DE10327756B4

DE10327756B4 - Verfahren zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure

Info

Publication number: DE10327756B4
Application number: DE10327756A
Authority: DE
Inventors: Roland Dr. Barten; Hans Dr. Kosak; Dirk Dr. Kuhlmeier; Jörg Dr. Hassmann; Ludek Dr. Havran; Jürgen Dr. Schülein
Original assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Current assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date: 2003-06-18
Filing date: 2003-06-18
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2023-06-19
Also published as: EP1673469A1; WO2004111269A1; CA2570382A1; DE10327756A1

Abstract

Verfahren zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure (10) mittels einer Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion, wobei dabei mindestens eine mit der Nukleinsäure (10) oder deren komplementären Gegenstrang (8) spezifisch eine Hybridisierung ausbildende Sonde (18) anwesend ist, wobei die Hybridisierung bei Anwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure bei der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion durch enzymatischen Abbau der Sonde (18) aufgehoben wird, wobei das Aufheben der Hybridisierung elektrochemisch nachgewiesen wird, wobei die Sonde (18) mindestens eine elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz (20) aufweist, mittels welcher das elektrochemische Nachweisen erfolgt, wobei der elektrochemische Nachweis ein direkter Nachweis einer elektrochemischen Reaktion durch Ableiten eines elektrischen Signals an einer Elektrode ist, wobei der Zugang der intakten Sonde (18), nicht aber der Zugang der Abbauprodukte der Sonde (18) zur Elektrode (30) verhindert wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure mittels einer Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Elektrode und einer Sonde zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure.

Bei der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion kann es sich beispielsweise um eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder eine Ligase-Kettenreaktion (LCR) handeln. Bei einer Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion erfolgt im Allgemeinen ein zyklisches Durchlaufen definierter erhöhter Temperaturschritte. Unter Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure mittels einer Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion werden Verfahren verstanden, bei denen während der Nukleinsäure-Verfältigungsreaktion in einem Reaktionsansatz die sich ändernde Menge der Nukleinsäure bestimmt wird. Dabei wird üblicherweise in jedem Zyklus der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion mindestens einmal die Menge der bei der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion erzeugten Nukleinsäure gemessen. Im Stand der Technik sind solche Verfahren bekannt. Dabei wird mindestens ein eine intramolekulare Hybridisierung aufweisender Primer oder mindestens eine mit der Nukleinsäure spezifisch eine Hybridisierung ausbildende Sonde eingesetzt. Die Sonde besteht im Allgemeinen aus Nukleinsäure. Bei den Verfahren wird die Hybridisierung bei der PCR aufgehoben oder gebildet. Das Aufheben oder Bilden der Hybridisierung wird mittels der spezifischen Fluoreszenz von Fluorophoren nachgewiesen, mit denen die Primer oder die Sonde markiert sind. Es sind, z. B. aus Didenko V.V., BioTechniques Band 31 Nr. 5 (2001), Seiten 1106 bis 1121, die folgenden Prinzipien bekannt:

