DE102010052524A1

DE102010052524A1 - Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen in Echtzeit

Info

Publication number: DE102010052524A1
Application number: DE201010052524
Authority: DE
Inventors: Dr. Graser Elmara; Timo Hildebrand
Original assignee: AJ Innuscreen GmbH
Current assignee: AJ Innuscreen GmbH
Priority date: 2010-11-22
Filing date: 2010-11-22
Publication date: 2012-05-24
Also published as: WO2012069484A2; WO2012069484A3

Abstract

Das Verfahren und Testkit dient dem qualitativen und quantitativen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen in Echtzeit. Gegenstand der Erfindung ist die Nutzung einer nur mit einem Fluorochrom (Fluorophor) markierten DNA-Sonde, wobei die mit dem Fluorophor markierte Base sich immer in räumlicher Nähe zu einer Guaninbase befindet und so – ohne Verwendung eines Quencherfarbstoffes – das Fluorophor quencht. Mittels Primern wird unter Hybridisierungsbedingungen ein Gemisch von Duplexen zu erzeugen, wobei die Duplexe die Ziel-Nullleinsäure, angelagert an das markierte Oligonukleotid (Sonde), umfassen. Durch Zugabe einer Polymerase mit Exonukleaseaktivität, die das angelagerte markierte Oligonukleotid (Sonde) zwischen der Fluorophor-Markierung und der Guanin-Base schneidet und somit das Quenching aufhebt, wird ein messbares Fluoreszenz-Signal erzeugt.

