DE69838210T2

DE69838210T2 - Markierter Primer, geeignet für die Detektion von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69838210T2
Application number: DE69838210T
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr. Weimer
Original assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Current assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Priority date: 1997-12-15
Filing date: 1998-12-10
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2018-12-11
Also published as: EP0930370A1; AU9708898A; AU741053B2; ATE369439T1; DE69838210D1; JP4331812B2; ES2290979T3; KR100702338B1; CA2255531A1; JPH11313685A; KR19990063053A; CA2255531C; US6248526B1; EP0930370B1

Description

Die Erfindung betrifft einen markierten Primer für Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen (z. B. die Polymerase-Kettenreaktion) und ein Verfahren zur Detektion einer DNA-Sequenz mit Hilfe eines Nukleinsäure-Amplifikationsverfahrens, bei dem ein markierter Primer verwendet wird.
Wie bekannt, ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein sehr effektives Verfahren zur Detektion kleiner Mengen einer bekannten Nukleinsäuresequenz in einer Probe (Erlich H.A., Gelfand, D., Sninsky, J.J. (1991), Science 252, S. 1643–1651, wobei diese Veröffentlichung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist; PCR Protocols, Current Methods and Applications (1993), Herausg. B.A White, Humana Press, Totowa, New Jersey, ISBN 0-89603-244-2, wobei diese Publikation hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist). Wenn die Sequenz z. B. einer viralen DNA bereits bekannt ist, ist es möglich, ein Paar Primer zu synthetisieren, die zu Regionen an gegenüberliegenden Einzelsträngen komplementär sind und die die gesuchte DNA-Sequenz flankieren. Unter PCR-Bedingungen, die an sich bekannt sind, kann dann eine Sequenz von üblicherweise mehr als 30 Reaktionszyklen verwendet werden, um große Mengen einer spezifischen DNA in vitro zu amplifizieren. Die PCR-Zyklen amplifizieren ein DNA-Fragment, das eine bestimmte Größe aufweist und das aus den Längen der beiden Primer plus der Länge der z. B. viralen DNA zwischen ihnen besteht, wenn die gesuchte z. B. virale DNA in der Probe vorhanden ist. Die PCR-Technik ist so empfindlich, dass sie verwendet werden kann, um kleinste Mengen einer DNA mit einem hohen Grad an Zuverlässigkeit zu detektieren.
Die internationale Patentanmeldung WO 92/02638 , die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist, offenbart ein Verfahren zur Detektion einer DNA-Sequenz, wobei bei diesem Verfahren eine Probe, die die zu detektierende DNA (als Einzelstrang), d. h. die Target-DNA enthält, oder von der dies angenommen wird, mit zwei verschiedenen Primern, d. h. mit dem Vorwärts-Primer und dem Rückwärts-Primer, die den zu amplifizierenden DNA-Strang, d. h. die Target-DNA flankieren, hybridisiert. Eine markierte Oligonukleotidsonde, die in einer bevorzugten Ausführungsform der WO 92/02638 mit einem Fluoreszenz-Farbstoffsystem als Markierung an ihrem 5'-Ende und an ihrem 3'-Ende versehen ist, wird bei der Reaktion ebenfalls verwendet. Diese markierte Sonde wird derart ausgewählt, dass sie zwischen den beiden Primern innerhalb des zu amplifizierenden DNA-Segments, d. h. innerhalb der Target-DNA, hybridisiert. Die beiden Fluoreszenzfarbstoffe, die auf die Sonde als bevorzugte Markierung aufgebracht werden, besitzen das charakteristische Merkmal, dass die Fluoreszenz eines der Farbstoffe, des Reporter-Farbstoffes, durch die Nähe des zweiten Moleküls, d. h. durch den Quencher durch einen als Fluoreszenzresonanz-Energietransfer bekannten Prozess verringert („gequencht") ist (Stryer, L. 1978; Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Ann. Rev. Biochem. 47: 819–846, hierin durch Bezugnahme aufgenommen). Diese markierte Sonde, die die DNA zwischen den beiden Primern bindet, welche durch die oben erwähnten Sequenzen charakterisiert sind, besitzt z. B. die folgende Sequenz: ^5'FAM-TGG TGG TCT GGG ATG AAG GTA TTA TT-TAMRA^3'
Eine derartige Sequenz kann bei einer Anzahl von Unternehmen bestellt und erworben werden und ist zur Verwendung in einem 5'-Nuklease-Assay, d. h. dem TaqMAN^®-Assay vorgesehen. Das oben stehende Verfahren ist im Detail von Livak, K.J., Flood, S.J.A, Marmaro, J., Giusti, W., Deetz, K., in Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Method and Appl. 1995; 4: 357–362, be schrieben, wobei diese Veröffentlichung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Das spezielle Merkmal dieser Sonde besteht darin, dass die Fluoreszenz des Farbstoffes (FAN), d. h. des Reporter-Farbstoffes, der auf dem 5'-Ende der Sonde aufgebracht ist, durch die Nähe des zweiten Fluoreszenzfarbstoffes (TAMRA), d. h. des Quencher-Farbstoffes, der an dem 3'-Ende der Sonde angebracht ist, verringert ist, siehe oben.
Wenn nun der neue DNA-Strang gebildet wird, verschiebt sich im Verlauf der Amplifikation und unter dem Einfluss einer geeigneten, vorzugsweise thermostabilen DNA-Polymerase, z. B. der TaqDNA-Polymerase, nicht nur die markierte Sonde von dem Einzelstrang, sondern mit Hilfe ihrer 5'-33'-Nukleaseaktivität wird die Sonde auch abgebaut und setzt dabei die beiden Fluoreszenzfarbstoffe frei. Die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffes wird nun nicht mehr durch den Quencher-Farbstoff unterdrückt und steigt an. Wird nun ein Fluoreszenz-Spektrometer verwendet, um die Fluoreszenz bei der Wellenlänge des Reporter-Farbstoffes zu messen, so ist es dann möglich, einen Anstieg der Fluoreszenz zu beobachten, der der Menge an neu gebildeter DNA entspricht.