– Durchführen einer PCR in Gegenwart von "Hairpin-Primern". Ein Hairpin-Primer weist eine intramolekulare Hybridisierung auf. Dadurch befinden sich zwei an entfernten Enden des Hairpin-Primer-DNA-Strangs angeordnete unterschiedliche Fluorophore so in Nachbarschaft zueinander, dass ein Fluoreszenz-Energietransfer (FRET) stattfinden kann. Bei der PCR löst sich nach der Verlängerung des Hairpin-Primers die intramolekulare Hybridisierung. Der Fluoreszenz-Energietransfer kann nicht mehr stattfinden. Mit zunehmender Bildung eines PCR-Produkts wird bei Anregung des einen Fluorophors Licht von diesem statt von dem anderen Fluorophor emittiert. Dadurch ändert sich die Wellenlänge des als Messsignal messbaren emittierten Lichts.
– Durchführung einer PCR in Gegenwart von "Hairpin-Sonden". Eine Hairpin-Sonde bildet eine intramolekulare Hybridisierung aus. Dadurch befinden sich zwei jeweils an entfernten Enden eines die Hairpin-Sonde bildenden DNA-Strangs angeordnete unterschiedliche Fluorophore so in Nachbarschaft zueinander, dass ein FRET stattfinden kann. Die Sonde kann unter Auflösung der intramolekularen Hybridisierung mit einem PCR-Produkt hybridisieren. Dabei vergrößert sich der Abstand zwischen den Fluorophoren so, dass kein FRET mehr stattfinden kann. Die Wellenlänge des bei Anregung des einen Fluorophors als Messsignal messbaren emittierten Lichts ändert sich mit der Zunahme an gebildetem PCR-Produkt.
– TaqMan-Prinzip: Bei der PCR wird eine Sonde eingesetzt, die innerhalb der bei der PCR zu amplifizierenden Nukleinsäure hybridisieren kann. Die Sonde ist an einem Ende mit einem Fluorophor markiert, während das andere Ende ein Fluoreszenzlöschendes Molekül, einen so genannten Fluoreszenz-Quencher, aufweist. Nach Anregung des Fluorophors wird dessen Fluoreszenz vom Fluoreszenz-Quencher gelöst. Während der DNA-Synthese bei der PCR hydrolysiert eine Taq-Polymerase die mit der Nukleinsäure hybridisierte Sonde durch ihre Exonuklease-Aktivität und hebt so die Hybridisierung auf. Das Fluorophor und der Fluoreszenz-Quencher werden dadurch räumlich voneinander getrennt und es entsteht ein detektierbares Fluoreszenzsignal. Das Fluoreszenzsignal korreliert mit der Zunahme an gebildetem PCR-Produkt.
– Durchführen einer PCR in Gegenwart von zwei Hybridisierungssonden, welche auf der zu amplifizierenden Nukleinsäure benachbart hybridisieren. Die Hybridisierungssonden sind jeweils mit einem Fluorophor markiert. Die Fluorophore kommen im Falle der Hybridisierung beider Sonden so in Nachbarschaft zueinander, dass ein FRET stattfinden kann. Je mehr PCR-Produkt gebildet wird, desto mehr Licht wird bei der Anregung des einen Fluorophors vom anderen Fluorophor emittiert und kann als Messsignal erfasst werden.

Bei allen genannten Verfahren kann aus dem während der PCR messbaren Messsignal auf den Anfangsgehalt an DNA geschlossen werden.

Nachteilig ist bei diesen Verfahren, dass zum Messen der Fluoreszenz eine aufwändige Vorrichtung mit optischen Komponenten zur Anregung und Detektion von Fluoreszenz erforderlich ist. Die Messgeräte zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure sind daher verhältnismäßig teuer.

Aus der WO 01/40511 A2 ist ein Verfahren bekannt, bei dem eine nachzuweisende Nukleinsäuresequenz in einer Probe einer Vervielfältigungsreaktion unterworfen wird, wobei kontinuierlich elektrochemische Messungen an der Probe vorgenommen werden. Die Vervielfältigungsreaktion kann in Gegenwart einer spezifischen Oligonukleotidsonde durchgeführt werden, welche eine elektrochemische Markierung enthält. Die Sonde kann auf einem Träger, beispielsweise auf einer Elektrode, immobili siert sein. Sie kann ein Paar von Markierungen enthalten, die sich in ihren Redoxeigenschaften unterscheiden, wenn sie benachbart angeordnet sind. Die Sonde kann durch eine Hydrolyse während der Vervielfältigungsreaktion, ähnlich einer TaqMan-Sonde, abgebaut und die Markierung dadurch freigesetzt werden. Die freigesetzte Markierung ändert dadurch ihren Abstand zu der anderen Markierung und kann dadurch von einer nicht freigesetzten Markierung unterschieden werden.

Aus Torimura M. et al., Analytical Sciences, Januar 2001, Band 17, Seiten 155 bis 160 ist es bekannt, dass Fluoreszenzfarbstoffe elektrochemisch messbare Eigenschaften aufweisen können.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein alternatives Verfahren und eine Verwendung zur Durchführung einer Echtzeit-Quantifizierung bereitzustellen, welches mit einer weniger aufwändigen Messvorrichtung durchführbar ist.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Patentansprüche 1, 13 und 15 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 12 und 14.

Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure mittels einer Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion vorgesehen, wobei dabei mindestens eine mit der Nukleinsäure oder deren komplementären Gegenstrang spezifisch eine Hybridisierung ausbildende erste Sonde oder mindestens ein eine intramolekulare Hybridisierung aufweisender Primer oder mindestens eine eine intramolekulare Hybridisierung aufweisende an der Nukleinsäure oder deren komplementären Gegenstrang spezifisch bindende zweite Sonde anwesend ist, wobei die Hybridisierung bei Anwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure bei der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion aufgehoben oder gebildet wird, wobei das Aufheben oder Bilden der Hybridisierung elektrochemisch nachgewiesen wird. Beim erfindungsgemäßen Echtzeit-Quantifizieren erfolgt das elektrochemische Nachweisen des Aufhebens oder Bildens der Hybridisierung vorzugsweise mindestens einmal in jedem Zyklus der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion. Das Aufheben oder Bilden der Hybridisierung kann dabei grundsätzlich in gleicher Weise erfolgen, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist: Beispielsweise kann eine intramolekulare Hybridisierung eines Primers oder einer Sonde mit Hairpin-Struktur aufgehoben werden oder es kann eine mit der Nukleinsäure hybridisierte Sonde durch die Aktivität einer Polymerase bei der PCR hydrolysiert werden. Weiterhin können Sonden benachbart zueinander auf einem gebildeten PCR-Produkt oder LCR-Produkt hybridisieren. Die erste oder zweite Sonde oder der Primer weist mindestens eine elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz auf, mittels welcher das elektrochemische Nachweisen erfolgt. Die Markierungssubstanz kann dabei an die erste oder zweite Sonde oder den Primer gebunden sein. Es kann sich bei der Markierungssubstanz aber auch um bestimmte Atome oder Gruppen handeln, welche direkt als Bestandteil der Sonde oder des Primers in die Sonde oder den Primer eingebaut sind.

Beim Aufheben oder Bilden der Hybridisierung kann eine elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz so in Nachbarschaft zu einer elektrochemisch aktiven Substanz kommen, dass sich eine elektrochemische Eigenschaft der Markierungssubstanz, z. B. deren Redox-Potenzial, ändert. Die elektrochemische Eigenschaft ändert sich dabei in Abhängigkeit vom räumlichen Abstand der Markierungssubstanz zur Substanz. Bei der Markierungssubstanz und der Substanz kann es sich beispielsweise um spezifische elektrochemische Eigenschaften aufweisende Fluorophore handeln.

Vorzugsweise handelt es sich bei der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion um eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Vorteilhafterweise ist der elektrochemische Nachweis ein direkter Nachweis einer elektrochemischen Reaktion durch Ableiten eines elektrischen Signals an einer Elektrode. Dadurch kann gegenüber einem indirekten Nachweis einer elektrochemischen Reaktion, wie beispielsweise beim Nachweis einer Elektrochemilumineszenz, die zum elektrochemischen Nachweis erforderliche Vorrichtung weiter vereinfacht werden, weil neben einer Elektrode keine optischen Komponenten erforderlich sind.

Die Hybridisierung kann durch enzymatischen Abbau der ersten Sonde aufgehoben werden. Der Abbau kann durch die Aktivität einer Nuklease, insbesondere einer zur Amplifikation bei der PCR verwendeten DNA-Polymerase mit Exonuklease-Aktivität, erfolgen.

Das Aufheben der Hybridisierung kann auch elektrochemisch nachgewiesen werden, indem die durch den enzymatischen Abbau entstehenden die Markierungssubstanz enthaltenden Abbaupro dukte elektrochemisch nachgewiesen werden. Bei den Abbauprodukten kann es sich um Nukleotide oder um aus weniger als 10, vorzugsweise weniger als 5, Nukleotiden bestehende Oligonukleotide oder die durch den enzymatischen Abbau freigesetzte Markierungssubstanz selbst handeln.

Vorteilhafterweise weist die erste, die zweite oder eine bei der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion weiterhin anwesende dritte Sonde oder der Primer eine Substanz auf, welche eine elektrochemische Eigenschaft der Markierungssubstanz in Abhängigkeit von deren räumlichen Abstand zur Markierungssubstanz beeinflusst. Beispielsweise können bei der in Form einer Haarnadelschleife vorliegenden zweiten Sonde (Hairpin-Sonde) die Markierungssubstanz und die Substanz jeweils an entgegengesetzten Enden des die zweite Sonde bildenden Nukleinsäurestrangs so angeordnet sein, dass sie sich bei geschlossener Haarnadelschleifenstruktur in räumlicher Nähe zueinander befinden. Die Markierungssubstanz weist infolgedessen eine bestimmte elektrochemische Eigenschaft, z. B. ein bestimmtes Redox-Potenzial, auf. Hybridisiert diese Sonde mit einer bei der PCR gebildeten Nukleinsäure und öffnet sich dabei die Haarnadelschleifenstruktur, so verändert sich der Abstand zwischen der Markierungssubstanz und der Substanz. Dadurch ändert sich auch die elektrochemische Eigenschaft der Markierungssubstanz. Der Abstand zwischen der Markierungssubstanz und der Substanz kann sich auch dadurch ändern, dass die erste Sonde abgebaut wird.