Description

Das vorgestellte Verfahren dient dem qualitativen und quantitativen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen in Echtzeit und damit der molekularen Diagnostik. Basis des neuartigen Verfahrens ist die Nutzung einer nur mit einem Fluorochrom (Fluorophor) markierten DNA-Sonde, wobei die mit dem Fluorophor markierte Base sich immer in räumlicher Nähe zu einer Guaninbase befindet. In einer besonders effizienten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden für eine qualitative oder quantitative Echtzeitmessung einer spezifischen Targetnukleinsäure zwei Sonden eingesetzt. Dadurch kann eine deutliche Verstärkung der Nachweissensitivität und Signalstärke erzeugt werden.
Stand der Technik
Die Gendiagnostik ist zu einem unverzichtbaren Bestandteil der modernen medizinischen Labordiagnostik, der forensischen Diagnostik, der veterinärmedizinischen Labordiagnostik oder der Lebensmittel- und Umweltdiagnostik geworden.
Revolutioniert wurde die genetische Diagnostik mit der Erfindung der PCR-Technologie, die es gestattet, jede beliebige Nukleinsäuresequenz spezifisch zu vervielfachen.
Diese Technologie besitzt aber neben ihren eindeutigen Vorteilen (wie Sensitivität, Spezifität) auch ihre Nachteile. Für die Durchführung der Amplifikationsreaktion werden teure Gerate benötigt, die den schnellen Temperaturwechsel gewährleisten können; die Ergebnisse der Amplifizierung bzw. die mit der Amplifizierung gekoppelte Sondenhybridisierung müssen ebenfalls mittels teurer und aufwendig zu bedienender Labortechnik ausgewertet werden. Hierbei ist eine „einfache” Visualisierung mittels Gelelektrophorese manchmal wegen ihrer Ungenauigkeit unzureichend.
Eine weit verbreitete Methode zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuren ist z. B. die Light Cycler Technologie (Fa. Roche). Die Firma Roche entwickelte dazu spezielle Hybridisierungssonden bestehend aus zwei verschiedenen Oligonukleotiden, die jeweils mit nur einem Fluorochrom markiert sind. Am 3'-Ende der einen Sonde befindet sich der Akzeptor, das andere Oligonukleotid ist am 5'-Ende mit einem Donor versehen. Die Sonden werden so gewählt, dass sie beide an den gleichen DNA Strang binden, wobei der Abstand zwischen Akzeptor und Donor nur maximal 1 bis 5 Nukleotide betragen darf, damit es zum sog. FREI-Effekt kommen kann. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt während des Annealingschrittes, wobei nur Licht dieser Wellenlänge nachweisbar ist, solange beide Sonden an die DNA gebunden sind und sich in räumlicher Nähe befinden. Der Schmelzpunkt beider Sonden sollte bei diesem System identisch sein. Durch die Verwendung zweier hybridisierender Sonden zusätzlich zu den verwendeten Primern ist die Spezifität dieses Detektionssystems äußerst hoch.
Eine weitere Real-Time PCR Anwendung zum Nachweis spezifischer Nukleinsäure-Targets kann mit sog. Double Dye Sonden, welche in der Patentschrift US 5210015 und US 5487972 offenbart sind (TaqMan-Sonden), durchgeführt werden. Double Dye Sonden tragen zwei Fluorochrome auf einer Sonde. Der Reporterfarbstoff befindet sich hier am 5'-Ende, der Quencherfarbstoff am 3'-Ende. Zusätzlich befindet sich am 3'-Ende der Sonde eventuell noch eine Phosphatgruppe, damit die Sonde bei der Elongation nicht als Primer fungieren kann. Solange die Sonde intakt ist, ist die freigesetzte Lichtstarke gering, da fast die gesamte Lichtenergie, die nach der Anregung des Reporters entsteht, aufgrund der räumlichen Nähe vom Quencher aufgenommen und umgeformt wird. Das emittierte Licht des Reporterfarbstoffes wird „gequenched”, d. h. gelöscht. Dieser FREI-Effekt bleibt auch erhalten, nachdem die Sonde an den komplementären DNA-Strang gebunden hat. Während der Elongationsphase trifft die Polymerase auf die Sonde und hydrolysiert sie. Man bezeichnet die Fähigkeit der Polymerase, ein Oligonukleotid (bzw. eine Sonde) während der Strangsynthese zu hydrolysieren, als 5'-3' Exonukleaseaktivität. Nicht alle Polymerasen haben eine 5'-3' Exonukleaseaktivität (Taq- und Tth-Polymerase). Als erstes wurde dieses Prinzip für die Taq-Polymerase beschrieben. Das Prinzip wird als TaqMan-Prinzip bezeichnet. Nach Sondenhydrolyse befindet sich der Reporterfarbstoff nicht mehr in räumlicher Nähe zum Quencher. Die emittierte Fluoreszenz wird jetzt nicht mehr umgeformt, dieser Fluoreszenzanstieg wird gemessen.
Eine weitere Möglichkeit zum spezifischen Nachweis von Amplifikationsprodukten mittels Real-Time PCR Technologie besteht in der Nutzung von interkalierenden Farbstoffen (Ethidiumbromid, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR Green^TM u. ä.). Eine klare Differenzierung zwischen spezifischem Amplifikationsereignis bzw. Artefakt ist aber zwingend notwendig. Um dies dennoch zu erreichen, nutzt man eine sog. Schmelzpunktanalyse am Ende der eigentlichen PCR-Reaktion.
