CN1670222A - 单核苷酸多态性（SNPs）及点突变的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种以利用聚合酶之链延伸为基础而将核酸内之单核苷酸多态性(SNP)与点突变作基因分型的方法。本发明是根据下列事实：紧邻在任何一个SNP/点突变位置之5′端的核苷是已知的，且紧接于该位置之3′端的相邻序列也是已知的。一个互补于紧邻在靶多核苷酸内SNP3′侧之序列的引物被用于链延伸。聚合酶反应混合物包含有一个链终止核苷酸，该链终止核苷酸所具的碱基互补于紧邻该靶多核苷酸之SNP5′侧的核苷酸。可加入一个额外的dNTP以产生一个最多有两个碱基延伸的引物。对引物的链延伸长度或者从终止核苷酸标记了的形式渗入的标记量，以所形成的延长/终止反应产物来分析。

Description

单核苷酸多态性(SNPs)及点突变的检测方法

技术领域

此项检测及鉴定基因组单核苷酸多态性方法的发明，涉及使用含有单核苷酸多态性或点突变核酸分子互补的寡核苷酸引物，测试不同程度的碱基延伸，例如零、单一或二重延伸。对该寡核苷酸引物的预测延伸长度与实验的延伸长度或渗入延伸核苷酸的同位素标记量作比较，以识别SNP或点突变。

背景技术

人类基因组已经排序，而在遗传学方面将致力于比较不同个体的序列以了解人类的疾病。大约每壹千个碱基中有一个多态现象，其中绝大多数都属于SNP或点突变的基因变异形式。尽管大部分变异都发生于基因间的非编码区内，但仍有许多出现在有用碎片(exon)及无用碎片(intron)上，成为编写图谱和诊断与疾病有关的对偶基因的有效工具。

单核苷酸多态性或点突变此类异常型的基因序列可用于法医学上的个体识别及测定由遗传而得的基因缺陷，如缺失、插入和突变。可用基因组DNA位标与染色体上SNP和点突变位置的广泛分布，促使SNP成为备受关注的研究目标。此外，通过SNP分布图与特异表现型联系分析，能有效率地测定基因表达。

为解决大量的基因测序，一套精确而经济的方法是必需的，能用有限的试剂及单一的化验辨别不同的SNPs或点突变。测试基因多态性的方法有许多，例如美国专利编号6,110,709，方法是先将核苷酸扩增继而进行限制性分析，再把扩增了的产物固定于附着结合物的支撑物上。专利发表编号WO9302212应用双脱氧核酸引起不同长度的扩增产物，用凝胶电泳显形及分离作基因测序。另外，专利发表编号WO0020853进一步描述了测试单一碱基变化的方法，利用凝胶电泳属性审视因序列变化而产生的构象变化。

提供一套能从大量样品中高效筛选单核苷酸多态性的新颖方法为此项发明的目标。

发明内容

此项发明讲述鉴别靶核苷酸(即单核苷酸多态性或点突变)的方法，应用与单核苷酸多态性(“SNP”)或点突变互补的寡核苷酸引物进行单一或二重碱基延伸。延伸产物长度取决于双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)和脱氧核糖核苷酸(dNTP)的存或缺，把预报延伸产物长度或标记渗入量跟实验结果作比较，可鉴定单核苷酸多态性及基因点突变。

此项发明具体描述了寡核苷酸引物与核酸分子的杂交，核酸分子上邻近已知SNP或点突变3’端的核苷酸跟寡核苷酸引物3’末端的互补核苷酸杂交成一核酸杂种结构。以载有SNP或点突变的核酸作为模板，经过聚合过程，该寡核苷酸引物将进行跟模板互补的零、单一或二重碱基延伸。例如把双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)加进聚合混合物，当聚合到核酸分子上与ddNTP互补的核苷酸时，寡核苷酸引物延伸便会终止。此项发明是透过聚合过程中，采用跟SNP或点突变位5’端旁核苷酸相同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，作为延伸终止剂，进行零、单一或二重碱基延伸。方法是分别于三个反应容器内放置相同的ddNTP但三种不同的dNTP，而且所用ddNTP核苷跟同一反应容器内dNTP核苷是不一样的，当进行聚合过程时，反应混合物内寡核苷酸引物会于3’氢氧基末端作延伸。利用反应容器内延伸寡核苷酸产物的长度(或标记ddNTP渗入量)作比较，便可测定单倍体核酸模板上及于双倍体核酸模板上跟SNP或点突变纯合和杂合的相对位置。同样地，利用预报标记标记ddNTP渗入引物量跟实验结果作比较，亦能达到目的。

