CN1414110A - 利用具有3'至5'外切酶活性的多聚酶进行基因序列分析 - Google Patents

Abstract

本发明利用具有3至5外切酶活性的多聚酶进行碱基序列快速分析。该方法利用具有3至5外切酶活性的多聚酶在引物延伸时的高度特异性而直接利用已被延伸的引物3’末端和近3’末端的已知序列信息，通过碱基严格配对的原则而准确获取引物延伸反应中相应模板的未知序列，达到基因序列的快速测定。

Description

利用具有3’至5’外切酶活性的多聚酶进行基因序列分析

技术领域

本发明涉及一种用于基因测序的方法，具体即指利用具有3至5外切酶活性的多聚酶进行基因碱基序列的快速测序。

技术背景

目前可靠的基因测序方法，采用没有3’至5’外切酶活性的多聚酶进行引物延伸反应，基因测序分析过程复杂，且每检测到一个信号最多只能提供一个碱基的信息。更为突出的问题是现有方法难以对单碱基多态性进行高通量分析。虽然现有的方法能够实现全基因测序，但更经济和快速的测序技术，已成为各国竞争的一个热点。如Affimetrix的寡核甘酸杂交芯片，已具有一定的研究价值。

末端中止法是当代基因测序的主要方法，该方法虽然十分可靠，但因其每一信号最多只能提供有关一个碱基的信息，测序速度受到限制。更为重要的是，这一方法要求一段已知的基因序列作为测序的基础。这种对已知序列的依赖性，极大地减慢了这一方法在未知序列测定时的速度。此外，这一方法放大效率有限，常常需要对待测基因先进行放大。这一方法既费时，实际上还是一种间接的测序方法。

对寡核甘酸杂交测序芯片而言，由于杂交技术固有的热力学不均一性，其准确性不高，目前仍处在实验室研究和改进阶段，实用性尚有待观察。

另外，目前所有与测序有关的酶法包括经典的末端终止法和最近发展的单碱基延伸法，其标记途径均通过双脱氧三磷酸核甘酸。由于双脱氧三磷酸核甘酸不能脱水而具有终止延伸的作用，其反应为单向引物延伸过程。由于双脱氧三磷酸核甘酸在单向引物延伸反应中的应用，而使引物延伸的放大效率仅与反应循环次数成正比。在没有双脱氧三磷酸核甘酸的双向引物延伸反应中，效率是与反应循环次数的二次方成正比的。

目前基因序列分析中最大的问题是缺乏用于全基因范围的单碱基多态性检测的技术。

发明内容：一、准确性的基础

本发明采用具有3’至5’外切酶活性的多聚酶进行引物延伸反应，利用引物与模板的配对或不完全配对的差别以进行核酸序列分析。本方法利用该酶在引物延伸时的校对作用所具有的高度特异性而直接获取已知引物3’末端或近3’末端的碱基序列信息，从而达到对引物延伸反应中模板的未知碱基序列的快速测定。

就第一个碱基加上之后的延伸过程而言，没有3’至5’外切酶活性的多聚酶所进行的引物延伸反应产物中，突变发生的机率约为2/1000，而利用具有3’至5’外切酶活性的多聚酶进行引物延伸反应，则能使突变发生的机率减少80-90％，从而大大提高正确产物的数量和减少错误产物的数量。这一巨大差别，已为世人所知。伸的第一步，决定该反应是否改变引物的序列。没有3’至5’外切酶活性的多聚酶所进行的引物延伸反应以100％不改变引物的序列的方式进行，无论引物与模板是否完全配对。这样就可能造成引物与模板相互配对的失真，即无法从引物序列来准确无误地反映出模板的序列。与此相反，具有3’至5’外切酶活性的多聚酶所进行的引物延伸反应则视配对情况而定，若配对则100％不改变引物的序列；若不配对则改变引物的序列，使之与模板完全配对。由此可见，若能合理利用具有3’至5’外切酶活性的多聚酶在引物延伸反应时对配对情况的区别能力，则可从引物序列准确无误地阅读出模板的序列。(见图1)

