方法，其中当所述寡聚体彼此碱基配对时，所述第二寡聚体的5’端与所述第一寡聚体的内部碱基包含单元对齐。
36.根据段1到35中任一项所述的方法，所述报告子是第一报告子，还包含第二报告子，所述第二报告子包含寡聚体对，所述寡聚体对能够在低于所述第二报告子的解链温度彼此碱基配对，以影响从所述第二报告子可检测且任选地与从所述第一报告子可检测的光致发光可区分的光致发光，其中扩增靶标的步骤包括延伸正向引物的步骤和延伸反向引物的步骤，所述正向引物至少部分由所述报告子之一提供，所述反向引物至少部分由另一报告子提供，且其中基于从所述第一报告子和第二报告子的每个检测到的光致发光确定所述靶标的所述性质。
37.根据段1所述的方法，其中所述第一寡聚体包括光致发光团，从所述光致发光团检测光致发光，且还包括所述光致发光团的能量传递伴侣(和/或所述光致发光团的其它调节剂)。
38.根据段37所述的方法，其中所述能量传递伴侣是猝灭剂。
39.根据段37或38所述的方法，其中当所述第一寡聚体和所述第二寡聚体彼此碱基配对时，所述报告子的光致发光增加。
40.根据段37到39中任一项所述的方法，其中扩增靶标的步骤使用所述第二寡聚体作为引物。
41.根据段37到40中任一项所述的方法，其中所述第二寡聚体不包含所述光致发光团的能量传递伴侣。
42.根据段37到41中任一项所述的方法，其中扩增靶标的步骤不降解所述第一寡聚体，或任选地至少不在化学计量学上降解所述第一寡聚体。
43.根据段37到42中任一项所述的方法，其中扩增靶标的步骤增加第一寡聚体的数目，所述第一寡聚体不与第二寡聚体结合。
44.根据段37到43中任一项所述的方法，其中所述第一寡聚体具有比所述第二寡聚体更短的碱基包含单元的链。
45.根据段37到44中任一项所述的方法，其中所述第一寡聚体包含第二光致发光团和所述光致发光团的第二能量传递伴侣的至少之一。
46.根据段37到45中任一项所述的方法，其中检测所述报告子的光致发光的步骤在所述至少一个体积在低于所述报告子的所述解链温度的温度时进行。
47.根据段37至46中任一项所述的方法，其中所述性质是所述靶标的水平。
48.根据段37到47中任一项所述的方法，其中形成至少一个体积的步骤包括形成多个分区的步骤，所述多个分区包含部分占据的靶标。
49.根据48所述的方法，其中所述分区是微滴。
50.根据段48或49所述的方法，其中扩增的步骤包括暴露所述多个分区于多个热循环的步骤，且其中在整个多个热循环期间将所述分区持续地保持在高于所述报告子的所述解链温度。
51.根据段37到50中任一项所述的方法，所述报告子是第一报告子，还包含第二报告子，所述第二报告子包含寡聚体对，所述寡聚体对能够在低于所述第二报告子的解链温度彼此碱基配对，以影响从所述第二报告子可检测且任选地与从所述第一报告子可检测的光致发光可区分的光致发光，其中扩增靶标的步骤包括延伸正向引物的步骤和延伸反向引物的步骤，所述正向引物至少部分由所述报告子之一提供，所述反向引物至少部分由另一报告子提供，且其中基于从所述第一报告子和第二报告子的每个检测到的光致发光确定所述靶标的所述性质。
52.根据段37到51中任一项所述的方法，所述方法还包括与段37到51的限定不一致的段2到36的一种或更多种限定，包括但不限于描述以下的限定：光致发光团和所述光致发光团的能量传递伴侣的放置、扩增子和检测的细节、所述第一寡聚体和所述第二寡聚体的相对对齐、所述第一和第二寡聚体和所述靶标间错配的存在等等。
53.一种分析的方法，所述方法包括：(A)形组分区，所述分区每个包含报告子，所述报告子包含第一寡聚体且还包含第二寡聚体，所述第一寡聚体具有光致发光团，所述第二寡聚体能够与所述第一寡聚体在低于所述报告子的解链温度碱基配对，以通过能量传递减少从所述光致发光团可检测的光致发光；(B)暴露所述分区到多个热循环，以扩增靶标序列，所述扩增至少部分通过在高于所述报告子的所述解链温度的温度延伸一种或更多种引物进行，其中所述靶标序列仅在所述分区的子集中存在；(C)在所述分区在低于所述报告子的所述解链温度的温度时对多个所述分区的每个分区检测所述光致发光团的所述光致发光；及(D)基于检测到的所述光致发光确定所述靶标的性质。
54.根据段53所述的方法，其中在整个所述多个热循环期间将所述分区持续地保持在高于所述报告子的所述解链温度。
55.根据段53或段54所述的方法，其中所述第一寡聚体是引物，所述引物被包含在所述一种或更多种引物中。
56.根据段53至55中任一项所述的方法，其中所述光致发光团包含在所述第一寡聚体中。
57.根据段53至56中任一项所述的方法，其中所述光致发光团的猝灭剂包含在所述第二寡聚体中。
58.根据段53至57中任一项所述的方法，其中所述光致发光团的猝灭剂被包含在所述第一寡聚体中。
59.一种组合物，包含：多个分区，所述分区包含部分占据的靶标和扩增所述靶标的扩增试剂且还包含检测靶标扩增的报告子，所述报告子包含第一寡聚体和第二寡聚体，所述第一寡聚体具有光致发光团，所述第二寡聚体与所述第一寡聚体碱基配对以影响从所述光致发光团可检测的光致发光。
以上列举的本公开内容可以涵盖具有独立用途的多种有区别的发明。尽管这些发明的每一个已经被以其优选形式公开，如在本文公开和说明的其特定实施方案不应考虑为限制的意义，因为无数的变化形式是可能的。本发明的主题包括在本文公开的各种元素、特征、功能、和/或性质的所有新颖和非显而易见的组合和子组合。以下的权利要求特别指出认为新颖和非显而易见的某些组合和子组合。在要求本申请或相关申请的优先权的申请中，可以要求保护以特征、功能、元素、和/或性质的其它组合和子组合体现的发明。这样的权利要求，无论指向不同发明还是相同发明，且无论范围比原始权利要求的更宽、更窄、等同或不同，也被认为包括在本公开内容的发明的主题内。进一步，用于标识元素的序数指示符，诸如第一、第二或第三，用以区别元素，且不指示这些元素的特定位置或顺序，除非另行特别声明。
