WO2013001005A1 - Rehybridisierendes sondensystem zur qualitativen und quantitativen messung von spezifischen nukleinsäuren in echtzeit - Google Patents

Rehybridisierendes sondensystem zur qualitativen und quantitativen messung von spezifischen nukleinsäuren in echtzeit Download PDF

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probes
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target
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Timo Hillebrand
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Aj Innuscreen Gmbh
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    • C12Q2565/101—Interaction between at least two labels

Definitions

  • the novel rehybridizing probe system serves the qualitative and
  • the novel probe system is characterized by a possibility to enable a homogeneous and automatable high-throughput nucleic acid detection.
  • the rehybridizing probe system also enables multiplex detection.
  • two probes are used for a qualitative or quantitative real-time measurement of specific target nucleic acids.
  • a significant increase in the detection sensitivity and signal strength can be generated and a target differentiation can be achieved.
  • this technology also has its disadvantages.
  • To carry out the amplification reaction expensive equipment is needed, which can ensure the rapid change in temperature; the results of the amplification or the coupled with the amplification
  • a widely used method for detecting specific nucleic acids is e.g. the Light Cycler technology (Roche).
  • the company Roche has developed special
  • Hybridization probes consisting of two different oligonucleotides, each labeled with only one fluorochrome.
  • the 3 "end of a probe is the Acceptor
  • the other oligonucleotide is donated at the 5 "end
  • the probes are chosen so that they both bind to the same strand of DNA, with the distance between the acceptor and donor being only a maximum of 1 to 5 nucleotides the so-called FRET effect can occur
  • the fluorescence is measured during the
  • Double Dye Probes carry two fluorochromes on a probe.
  • the reporter dye is here at the 5 " end, the quencher dye at the 3 " end.
  • the polymerase During the elongation phase, the polymerase hits the probe and hydrolyzes it.
  • the ability of the polymerase to hydrolyze an oligonucleotide (or probe) during strand synthesis is referred to as 5 "-3" exonuclease activity.
  • Taq and Tth polymerase This principle has been described for the Taq polymerase. The principle is called the TaqMan principle. After probe hydrolysis, the reporter dye is no longer in close proximity to the quencher. The emitted fluorescence is no longer transformed, this increase in fluorescence is measured.
  • Dyes ethidium bromide, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 or SYBR Green TM and the like.
  • a clear differentiation between specific amplification event or artifact is absolutely necessary. To achieve this, one uses a so-called.
  • TaqMan assay is state of the art. This elegant method of real-time measurement of target nucleic acids is used worldwide for qualitative and quantitative molecular diagnostics.
  • the prior art also includes the patent application US 2008/0213792 AI. This deals with a color coding in a multiplex proof. Molecular beacons are used as probes for RealTime PCR (see Example 1). In this case, the FRET pair is located on one probe and not on two as probes. The same applies to the patent US 6150097 A.
  • the invention had the object to eliminate the disadvantages of the solutions described in the prior art or to provide alternative solutions.
  • the present invention describes a detection system, which is a complete alternative to existing real-time PCR detection technologies.
  • the rehybridizing probe system represents one or more pairs of mutually associated oligonucleotides.
  • the oligonucleotides of the respective pair are partially or completely complementary.
  • An oligonucleotide of the pair also has a complementarity to the target nucleic acid. It is the Hybridization temperature of one of the probes to the target nucleic acid higher than the hybridization temperature between the probes of the respective pair.
  • One probe is labeled with a reporter dye (in the general sense) and the other probe of the respective pair is labeled with a corresponding quencher dye.
  • FIG. 1 An amplification reaction with the rehybridizing probe system is shown in FIG.
  • the respective oligonucleotide pairs are hybridized with each other and the fluorescence of the sample is quenched as a result of a FRET effect. Subsequently, the double helix bonds are denatured at 95 ° C. After the reaction has cooled to hybridization temperature 1 (annealing, HT1), the target nucleic acid is amplified using the primers contained in the reaction mixture. At the same time it binds to the
  • Target sequence complementary probe which during the amplification reaction of the
  • Target nucleic acid is destroyed by the 5 “ -3 " exonuclease activity of the Taq polymerase. Subsequently, the PCR mix is adjusted to the hybridization temperature of the respective
  • Probe pair (Reanealing, HT 2) cooled.
  • the free probes rehybridize and the fluorescence of the probe left over after the reaction is quenched.
  • the probes destroyed by the Taq polymerase can not rehybridize, thereby preventing quenching.
  • This release of fluorescence is surprisingly in direct proportionality to the amplification event and therefore also provides quantitative information about the presence of the target nucleic acid.
  • the rehybridizing probe system according to the invention surprisingly discloses an additional and considerable advantage in a further specific embodiment.
  • the use of two probes in a reaction approach results in much higher diagnostic sensitivity.
  • a first probe binds to the "plus strand” and a second probe to the "minus strand" of the target nucleic acid.