应用含有多个不同反应的单一反应体系的关键之一，是这些不同的反应必须能在相似或相同的反应条件下进行。我们通过对具有3’至5’外切酶活性的多聚酶进行引物延伸反应的研究，找到了从46℃至66℃的广泛范围内，使该酶能够很容易地分辨完全配对与不完全配对的引物序列的反应条件。由于具有校正功能的DNA多聚酶的校正能力与反应体系中的三磷酸核甘酸浓度呈现出反相关关系，在1X至2X浓度的三磷酸核甘酸中，完全配对与不完全配对的引物序列的分辨依赖于产物多与少的比较；当三磷酸核甘酸的浓度降为0.8X至0.2X时，这种分辨则越来越容易，表现为信号的有或无的变化。

合理利用具有3’至5’外切酶活性的多聚酶在引物延伸反应中对配对情况的区别能力的另一关键，是如何将具有3’至5’外切酶活性的多聚酶对引物序列的准确无误辨认转化为可为高通量分析方法所能检测到的信号。本发明通过对引物的修饰，包括(1)标记引物的3’末端核甘酸，达到完全配对的引物的产物保留该标记核甘酸，而不完全配对的引物的产物则该标记核甘酸被3’至5’外切酶的校正功能所切除而不带标记信号；(2)利用修饰的3’末端核甘酸以造成对3’至5’外切酶的不敏感性，达到完全配对的引物具有延伸产物而3’或近3’末端不完全配对的引物没有延伸产物的效果。二、信号标记与读取

本发明的信号来源视其标记方法不同而不同。可采用的标记方法主要有三种，即引物集合中引物的3’末端碱基，标记的三磷酸核甘酸底物，和标记配对引物。

当采用引物3’末端标记时，与模板完全配对的引物将产生含有标记信号的产物。这种标记可以是放射性的标记也可以是非放射性的标记如荧光标记。而与模板不完全配对的引物将视引物的修饰情况而具有两种可能，即由于碱基不配对不产生产物，或由于3’至5’外切酶活性的多聚酶的校正功能而产生不含标记的产物。(见图1和图2)

当采用标记的三磷酸核甘酸作为标记来源时，标记的三磷酸核甘酸底物与未标记的三磷酸核甘酸底物的比例视标记物的种类的不同而不同，变化在1∶10至1∶100之间。

当对非碱基特异性的配对引物进行标记时，标记可在其5’末端，也可在非3’末端的其他任何碱基。

在显像与获取信号之前，需对DNA分子上的标记信号与非DNA分子上的标记信号进行分离。具体分离方法视具体应用方法而决定。当本发明用于电泳时，分离过程可省略；当本发明用于生物芯片时，严格条件的洗涤将去除非延伸的DNA分子上的标记信号。若标记信号来源于标记的引物且背景噪音太大时，则可在25℃至37℃时使用低浓度的核酸外切酶孵化15分钟至1小时。DNA分子上的标记信号，可采用相应的常规方法进行显像与检测，具体方法由标记方法决定。对采用酶标记或其他化学反应物标记如地高辛原和生物素，在检测信号之前则需进行专一的化学显像反应。

在进行到显像与检测阶段时，若标记方式为放射性或直接荧光法，则不需显像的过程，即可直接扫描测定放射性强度或荧光强度或采用自显影方式而随后进行图像的扫描分析。如标记方式为化学发光法或间接荧光，则需要进行显影预阻断，显像反应，显像后的洗涤过程，然后再进行标记信号的检测。三、序列分析

所检测到的标记信号直接代表相应部位的引物的3’末端的特异性碱基序列。序列分析可采用人工分析，或计算机辅助。当待测基因序列的数量不超过100碱基对时人工分析既快速又方便，对于较长序列的情形则需利用计算机辅助分析。