序列表
<110> 伯乐生命医学产品有限公司
<120> 具有碱基配对的寡聚体的扩增报告子
<130> QLI 353
<150> US 61/864,788
<151> 2013-08-12
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCND1探针和引物
<220>
<221> FAM
<222> (1)..(1)
<223> 缀合至第一个残基的羧基荧光素标记物
<400> 1
tatctgaggg gcgggagag 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 2
gaggtcacga cattttagcg 20
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接纳体
<220>
<221> IB
<222> (13)..(13)
<223> 缀合至最后一个残基的Iowa Black(R)暗猝灭剂
<400> 3
cgcccctcag ata 13
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCND1的正向引物
<400> 4
acattgattc agcctgtttg g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCND1的反向引物
<400> 5
gaattcatcg gaaccgaact t 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCND1的探针
<220>
<221> FAM
<222> (1)..(1)
<223> 缀合至第一个残基的羧基荧光素标记物
<220>
<221> IB
<222> (22)..(22)
<223> 缀合到最后一个残基的Iowa Black(R)暗猝灭剂
<400> 6
tccttgcacc catgcctgtc ca 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K-Ras的正向引物
<400> 7
agaagcaatg ccctctcaag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K-Ras的反向引物
<400> 8
aaacaggctc aggacttagc 20
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K-Ras探针
<220>
<221> HEX
<222> (1)..(1)
<223> 缀合至第一个残基的六氯荧光素标记物
<220>
<221> IB
<222> (26)..(26)
<223> 缀合至最后一个残基的Iowa Black(R)暗猝灭剂
<400> 9
attgaaacat cagcaaagac aagaca 26
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K-Ras探针
<220>
<221> FAM
<222> (1)..(1)
<223> 缀合至第一个残基的羧基荧光素标记物
<220>
<221> IB
<222> (27)..(27)
<223> 缀合至最后一个残基的Iowa Black(R)暗猝灭剂
<400> 10
ttgaaacatc aacaaagaca agacagg 27
<210> 11
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接纳体
<220>
<221> IB
<222> (13)..(13)
<223> 缀合至最后一个残基的Iowa Black(R)暗猝灭剂
<400> 11
gttgatgttt caa 13
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K-Ras探针
<220>
<221> HEX
<222> (1)..(1)
<223> 缀合至第一个残基的六氯荧光素标记物
<400> 12
attgaaacat cagcaaagac aagaca 26
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K-Ras探针
<220>
<221> FAM
<222> (1)..(1)
<223> 缀合至第一个残基的羧基荧光素标记物
<400> 13
ttgaaacatc aacaaagaca agacagg 27

Claims (26)

1.一种分析的方法，所述方法包括：
形成分区，所述分区各自包含报告子，所述报告子包含彼此不共价连接的第一寡聚体和第二寡聚体，所述第一寡聚体和所述第二寡聚体中的一个寡聚体包含光致发光团并且所述第一寡聚体和所述第二寡聚体中的另一个寡聚体包含所述光致发光团的猝灭剂，所述第一寡聚体和所述第二寡聚体能够在低于所述报告子的解链温度彼此碱基配对以通过猝灭减少来自所述光致发光团的可检测的光致发光，其中核酸靶标仅存在于所述分区的子集中；
暴露所述分区于多个热循环以使用所述第一寡聚体作为扩增引物扩增所述核酸靶标，所述第一引物在高于所述报告子的所述解链温度延伸；
当所述分区在低于所述报告子的所述解链温度的温度时，检测多个所述分区的每个分区的所述光致发光团的光致发光；及