Die Tatsache, dass eine markierte Sonde zusätzlich zu dem Vorwärts-Primer und dem Rückwärts-Primer erforderlich ist, um die Amplifikation des zu detektierenden DNA-Segments zu beobachten oder messen zu können, muss als Nachteil dieses Verfahrens gesehen werden. Es ergab sich daher das Ziel, dieses bekannte Verfahren zu vereinfachen.
Nun hat sich herausgestellt, dass keine Notwendigkeit besteht, eine zusätzliche markierte Sonde in der Polymerase-Kettenreaktion zu verwenden, wenn wenigstens einer der beiden Primer mit, z. B. in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, einem Reporter-Molekül und einem Quencher-Molekül (allgemein ausgedrückt: einem interaktiven Markierungssystem) markiert ist und gleichzeitig darauf geachtet wird, dass sichergestellt ist, dass der markierte Primer mit dem zu amplifizierenden DNA-Strang nicht vollständig hybridisiert.
Die Erfindung verwendet daher einen markierten Primer für Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen (z. B. die Polymerase-Kettenreaktion), wobei der Primer in einer bevorzugten Ausführungsform mit einem Markierungssystem an oder nahe dem Ende des 3'-Endes des Primers markiert ist, wobei in der bevorzugten Ausführungsform ein Reporter-Farbstoffmolekül und ein Quencher-Molekül und wenigstens eine, vorzugsweise wenigstens die letzten zwei bis fünf oder mehr Basen an dem 3'-Ende des Primers (d. h. ein beliebig unpassender 3'-terminaler Abschnitt), der auf diese Weise markiert ist, zu der zu amplifizierenden DNA-Sequenz nicht komplementär sind. Die Markierung oder ein Teil des Markierungssystems wird an dem unpassenden 3'-terminalen Abschnitt, vorzugsweise an dem 3'-Endnukleotid angebracht. Die Länge der ungepaarten Region ist, wie dem Fachmann bekannt, in Übereinstimmung mit der speziellen Markierung und der speziellen Polymerase, die verwendet werden, ausgewählt und/oder optimiert. Solch ein markierter Primer ist nicht in der Lage, eine vollständige Basenpaarung an seinem 3'-Ende mit der zu amplifizierenden DNA-Sequenz einzugehen. Unter dem Einfluss der für die Amplifikation verwendeten Polymerase, wobei die Polymerase Korrekturleseeigenschaften aufweisen muss, werden die ungepaarten Basen des markierten Primers zusammen mit der verwendeten Markierung wie z. B., je nachdem, dem Reporter-Farbstoffmolekül oder dem Quencher-Molekül durch die 3'-5'-nukleolytische Aktivität der Polymerase freigesetzt, bevor die eigentliche Verlängerungsreaktion stattfindet. Dies führt jedoch in dem beispielhaften Fall dazu, dass sich der Quencher nicht mehr in räumlicher Nähe zu dem Reporter-Farbstoff befindet, dessen Fluoreszenz somit an steigt, wodurch das Vorhandensein einer Target-Nukleinsäure und/oder einer Target-Nukleinsäureamplifikation angezeigt wird.
Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Detektion einer DNA-Targetnukleinsäure mittels Nukleinsäureamplifikation, wobei in diesem Verfahren einer der Primer die oben erwähnten Merkmale aufweist. In der Amplifikation, für die eine oder mehrere thermostabile DNA-Polymerase/n, von denen wenigstens eine auch Korrekturleseeigenschaften aufweisen muss, verwendet werden kann/können, werden dann die ungepaarten Basen des markierten Primers zusammen mit der Markierung oder einem Teil eines Markierungssystems wie z. B. dem daran angebrachten Reporter-Farbstoff freigesetzt, was zu einem Signalanstieg, z. B. einem Fluoreszenzanstieg bei der Wellenlänge des Reporter-Farbstoffes führt.
In dem neuen Verfahren können sowohl der Vorwärts-Primer als auch der Rückwärts-Primer jeweils mit den Reporter- und Quencher-Molekülen markiert werden, wie oben beschrieben. Während der Quencher-Farbstoff in die Reaktionslösung freigesetzt wird, trägt das neu gebildete DNA-Segment zusätzlich zum Rest des Primers auch den Fluoreszenz-Reporter-Farbstoff. Dies ist das bevorzugte Verfahren für quantitative Anwendungen. Die Markierung mit dem Quencher- und dem Reporter-Farbstoff kann jedoch auch gleich gut auf gegensätzliche Weise bewirkt werden, sodass der Reporter-Farbstoff in die Reaktionslösung freigesetzt wird und das neu gebildete DNA-Segment den Quencher trägt. Wenn mehrere Parameter gleichzeitig parallel detektiert werden sollen (Multiplexen), ist es von Vorteil, Reporter-Farbstoffe auszuwählen, die parallel detektiert werden können. Hierin ist offenbart, dass das Verfahren der Erfindung zum Multiplexen sehr gut geeignet ist.
Allgemein wird das 3'-Ende eines Primers markiert oder an dem Teil eines Markierungssystems angebracht, wie unten stehend beschrieben, indem Teile eingebaut werden, die mit spektroskopischen, photochemischen, immunochemischen oder chemischen Mitteln detektierbar sind. Das Verfahren zum Verbinden oder Konjugieren der Markierung mit dem Primer ist naturgemäß abhängig von der Art des/der verwendeten Markierung/en und der Position der Markierung an dem Primer.