本发明提供了一种未知基因序列测定新方法，该方法的特点是直接、敏感、简单、快速。使用本发明测定基因序列既不要求一段已知的序列作为测序的基础，也不要求对待测模板预先进行放大。因而本发明创造的直接碱基测序技术，使要求高可靠性和高敏感性的生物样本的快速基因序列测定成为可能。本发明的有益效果是：本方法使用具有校正功能的多聚酶进行引物延伸反应，其准确性要高于常规测序使用无校正功能的多聚酶进行的引物延伸反应。当用于基因序列分析时，由于本方法测序时不依赖一段已知序列，故本方法可用于未知序列的直接测序；这是本方法与现有测序方法相比的第一大优点；另外，在序列分析时，本方法所得每一信号都含有多于一个碱基序列的信息，通常每一信号代表四至八个碱基的信息。每一信号都含有多于一个碱基序列的信息能产生两种功效：第一，使测序速度加快；第二，序列间的相互重叠能提高测序的准确性。

目前基因分析中尚急需开发可用于多个单碱基多态性位点测定的技术，本发明对基因序列的快速准确测定，尤其是该方法在大范围的退火温度下能有效工作，使其在全基因层次的单碱基多态性分析上，具有所有其他现有基因分析方法无可比拟的功效。目前的芯片制造技术，可以在一张玻片上载有40万个不同的DNA寡核甘酸，采用本方法与微芯片结合，则一张微芯片可达到测定近20万个不同的单碱基多态性位点的高效率。因此，本方法为单碱基多态性分析和基因序列分析提供了高通量分析手段。

具体实施方式：实用例1：利用具有3’至5’外切酶活性的多聚酶Deep Vent和不具有3’至5’外切酶活性的多聚酶Deep Vent-分辨与模板序列完全配对和不完全配对的引物。本实验用以说明多聚酶的校对作用在序列分析中的意义。

试验用放大元的有义引物为碱基特异性引物，且含有一限制性内切酶EcoR I的位点的野生序列或3’单碱基不配对碱基。反义引物与有义引物的产物长度为220碱基对。完全配对的有义引物序列为：

AGT CCT CTC CTA TCC CAA GAT ATC TGA GAA TTC引物延伸反应为：第一次解链95度5分钟，然后解链95度10秒，退火30秒，72度延伸1秒，循环30次。反应的退火温度为49度至69度。

结果：与模板完全配对的引物有大小正确的产物，能被EcoR I消化。而与模板不完全配对的引物，使用具有3至5外切酶活性的多聚酶进行引物延伸反应时，其产物能被EcoR I消化；相反，使用不具有3至5外切酶活性的多聚酶进行引物延伸反应时，其产物则不能被EcoR I消化。见图3和图4。实用例2：利用具有3’至5’外切酶活性的多聚酶Deep Vent及与模板序列完全配对和不完全配对的放射标记引物进行单碱基多态性测定(见图5)。实用例3：利用具有3’至5’外切酶活性的多聚酶Deep Vent及与模板序列完全配对和不完全配对的3’末端硫取代核甘酸引物进行单碱基多态性测定(见图6)实用例4：利用具有3’至5’外切酶活性的多聚酶Deep Vent及与模板序列完全配对和不完全配对的3’末端硫取代核甘酸引物进行基因序列测定(见图7)