  • this embodiment results in significantly higher fluorescence as well as earlier G values in the real-time measurement. This observation is shown in the embodiment.
  • a much higher diagnostic sensitivity can be achieved than e.g. with a system which is one of the prior art
  • a second probe makes it possible to use a introduce the second detection sequence region into the detection reaction. This is especially important when specific target sequences often vary due to mutations. With a second probe, a larger sequence range can thus be covered specifically for the detection reaction. In such a case, for example, the second probe may also be labeled with a different dye than the first probe. This allows both probes to be measured and detected independently of each other. The placement of multiple probes may also be done on the same strand of the target nucleic acid.
  • the present inventive method is thus an alternative method for the qualitative and quantitative real-time measurement of nucleic acids available, which even compared to the prior art method shows significant advantages.
  • it is also a homogeneous assay format, which is universally applicable and can be performed with all devices used for real-time measurement of nucleic acids.
  • the inventive method and test kit are ideal for a
  • the rehybridizing probe system represents one or more pairs of mutually associated oligonucleotides.
  • the oligonucleotides of the respective pair are partially or completely complementary.
  • An oligonucleotide of the pair also has a complementarity to the target nucleic acid. It is the
  • Hybridization temperature of one of the probes to the target nucleic acid higher than
  • Hybridization temperature between the probes of the respective pair One probe is labeled with a reporter dye (in the general sense) and the other probe of the respective pair is labeled with a corresponding quencher dye.
  • Fluorescence is measured during the rehybridization step (in contrast, TaqMan is measured during the annealing step / extension).
  • the probe which binds to the target should be modified so that no extension takes place (eg phosphorylation, etc.).
  • the other probe should preferably be shorter than having a probe for the target or a non-complementary sequence to the target probe. According to a preferred embodiment of the invention is a
  • Double probe system with same marking used to increase the sensitivity Double probe system with same marking used to increase the sensitivity.
  • the rehybridizing probe system according to the invention shows another temperature profile image:
  • 3B AAAAAAAAAAgttgaaatattcgtacaat-ROX
  • the reaction was carried out on another real-time device (BioRad).
  • the target nucleic acid (HilA gene from Salmonella sp.) was amplified with the following primers:
  • Primer 1 (5'-GAG AGA AGC GGG TTG GTG TTC ACT C -3 ')
  • antisense primer 50 pmol / ⁇
  • Step 1 Denaturation 95 ° C 180 "
  • Step 2 Amplification / rehybridization 45 cycles
  • Fig. 3a shows the real-time PCR results
  • Fig. 3b shows the standard curve of the samples tested
  • Table 1 below contains the respective Ct values and the calculation of the relative sample concentration.
  • probe system according to the invention allows a relative quantification of the target nucleic acid, similar to a real-time TaqMan quantification.
  • the rehybridizing probe system according to the invention also works on common commercially available devices and can thus be used on these Systems can be used as an alternative to TaqMan tests, without the need for a new device system.
  • Primer 1 (5'-GAG AGA AGC GGG TTG GTG TTC ACT C -3 ')
  • Primer 2 (5'-CCG GGC AGA TGA TAC CCG ATG -3 ')
  • Probe pair 1 Rehybrydising probe pairs according to the invention:
  • antisense primer 50 pmol / ⁇
  • Step 1 Denaturation 95 ° C 120 "
  • Step 2 Amplification / rehybridization 40 cycles
  • the measurement of the released fluorescence was carried out in real time during the
  • Step 1 Denaturation 95 ° C 120 "
  • Step 2 Amplification 40 cycles
  • the measurement of the released fluorescence was carried out in real time during the

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Abstract

Das Verfahren zur RealTime-bzw. Endpunkt-Bestimmung von Nukleinsäuren erfolgtmittels rehybridisierender Sondensysteme. Das neuartige Sondensystem ist charakterisiert durch eine Möglichkeit, einen homogenen und automatisierbaren Hochdurchsatz-Nukleinsäurenachweis zu ermöglichen. Durch das rehybridisierende Sondensystem wird auch ein Multiplex-Nachweis ermöglicht.In einer besonders effizienten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden für eine qualitative oder quantitative Echtzeitmessung von spezifischen Targetnukleinsäuren zwei Sonden eingesetzt. Dadurch kann eine deutliche Verstärkung der Nachweissensitivität und Signalstärke erzeugt werden sowie eine Targetdifferenzierung erreicht werden.

Description

REHYBRIDISIERENDES SONDENSYSTEM ZUR QUALITATIVEN UND QUANTITATIVEN MESSUNG VON SPEZIFISCHEN NUKLEINSÄUREN IN
ECHTZEIT
Beschreibung
[0001] Das neuartige rehybridisierende Sondensystem dient dem qualitativen und
quantitativen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen in Echtzeit und damit der molekularen Diagnostik. Das neuartige Sondensystem ist charakterisiert durch eine Möglichkeit, einen homogenen und automatisierbaren Hochdurchsatz- Nukleinsäurenachweis zu ermöglichen. Durch das rehybridisierende Sondensystem wird auch ein Multiplex- Nachweis ermöglicht.