Vorteilhafterweise werden die Sequenzen der dritten Sonde und der ersten oder zweiten Sonde so gewählt, dass die dritte Sonde und die erste oder zweite Sonde so benachbart zueinander spezifisch an der Nukleinsäure oder deren komplementären Gegenstrang binden, dass die Markierungssubstanz der ersten oder zweiten Sonde und die Substanz in eine solche räumliche Nähe zueinander gelangen, dass die elektrochemische Eigen schaft der Markierungssubstanz durch die Substanz beeinflusst wird. Ist die elektrochemische Eigenschaft beispielsweise ein Redox-Potenzial, welches durch die Nähe der Substanz zur Markierungssubstanz einen bestimmten Wert erreicht, so ist die zunehmende Messbarkeit dieses Werts ein Maß für das Vorhandensein der Nukleinsäure und damit das Fortschreiten der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion.

Die Markierungssubstanz und/oder die Substanz können Redoxaktiv sein. Bevorzugt wird die Markierungssubstanz so gewählt, dass ihr Redox-Potenzial ohne eine Beeinflussung durch die Substanz, insbesondere unter den Bedingungen der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion, unterhalb des Redox-Potenzials von Guanin liegt. Vorteilhafterweise werden die Substanz und die Markierungssubstanz so gewählt, dass sich das Redox-Potenzial der Markierungssubstanz durch die räumliche Nähe zur Substanz so verschiebt, dass es oberhalb des Redox-Potenzials von Guanin liegt.

Die Markierungssubstanz oder die Substanz kann ein Osmium-Komplex, ein Nanogold-Partikel, eine Cystein-, Ferrocenyl-, Daunomyzin-, Benzochinon-, Naphthochinon-, Anthrachinon- oder p-Aminophenol-Gruppe, ein Farbstoff, insbesondere Indophenol, Thiazin oder Phenazin, oder ein Fluoreszenzfarbstoff, insbesondere 6-FAM, HEX, TET, Cy3, Cy5, IRDye^TM700, IRDye^TM800, Biodipy, Flourescein, Joe, Rox, TAMRA oder Texas Red, oder ein Fluoreszenz-Quencher sein. Interessanterweise weisen die meisten Fluorophore und Fluoreszenz-Quencher eine elektrochemisch messbare Eigenschaft auf. Die Eigenschaft kann auch in der Beeinflussung der elektrochemischen Eigenschaft der Markierungssubstanz durch die Substanz bestehen. Somit können die für die bekannten auf Fluoreszenzmessungen beruhenden Verfahren verwendeten Sonden und Primer meist direkt für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Die Sonden und Primer können z.B. mit einem Fluorophor, zwei Fluorophoren oder einem Fluorophor und einem Fluoreszenz-Quencher markiert sein. Das Fluorophor und der Fluoreszenz-Quencher kann dabei jeweils als Markierungssubstanz oder als Substanz fungieren.

Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird der Zugang der intakten ersten Sonde, nicht aber der Zugang der Abbauprodukte der ersten Sonde zur Elektrode verhindert. Der Zugang der intakten ersten Sonde zur Elektrode kann dadurch verhindert werden, dass die Elektrode von der ersten Sonde durch eine den Zugang der ersten Sonde zur Elektrode verhindernden Membran oder Elektrodenbeschichtung getrennt ist, wobei die Membran oder die Elektrodenbeschichtung für Abbauprodukte der ersten Sonde, insbesondere für die Markierungssubstanz, durchgängig ist. Die Abbauprodukte können aus der Sonde bei deren Abbau durch die Aktivität einer Polymerase entstehen. Ein Signal kann nur entstehen, wenn die erste Sonde abgebaut wird und somit die Abbauprodukte der ersten Sonde die Membran oder Elektrodenbeschichtung durchdringen können. Bei einer eine Markierungssubstanz aufweisenden ersten Sonde können die Abbauprodukte die Markierungssubstanz aufweisen. Das Abbauprodukt kann auch die Markierungssubstanz selbst sein. Ein Vorteil des Vorsehens der Membran oder Elektrodenbeschichtung besteht auch darin, dass dadurch verhindert werden kann, dass für die Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion erforderliche Reagenzien, wie z. B. die DNA-Polymerase, zur Elektrode gelangen. Dadurch kann gewährleistet werden, dass diese Reagenzien nicht durch oxidative oder reduktive Prozesse inaktiviert werden. Weiterhin kann dadurch vermieden werden, dass störende elektrochemische Signale durch diese Reagenzien erzeugt werden.