Mittels Real-Time PCR Anwendungen ist es darüber hinaus auch möglich, eine Quantifizierung der nachzuweisenden Targets durchzuführen.
Wie schon aufgeführt, ist die Nutzung des sog. TaqMan-Assays Stand der Technik. Dieses elegante Verfahren der Echtzeit- Messung von Targetnukleinsäuren wird weltweit für die qualitative und quantitative molekulare Diagnostik eingesetzt. Allerdings sind die dafür einzusetzenden Sonden durch die benötigten zwei Markierungen teuer.
Es ist bekannt, dass die Base Guanin als Fluoreszenz-Akzeptor fungiert und dass die Fluoreszenz einiger Fluorophore infolge der Interaktion mit Guanin gequencht wird (Cooper et al. (1990) "Analysis of fluorescence energy-transfer in duplex and branched DNA-molecules." Biochemistry 29: 9261–9268.; Lee et al. (1994) "A fluorometric assay for DNA cleavage reactions characterized with BamHI restriction endonuclease." Anal. Biochem. 220: 377–383., Horn T et al. (1997) "Chemical synthesis and characterization of branched oligodeoxyribonucleotides (bDNA) for use as signal amplifiers in nucleic acid quantification assays." Nucleic Acids Res. 25: 4842–4849.).
Maruyama et al. beschreiben in "Mutation detection in DNA oligonucleotides based an a guanine quenching method coupled with enzymatic digestion of single-stranded DNA" Biotechnology Letters (2005) 27: 1349–1354, die Bestimmung von G > T-Mutationen mittels Guanin-Quenching. Guanin-Quenching ermöglicht dabei die DNA-Hybridisierung zu beobachten und Punktmutationen zu bestimmen. Der entstehende Duplex wird dabei mittels T7-Endonuklease gespalten.
Genauere Untersuchungen zum Guanin-Quenching sind von Torimura et al. in Analytical Sciences (2001) Vol. 17, S. 155ff. durchgeführt worden.
Bisher ist in keinem Real-Time PCR-Verfahren das Guanin-Quenching unter Verwendung einer Polymerase mit 5'-3' Exonukleaseaktivität beschrieben worden.
Aufgabe der Erfindung
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen zu vereinfachen.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
Überraschenderweise zeigt sich in einem Versuchsausbau, dass eine Echtzeitmessung von Targetnukleinsäuren auch möglich ist, wenn man kein Double Dye Sonden System, wie in US5.538848 beschrieben, verwendet. Es zeigte sich, dass bei Verwendung einer nur mit einem Fluorochrom markierten Sonde ein FRET-Effekt genutzt werden kann. Erfindungsgemäß wird dabei gerade eine Variante genutzt, die eigentlich bei TaqMan-Sonden eine Limitierung darstellt und dort nie eingesetzt wird. Dies betrifft die Positionierung des Reporterfarbstoffes in direkter räumlicher Nähe zu einer Guaninbase.
Eine solche Anordnung zeigt genau den Effekt, den ein Double Dye Sonden System zum Prinzip hat. Solange die Sonde intakt ist, ist die freigesetzte Fluoreszenz gering, da fast die gesamte Energie, die nach der Anregung des Reporters entsteht, aufgrund der räumlichen Nähe vom Quencher aufgenommen und umgeformt wird. Dieses Phänomen wird jetzt durch die Guaninbase erfüllt, d. h. die auf der Sonde befindliche Guaninbase erfüllt erfindungsgemäß die Funktion des Quenchers eines Double Dye Sonden Systems. Das emittierte Licht des Reporterfarbstoffes wird „gequenched”, d. h. gelöscht. Dieser FREI-Effekt bleibt beim erfindungsgemäßen Verfahren auch erhalten, nachdem die Sonde an den komplementären DNA-Strang gebunden hat. Alle nachfolgenden Schritte der Reaktion laufen dann genauso ab, wie bei dem bekannten TaqMan-Assay. Unter Nutzung von Polymerasen, vorzugsweise mit 5'-3'-Exonukleaseaktivität, wird während der Elongationsphase die Sonde hydrolysiert, wobei das Fluorochrom der Sonde nicht mehr in räumlicher Nähe zur quenchenden Guaninbase ist.
Die emittierte Fluoreszenz wird jetzt nicht mehr umgeformt und der Fluoreszenzanstieg wird gemessen.
Für jede angesetzte Sonde wird wie bei anderen Echtzeit-Technologien ein sog. C_T-Wert ermittelt. Der Schnittpunkt zwischen der Fluoreszenz der Probe und dem Schwellenwert (Hintergrundfluoreszenz) projiziert auf die Abzisse wird als Cycle-threshold (C_T) bezeichnet und stellt den niedrigsten messbaren positiven Wert der Real-Time PCR dar. Der C_T-Wert gibt also eine Zyklenanzahl an. Er steht in direkter Beziehung zur Ausgangsmenge der eingesetzten DNA. Ist der C_T-Wert niedrig, ist die eingesetzte Menge DNA groß. Ist der C_T-Wert hoch, so ist die Ausgangsmenge an DNA klein. Der C_T-Wert ist daher Grundlage für die Quantifizierung einer Reaktion. Mit dieser Auswertungsmethode ist darüber hinaus auch eine einfache qualitative Aussage über das vorliegen einer spezifischen Targetnukleinsäure möglich. Damit kann eine nur mit einem Farbstoff markierte Sonde in der erfindungsgemäßen Ausführung des Sondendesigns preiswerter einen Echtzeit Nachweis von Nukleinsäuren ermöglichen. Die für eine solche Technologie verfügbaren Gerätesysteme (Real-Time PCR Geräte) können ohne Änderungen eingesetzt werden. Dies betrifft auch die Auswertealgorithmen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf allen diesen Systemen ausgeführt werden.