[0002] In einer besonders effizienten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden für eine qualitative oder quantitative Echtzeitmessung von spezifischen Targetnukleinsäuren zwei Sonden eingesetzt. Dadurch kann eine deutliche Verstärkung der Nachweissensitivität und Signalstärke erzeugt werden sowie eine Targetdifferenzierung erreicht werden.
Stand der Technik
[0003] Die Gendiagnostik ist zu einem unverzichtbaren Bestandteil der modernen
medizinischen Labordiagnostik, der forensischen Diagnostik, der veterinärmedizinischen Labordiagnostik oder der Lebensmittel- und Umweltdiagnostik geworden.
[0004] Revolutioniert wurde die genetische Diagnostik mit der Erfindung der PCR- Technologie, die es gestattet, jede beliebige Nukleinsäuresequenz spezifisch zu vervielfachen.
[0005] Diese Technologie besitzt aber neben ihren eindeutigen Vorteilen (wie Sensitivität, Spezifität) auch ihre Nachteile. Für die Durchführung der Amplifikationsreaktion werden teure Geräte benötigt, die den schnellen Temperaturwechsel gewährleisten können; die Ergebnisse der Amplifizierung bzw. die mit der Amplifizierung gekoppelte
Sondenhybridisierung müssen ebenfalls mittels teurer und aufwendig zu bedienender
Labortechnik ausgewertet werden. Hierbei ist eine„einfache" Visualisierung mittels
Gelelektrophorese manchmal wegen ihrer Ungenauigkeit unzureichend.
[0006] Eine weit verbreitete Methode zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuren ist z.B. die Light Cycler Technologie (Fa. Roche). Die Firma Roche entwickelte dazu spezielle
Hybridisierungssonden, bestehend aus zwei verschiedenen Oligonukleotiden, die jeweils mit nur einem Fluorochrom markiert sind. Am 3" -Ende der einen Sonde befindet sich der Akzeptor, das andere Oligonukleotid ist am 5" -Ende mit einem Donor versehen. Die Sonden werden so gewählt, dass sie beide an den gleichen DNA- Strang binden, wobei der Abstand zwischen Akzeptor und Donor nur maximal 1 bis 5 Nukleotide betragen darf, damit es zum sog. FRET- Effekt kommen kann. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt während des
Annealingschrittes, wobei nur Licht dieser Wellenlänge nachweisbar ist, solange beide Sonden an die DNA gebunden sind und sich in räumlicher Nähe befinden. Der Schmelzpunkt beider Sonden sollte bei diesem System identisch sein. Durch die Verwendung zweier hybridisierender Sonden zusätzlich zu den verwendeten Primern ist die Spezifität dieses Detektionssystems äußerst hoch.
[0007] Eine weitere Real- Time- PCR- Anwendung zum Nachweis spezifischer
Nukleinsäure-Targets kann mit sog. Double Dye Sonden, welche in der Patentschrift
US 5210015 und US 5487972 offenbart sind (TaqMan-Sonden), durchgeführt werden. Double Dye Sonden tragen zwei Fluorochrome auf einer Sonde. Der Reporterfarbstoff befindet sich hier am 5" -Ende, der Quencherfarbstoff am 3"- Ende. Zusätzlich befindet sich am 3"- Ende der Sonde eventuell noch eine Phosphatgruppe, damit die Sonde bei der Elongation nicht als Primer fungieren kann. Solange die Sonde intakt ist, ist die freigesetzte Lichtstärke gering, da fast die gesamte Lichtenergie, die nach der Anregung des Reporters entsteht, aufgrund der räumlichen Nähe vom Quencher aufgenommen und umgeformt wird. Das emittierte Licht des Reporterfarbstoffes wird„gequenched", d.h. gelöscht. Dieser FRET- Effekt bleibt auch erhalten, nachdem die Sonde an den komplementären DNA- Strang gebunden hat. Während der Elongationsphase trifft die Polymerase auf die Sonde und hydrolysiert sie. Man bezeichnet die Fähigkeit der Polymerase, ein Oligonukleotid (bzw. eine Sonde) während der Strangsynthese zu hydrolysieren, als 5" -3" Exonukleaseaktivität. Nicht alle Polymerasen haben eine 5" -3" Exonukleaseaktivität (Taq-und Tth-Polymerase). Als erstes wurde dieses Prinzip für die Taq-Polymerase beschrieben. Das Prinzip wird als TaqMan-Prinzip bezeichnet. Nach Sondenhydrolyse befindet sich der Reporterfarbstoff nicht mehr in räumlicher Nähe zum Quencher. Die emittierte Fluoreszenz wird jetzt nicht mehr umgeformt, dieser Fluoreszenzanstieg wird gemessen.