Der Zugang der intakten ersten Sonde zur Elektrode kann auch dadurch verhindert werden, dass die erste Sonde an einer von der Elektrode entfernten Stelle, z. B. einer Wand eines Gefäßes in dem das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, oder an einem Partikel immobilisiert ist. Dadurch ist es auf einfache Weise möglich zu verhindern, dass die Elektrode mit intakten, vollständigen Sonden in Kontakt kommt, die, z. B. auf Grund der gebundenen Markierungssubstanz, ein Signal auslösen würden. Die Abbauprodukte können erst zur Elektrode gelangen, wenn sie durch die Aktivität der Polymerase von der übrigbleibenden immobilisierten Sonde getrennt werden. Der Zugang der an Partikel immobilisierten ersten Sonde kann z. B. auch dadurch verhindert werden, dass es sich bei den Partikeln um magnetische Partikel handelt, welche durch Anlegen eines magnetischen Felds von der Elektrode entfernt werden. Weiterhin können die Partikel mit der Membran oder Elektrodenbeschichtung zusammenwirken, indem die Membran oder Elektrodenbeschichtung den Durchgang der Partikel durch die Membran oder Elektrodenbeschichtung und dadurch den Zugang der ersten Sonde zur Elektrode verhindert.

Die Elektrodenbeschichtung kann aus Polyacrylamid gebildet sein. Das ermöglicht eine einfache Herstellung der Elektrodenbeschichtung, beispielsweise durch Eintauchen der Elektrode in eine Acrylamid-Lösung. Die Polymerisation kann elektrochemisch durch das Anlegen eines elektrischen Potenzials an der Elektrode ausgelöst werden. Die Dichte der Elektrodenbeschichtung und damit deren Permeabilität kann durch die Acrylamid-Konzentration, die Konzentration eines Quervernetzers, wie beispielsweise Bisacrylamid, und die Dauer der Polymerisation bestimmt werden. Vorzugsweise ist die Elektrode mit der Membran, insbesondere einer Dialyse-Membran, verbunden. Die Membran oder die Elektrodenbeschichtung kann die Elektrode vollständig oder teilweise umgeben. Eine solche Elektrode erleichtert die Durchführung des Verfahrens.

Die Elektrode kann eine Kohlenstoff-Elektrode, insbesondere eine Screen-Print-, Pencil-, eine Glassy-Carbon-, eine Pyrolytic-Grafit- oder eine Kunststoff-Composit-Elektrode, vor zugsweise eine Grafit enthaltende Polycarbonat-Elektrode, sein. Bei der Screen-Print-Elektrode handelt es sich um eine im Siebdruckverfahren hergestellte Elektrode. Als Pencil-Elektrode kann eine herkömmliche Bleistiftmine verwendet werden. Die Grafit enthaltende Polycarbonat-Elektrode wird auch als Polycarbonat/Grafit-Elektrode bezeichnet. Die Herstellung von Kohlenstoff-Elektroden kann sehr preiswert gestaltet werden. Es ist damit möglich, beispielsweise speziell beschichtete Elektroden zum einmaligen Gebrauch herzustellen. Dadurch kann die Reproduzierbarkeit des Verfahrens erhöht werden, da nachfolgende Messungen nicht durch auf den Elektroden verbleibende Reste von einer vorherigen Messung beeinflusst werden.

Die Bedingungen, bei denen die Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion erfolgt, können, insbesondere bei einer PCR, beispielsweise infolge der zyklische Temperaturschwankungen, für die Elektrode oder die Elektrodenbeschichtung oder die Membran schädlich sein. Vorteilhaft ist es daher, wenn die Elektrode im Wesentlichen nur während des elektrochemischen Nachweises, insbesondere bei einer definierten Temperatur, mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, in der die Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion stattfindet. Die Temperatur kann eine bei der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion vorkommende Temperatur sein. Die Elektrode kann in jedem Zyklus der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion jeweils immer nur bei der gleichen Temperatur mit der Lösung in Kontaktgebracht werden. Dadurch kann eine Beeinflussung der Messung durch eine Beschädigung der Elektrode vermieden werden.