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unterscheidet sich von dem bekannten Taq-Man-Verfahren darin, dass bei der Sonde die mit dem Fluorophor markierte Base sich immer in räumlicher Nähe zu einer Guaninbase befindet – also das, was im Taq-Man-Verfahren gerade ausgeschlossen werden sollte. Räumliche Nähe bedeutet im Sinne der Erfindung, dass sich die Guaninbase ein bis vier Basen neben der Base mit dem Fluorophor auf dem gleichen Strang befindet. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn sich die Guaninbase direkt neben der Base mit dem Fluorophor auf dem gleichen Strang befindet. Unter Verwendung einer Polymerase mit Exonukleaseaktivität wird während der Elongationsphase die Sonde hydrolysiert, wobei das Fluorochrom der Sonde nicht mehr in räumlicher Nähe zur quenchenden Guaninbase ist. Entsprechende Polymerasen mit Exonukleaseaktivität sind dem Fachmann bekannt.
Die eingesetzte Sonde muss mit der zu bestimmenden Sequenz komplementär sein. Der Begriff ”komplementär” ist mit dem Begriff ”komplementär” der Patentschriften US 5210015 und US 5487972 identisch. Ein Komplementär einer Nukleinsäuresequenz liegt vor, wenn es mit der Nukleinsäuresequenz so ausgerichtet ist, dass das 5'-Ende einer Sequenz gepaart ist mit dem 3'-Ende der anderen, in der ”antiparallelen Assoziation” ist. Komplementarität liegt vor, wenn stabile Duplexmoleküle entstehen. Sie können falsch gepaarte Basenpaare oder nicht gepaarte Basen enthalten. Einem Fachmann ist der Begriff ”komplementär” bekannt.
Der entscheidende Grundgedanke der Erfindung ist die Ausnutzung eines an sich beim Taq-Man-Verfahren unerwünschten Effekts, nämlich des Guanin-Quenchings, wobei auf Quencherfarbstoffe verzichtet wird.
Als Markierungen können alle Fluorophore eingesetzt werden, die mit der Base Guanin gequencht werden können. Solche Fluorophore sind Stand der Technik. Als Beispiel seien hier FAM, FITC, BODIPY FL, TAMRA oder die CCP-Farbstoffe genannt. Untersuchungen ergaben, dass solche Fluorophore verwendet werden können, die Licht der Wellenlängen 300 bis 700 nm, vorzugsweise der der Wellenlängen 400 bis 500 nm emittieren.
Der pH-Wert während der PCR Reaktion sollte zwischen 6,5 und 9,5, vorzugsweise zwischen 7,3 und 8,5 liegen.
Das erfindungsgemäße Verfahren offenbart in einer weiteren speziellen Ausführungsform überraschenderweise einen zusätzlichen und erheblichen Vorteil. So fuhrt die Verwendung von zwei Sonden in einem Reaktionsansatz zu einer viel höheren diagnostischen Sensitivität. Dabei bindet die eine Sonde an den „Plus-Strang” und die zweite Sonde an den „Minus-Strang”. Wenn beide Sonden mit demselben Farbstoff markiert wurden, fuhrt diese Ausführungsform zu einer deutlich höheren Fluoreszenz sowie zu früheren C_T-Werten bei der Echtzeit-Messung. Diese Beobachtung ist im Ausführungsbeispiel dargestellt. Damit kann eine viel höhere diagnostische Sensitivität erreicht werden als mit einer einzigen TaqMan Sonde. Eine solche erfindungsgemäße Strategie der Verwendung von zwei Sonden, ermöglicht einen weiteren wesentlichen Vorteil. Über die Nutzung einer zweiten Sonde wird es möglich, einen zweiten Detektionssequenzbereich in die Nachweisreaktion einzuführen. Dies ist gerade dann bedeutsam, wenn spezifische Zielsequenzen durch Mutationen häufig variieren. Mit einer zweiten Sonde kann somit ein größerer Sequenzbereich spezifisch für die Nachweisreaktion abgedeckt werden. In einem solchen Fall kann die zweite Sonde dann z. B. auch mit einem anderen Farbstoff markiert sein als die erste Sonde. Damit können dann beide Sonden unabhängig voneinander gemessen und detektiert werden. Die Platzierung von mehreren Sonden kann auch ggf. auf dem gleichen Strang der Zielnukleinsäure erfolgen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen dargestellt. Dabei stellen die Ausführungsbeispiele keine Limitierung des erfindungsgemäßen Verfahrens dar.
Ausführungsbeispiele
Ausführungsbeispiel 1
Vergleich der Fluoreszenz von einer bzw. zwei guaningequenchten Sonden mit einem TaqMan-Nachweis
Im Ansatz werden drei verschiedene Ansätze gegeneinander getestet. Die Target-Nukleinsäure (Hi1A-Gen von Salmonella sp.) wurde in allen drei Ansätzen mit den gleichen Primern amplifiziert:
PCR-Primer:

Primer 1 (5'-GAG AGA AGC GGG TTG GTG TTC TAT C-3')
Primer 2 (5'-CCG GGC AGA TGA TAC CCG ATG-3')

Im Ansatz 1 wurde eine guaningequenchte Sonde eingesetzt. Die Sonde ist am 5'-Ende mit dem Fluoreszenzstoff FAM ((3',6'-Dipivaloylfluoresceinyl)-6-carboxamidohexyl)-1-O-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit)) markiert und am 3'-Ende mit einer Phosphat-Gruppe gegen die Polymeraseaktivität geschützt (1).

Sonde 1: (5'-FAM-TGC ACC AGG AAA GCA TTA AGT-Pho-3')

Im Ansatz 2 wurden zwei guaningequenchte Sonden eingesetzt, die an den gegenüber liegenden Strängen der Zielnukleinsäure binden (1).

Sonde 1: (5'-FAM-TGC ACC AGG AAA GCA TTA AGT-Pho-3')
Sonde 2: (5'-FAM- TGG TGC AGC AGG TGA TAA CCT TT-Pho-3')

1 zeigt das Bindungsschema der beiden Sonden.
Im Ansatz 3 wird eine BHQ1(Black Hole Quencher-1)-gequenchte TaqMan-Sonde eingesetzt:

Sonde 3: (5'-FAM-TGC ACC AGG AAA GCA TTA AGT-BHQ1-3')

Reaktionsansatz (Amplifikation/Hybridisierung)

Pro Probe:

sense Primer (50 pmol/μl)	0,1 μl
antisense Primer (50 pmol/μl)	0,1 μl
Sonde (25 pmol/μl)	je 0,1 μl
dNTP-Mix (12,5 mM)	0,3 μl
10X PCR-Buffer (MgCl₂ included)	1,5 μl
Taq-DNA-Polymerase	0,75 U
PCR-Grade H₂O	add 15 μl

Zur Testung wurde von jedem Ansatz jeweils eine negative Probe (beinhaltend nur PCR-Chemikalien und H₂O) und eine positive Probe (beinhaltend zusätzlich S. enterica DNA (1,5 μl, Gesamt DNA-Konzentration ca. 50 ng/μl)) eingesetzt.
Die Echtzeit-PCR wurde im Q-Tower (Analytik Jena) unter der Nutzung der Rapid-Cycler-Technologie durchgeführt:

Amplifikation/Hybridisierungskonditionen

Schritt 1: Denaturierung 95°C 120''

Schritt 2: Amplifizierung 50 Zyklen

95°C 4''

50°C 40''
Die Messung der freigesetzten Fluoreszenz erfolgte in Echtzeit während der Annealingphase jedes Zyklus (2).
2 zeigt den Ansatz 1 mit der Sonde 1, den Ansatz 2 mit den Sonden 1 und 2, Anatz 3 mit TaqMan-Probe und die Negativkontrollen (NK) der jeweiligen Ansätze.