[0008] Eine weitere Möglichkeit zum spezifischen Nachweis von Amplifikationsprodukten mittels Real- Time- PCR- Technologie besteht in der Nutzung von interkalierenden
Farbstoffen (Ethidiumbromid, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR Green™ u.ä.). Eine klare Differenzierung zwischen spezifischem Amplifikationsereignis bzw. Artefakt ist aber zwingend notwendig. Um dies dennoch zu erreichen, nutzt man eine sog.
Schmelzpunktanalyse am Ende der eigentlichen PCR- Reaktion. [0009] Mittels Real- Time- PCR- Anwendungen ist es darüber hinaus auch möglich, eine Quantifizierung der nachzuweisenden Targets durchzuführen.
[0010] Wie schon aufgeführt, ist die Nutzung des sog. TaqMan-Assays Stand der Technik. Dieses elegante Verfahren der Echtzeit- Messung von Targetnukleinsäuren wird weltweit für die qualitative und quantitative molekulare Diagnostik eingesetzt.
[0011] Anwendungslimitierend sind die für diese Nachweistechnologie bestehenden
Schutzrechte. Dadurch ist die Anwendung extrem teuer und kann so z.B. in Entwicklungsund Schwellenländern oftmals nicht genutzt werden. Ziel der Erfindung war es deshalb, ein alternatives System zu finden, welches ebenfalls die Durchführung eines homogenen Assays erlaubt und dieselben Anwendungsfelder bedienen kann.
[0012] Zum Stand der Technik gehört auch die Patentanmeldung US 2008 / 0213792 AI . Diese beschäftigt sich mit einer Farbkodierung bei einem Multiplexnachweis. Als Sonden für die RealTime PCR werden Molecular Beacons verwendet (s. Example 1). Dabei befindet sich das FRET-Paar an einer Sonde und nicht an zwei wie Sonden. Ähnliches gilt für das Patent US 6150097 A.
Aufgabe der Erfindung
[0013] Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Lösungen zu beseitigen bzw. alternative Lösungen bereitzustellen.
Lösung der Aufgabe
[0014] Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
[0015] Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Nachweissystem, was eine komplette Alternative zu den bestehenden Real- Time- PCR- Nachweistechnologien darstellt.
[0016] Dabei handelt es sich um ein rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von Nukleinsäuren in Echtzeit.
[0017] Das erfindungsgemäße rehybridisierende Sondensystem stellt ein oder mehrere Paare von einander jeweils zugeordneten Oligonukleotiden dar. Die Oligonukleotide des jeweiligen Paares sind partiell oder vollständig komplementär. Ein Oligonukleotid des Paares besitzt darüber hinaus eine Komplementarität zur Target-Nukleinsäure. Dabei ist die Hybridisierungstemperatur einer der Sonden zur Targetnukleinsäure höher als die Hybridisierungstemperatur zwischen den Sonden des jeweiligen Paares. Dabei ist eine Sonde mit einem Reporterfarbstoff (im allgemeinen Sinne) und die andere Sonde des jeweiligen Paares mit entsprechendem Quencherfarbstoff markiert.
[0018] Eine Amplifikationsreaktion mit dem rehybridisierenden Sondensystem ist in Figur 1 dargestellt.
[0019] Am Anfang der PCR sind die jeweiligen Oligonukleotidpaare miteinander hybridisiert und die Fluoreszenz der Probe in Folge eines FRET- Effekts gequencht. Nachfolgend werden die Doppelhelixbindungen bei 95°C denaturiert. Nach der Abkühlung der Reaktion auf die Hybridisierungstemperatur 1 (Anealing, HT1) wird die Targetnukleinsäure mithilfe der im Reaktionsansatz enthaltenen Primer amplifiziert. Gleichzeitig bindet auch die zu der
Targetsequenz komplementäre Sonde, die während der Vervielfältigungsreaktion der
Targetnukleinsäure von der 5" -3" Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase zerstört wird. Anschließend wird der PCR- Mix auf die Hybridisierungstemperatur des jeweiligen
Sondenpaares (Reanealing, HT 2) abgekühlt. Die freien Sonden rehybridisieren und die Fluoreszenz der nach der Reaktion übrig gebliebenen Sonde wird gequencht. Die von der Taq-Polymerase zerstörten Sonden können aber nicht rehybridisieren, wobei die Quenchung verhindert wird. Diese Freisetzung der Fluoreszenz liegt überraschenderweise in der direkten Proportionalität zu dem Amplifikationsgeschehen und liefert daher auch eine quantitative Information über das Vorhandensein der Targetnukleinsäure.