Im Stand der Technik sind eine Vielfalt an Markierungen, die zur Verwendung bei der Erfindung geeignet sind, als auch Verfahren für deren Einschluss im Primer bekannt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Enzyme (z. B. alkalische Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase) und Enzymsubstrate, radioaktive Atome, Fluoreszenzfarbstoffe, Chromophore, Chemilumineszenz-Markierungen, Elektrochemolumineszenz-Markierungen wie z. B. Origen^TM (Igen), Liganden mit speziellen Bindungspartnern oder beliebige andere Markierungen, die miteinander interagieren können, um ein Signal zu erhöhen, zu verändern oder zu erniedrigen. Selbstverständlich muss die Markierung, wenn die Amplifikation mittels PCR erfolgen und unter Verwendung eines Thermozyklers ausgeführt werden soll, den in diesem automatisierten Verfahren erforderlichen Temperaturzyklus unbeschadet überdauern können.
Von den radioaktiven Atomen ist ³²P bevorzugt. Verfahren zum Einbauen von ³²P in Nukleinsäuren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen z. B. das 5'-Markieren mit einer Kinase oder einen zufälligen Einbau über eine Nick-Translation. Enzyme werden typischerweise durch ihre Aktivität detektiert. Der Begriff „spezifischer Bindungspartner" bezieht sich auf ein Protein, das in der Lage ist, einen dafür spezifischen monoklonalen Antikörper-Liganden zu binden. Weitere spezifische Bindungspartner umfassen Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A und die vielen im Stand der Technik bekannten bekannten Rezeptor-Liganden-Paare.
Die obige Beschreibung ist nicht dazu gedacht, die verschiedenen Markierungen in unterschiedliche Klassen zu kategorisieren, da dieselbe Markierung in mehreren verschiedenen Arten nützlich sein kann. ¹²⁵J kann als eine radioaktive Markierung oder als ein elektronendichtes Reagens dienen. HRP kann als Enzym oder als Antigen für einen monoklonalen Antikörper dienen. Des Weiteren ist es möglich, verschiedene Markierungen für eine gewünschte Wirkung zu kombinieren. Beispielsweise kann man einen Primer mit Biotin markieren und das Vorhandensein des Primers mit einer Avidin-Markierung mit ¹²⁵J oder mit einem monoklonalen Antibiotin-Antikörper, der mit HRP markiert ist, detektieren. Dem Fachmann werden weitere Permutationen und Möglichkeiten bekannt sein und diese werden als Äquivalente innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung betrachtet.
Fluorophore zur Verwendung als Markierungen beim Aufbau von markierten Primern der Erfindung umfassen Rhodamin und Derivate wie z. B. Texas Red, Fluoreszein und seine Derivate wie z. B. 5-Bromomethyl-fluoreszein, Lucifer Yellow, IAEDANS, 7-Me₂N-Cumarin-4-acetat, 7-OH-4-CH₃-Cumarin-3-acetat, 7-NH₂-4-CH₃-Cumarin-3-acetat (AMCA), Monobrombiman, Pyrentrisulfonate wie z. B. Cascade Blue und Monobromtrimethylammoniobiman. Im Allgemeinen sind Fluorophore mit breiten stokeschen Verschiebungen bevorzugt, um die Verwendung von Fluorimetern mit Filtern anstelle eines Monochromometers zuzulassen und die Effizienz der Detektion zu erhöhen. Allerdings weist/weisen die speziellen gewählte/n Markierung/en vorzugsweise eine bestimmte Qualität auf (z. B. die Reporter-Quencher-Beziehung), um eine Detektion in einem homogenen Assay-System zuzulassen.
Die Detektion oder Verifizierung der Markierung in den offenbarten Verfahren wird durch eine Vielzahl von Verfahren bewerkstelligt und ist abhängig von der Quelle des/der verwendeten Markierung/en. In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Anstieg der Fluoreszenz in einem geeigneten Fluorometer gemessen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zwei interaktive Markierungen an einem einzigen Primer als ein Reporter-Quencher-Markierungssystem verwendet, siehe oben und die Beispiele.
Beispiele für Reporter-Moleküle sind 6-Carboxyfluoreszein (FAN), Tetrachlor-6-carboxyfluoreszein (TET), 6-Carboxy-X-carboxy-tetramethyl-rhodamin (ROX). Beispiele für Quencher-Moleküle sind 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin (TAMPA) oder 4-(4'-Dimethylamino-phenylazo)benzoesäure (DABCYL), wobei TAMRA ein Fluoreszenzfarbstoff ist, DABCYL jedoch nicht.
Für die neue Amplifikationsreaktion können verschiedene DNA-Polymerasen verwendet werden. Wenn die DNA-Polymerase, die verwendet wird, die Korrekturleseeigenschaft aufweist, so ist es möglich, die Reaktion unter Verwendung einer einzigen Polymerase (z. B. ULTma^®-DNA-Polymerase, die für Perkin Elmer von Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey, USA hergestellt wird) auszuführen. Ansonsten ist es erforderlich, eine Mischung von mehreren Polymerasen zu verwenden, wobei weitere Polymerasen mit einer 3'-5'-Nukleaseaktivität auch zusätzlich zu z. B. einer Taq-DNA-Polymerase verwendet werden. Die Tli-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, WI, USA) oder die Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Beverley, MA, USA) sind geeignete thermostabile Polymerasen, die eine 3'-5'-Nukleaseaktivität besitzen. Sehr gut für die vorliegende Erfindung geeignet ist die Accu Taq^TM-LA-DNA-Polymerase-Mischung, vertrieben von SIGMA Corp. (Anhang 1). Solch eine Mischung und verwandte Enzym-Zusammensetzungen sind in dem US-Patent Nr. 5 436 149 in Beispiel 6 ebenda beschrieben, wobei diese Patentoffenlegung hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Die neuen Verfahren basieren auf der Erkenntnis der Tatsache, dass die ungepaarten Basen des Primers eine Angriffsstelle für die Polymerase, die eine Korrekturlesefunktion besitzt, darstellen. Die thermostabilen DNA-Polymerasen, die verwendet werden, besitzen eine 3'-5'-Nukleaseaktivität, vorzugsweise eine 3'-5'-Exo-Nukleaseaktivität, was dazu führt, dass die nicht hybridisierten Basen zusammen mit dem, wie es der Fall sein kann, Quencher- oder Reporter-Molekül freigesetzt werden.