Probe Ct-Wert

Ansatz 1 DNA 27,7

Ansatz 1 NK No Ct

Ansatz 2 DNA 22,6

Ansatz 2 NK No Ct

Ansatz 3 DNA 29,5

Ansatz 3 NK No Ct
Die Vergleiche des Kurvenverlaufs und die Ct-Werte demonstrieren, dass die guaningequenchte Sonde eine mit der Taqman-Sonde vergleichbare Freisetzung der Fluoreszenz während der Amplifikation zeigt. Die zwei gleichzeitig angesetzten Sonden funktionieren aber synergistisch und zeigen dadurch eine höhere Signalstärke und einen früheren Ct-Wert im Vergleich zu den beiden Ansätzen mit nur einer Sonde.
Ausführungsbeispiel 2
Bestimmung der Nachweisgrenzen der drei im Anwendungsbeispiel 1 beschriebenen Sondensysteme
Im Ansatz werden zwei verschiedene Ansätze gegeneinander getestet. Die Target-Nukleinsäure (HilA-Gen von Salmonella sp.) wird bei beiden Ansätzen mit den gleichen Primer amplifiziert:
PCR-Primer:

Im Ansatz 1 wurden zwei guaningequenchte Sonden eingesetzt, die an den gegenüber liegenden Strängen der Zielnukleinsäure binden 1:

Sonde 1: (5'-FAM-TGC ACC AGG AAA GCA TTA AGT-Pho-3')
Sonde 2: (5'-FAM-TGG TGC AGC AGG TGA TAA CCT TT-Pho-3')

Im Ansatz 2 wurde eine BHQ1(Black Hole Quencher-1)- gequenchte Taqman-Sonde eingesetzt:

Sonde 3: (5'-FAM-TGC ACC AGG AAA GCA TTA AGT-BHQ1-3')

Reaktionsansatz (Amplifikation/Hybridisierung)

Pro Probe:

sense Primer (50 pmol/μl)	0,1 μl
antisense Primer (50 pmol/μl)	0,1 μl
Sonde (25 pmol/u1)	je 0,1 μl
dNTP-Mix (12,5 mM)	0,3 μl
10X PCR-Buffer (MgCl₂ included)	1,5 μl
Taq-DNA-Polymerase	0,75 U
PCR-Grade H₂O	add 15 μl

Zur Testung wurde von jedem Ansatz jeweils eine negative Probe (beinhaltend nur PCR-Chemikalien und H₂O) und eine Verdünnungsreihe von positiven Proben (beinhaltend zusätzlich S. enterica DNA: ca. 50 ng/μl, 0.5 ng/μl, 0,05 ng/μl sowie 0,005 ng/μl Proben-DNA) eingesetzt.
Die Echtzeit-PCR wurde im Q-Tower (Analytik Jena) unter der Nutzung der Rapid-Cycler-Technologie durchgeführt:

Amplifikation/Hybridisierungskonditionen

Schritt 1: Denaturierung 95°C 120''

Schritt 2: Amplifizierung 50 Zyklen

95°C 4''

50°C 40''
Die Messung der freigesetzten Fluoreszenz erfolgte in Echtzeit während der Annealingphase jedes Zyklus und ist in 3 abgebildet.
Erklärung zu Fig. 3:

Probe 1: erfindungemäßes Verfahren mit zwei guaningequentschten Sonden; 50 ng/μl DNA
Probe 2: erfindungemäßes Verfahren mit zwei guaningequentschten Sonden; 0,5 ng/μl DNA
Probe 3: erfindimgemäßes Verfahren mit zwei guaningequentschten Sonden; 0,05 ng/μl DNA
Probe 4: erfindungemäßes Verfahren mit zwei guaningequentschten Sonden; 0,005 ng/μl DNA
Probe 5: Taqman-Verfahren; 50 ng/μl DNA
Probe 6: Taqman-Verfahren; 0,5 ng/μl DNA
Probe 7: Taqman-Verfahren; 0,05 ng/μl DNA
Probe 8: Taqman-Verfahren; 0,005 ng/μl DNA
NK: Negativkontrollen der jeweiligen Ansätze