[0020] Das erfindungsgemäße rehybridisierende Sondensystem offenbart in einer weiteren speziellen Ausführungsform überraschenderweise einen zusätzlichen und erheblichen Vorteil. So führt die Verwendung von zwei Sonden in einem Reaktionsansatz zu einer viel höheren diagnostischen Sensitivität. Dabei bindet eine erste Sonde an den„Plus- Strang" und eine zweite Sonde an den„Minus- Strang" der Targetnukleinsäure. Wenn beide Sonden mit demselben Farbstoff markiert sind, führt diese Ausführungsform zu einer deutlich höheren Fluoreszenz sowie zu früheren Gr- Werten bei der Echtzeit- Messung. Diese Beobachtung ist im Ausführungsbeispiel dargestellt. Damit kann eine viel höhere diagnostische Sensitivität erreicht werden, als z.B. mit einem System, welches eine dem Stand der Technik
entsprechende TaqMan-Sonde zur quantitativen Echtzeitmessung benutzt. Die
erfindungsgemäße Verwendung von zwei Sonden offenbart überraschenderweise noch einen weiteren wesentlichen Vorteil. Über die Nutzung einer zweiten Sonde wird es möglich, einen zweiten Detektionssequenzbereich in die Nachweisreaktion einzuführen. Dies ist gerade dann bedeutsam, wenn spezifische Zielsequenzen durch Mutationen häufig variieren. Mit einer zweiten Sonde kann somit ein größerer Sequenzbereich spezifisch für die Nachweisreaktion abgedeckt werden. In einem solchen Fall kann die zweite Sonde dann z.B. auch mit einem anderen Farbstoff markiert sein als die erste Sonde. Damit können dann beide Sonden unabhängig voneinander gemessen und detektiert werden. Die Platzierung von mehreren Sonden kann auch ggf. auf dem gleichen Strang der Zielnukleinsäure erfolgen.
[0021] Mit dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren steht somit ein alternatives Verfahren zur qualitativen und quantitativen Echtzeitmessung von Nukleinsäuren zur Verfügung, welches gegenüber dem Stand der Technik eingesetzter Verfahren sogar noch deutliche Vorteile aufzeigt. Darüber hinaus handelt es sich auch um ein homogenes Assay- Format, welches universell einsetzbar ist und auch mit allen eingesetzten Geräten zur Echtzeitmessung von Nukleinsäuren durchgeführt werden kann.
[0022] Das erfindungsgemäße Verfahren und Testkit eignen sich bestens für einen
Salmonellen- Test
[0023] Das erfindungsgemäße rehybridisierende Sondensystem stellt ein oder mehrere Paare von einander jeweils zugeordneten Oligonukleotiden dar. Die Oligonukleotide des jeweiligen Paares sind partiell oder vollständig komplementär. Ein Oligonukleotid des Paares besitzt darüber hinaus eine Komplementarität zur Target-Nukleinsäure. Dabei ist die
Hybridisierungstemperatur einer der Sonden zur Targetnukleinsäure höher als die
Hybridisierungstemperatur zwischen den Sonden des jeweiligen Paares. Dabei ist eine Sonde mit einem Reporterfarbstoff (im allgemeinen Sinne) und die andere Sonde des jeweiligen Paares mit entsprechendem Quencherfarbstoff markiert.
[0024] Die Messung der Fluoreszenz erfolgt während des Schrittes der Rehybridisierung (im Gegensatz dafür wird bei TaqMan während des Annealing Schrittes/Extension gemessen).
[0025] Die Sondenmarkierung mit sämtlichen dafür geeigneten Farbstoffen
(Reporter/Quencher Systeme), sowie Umkehrung der Farbstoffe sind auch möglich.
[0026] Die Sonde die an das Target bindet, sollte modifiziert sein, damit keine Verlängerung erfolgt (z.B. Phosphorylierung, etc.). [0027] Die andere Sonde soll vorzugsweise kürzer sein, als Sonde fürs Target oder eine nichtkomplementäre Sequenz zur Targetsonde besitzen. [0028] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein
Doppelsondensystem mit gleicher Markierung zur Steigerung der Sensitivität verwendet.
[0029] Es ist auch möglich, ein Doppelsondensystem mit unterschiedlicher Markierung zur zusätzlichen Targetdiskriminierung zu verwenden.
[0030] Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen dargestellt. Dabei stellen die Ausführungsbeispiele keine Limitierung des erfindungsgemäßen Verfahrens dar.
Ausführungsbeispiel 1:
Testung der Hybridisierung, Denaturierung und Rehybridisierung der Sondenpaare.
[0031] Dieser Versuch belegt, dass die Sondenpaare (Reporter/ Quencher) FAM/ BHQl und ROX/ BHQ2 die Fluoreszenz der Probe in der Abhängigkeit von der Temperatur verändern. Dieses Experiment beweist darüber hinaus, dass es sich nicht um die herkömmlichen „TaqMan" -Sonden handelt (Abb. 2a FAM/ BHQl; Abb. 2b ROX/ BHQ2). Alle Messungen wurden auf dem Real- Time- PCR- Gerät (QTower; Analytik Jena AG) durchgeführt.