Die in den neuen Verfahren verwendeten Primer umfassen vorzugsweise Oligonukleotide aus 18 bis 25 Basen in der gepaarten oder zusammengefügten Region wie in Bezug auf die Target-Nuklensäure für durchschnittliche G/C und A/T-Verhältnisse, sind jedoch im Falle von mehr A/T-Basenpaaren etwas länger und entsprechen der oben für die PCR offenbarten allgemeinen Methodik.
Die offenbarten Verfahren sind insbesondere auf Grund ihrer Einfachheit nützlich im Vergleich mit z. B. der WO 92/02638 , da nur zwei Oligonukleotide (Primer) notwendig sind, um die Nukleinsäureamplifikation, z. B. die PCR auszuführen. Dies ist von Vorteil, wenn z. B. konservierte Nukleinsäuresegmente amplifiziert werden müssen, um verschiedene Target-Sequenzen wie jene von Viren zu detektieren, oder mehrere, z. B. virale Parameter, gleichzeitig detektiert werden sollen Darüber hinaus ist das hier beschriebene Verfahren sehr gut für die quantitative Amplifikation geeignet, da der Anstieg der Fluoreszenz direkt proportional zu der Menge an amplifizierter DNA ist.
Die bevorzugtesten Ausführungsformen der Erfindung sind Verfahren, die die PCR als Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren verwenden und in denen der unpassende 3'-Primer mit einem quenchbaren Fluoreszenzfarbstoffmolekül und einem Quencher-Molekül markiert ist, wobei wenigstens eines der Moleküle an oder in dem unpassenden 3'-Ende des Primers vorhanden ist. Wenn ein RNA-Target detektiert werden soll, wird vor einer Amplifikation mittels PCR eine umgekehrte Transkription der Target-RNA in eine DNA durchgeführt. Wenn die Targetnukleinsäure reichlich vorhanden ist, ist eine einzige normale PCR aus den dem Fachmann bekannten Protokollen, aber unter Verwendung eines markierten Primers zu bevorzugen (Beispiel 2). Wenn eine hohe Empfindlichkeit der Target-Detektion erwünscht ist, kann eine erste PCR-Amplifikation, die das Target unter Verwendung nicht markierter, vollständig passender Primer amplifiziert, einer zweiten Amplifikation der Targetnukleinsäure mittels nested PCR unter Verwendung der markierten Primer der Erfindung vorangehen. Speziell bei der zweiten Amplifikation (nested PCR) hat sich gezeigt, dass der Zusatz eines nicht markierten Primers mit oder ohne dem unpassenden 3'-Abschnitt oder -Schwanz insofern von Vorteil sein kann, als dies die Amplifikation effizienter machen kann und eine Reduktion des markierten Primers zulässt.
Reagenzien, die in den Verfahren der Erfindung verwendet werden, können in Diagnosekits abgepackt sein. Diagnosekits umfassen die markierten Primer in getrennten Behältern. Wenn der/die Primer unmarkiert ist/sind, können die spezifischen Markierungsreagenzien ebenfalls im Kit umfasst sein. Der Kit kann auch weitere geeignet abgepackte Reagenzien und Materialien beinhalten, die für die Probenvorbereitung und -amplifikation benötigt werden, z. B. Extraktionslösungen für die Targetnukleinsäure, Puffer, dNTPs und/oder Polymerisationsmittel und für die Detektionsanalyse z. B. Enzyme und Fest phasenextraktionsmittel wie auch Instruktionen zur Durchführung des Assays. Ein weiteres Ziel der Erfindung sind die verschiedenen Reaktionsgemische zum Detektieren einer Targetnukleinsäure in einer Probe, die für die offenbarten Verfahren nützlich sind. Proben können Körperfluide menschlichen oder tierischen Ursprungs oder Auszüge eines beliebigen Körperteils von Interesse sein. Bevorzugte Proben sind Blut, Plasma oder jegliche daraus resultierende Produkte.
Die Erfindung ist durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht, jedoch nicht beschränkt:
Beispiel 1
Dieses Beispiel steht für Anwendungen, die höchste Empfindlichkeit erfordern. In diesem Fall geht ein erster Amplifikationsumlauf der nested PCR, die den markierten Primer enthält, voran.
Um die RNA des Hepatitis-C-Virus zu detektieren, wird sie zuerst unter Verwendung von Standardverfahren (z. B. Ishizawa, M., Kobayashi, Y., Miyamura, S: Simple procedure of DNA isolation from human serum. Nucl, Acids Res. 1991; 19:5792, wobei diese Veröffentlichung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist) extrahiert und die isolierte RNA wird danach unter Verwendung von Standardverfahren (RT-PCR) umgekehrt transkribiert und amplifiziert. Der Aufbau der nested Amplifikations- und Detektionsreaktion ist wie folgt:
5 μl 10 × ULTma-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,8, 100 mM KCl, 0,02 % Tween 20, von Perkin-Elmer), 7 μl 25 mM MgCl₂, 8 μl Primer 1 (siehe SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls) (10 pmol/μl), 4 μl Pimer 2 (siehe SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls) (10 pmol/μl), 0,25 μl Primer 3 (siehe SEQ ID Nr. 3 des Sequenzprotokolls) (10 pmol/μl), 2 μl dNTPs (10 mM) und 0,5 μl ULTma DNA-Polymerase mit einer Korrekturlesefunktion (Perkin-Elmer, 6 Einheiten/μl) werden 5 μl der RT-PCR-Reaktion zugesetzt, wonach alles mit 18,25 μl Wasser gemischt wird und den nachfolgenden Thermozyklen unterzogen wird:

1. Anfängliche Denaturierung, eine Minute bei 90°
2. 35 Zyklen von jeweils 28 Sekunden bei 94°C zur Denaturierung und eine Minute bei 56°C zum Annelieren und Verlängern
3. Kühlen bei 4°C bis zur Auswertung.

Die PCR-Reaktion wird mit einem Fluoreszenz-Spektrometer ausgewertet. Zu diesem Zweck wird die Fluoreszenz bei der Reporter-Wellenlänge (518 nm für FAM) gemessen. Ein Schwellenwert auf der Basis der Fluoreszenz von negativen Kontrollen, die keine Target-Sequenz enthalten, wird berechnet und verwendet, um unbekannte Werte auszuwerten.
Beispiel 2
Dieses Beispiel steht für Anwendungen, die keine höchste Empfindlichkeit erfordern. In diesem Fall enthält die einzige Amplifikationsreaktion den markierten Primer.
Um die DNA des Hepatitis-B-Virus von seropositiven Patienten zu amplifizieren, wird sie zuerst unter Verwendung von Standardverfahren (z. B. Ishizawa, M., Kobayashi, Y., Miyamura, T., Matsuma, S: Simple procedure of DNA isolation from human serum. Nucl. Acids Res. 1991; 19:5792) extrahiert. Der Aufbau der Amplifikation ist wie folgt:
5 μl 10 × ULTma-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,8, 100 mM KCl, 0,02% Tween 20, von Perkin-Elmer), 7 μl 25 mM MgCl₂, 8 μl Primer 4 (siehe SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls) (10 pmol/μl), 4 μl Primer 5 (siehe SEQ ID Nr. 5 des Sequenzprotokolls) (10 pmol/μl), 0,25 μl Primer 6 (siehe SEQ ID Nr. 6 des Sequenzpro tokolls) (10 pmol/μl), 2 μl dNTPs (10 mM) und 0,5 μl ULTma DNA-Polymerase mit einer Korrekturlesefunktion (Perkin-Elmer, 6 Einheiten/μl) werden 5 μl der extrahierten DNA (d. h. der Targetnukleinsäure) zugesetzt, wonach alles mit 18,25 μl Wasser gemischt wird und den nachfolgenden Thermozyklen unterzogen wird:

1. Anfängliche Denaturierung, eine Minute bei 90°
2. 35 Zyklen von jeweils 28 Sekunden bei 94°C zur Denaturierung und eine Minute bei 58°C zum Annelieren und Verlängern
3. Kühlen bei 4°C bis zur Auswertung

Die Auswertung der Ergebnisse erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
In beiden Beispielen 1 und 2 war der Reporter FAN und der Quencher TAMRA.
Legende zu 1.
Die Fig. zeigt einen Zyklus eines beanspruchten Verfahrens („TaqWoman Assay").