Probe	DNA-Konzentration	Ct-Wert
Ansatz 1	50 ng/μl	22,9
Ansatz 2	0,5 ng/μl	30,3
Ansatz 3	0,05 ng/μl	32,8
Ansatz 4	0,005 ng/μl	36,0
Ansatz 1–4 NK	-	no Ct
Ansatz 5	50 ng/μl	30,4
Ansatz 6	0,5 ng/μl	37,1
Ansatz 7	0,05 ng/μl	41,9
Ansatz 8	0,005 ng/μl	no Ct
Ansatz 5–8 NK	-	no Ct

Die Vergleiche des Kurvenverlaufs und die Ct-Werte demonstrieren eindeutig, dass die synergistische Wirkung der zwei gleichzeitig angesetzten Sonden nicht nur zu einer erhöhten Signalstärke, sondern auch dadurch zu einem deutlich sensitiveren Nachweis der Zielnukleinsäure im Vergleich zu einem Taqman-Assay führt.
Beispiel 3
Anwendung eines Systems aus zwei guammgequenchten Sonden, die sich am gleichen DNA-Strang befinden, im Vergleich zu einem auf TaqMan-Sonde basierendem Nachweis.
Im Ansatz werden zwei verschiedene Ansätze gegeneinander getestet. Die Target-Nukleinsäure (ein künstlich synthetisiertes Fragment mit den Primer- und Sondensequenzen für den Nachweis von Listeria monozytogenes und einer sich wiederholenden Nonsenssequenz für die Bindung von einer guaningequenchten Sonde) wird bei beiden Ansätzen mit den gleichen Primern amplifiziert:
PCR-Primer:

Primer 1 (5'-CGC AAC AAA CTG AAG CAA AGG-3')
Primer 2 (5'- TCC GCG TGT TTC TTT TCG AT-3')

Im Ansatz A wurden guaningequenchte Sonden eingesetzt, die zwei Mal an den gleichen Strang der Zielnukleinsäure bindet (4).

Sonde 1: (5'-FAM-TGT GTT CGT GTC ATC TAG GA-Pho-3')

4 und 5 zeigen das Bindungsschema der guaningequenchten Sonde.
Im Ansatz B wurde eine BHQ1(Black Hole Quencher-1)-gequenchte TaqMan-Sonde eingesetzt (5).

Sonde 2: (5'-FAM-CCA TGG CAC CAC CAG CAT CT-BHQ1-3')

Reaktionsansatz (Amplifikation/Hybridisierung) Pro Probe:

Zur Testung wurde von jedem Ansatz jeweils eine negative Probe (beinhaltend nur PCR-Chemikalien und H₂O) und der synthetische Standard (1,5 μl, Gesamt DNA-Konzentration ca. 50 ng/μl DNA) eingesetzt.
Die Echtzeit-PCR wurde im Q-Tower (Analytik Jena) unter der Nutzung der Rapid-Cycler-Technologie durchgeführt:

Amplifikation/Hybridisierungskonditionen

Schritt 1: Denaturierung 95°C 120''

Schritt 2 Amplifizierung 50 Zyklen

95°C 4''

53°C 40''
Die Messung der freigesetzten Fluoreszenz erfolgte in Echtzeit während der Anealingsphase jedes Zyklus (6).
Erklärung zu Fig. 6:

A: Ansatz mit der Sonde 1;
B: Ansatz mit TaqMan-Sonde
NK. Die Negativkontrollen der jeweiligen Ansätze

Probe	Ct-Wert
Ansatz A DNA	16,7
Ansatz A DNA	16,8
Ansatz A NK	No Ct
Ansatz B DNA	21,0
Ansatz B DNA	22,1
Ansatz B NK	No Ct