[0032] Es wurden folgende Ansätze getestet:
Ansatz A:
[0033] 15 μΐ - PCR- Ansatz mit 2 FAM bzw. BHQl markierten Sondenpaaren. Jede FAM- markierte Sonde wurde in einer Konzentration von 0,15 pmol/ μΐ des PCR- Ansatzes der Reaktion zugefügt. (Abb.2a; 1-6)
Sondenpaar 1 :
1 A: BHQ 1 -attgtacgaatatttcaactaatgtggtcc-Ph
1B: AAAAAAAAgttgaaatattcgtacaat-FAM Sondenpaar 2:
2A: BHQ 1 -caccattaaggaccacattagttgaaat-Ph
2B: AAAAAAAAtggtccttaatggtg-FAM
Ansatz B
[0034] 15 μΐ PCR- Ansatz mit einer FAM/ BHQ- markierten TaqMan- Sonde der gleichen Sequenz wie die Sonde 1 A in der Konzentration 0,3 pmol/ μΐ des PCR- Ansatzes (Figur 2a; 7- 9)·
FAM-attgtacgaatatttcaactaatgtggtcc-BHQl
[0035] Bei der Erhöhung der Cycler- Temperatur bis 95°C wurde bei den PCR- Proben mit der FAM/ BHQl - markierten Sonde kein relevanter Anstieg der Fluoreszenz beobachtet. Die geringe Fluoreszenzerhöhung dieser Sonde ist durch die„Streckung" der Sonde zu erklären. Ein solcher„Fluoreszenzanstieg" wird z.B. bei der Patentschrift EP 0 826 066 Bl als
Messgröße verwendet. Bei dem erfindungsgemäßen rehybridisierenden Sondensystem zeigt sich ein anderes Temperaturverlaufsbild:
Bei einer Temperatur von 40°C (dies ist die Hybridisierungstemperatur des jeweiligen Sondenpaares) ist die Fluoreszenz niedrig.
Bei einer Erhöhung der Temperatur auf 95°C denaturiert die Wasserstoffbindung zwischen den beiden Sonden des Paars, FAM und BHQl verlieren ihre räumliche Nähe und die Fluoreszenz der Probe steigt um das drei- bis vierfache an.
Dieser Prozess scheint auch reversibel zu sein. Eine Temeraturverringerung auf die Hybridisierungstemperatur des Sondenpaars führt zur Rehybridisierung der Sonden. Dieser Prozess bewirkt dann ein erneutes deutliches Absinken der Probenfluoreszenz.
Ansatz 3
[0036] 15 μΐ - PCR- Ansatz mit jeweils nur einem ROX bzw. BHQ2 markierten Sondenpaar. Die ROX- markierte Sonde wurde in einer Konzentration von 0,15 pmol/ μΐ des PCR- Ansatzes der Reaktion zugefügt. (Figur 2b 1-3 und 4-6) Sondenpaar 1 :
3A: BHQ2-attgtacgaatatttcaactaatgtggtcc-Ph
3B: AAAAAAAAgttgaaatattcgtacaat-ROX
Sondenpaar 2:
4A: BHQ2-caccattaaggaccacattagttgaaat-Ph
4B: AAAAAAAAtggtccttaatggtg-ROX
Ansatz 4
[0037] 15 μΐ - PCR- Ansatz mit zwei ROX bzw. BHQ2 markierten Sondenpaaren (wie bei Punkt 3 beschrieben (7-9).
[0038] Bei diesem Ansatz konnte man gleichfalls eine Denaturierung und Rehybridisierung der ROX- BHQ2- Sondenpaare während der Temperaturveränderung beobachten. Dies eröffnet eine Möglichkeit für den multiplexen Nachweis der Proben. Darüber hinaus sieht man, dass die Anwendung von zwei Sondenpaaren zu einer deutlichen Signal Verstärkung führt. Dies ermöglicht die Steigerung der diagnostischen Sensitivität.
Ausführungsbeispiel 2
Relative Quantifizierung einer unbekannten Probe mittels des erfindungsgemäßen rehvbridisierenden Sondensvstem.
[0039] Im Ansatz werden zwei Salmonellen- DNA- Proben mit einer unbekannten
Konzentration und eine Standardverdünnungsreihe amplifiziert. Die Reaktion wurde auf einem anderen Real- Time- Gerät (BioRad) durchgeführt. Die Target- Nukleinsäure (HilA- Gen von Salmonella sp.) wurde mit folgenden Primern amplifiziert:
PCR- Primer :
Primer 1 (5'- GAG AGA AGC GGG TTG GTG TTC TAT C -3')
Primer 2 (5'- CCG GGC AGA TGA TAC CCG ATG -3') Rehybrydisierende Sondenpaare
Sondenpaar 1 :
1 A: BHQ 1 -attgtacgaatatttcaactaatgtggtcc-Ph
1B: AAAAAAAAgttgaaatattcgtacaat-FAM
Sondenpaar 2:
2A: BHQ 1 -caccattaaggaccacattagttgaaat-Ph
2B: AAAAAAAAtggtccttaatggtg-FAM
Reaktionsansatz (Amplifikation/ Hybridisierung)
Pro Probe:
sense Primer (50 pmol/ μΐ) 0,1 μΐ
antisense Primer (50 pmol/ μΐ) 0,1 μΐ
Sonden (je 25 pmol/ μΐ) je 0,1 μΐ
dNTP-Mix (12,5 mM) 0,3 μΐ
10X PCR- Buffer (MgCl2 included) 1 ,5 μΐ
Taq- DNA- Polymerase 0,75 U
PCR- Grade H20 add 15 μΐ
Zur Testung wurden auch 3 negative Proben (beinhaltend nur PCR- Chemikalien und H20) eingesetzt.