A: bezeichnet den Vorwärts-Primer mit seinem ungepaarten 3'-Ende
B: bezeichnet den Rückwärts-Primer
R: bezeichnet das Reporter-Molekül
Q: bezeichnet das Quencher-Molekül.

Die sogenannte Annelierung erfolgt in Schritt 1, wobei das 3'-Ende ungepaart bleibt, da es nicht komplementär ist.
Das so genannte Korrekturlesen erfolgt in Schritt 2, wobei das Enzym eine Korrekturleseeigenschaft besitzt und das ungepaarte 3'-Ende korrigiert, d.h. entfernt.
Die so genannte Strangverlängerung (Verlängerungsphase) erfolgt in Schritt 3, wobei diese Phase dann in Schritt 4 beendet wird. Anhang 1

AccuTaq^TM LA DNA POLYMERASE MIX* D 8045 125 Einheiten

Für lange, genaue PCR 500 Einheiten

1500 Einheiten
AccuTaq LA DNA Polymerase Mix ist ein optimiertes Zwei-Polymerasen-Enzymsystem für eine lange, sehr genaue PCR. Dieses Gemisch ist eine optimale Mischung der Hochleistungs-Taq-DNA-Polymerase von Sigma und einer geringen Menge einer Polymerase mit der 3'-5'-Exonukleaseaktivität, die zum Korrekturlesen erforderlich ist. Diese Formulierung erzielt größere Ausbeuten mit einer größeren Genauigkeit (bis zu 6,5 x) als die Standard-Taq-DNA-Polymerase. PCR-Amplifikationen von 0,25 bis mehr als 40 kb sind möglich. AccuTaq ist ideal geeignet zum Amplifizieren von komplexen DNA-Templaten wie z. B. der humanen Genom-DNA. Seine hohe Genauigkeit macht es zum Enzym der Wahl bei der Durchführung von Amplifikationen, bei denen eine geringe Fehlerhäufigkeit wichtig ist, wie z. B. RT-PCR und Klonen.

– Größere Genauigkeit (bis zu 6,5 x) als bei der Standard-Taq-DNA-Polymerase.
– Amplifikationen bis zu 22 kb für komplexe DNA-Template wie z. B. Genom-DNA.
– Amplifikationen bis zu 40 kb für weniger komplexe Template wie z. B. Plasmid-DNA.
– Robustere Reaktionen und größere Flexibilität als sehr genaue Einzelenzymsysteme. – Ein Fläschchen DMSO ist enthalten, um die Amplifikation von komplexen Templaten wie z. B. einer Genom-DNA zu verbessern. Ein detaillierter technischer Bericht mit Amplifikations-Parametern für DNA-Längen von 1 bis 40 kb ist bereitgestellt. Geliefert als 5 Einheiten/μl und verwendet in 2,5 Einheiten/50 μl pro Reaktion.

Definition einer Einheit: eine Einheit inkorporiert 10 nmol von Gesamt-dNTPs in säurefällbare DNA in 30 min bei 74°C.
Lagerung: –20°C
Transport in nassem Eis
R: 22-36/37/38 S: 26-36-23
Lizensiert unter US-Patent Nr. 5 436 149 , Inhaber Takara Shuzo Co., Ltd.
ACCUTAQ LA DNA POLYMERASE MIX
Produktnummer D8045
Bericht Nr. MB-410
Lagerung: unter 0°C
August 1998
Technischer Bericht
Einleitung
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)+ ist eine leistungsstarke Technik, die häufig für Anwendungen in der Molekularbiologie wie z. B. Klonen, Sequenzieren und zur Gen-Kartierung verwendet wird. Das primäre in der PCR verwendete Enzym ist die Taq-DNA-Polymerase. Eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der Taq-DNA-Polymerase ist im Allgemeinen auf Amplifikationen bis zu 5 kb beschränkt. Dies liegt zum Teil darin begründet, dass die Taq-DNA-Polymerase keine 3'-5'-Exonuklease- oder „-Korrekturlese"-Aktivität aufweist, was bedeutet, dass periodische Fehleinbauten nicht repariert werden. Nach einem erfolgten Fehleinbau setzt das Enzym entweder damit fort, Nukleotide einzbauen, was einen fortschreitenden Fehler verursacht, oder ein Terminierungsereignis tritt auf und eine Verlängerung wird gehemmt. Eine Long and Accurate (LA) PCR kombiniert eine stark fortschreitende thermostabile Polymerase mit einer zweiten thermostabilen Polymerase, die eine 3'→5'-exonukleolytische Aktivität aufweist. Diese Mischung erhöht die Länge der Amplifikationsprodukte durch Verwendung der Korrekturlese-Polymerase zum Reparieren der endständigen Fehleinbauten. Diese Reparatur lässt zu, dass die Polymerase die Verlängerung des wachsenden DNA-Stranges wieder aufnimmt. Der AccuTaq LA-Polymerase-Mix kombiniert die qualitativ hochwertige Taq-DNA-Polymerase von Sigma mit einer geringen Menge eines thermostabilen Korrekturleseenzyms. Das Ergebnis ist ein Enzymgemisch, das Genom-Targets über 20 kb hinaus amplifiziert.
Bei Verwendung eines weniger komplexen Templats wie z. B. einer bakteriellen Genom- oder viralen DNA wurden Amplifikationen von bis zu 20 kb bzw. 40 kb erreicht. Die Genauigkeit der AccuTaq LA ist 6,5 mal größer als die der Taq-DNA-Polymerase allein.
Eine zuverlässige Amplifikation von langen DNA-Sequenzen erfordert: 1) eine effektive Denaturierung des DNA-Templats, 2) entsprechende Verlängerungszeiten zum Erzeugen von großen Produkten und 3) Schutz der Target-DNA vor Schäden durch Depurination. Eine effektive Denaturierung wird durch die Verwendung höherer Temperaturen über kürzere Zeitspannen oder durch die Verwendung von Co-Solvents wie z. B. Dimethylsulfoxid bewerkstelligt. In einigen Fällen sollten die Verlängerungszeiten auf mehr als 20 Minuten erhöht werden, um die längeren Längen der Target-DNA unterzubringen. Der Zustand der Target-DNA ist kritisch. Eine Depurination während der Zyklen wird durch die Verwendung von Puffern mit einem pH von mehr als 9,0 bei 25°C minimiert.
Mitgelieferte Reagenzien:

– AccuTaq LA-DNA-Polymerase, Produkt-Nr. D 5553 5 Einheiten/μl in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 % Tween 20, 0,5 % IGEPAL CA-630, 50 % Glyzerin, bereitgestellt als 125, 500 und 1500-Einheiten.
– 10X Puffer für AccuTaq LA-DNA-Polymerase, Produkt-Nr. B0174, 0,5 ml Fläschchen – 500 mM Tris-HCl, 150 mM Ammoniumsulfat (pH 9,3, eingestellt mit KOH), 25 mM MgCl₂, 1% Tween 20, bereitgestellt als 3 Fläschchen zu je 125 Einheiten, 3 Fläschchen zu je 500 Einheiten und 9 Fläschchen zu je 1500 Einheiten.
– DMSO, Produkt-Nr. D 8418

Bereitgestellt als 1 ml
Benötigte, aber nicht bereitgestellte Materialien und Reagenzien (die Produktnummern von Sigma sind gegebenenfalls angegeben).

– Deoxynucleotide Mix, Produkt-Nr. D 7295 10 mM dATP, 10 mM dCTP 10 mM dGTP, 10 mM TTP
– Wasser, Produkt-Nr. W 1754
– Mineralöl, Produkt-Nr. M 8662 – Primer – Zu amplifizierende DNA – Zugehörige Pipetten – PCR-Pipettenspitzen – Dünnwandige 0,5 ml-PCR-Mikrozentrifugenröhrchen – Thermozykler

Vorsichtsmaßnahmen und Haftungsausschluss.
Der AccuTaq LA-Polymerase-Mix von Sigma ist nur zur Verwendung im Labor, nicht für Arzneimittel, im Haushalt oder andere Verwendungszwecke vorgesehen. Warnungen sind gegebenenfalls am Etikett oder im jeweiligen Abschnitt dieses Berichts enthalten. Überdies sind bei der Verwendung von radioaktiv markierten Nukleinsäuren Standardverfahren zum sicheren Umgang mit radioaktiven Materialien zu befolgen.

4. Die Amplifikationsparameter sollten für einzelne Primer, das Templat und den Thermozykler optimiert werden. Vorgeschlagene Zyklusparameter (auf der Basis der hausinternen Amplifikation von λ-Globin-Gencluster-Fragmenten der humanen Genom-DNA):

Anfängliche Denaturierung	98°C	30 s
Denaturierung	94°C	5–15 s
Annelierung	65°C	20 s*
Verlängerung	68°C	20 min**

Es werden 30 Amplifikationszyklen gefolgt von einer Verlängerung von 10 min am Schluss bei 68°C empfohlen.
Anmerkungen:

* Die Oligonukleotide wiesen eine Länge zwischen 21 Basen (hoher G + C-Gehalt) und 34 Basen (hoher A + T-Gehalt) auf. Die Schmelztemperaturen der für die Amplifikation der Genom-DNA verwendeten Oligonukleotide betrugen 62°C–70°C. Dies wurde unter Verwendung des Algorithmus auf der Basis der Analyse des nächsten Nachbarn von Rychlik und Rhoads (1989) bestimmt.
** Beim Amplifizieren von Templaten mit 20 kb oder mehr wird eine zweite Auto-Verlängerung von 15 Sekunden über die Zyklen 16–30 vorgeschlagen. Einige Thermozykler mögen diese Auto-Verlängerungsfunktion nicht aufweisen; es wird empfohlen, die Verlängerungszeit in Schritten von 1 bis 4 Minuten zu erhöhen.

5. Die amplifizierte DNA kann durch Agarose-Gelelektrophorese und nachfolgende Ethidiumbromidfärbung ausgewertet werden.

Amplifikationsverfahren für Lambda-DANN.
Die optimalen Bedingungen für die Konzentration der Taq-DNA-Polymerase, der Templat-DNA, des Primers und des MgCl₂ ist abhängig vom verwendeten System. Es mag notwendig sein, die optimalen Bedingungen für jede einzelne Komponente zu bestimmen.