Die Vergleiche des Kurvenverlaufs und die Ct-Werte demonstrieren, dass in diesem Fall zwar die Signalstärke der TaqMan-Sonde höher ist, aber die Sensitivität der Reaktion in Bezug auf die CT-Werte beim erfindumgsgemäßen Verfahren wieder besser ist. Man erhält beim Einsatz von zwei hintereinander platzierten guaningequenchten Sonden viel frühere Ct-Signale. Diese Eigenschaft des Sondensystems kann damit zu einer Verkürzung der Laufzeit von einem PCR-Nachweis führen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 5210015 [0006, 0021]
US 5487972 [0006, 0021]
US 5538848 [0016]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Cooper et al. (1990) ”Analysis of fluorescence energy-transfer in duplex and branched DNA-molecules.” Biochemistry 29: 9261–9268 [0010]
Lee et al. (1994) ”A fluorometric assay for DNA cleavage reactions characterized with BamHI restriction endonuclease.” Anal. Biochem. 220: 377–383 [0010]
Horn T et al. (1997) ”Chemical synthesis and characterization of branched oligodeoxyribonucleotides (bDNA) for use as signal amplifiers in nucleic acid quantification assays.” Nucleic Acids Res. 25: 4842–4849 [0010]
Maruyama et al. beschreiben in ”Mutation detection in DNA oligonucleotides based an a guanine quenching method coupled with enzymatic digestion of single-stranded DNA” Biotechnology Letters (2005) 27: 1349–1354 [0011]
Torimura et al. in Analytical Sciences (2001) Vol. 17, S. 155ff. [0012]

Claims

Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis von spezifischen Ziel-Nukleinsäuresequenzen, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) eine Nukleinsäure enthaltende Probe wird mit mindestens einem Fluorophormarkierten Oligonukleotid (Sonde), das eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu einem Ziel-Nukleinsäuresequenzstrang, in Kontakt gebracht, wobei sich die Fluorophor-Markierung in räumlicher Nähe zu einer Guanin-Base auf demselben Strang des markierten Oligonukleotids (Sonde) befindet und so – ohne Verwendung eines Quencherfarbstoffes – das Fluorophor quencht, um mittels Primern unter Hybridisierungsbedingungen ein Gemisch von Duplexen zu erzeugen, wobei die Duplexe die Ziel-Nukleinsäure, angelagert an das markierte Oligonukleotid (Sonde), umfassen und b) Zugabe einer Polymerase mit Exonukleaseaktivität, die das angelagerte markierte Oligonukleotid (Sonde) zwischen der Fluorophor-Markierung und der Guanin-Base schneidet, somit das Quenching aufhebt und ein messbares Fluoreszenz-Signal erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Guanin-Base ein bis vier Basen von der Base mit der Fluorophor-Markierung entfernt ist, vorzugsweise sich direkt neben der Base mit der Fluorophor-Markierung auf demselben Strang befindet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Polymerase mit 5'-3'-Exonukleaseaktivität eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Markierungen Fluorophore Verwendung finden, die Licht einer Wellenlänge von 300 bis 700 nm, vorzugsweise der der Wellenlängen 400 bis 500 nm, emittieren.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Fluorophore FAM, FITC, BODIPY FL, TAMRA oder CCP-Farbstoffe verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert zwischen 6,5 und 9,5, vorzugsweise zwischen 7,3 und 8,5 liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehrere markierte Sonden, bei denen sich die Fluorophor-Markierung in räumlicher Nähe zu einer Guanin-Base auf demselben Strang des markierten Oligonukleotids (Sonde) befindet und so – ohne Verwendung eines Quencherfarbstoffes – das Fluorophor quencht, eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sonde an den „Plus-Strang” und die zweite Sonde an den „Minus-Strang” der Ziel-Nukleinsäure oder beide Sonden an den gleichen Strang hybridisieren.
Testkit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend: – mindestens ein Fluorophor-markiertes Oligonukleotid (Sonde), das einerseits eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu einem Ziel-Nukleinsäuresequenzstrangs, wobei sich die Fluorophor-Markierung in räumlicher Nähe zu einer Guanin-Base auf demselben Strang des markierten Oligonukleotids (Sonde) befindet und andererseits eine Nuklease-Schnittstelle zwischen der Base mit der Fluorophor-Markierung und der Guanin-Base aufweist – eine Polymerase mit Exonukleaseaktivität, die das Oligonukleotid (Sonde) zwischen der Fluorophor-Markierung und der Guanin-Base schneidet – mindestens einen Primer – an sich bekannte PCR-Puffer und dNTPs.
Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 oder des Testkits gemäß Anspruch 9 zum qualitativen oder quantitativen Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen in Echtzeit.