Erfindungsgemäß ist weiterhin die Verwendung einer Elektrode zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure mittels eines erfindungsgemäßes Verfahren vorgesehen. Die Elektrode kann dazu eine den Zugang einer mit der Nukleinsäure oder deren komplementären Gegenstrang spezifisch eine Hybridisierung ausbildenden eine elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz aufweisenden ersten Sonde zu der Elektrode verhindernde Membran oder Elektrodenbeschichtung aufweisen. Die Membran ist dabei mit der Elektrode verbunden. Die Membran oder die Elektrodenbeschichtung ist für die Markierungssubstanz enthaltende Abbauprodukte der ersten Sonde durchgängig. Die Abbauprodukte der ersten Sonde können Nukleotide, aus weniger als 10, vorzugsweise weniger als 5, Nukleotiden bestehende Oligonukleotide oder die durch enzymatischen Abbau freigesetzte elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz der ersten Sonde sein.

Weiterhin ist erfindungsgemäß die Verwendung einer mit einer Nukleinsäure oder deren komplementären Gegenstrang spezifisch eine Hybridisierung ausbildenden ersten Sonde oder eines eine intramolekulare Hybridisierung aufweisenden Primers oder einer eine intramolekulare Hybridisierung aufweisenden mit der Nukleinsäure oder deren komplementären Gegenstrang spezifisch hybridisierenden zweiten Sonde zur Echtzeit-Quantifizierung der Nukleinsäure mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, wobei die erste oder zweite Sonde oder der Primer mit einem Fluorophor oder zwei Fluorophoren oder einem Fluorophor und einem Fluoreszenz-Quencher markiert sind.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines eine intramolekulare Hybridisierung aufweisenden Primers oder einer eine intramolekulare Hybridisierung aufweisenden mit einer Nukleinsäure oder deren komplementären Gegenstrang spezifisch hybridisierenden zweiten Sonde zum Echtzeit-Quantifizieren der Nukleinsäure mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei die zweite Sonde oder der Primer mindestens eine elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz aufweist, deren elektrochemische Eigenschaft durch die intramolekulare Hybridisierung beeinflusst ist, wobei die Hybridisierung bei Anwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure aufgehoben wird. Das Aufheben der Hybridisierung wird durch eine veränderte elektrochemische Eigenschaft mittels einer Elektrode elektrochemisch nachgewiesen. Die Markierungssubstanz kann eine Redoxaktive Gruppe sein. Vorzugsweise weist der Primer oder die zweite Sonde eine bei der intramolekularen Hybridisierung in räumlicher Nähe zur Markierungssubstanz angeordnete Substanz auf, welche eine elektrochemische Eigenschaft der Markierungssubstanz beeinflusst. Durch das Aufheben der Hybridisierung wird auch die räumliche Nähe zur Markierungssubstanz und dadurch die Beeinflussung der elektrochemischen Eigenschaft aufgehoben.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Primer zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens. Der Primer weist eine intramolekulare Hybridisierung, eine Markierungssubstanz und eine Substanz auf. Die Markierungssubstanz und die Substanz sind so an dem Primer angeordnet, dass sie sich auf Grund der intramolekularen Hybridisierung in räumlicher Nähe zueinander befinden. Die Substanz beeinflusst eine elektrochemische Eigenschaft der Markierungssubstanz auf Grund der durch die Hybridisierung bedingten räumlichen Nähe. Die Markierungssubstanz und/oder die Substanz sind/ist aus einer Gruppe ausgewählt, enthaltend mindestens einen Osmium-Komplex, mindestens ein Nanogold-Partikel, mindestens eine Cystein-, Ferrocenyl-, Daunomyzin-, Benzochinon-, Naphthochinon-, Anthrachinon- oder p-Aminophenol-Gruppe und mindestens einen Farbstoff, insbesondere Indophenol, Thiazin oder Phenazin.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung eine Sonde zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei die Sonde eine Markierungssubstanz und eine dazu in räumlicher Nähe angeordnete, eine elektrochemische Eigenschaft der Markierungssubstanz auf Grund der räumlichen Nähe beeinflussende Substanz enthält.