Amplifikations-/ Hybridisierungskonditionen
Schritt 1 : Denaturierung 95°C 180"
Schritt 2: Amplifizierung/ Rehybridisierung 45 Zyklen
95°C 10"
52°C 10"
40°C 30" [0040] Die Messung der freigesetzten Fluoreszenz erfolgte in Echtzeit während der
Rehybridisierungsphase (40°C) jedes Zyklus (Fig. 3a und Fig. 3b).
Fig.3a zeigt die Real- Time- PCR- Ergebnisse
S: Standard- Verdünnungsreihe P: Probe
N: Negativkontrolle
Fig. 3b zeigt die Standardkurve der getesteten Proben
[0041] Die nachfolgende Tabelle 1 enthält die jeweiligen Ct- Werte und die Berechnung der relativen Probenkonzentration.
Quantification Data
Figure imgf000012_0001
Tabelle 1
[0042] Dieser Versuch beweist, dass das erfindungsgemäße Sondensystem eine relative Quantifizierung der Targetnukleinsäure, ähnlich wie bei einer Real- Time- TaqMan- Quantifizierung ermöglicht. Das erfindungsgemäße rehybridisierende Sondensystem funktioniert auch auf gängigen kommerziell verfügbaren Geräten und kann damit auf diesen Systemen als eine Alternative zu TaqMan- Tests eingesetzt werden, ohne das ein neues Gerätesystem benötigt wird.
Ausführungsbeispiel 3
Vergleich einer relativen Quantifizierung einer unbekannten Probe mittels des rehybridisierenden Sondensystems und mittels herkömmlichen TaqMan Sonden.
[0043] Es werden zwei unterschiedliche Real- Time- PCR- Ansätze mit den gleichen
Standardreihen und Proben gegeneinander getestet. Die Reaktionen wurden auf einem dritten Real-Time-Gerät (Eppendorf AG) durchgeführt. Die Target- Nukleinsäure (HilA-Gen von Salmonella sp.) wurde in beiden Fällen mit folgenden Primern amplifiziert:
PCR-Primer
Primer 1 (5'- GAG AGA AGC GGG TTG GTG TTC TAT C -3')
Primer 2 (5'- CCG GGC AGA TGA TAC CCG ATG -3')
Ansatz 1 :
Erfindungsgemäße rehybrydisierende Sondenpaare: Sondenpaar 1 :
1 A: BHQ 1 -attgtacgaatatttcaactaatgtggtcc-Ph
1B: AAAAAAAAgttgaaatattcgtacaat-FAM
Sondenpaar 2:
2A: BHQ 1 -caccattaaggaccacattagttgaaat-Ph
2B: AAAAAAAAtggtccttaatggtg-FAM
Ansatz 2:
TaqMan- Sonde:
FAM-attgtacgaatatttcaactaatgtggtcc-BHQl
Reaktionsansatz (Amplifikation/ Hybridisierung)
Pro Probe: sense Primer (50 pmol/ μΐ) 0,1 μΐ
antisense Primer (50 pmol /μΐ) 0,1 μΐ
Sonden (je 25 pmol/ μΐ) je 0,1 μΐ
dNTP-Mix (12,5 mM) 0,3 μΐ
10X PCR- Buffer (MgCl2 included) 1 ,5 μΐ
Taq- DNA- Polymerase 0,75 U
PCR- Grade H20 add 15 μΐ
[0044] Zur Testung wurden auch 3 negative Proben (beinhaltend nur PCR- Chemikalien und H20) eingesetzt.
Amplifikations-/ Hybridisierungskonditionen Ansatz 1
Schritt 1 : Denaturierung 95°C 120"
Schritt 2: Amplifizierung/ Rehybridisierung 40 Zyklen
95°C 15"
52°C 15"
40°C 40"
[0045] Die Messung der freigesetzten Fluoreszenz erfolgte in Echtzeit während der
Rehybridisierungsphase (40°C) jedes Zyklus (Fig.4a).
Amplifikations-/ Hybridisierungskonditionen Ansatz 2
Schritt 1 : Denaturierung 95°C 120"
Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen
95°C 15"
53°C 60"
[0046] Die Messung der freigesetzten Fluoreszenz erfolgte in Echtzeit während der
Anealingphase (53°C) jedes Zyklus (Fig. 4b).