1. Die folgenden Reagenzien werden in ein dünnwandiges 500 μl-PCR-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben.

Volumen	Reagens	Endkonzentration
5 μl	10X PCR-Puffer	1X
2,5 μl	dNTP Mix (jeweils 10 mM)	500 μM
3 μl	Templat-DNA (2,5 ng/μl)	0,15 ng/μl
3 μl	Vorwärts-Primer (10 pmol/μl)	600 nM
3 μl	Rückwärts-Primer (10 pmol/μl)	600 nM
33 μl	Wasser	– –
0,5 μl	AccuTaq LA-DNA-Polymerase-Mix	0,05 Einheiten/μl
50 μl Gesamtvolumen

2. Gemisch vorsichtig und kurz zentrifugieren, sodass sich alle Komponenten am Boden des Röhrchens sammeln.
3. 50 μl Mineralöl oben in jedes Röhrchen zusetzen, um ein Verdampfen zu verhindern.
4. Die Amplifikationsparameter sollten für einzelne Primer, das Templat und den Thermozykler optimiert werden. Vorgeschlagene Zyklusparameter (auf der Basis der hausinternen Amplifikation einer Lambda-DNA):

5. Die amplifizierte DNA kann durch Agarose-Gelelektrophosese und nachfolgende Ethidiumbromidfärbung ausgewertet werden.

Literaturnachweis

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Innis, M., et al. (Eds.) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, California (1990). (Product No. P 8177)
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Saiki, R., PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton, New York (1989)
Sambrook, J, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989). (Product No. M 3401)
+ Das PCR-Verfahren wird von Patenten im Besitz von Hoffman-LaRoche Inc. umfasst.

Sequenzprotokoll:
Sequenzprotokoll:

Claims

Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins einer Targetnukleinsäure in einer einzelsträngige DNA umfassenden Probe, welches Verfahren umfaßt (a) das Inkontaktbringen der Probe mit einem Vorwärts- und/oder Rückwärts-Primer, wobei wenigstens ein Primer eine Markierung oder einen Teil eines Markierungssystems im 3'-terminalen Abschnitt des Primers aufweist, und worin der Primer derart ausgewählt ist, daß wenigstens eines, vorzugsweise wenigstens die letzten zwei bis fünf oder mehr Nukleotide am 3'-Ende des Primers zur zu detektierenden Nukleinsäuresequenz nicht komplementär sind, um ein Gemisch von Duplexen während der Hybridisierungsbedingungen mit dem Vorwärts- und/oder Rückwärts-Primer auszubilden, aneliert an komplementäre DNA-Sequenzen jeder Targetnukleinsäure im Fall ihres Vorliegens; (b) Halten des Gemisches aus Schritt (a) mit einer Template-abhängigen Nukleinsäure-Polymerase mit einer 3' nach 5'-Korrekturleseaktivität oder einem Gemisch von Enzymen mit einer derartigen Korrekturleseaktivität unter Bedingungen, die ausreichend sind, die 3' nach 5'-Nuklease-Aktivität der Polymerase oder des Gemisches von Enzymen zu ermöglichen, um den unpassenden 3'-Abschnitt des anelierten Primers abzuspalten, wodurch eine Markierung oder ein Teil eines Markierungssystems freigesetzt wird; (c) das Detektieren und/oder Messen der Freisetzung der Markierung oder des Teils eines Markierungssystems.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Targetnukleinsäure amplifiziert wird und dadurch mehr von der Markierung oder dem Teil eines Markierungssystems freigesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Freisetzung der Markierung direkt proportional zur Menge an amplifizierter DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, worin die Amplifikation durch PCR, wahlweise durch RT-PCR im Fall, daß die Targetnukleinsäure RNA ist, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Markierung ein Reporter-Quencher-Molekülpaar ist, welches an die 3' und 5' terminalen Regionen des Vorwärts- und/oder Rückwärts-Primers gebunden ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Reporter-Molekül am unpassenden 3'-Teil des Primers vorliegt und das Quencher-Molekül am passenden Teil des Primers in geeignetem Abstand zum Reporter-Molekül vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das Quencher-Molekül am unpassenden 3'-Teil des Primers vorliegt und das Reporter-Molekül am passenden Teil des Primers in geeigneter Entfernung zum Reportermolekül, vorzugsweise am 5'-Ende, vorliegt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Nukleinsäurepolymerase oder das Enzymgemisch thermostabil ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin eine Mehrzahl von Nukleinsäuretargets durch Auswahl der entsprechenden Primer gleichzeitig detektiert wird, wobei we nigstens ein Primer für jedes Target eine Markierung oder einen Teil eines Markierungssystems im 3'-Terminalabschnitt des Primers umfaßt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Probe ein tierisches oder humanes Körperfluid, vorzugsweise Plasma ist.
Kit zur Detektion einer Targetnukleinsäure in einer Probe, umfassend markierte Primer, wie sie in den Verfahren der Ansprüche 1 bis 10 verwendet werden, und eine geeignete Nukleinsäurepolymerase mit einer 3' nach 5'-Korrekturleseaktivität oder ein Gemisch von Enzymen mit einer derartigen Korrekturleseaktivität.
Kit nach Anspruch 10, worin die Primer virale Targetnukleinsäuren detektieren.