此项发明的固态模式应用，可用于大规模基因筛选，如基因芯片。把跟SNP或点突变位3’端旁基因序列互补的各类寡核苷酸引物，如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及肽核酸(PNA)，固定于固体基质上，如玻璃片、金属片、塑料膜、尼龙膜、珠子或其它适合的基体。采用靶聚合酶链式反应(PCR)产物，跟固定寡核苷酸引物杂交，并充当延伸模板。如上所述，加入恰当的dNTP或ddNTP，可把固定寡核苷酸引物作零、单一或二重延伸，就如一个使用标记ddNTP的有效延伸便能产生标记寡核苷酸引物，而没标记的寡核苷酸引物即表示没有碱基延伸。运用适当的实验条件，标记ddNTP渗入量跟核酸模板上SNP或点突变的数量是成正比的，此关系有助推算核酸模板上的特定SNP或对偶基因的点突变。在此基础上，利用标记渗入量图表就能够测定单倍体、纯合双倍体或杂合双倍体核酸模板上已知SNP或点突变的存在或缺失。

单核苷酸多态性(“SNP”)预报表是由表直列标题、横栏标题及寡核苷酸引物的预报长度(或标记渗入量)构成。表直列标题表示碱基延伸反应的条件，而横栏标题则表示具有潜在置换SNP的核酸序列，还有交汇于表直横栏间的引物长度数据。按预报寡核苷酸长度或标记渗入量与实际数据作对照，便能清楚显示单倍体或双倍体核酸分子上的独有SNP。

附图说明

图1显示此项发明的概要图解。核酸分子3’部分及5’杂交部分，互补寡核苷酸引物的3’及5’部分，靶核苷酸，或与寡核苷酸引物3’氢氧基末端紧接的SNP。

图2显示采用了如图1寡核苷酸引物延伸链长度分析鉴定单倍体靶核上的SNP，表直列标题表示碱基延伸反应的条件，而横栏标题则表示可能含有SNP的核酸序列，还有交汇于表直横栏间格内的引物长度数据。

图3显示采用了如图1寡核苷酸引物延伸链长度分析鉴定双倍体靶核上的SNP，表直列标题表示碱基延伸反应的条件，而横栏标题则表示可能含有SNP的核酸序列，还有交汇于表直横栏间格内的引物长度数据。

图4显示于寡核苷酸引物延伸过程中(如图1)采用了同位素、荧光或酶标记延伸终止核苷酸渗入的方法，没使用引物延伸实际长度分析，鉴定单倍体靶核上的SNP。图表中的0代表没标记渗入，而2x代表因引物延伸的标记渗入，此外，表直列标题表示碱基延伸反应的条件，而横栏标题则表示可能含有SNP的核酸序列，还有交汇于表直横栏间格内的引物中标记渗入量数据。

图5显示于寡核苷酸引物延伸过程中(如图1)采用了同位素、荧光或酶标记延伸终止核渗入的方法，没使用引物延伸实际长度分析，鉴定双倍体靶核上的SNP。图表中的0代表没标记渗入，1x代表从半组DNA范本(即单一SNP对偶基因)复印出的延伸引物的半量标记渗入，而2x则代表从全组DNA范本(即整对SNP对偶基因)复印出的延伸引物的全量标记渗入，此外，表直列标题表示碱基延伸反应的条件，而横栏标题则表示可能含有SNP的核酸序列，还有交汇于表直横栏间格内的引物中标记渗入量数据。

图6和图7显示了此项发明的概要图解。采用寡核苷酸扩增引物1及2以聚合酶链式反应把靶核苷酸分子上的3’部分及5’部分(或于引物1与2之间的SNP)作扩增。此核酸分子扩增物会再跟第三链互补寡核苷酸引物、靶核苷酸或与寡核苷酸引物3’氢氧基末端部分接近的SNP进行杂交。

图8显示于寡核苷酸引物延伸过程中(如图7)采用第三链寡核苷酸引物延伸长度分析鉴定单倍体靶核苷酸上的SNP，表直列标题表示第三链寡核苷酸引物延伸反应的条件，而横栏标题则表示可能含有SNP的核酸序列，还有交汇于表直横栏间格内的引物长度数据。