基于检测到的所述光致发光确定所述核酸靶标的水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在整个所述多个热循环期间将所述分区持续地保持在高于所述报告子的所述解链温度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡聚体具有比所述第二寡聚体更长的碱基包含单元的链。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡聚体具有(a)专用于与所述核酸靶标碱基配对的区域，及(b)专用于与所述第二寡聚体碱基配对的另一个区域。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡聚体与所述核酸靶标形成杂合体，所述杂合体具有比所述报告子的所述解链温度更高的解链温度。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述更高的解链温度比所述报告子的所述解链温度高至少10度。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡聚体与所述核酸靶标完全互补。
8.根据权利要求1所述的方法，其中当所述第一寡聚体和所述第二寡聚体彼此碱基配对时，所述第一寡聚体的5’端与所述第二寡聚体的3’端对齐。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡聚体具有与所述核酸靶标互补且不与所述第二寡聚体互补的3’引发区域。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述3’引发区域为至少10个核苷酸的长度。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡聚体具有与所述第二寡聚体互补且不与所述核酸靶标互补的5’结合区域。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述5’结合区域为至少十个核苷酸的长度。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡聚体包含所述光致发光团。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二寡聚体包含所述光致发光团。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述分区是微滴。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述微滴被包含在乳液中。
17.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括确定对于所述核酸靶标为阳性的所述多个所述分区的数目或对于所述核酸靶标为阴性的所述多个所述分区的数目的步骤，其中确定水平的步骤使用所述数目。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸靶标在暴露步骤中使用所述第一寡聚体和反向引物被扩增，其中所述第一寡聚体在暴露步骤期间被延伸以形成正向延伸产物，其中暴露步骤包括以所述正向延伸产物用作模板延伸所述反向引物以形成反向延伸产物的步骤，并且其中所述正向延伸产物和所述反向延伸产物彼此的杂交使得所述正向延伸产物不可用于结合所述第二寡聚体。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述分区当形成时包含相对于所述第一寡聚体摩尔过量的所述第二寡聚体。
20.根据权利要求1所述的方法，其中检测步骤在所述核酸靶标的扩增已经达到终点之后进行。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一寡聚体被构造成与所述核酸靶标形成比与所述第二寡聚体更多数目的碱基对。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述猝灭剂不光致发光的。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述光致发光团是荧光团。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述报告子的所述解链温度低于50摄氏度。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述光致发光团是包含在所述第一寡聚体中的第一光致发光团，其中所述分区的每个包含第三寡聚体，所述第三寡聚体包含第二光致发光团，其中所述第二寡聚体和所述第三寡聚体能够彼此碱基配对以减少所述第二光致发光团的光致发光，其中所述第一寡聚体是针对所述核酸靶标的第一等位基因的扩增引物，其中所述第三寡聚体是针对所述核酸靶标的第二等位基因的扩增引物，其中检测步骤包括检测所述第一光致发光团的光致发光和所述第二光致发光团的光致发光的步骤，并且其中确定步骤包括基于检测到的所述第一光致发光团的光致发光确定所述核酸靶标的所述第一等位基因的水平的步骤和基于检测到的所述第二光致发光团的光致发光确定所述核酸靶标的所述第二等位基因的水平的步骤。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一寡聚体和所述第三寡聚体中的每个是正向引物，且其中暴露步骤包括用不同的等位基因特异性反向引物扩增所述第一等位基因和所述第二等位基因的步骤。
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