Die Markierungssubstanz und/oder die Substanz sind/ist aus einer Gruppe ausgewählt, enthaltend mindestens einen Osmium-Komplex, mindestens ein Nanogold-Partikel, mindestens eine Cystein-, Ferrocenyl-, Daunomyzin-, Benzochinon-, Naphthochinon-, Anthrachinon- oder p-Aminophenol-Gruppe und mindestens einen Farbstoff, insbesondere Indophenol, Thiazin oder Phenazin.

Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung erläutert. Es zeigen:
1a–c Eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, bei welchem eine mit einem elektrochemischen Markierungsstoff versehene Sonde durch die Exonuklease-Aktivität einer Polymerase hydrolysiert wird,
2a–c eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer eine Markierungssubstanz und eine erste Substanz aufweisenden Sonde, wobei die erste Substanz die Markierungssubstanz in ihren elektrochemischen Eigenschaften beeinflusst und
3a–f eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer an einer von einer Elektrode entfernten Stelle immobilisierten, elektrochemische Markierungssubstanzen aufweisenden Sonde.
Bei dem in 1a bis c dargestellten Verfahren bindet eine Sonde 18 spezifisch an die zu quantifizierende Nukleinsäure 10. Die Nukleinsäure 10 wird mittels der Primer 14 und 12 bei einer PCR mit Hilfe der eine Exonuklease-Aktivität aufweisenden DNA-Polymerase 16 amplifiziert. An der Sonde 18 ist eine elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz 20 gebunden. 1b stellt schematisch das Verlängern des ersten Primers 12 durch die Aktivität der DNA-Polymerase 16 dar. Stößt die DNA-Polymerase 16 beim Verlängern des ersten Primers 12 auf die mit der Nukleinsäure 10 hybridisierte Sonde 18, baut es diese enzymatisch ab. Die dadurch entstehenden Nukleotide 21, 22, 24, 26 und 28 lösen sich von der Nukleinsäure 10 ab und können zu einer in 1c dargestellten Elektrode 30 diffundieren. Die Elektrode 30 ist durch eine Elektrodenbeschichtung 32 vor dem direkten Zugang der Sonde 18 geschützt. Das die Markierungssubstanz 20 aufweisende Nukleotid 21 oder die abgespaltene Markierungssubstanz 20 alleine kann die Elektrodenbeschichtung 32 jedoch durchdringen. Die Markierungssubstanz 20 kann auf Grund ihrer elektrochemischen Eigenschaften an der Elektrode 30 nachgewiesen werden.
Bei dem in 2a bis c dargestellten Ausführungsbeispiel weist die Sonde 18 eine elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz 20 und eine deren elektrochemische Eigenschaft auf Grund der räumlichen Nähe zur Markierungssubstanz 20 beeinflussende Substanz 19 auf. Wie in 2b schematisch dargestellt, wird die Sonde 18 durch die Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase 16 hydrolysiert. Dabei wird ein die Markierungssubstanz 20 aufweisendes Nukleotid 22 oder die Markierungssubstanz 20 selbst freigesetzt. Sowohl die Sonde 18 als auch das die Markierungssubstanz 20 aufweisende Nukleotid 22 können zur Elektrode diffundieren und dort elektrochemisch nachgewiesen werden. Das ist schematisch in 2c dargestellt. Durch die räumliche Trennung der Markierungssubstanz 20 von der Substanz 19 ist das beim Nachweis der Markierungssubstanz 20 entstehende elektrochemische Signal gegenüber einem Signal, welches von der sich in Nachbarschaft zur Substanz 19 befindlichen Markierungssubstanz 20 verursacht wird, verändert.
Bei der in den 3a bis f dargestellten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Sonde 18 an einem Träger 34 immobilisiert. Nach Denaturierung der doppelsträngig vor liegenden Nukleinsäure 8, 10 hybridisiert die einzelsträngige Nukleinsäure 10 mit der immobilisierten Sonde 18 (3b). An der Nukleinsäure 10 lagert sich der Primer 12 an (3c) und wird durch die DNA-Polymerase 16 verlängert (3d). Durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase 16 wird die Sonde 18 abgebaut und es werden die Markierungssubstanzen 20 oder die Markierungssubstanz 20 enthaltende Nukleotide freigesetzt (3e). Die freigesetzten Markierungssubstanzen 20 können dann zu Elektrode 30 diffundieren und dort elektrochemisch nachgewiesen werden (3f).