图9显示于寡核苷酸引物延伸过程中(如图7)采用第三链寡核苷酸引物延伸长度分析鉴定单倍体靶核苷酸上的SNP，表直列标题表示第三链寡核苷酸引物延伸反应的条件，而横栏标题则表示可能含有SNP的核酸序列，还有交汇于表直横栏间格内的引物长度数据。

图10显示于第三链寡核苷酸引物延伸过程中(如图7)采用了同位素、荧光或酶标记延伸终止核渗入的方法，没使用引物延伸实际长度分析，鉴定单倍体靶核苷酸上的SNP。图表中的0代表没标记渗入，而2x代表因引物延伸的标记渗入，此外，表直列标题表示第三链寡核苷酸引物延伸反应的条件，而横栏标题则表示可能含有SNP的核酸序列，还有交汇于表直横栏间格内的引物中标记渗入量数据。

图11显示于第三链寡核苷酸引物延伸过程中(如图7)采用了同位素、荧光或酶标记延伸终止核渗入的方法，没使用引物延伸实际长度分析，鉴定双倍体靶核苷酸上的SNP。图表直列标题表示第三链寡核苷酸引物延伸反应的条件，而横栏标题则表示具有潜在纯合或杂合SNP的核酸序列，还有交汇于表直横栏间格内的引物中标记渗入量数据。此外，图表中的0代表没标记渗入，1x代表从半组DNA模板(即单一SNP对偶基因)复印出的延伸引物的半量标记渗入，而2x则代表从全组DNA模板(即整对SNP对偶基因)复印出的延伸引物的全量标记渗入。

图12显示采用了同位素、荧光或酶标记延伸终止核酸渗入的双培育方法，培养于两组反应条件进行，没使用引物延伸实际长度分析，以鉴定单倍体或双倍体靶核苷酸上的SNP。图表直列标题表示寡核苷酸引物延伸反应的条件，而横栏标题则表示可能含有纯合或杂合SNP的核酸序列，还有交汇于表直横栏间格内的引物中标记渗入量数据。此外，图表中的0代表没标记渗入，1x代表从半组DNA模板(即单一SNP对偶基因)复印出的延伸引物的半量标记渗入，而2x则代表从全组DNA模板(即整对SNP对偶基因)复印出的延伸引物的全量标记渗入。

具体实施方式

术语

此项公开发明的任何替补和修改将不会偏离其所述领域及精神。

术语″一个″(″a″或″an″)用于具体说明时可解作一个或更多，连同″包含″(″comprising″)用于声明上，词组″a″或″an″则解作一个或多于一个，而″another″可解作至少一个第二或更多。

术语″独特的链延伸核苷酸″(″distinct chain-extending nucleotide″)意指于单一反应容器内加入链延伸核(如A、T、G、C、嘌呤碱或嘧啶衍生物)。虽然不同的反应容器内含有独特的链延伸核(如管1-dATP、管2-dTTP、管3-dGTP)，但是绝不能有多过一个链延伸核苷酸于同一反应容器内(如dATP和dTTP于同管内)。

术语.″杂交″(″hybridizing″)意指两条互补核酸分子链的缔合，形成双链核酸分子，可包含两条DNA链、两条RNA链或各一条DNA链和RNA链。互补链的缔合在分子生物学已知的条件下进行(如温度、酸碱值、盐分浓度等)。

术语″3’氢氧基部分″(″3’hydroxyl moiety″)意指附着到核酸分子糖端3’碳的氢氧基组，而3’氢氧基组跟另一个核苷酸上的磷酸盐形成estor化学键，在过程中一个水分子会被去除。

术语″靶核苷酸″(″target nucleotide″)意指特定核酸分子序列或选址上会被鉴定的核苷酸。靶核苷酸亦可解作核酸分子上第一个前选单核苷酸位置，通常靶核苷酸就是SNP或点突变。

术语″邻接核苷酸″(″adjacent nucleotide″)意指核酸分子上要识别的邻接靶核苷酸或第一个前选单核苷酸位置的核苷酸。此核苷酸亦可解作核酸分子上第二个前选单核苷酸位置。