[0047] Die nachfolgenden Tabellen 2 und 3 zeigen die jeweiligen Ct- Werte und die
Ergebnisse der relativen Quantifizierung im Vergleich der beiden Nachweissysteme. Tabelle 2: Ansatz mittels des erfindungsgemäßen rehybridisierenden Sondensystems
Pos Name Ct FAM Amount FAM [Copies]
B2 Std_1/1 20,79 1,00
B3 Std_0.1/1 25,48 0,100
B4 Std_0.01/1 28,72 1,000E-2X
B5 Std_0.001/1 32,31 1,000E-3X
B6 Std_0.0001/1 35,94 1,000E-4X
B8 2 30,20 4,170E-3X
C2 Std_1/1 21,05 1,00
C3 Std_0.1/1 26,09 0,100
C4 Std_0.01/1 28,93 1,000E-2X
C5 Std_0.001/1 32,53 1,000E-3X
C6 Std_0.0001/1 36,15 1,000E-4X
C8 2 30,51 3,440E-3X
E6 3 - -
E7 3 - -
E8 3
Tabelle 3 : Ansatz mit TaqMan- System
Name Ct FAM Amount FAM [Copies]
1_1/1 21,39 1,00
1_0.1/1 25,47 0,100
1_0.01/1 29,09 1,000E-2X
1_0.001/1 32,77 1,000E-3X
1_0.0001/1 35,71 1,000E-4X
2 30,23 3J50E-3X
1_1/1 21,06 1,00
1_0.1/1 25,62 0,100
1_0.01/1 29,04 1,000E-2X
1_0.001/1 32,64 1,000E-3X
1_0.0001/1 34,59 1,000E-4X
2 29,84 4,830E-3X
3 - -
3 - -
3 [0048] Wie man aus den Versuchsergebnissen entnehmen kann, sind die Ergebnisse mit beiden Systemen sowohl in Bezug auf die RA2- Werte, die PCR- Effizienz, die Ct- Werte und die Methodensensitivität absolut vergleichbar.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur RealTime- bzw. Endpunkt- Bestimmung von Nukleinsäuren,
gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Bereitstellung mindestens eines miteinander hybridisierten Sondenpaares, welches eine Hybridisierungstemperatur aufweist, die niedriger ist als die
Hybridisierungstemperatur einer dieser Sonden zur Nukleinsäure (Target), wobei die eine Sonde des Sondenpaares mit einer Markierung versehen ist, die ein
auswertbares Signal erzeugt ist und die andere Sonde des Sondenpaares mit einer Markierung versehen ist, die dieses Signal aufheben kann in einem konventionellen Amplifikationsansatz mit einer Polymerase mit 5" -3" Exonukleaseaktivität b) Erwärmen der zu bestimmenden Nukleinsäure und des miteinander hybridisierten Sondenpaares auf eine Temperatur, so dass sowohl eine Strangtrennung des
Sondenpaares als auch der Nukleinsäure erfolgt c) Abkühlung des Ansatzes auf eine Temperatur, bei der eine Sonde mit einem Strang der Nukleinsäure (Target) hybridisiert, Zugabe, wobei die Nukleinsäure amplifiziert und die an die Nukleinsäure hybridisierte Sonde durch die 5" -3" Exonukleaseaktivität der Polymerase gespalten wird. d) Abkühlung des Ansatzes auf eine Temperatur, bei der das ursprüngliche Sondenpaar re-hybridisiert. e) Bestimmung der Nukleinsäuren durch Auswertung des Signals, das nach der
Rehybridisierung vorhanden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde, die mit dem Target hybridisiert, gegen eine Verlängerung geschützt ist, vorzugsweise mittels
Phosphorylierung. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde, die mit dem Target hybridisiert, länger ist als die andere Sonde des Sondenpaares oder die andere Sonde eine zum Target nicht-komplementäre Sequenz enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Markierungen der Sonden um Farbstoffe, vorzugsweise Fluoreszenzfarbstoffe, bzw. Quencher handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein miteinander hybridisiertes Sondenpaar eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere miteinander hybridisierte Sondenpaare eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die jeweiligen Sondenpaare unterschiedliche Markierungen aufweisen.
Testkit zum Nachweis von Nukleinsäuren, umfassend
a) mindestens ein miteinander hybridisiertes Sondenpaares, welches eine
Hybridisierungstemperatur aufweist, die niedriger ist als die
Hybridisierungstemperatur einer dieser Sonden zur Nukleinsäure (Target), wobei die eine Sonde des Sondenpaares mit einer Markierung versehen ist, die ein
auswertbares Signal erzeugt ist und die andere Sonde des Sondenpaares mit einer Markierung versehen ist, die dieses Signal aufheben kann.
b) an sich bekannte Primer und eine Polymerase mit 5" -3" Exonukleaseaktivität c) an sich bekannte Geräte zum Erwärmen, Abkühlen und Auswerten des Mess-Signals.
Verwendung des Verfahrens oder des Testkits zum Nachweis von Salmonellen.
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