Claims

Verfahren zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure (10) mittels einer Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion, wobei dabei mindestens eine mit der Nukleinsäure (10) oder deren komplementären Gegenstrang (8) spezifisch eine Hybridisierung ausbildende Sonde (18) anwesend ist, wobei die Hybridisierung bei Anwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure bei der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion durch enzymatischen Abbau der Sonde (18) aufgehoben wird, wobei das Aufheben der Hybridisierung elektrochemisch nachgewiesen wird, wobei die Sonde (18) mindestens eine elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz (20) aufweist, mittels welcher das elektrochemische Nachweisen erfolgt, wobei der elektrochemische Nachweis ein direkter Nachweis einer elektrochemischen Reaktion durch Ableiten eines elektrischen Signals an einer Elektrode ist, wobei der Zugang der intakten Sonde (18), nicht aber der Zugang der Abbauprodukte der Sonde (18) zur Elektrode (30) verhindert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der enzymatische Abbau durch eine Nuklease, insbesondere eine DNA-Polymerase mit Exonuklease-Aktivität, erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die durch den enzymatischen Abbau entstehenden die Markierungssubstanz enthaltenden Abbauprodukte, insbesondere Nukleotide (21, 22, 24, 26, 28) oder aus weniger als 10, vorzugsweise weniger als 5, Nukleotiden bestehende Oligonukleotide oder die durch den enzymatischen Abbau freigesetzte Mar kierungssubstanz (20) selbst, elektrochemisch nachgewiesen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Markierungssubstanz (20) Redox-aktiv ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Markierungssubstanz (20) ein Osmium-Komplex, ein Nanogold-Partikel, eine Cystein-, Ferrocenyl-, Daunomyzin-, Benzochinon-, Naphthochinon-, Anthrachinon- oder p-Aminophenol-Gruppe, ein Farbstoff, insbesondere Indophenol, Thiazin oder Phenazin, oder ein Fluoreszenzfarbstoff, insbesondere 6-FAM, HEX, TET, Cy3, Cy5, IRDye^TM700, IRDye^TM800, Biodipy, Flourescein, Joe, Rox, TAMRA oder Texas Red, oder ein Fluoreszenz-Quencher ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Zugang der intakten Sonde (18) zur Elektrode (30) dadurch verhindert wird, dass die Elektrode (30) von der Sonde (18) durch eine den Zugang der Sonde (18) zur Elektrode (30) verhindernden Membran oder Elektrodenbeschichtung (32) getrennt ist, wobei die Membran oder die Elektrodenbeschichtung (32) für Abbauprodukte (21, 22, 24, 26, 28) der Sonde (18) durchgängig ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Zugang der intakten Sonde (18) zur Elektrode (30) dadurch verhindert wird, dass die Sonde (18) an einer von der Elektrode entfernten Stelle oder an einem Partikel immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Elektrodenbeschichtung (32) aus Polyacrylamid gebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Elektrode (30) mit der Membran verbunden ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elektrode (30) eine Kohlenstoff-Elektrode, insbesondere eine Screen-Print-, eine Pencil-, eine Glassy-Carbon-, eine Pyrolytic-Grafit- oder eine Kunststoff-Composit-Elektrode, vorzugsweise eine Grafit enthaltende Polycarbonat-Elektrode, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elektrode (30) im Wesentlichen nur während des elektrochemischen Nachweises, insbesondere bei einer definierten Temperatur, mit einer Lösung, in welcher die Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion erfolgt, in Kontakt gebracht wird.
Verwendung einer Elektrode (30) zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure (10) mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Elektrode (30) eine Membran oder Elektrodenbeschichtung (32) aufweist, welche den Zugang einer mit der Nukleinsäure (10) oder deren komplementären Gegenstrang (8) spezifisch eine Hybridisierung ausbildenden eine elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz aufweisenden Sonde (18) zur Elektrode (30) verhindert, wobei die Membran oder Elektrodenbeschichtung (32) für die Markierungssubstanz enthaltende Abbauprodukte (21, 22, 24, 26, 28) der Sonde (18), insbesondere Nukleotide (21, 22, 24, 26, 28) oder aus weniger als 10, vorzugsweise weniger als 5 Nukleotiden bestehenden Oligonukleotide oder die durch enzymatischen Abbau freigesetzte elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz (20) der Sonde (18), durchgängig ist.
Verwendung einer mit einer Nukleinsäure (10) oder deren komplementären Gegenstrang (8) spezifisch eine Hybridisierung ausbildenden Sonde (18) zum Echtzeit-Quantifizieren der Nukleinsäure (10) mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Sonde (18) mit einem Fluorophor markiert ist.