附图说明图1。利用具有3’至5’外切酶活性的DNA多聚酶辨认碱基序列的模型。当引物的3’末端不完全配对时，DNA多聚酶通过其校对功能，得到与模板序列完全配对的产物。然而，当引物的3’末端不完全配对且已修饰为对3’至5’外切酶耐受时，则只有与模极完全配对的引物能得到产物而与模板不完全配对的引物则不能得到产物。图2。利用具有3’至5’外切酶活性的DNA多聚酶辨认碱基序列的能力进行序列分析的数学模型。引物集合由4的6-8次方个5’末端为四碱基1∶1∶1∶1摇摆序列而3’为序列特异性的引物组成。序列分析时通过相邻序列的四或四个以上碱基的重叠为基础，进行序列的集成。具体方法如下：当下列五个引物有产物时：(1).xxxxxxxxaaacca，(2).xxxxxxxxaaccag，(3).xxxxxxxxaccagt，(4).xxxxxxxxcagtta，(5).xxxxxxxxgttaac.其表明模板中必有如下的序列：AAACCAGTTAAC。图3。EcoR I消化表明无3’至5’外切酶能力的多聚酶所产生的引物延伸产物不能对引物序列进行改变，而具有3’至5’外切酶能力的多聚酶所产生的引物延伸产物能够对引物序列进行改变以使其与模板序列互补。图4。对完全配对与不完全配对的引物所得到的产物的序列分析表明具有3’至5’外切酶能力的多聚酶所产生的引物延伸产物能更准确地映对出模板的序列，而无3’至5’外切酶能力的多聚酶所产生的引物延伸产物则可因引物上碱基的变化而导致序列突变。图5。放射标记3’末端的引物延伸反应，不完全配对的引物的延伸产物(泳道1)较完全配对的引物的延伸产物延伸产物(泳道2)稍少。放射定量测定表明产物不完全配对的引物的延伸产物已丢失放射标记信号，为91cpm，与空白对照无差异；而完全配对的引物的延伸产物则保留放射标记，为1019cpm，高出空白对照十倍以上。图6。利用3’含硫修饰的引物对SNP的检测。在大于十度以上的退火温度范围内，具有3′至5’外切酶能力的多聚酶以100％的准确率只延伸完全配对的引物，而无3’至5’外切酶能力的多聚酶则表现出对引物3’末端序列分辨能力极差。图7。利用3’含硫修饰的引物与具有3’至5’外切酶能力的多聚酶结合对模板链进行“多个碱基/一信号”方式的序列分析。有义引物为5’-AGT CCT CTC CTATCC CAAGAT ATC TGA GAA TTC-3’，此引物的最后一个碱基的磷脂键含有硫代氧结构，反义引物为AGT CCT CTC CTA TCC CAA GAT ATC TGA GAA TTC  相应的从-1至-6碱基位置用小写字母标明的不完全配对模板的序列分别为：

         AGT CCT CTC CTA TCC CAA GAT ATC TGA GAA TTC

         AGT CCT CTC CTA TCC CAA GAT ATC TGA GAA TTa

         AGT CCT CTC CTA TCC CAA GAT ATC TGA GAA TaC

         AGT CCT CTC CTA TCC CAA GAT ATC TGA GAA aTC

         AGT CCT CTC CTA TCC CAA GAT ATC TGA GAt TTC

         AGT CCT CTC CTA TCC CAA GAT ATC TGA GtA TTC

         AGT CCT CTC CTA TCC CAA GAT ATC TGA tAA TTC使用具有校对功能的多聚酶时，引物与模板完全配对时有产物，不完全配对时则没有产物。而使用不具有校对功能的多聚酶时，则不完全配对的引物也能得到产物。图中P代表完全配对，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12则代表上述六种不同的不完全配对的引物。

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Claims (9)

1、一种利用具有3至5外切酶活性的多聚酶进行引物延伸反应对未知序列进行测定的方法其特征在于该方法包括以下步骤：

a.制备含有多种不同序列的特定寡核甘酸引物集合；

b.用具有3至5外切酶活性的多聚酶进行引物延伸反应；

c.引物延伸反应产物的显像与序列分析；

2、权利要求1中的寡核甘酸引物集合其特征是由3’末端序列各异的引物亚集合组成；

3、权利要求1中的每一寡核甘酸引物亚集合其特征是3’末端具有相同的序列而其末端则含有4的n次方种长度为n的不同的序列；

4、权利要求1中的寡核甘酸引物集合其特征是由未被修饰的寡核甘酸和被修饰的寡核甘酸组成；

5、权利要求4中的修饰其特征是指对寡核甘酸进行化学修饰以改变其对核酸酶的反应特性；

6、权利要求4中的修饰其特征是指对寡核甘酸进行化学修饰以使其具有标记信号；

7、权利要求1中的引物延伸反应产物其特征是标记的产物；

8、权利要求1中引物延伸反应产物的标记信号其特征是来自于标记的引物；

9、权利要求1中引物延伸反应产物的标记信号其特征是来自于标记的三磷酸核甘酸底物。

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