术语″等分″(″aliquoting″)意指把容积均匀地等分为各部分。

术语″培养″(″incubating″)意指在满意的环境中进行混合物反应。满意的环境包括温度、酶、盐分浓度或酸碱值等等。

术语″聚合酶反应混合物″(″polymerase reaction mixture″)意指为促进聚合酶进行寡核苷酸引物延伸的有利成分。

术语″核苷酸″(″nucleotide″)意指任何由核苷跟糖基上的磷酸盐酯化后所构成的化合物。

术语″核苷″(″nucleoside″)意指任何糖基胺(glycosylamine)，是一核酸成分且包含连结糖的氮基。

术语″核苷酸碱基″(″nucleotide base″)意指在核酸中构成一个核苷或核苷酸的任何氮基，且与核碱基(nucleoside base)同义。

此项发明讲述鉴别靶核苷酸或单核苷酸多态性或点突变的方法，应用与单核苷酸多态或点突变互补的寡核苷酸引物进行单一或二重碱基延伸。预报延伸产物长度取决于特定的双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)和脱氧核糖核苷酸(dNTP)，把预报延伸产物长度跟实验结果作比较，可鉴定单核苷酸多态性及基因点突变。同样地，利用预报标记渗入量跟实验结果作比较，亦能达到目的。

此项发明体现了寡核苷酸引物与核酸分子的杂交，核酸分子上邻近已知SNP或点突变3’端的核苷酸跟寡核苷酸引物3’末端的互补核苷酸杂交成一核酸杂种结构。以载有SNP或点突变的核酸作为模板，经过聚合过程，该寡核苷酸引物将进行跟模板互补的零、单一或二重碱基延伸。例如把双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)加进聚合混合物，当聚合到核酸分子上与ddNTP互补的核苷酸时，寡核苷酸引物延伸便会终止。此项发明是聚合过程中，采用跟SNP或点突变位5’端旁核苷酸相同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，作为延伸终止剂，进行零、单一或二重碱基延伸。方法是分别于三个反应容器内放置相同的ddNTP但三种不同的dNTP，而且所用ddNTP的核苷碱基与同一反应容器内dNTP的核苷碱基是不一样的，当进行聚合过程时，反应混合物内寡核苷酸引物会于3’氢氧基末端作延伸。利用反应容器中延伸寡核苷酸产物的长度作比较，便可测定单倍体及双倍体核酸模板上的SNP或点突变。同样地，利用预报标记标记了的ddNTP渗入引物量跟实验结果作比较，亦能达到目的。

一个具体的例子是：一步延长/终止反应，接着作链长分析，就提供了感兴趣的SNP的完整数据，在此实例中，提供一个具有一个序列的引物，此序列互补于该靶多核苷酸的片段，而此片段紧邻于该靶核苷酸之3′侧。该靶核苷酸意指要被筛选的SNP或点突变已知将会坐落在其序列位置上。在这反应混合物内亦提供一个互补于邻接于该SNP/点突变5′端的核苷酸的单一ddNTP。该ddNTP可以是经标记或未标记的形式，这取决于在随后的步骤中所用的产物分析方法。在该反应混合物中亦可有一个dNTP，其碱基与ddNTP的不同。在一个靶DNA中，当在可能的SNP/点突变位置以及其邻接的5′侧位置共有同一碱基本体的情况下，反应的进行会没有加入dNTP。

在延伸/终止反应后，透过链延伸或标记了的ddNTP渗入量测定，可以确定在靶DNA上的潜在SNP或点突变处的碱基本体。当采用不同的反应混合物而各自含有不同的dNTP时，便能得到全面的数据结果。在双脱氧核苷酸终止聚合反应进行后，没有产生引物延伸或标记渗入，这表明该靶SNP核苷酸跟任何反应混合物内的ddNTP或dNTP，并没有互补关系。同时单一碱基延伸表示SNP核苷酸跟该ddNTP互补，二重碱基延伸则显示靶SNP核苷酸跟反应混合物内的dNTP互补。假设反应混合物内只有ddCTP和dATP，而SNP点5’邻近的核苷酸是G，经过延伸/终止反应后，将得到二重碱基延伸，延伸出的相对SNP及其5’邻近核苷酸应分别是T和G。另外，三组反应跟对照(缺乏dNTP)同时进行，所有反应混合物内均含有ddCTP但分别不同的dNTP。例如第一组A-mix含有dATP，第二组T-mix是dTTP，而第三组G-mix含有dGTP，发生于任何反应混合物内的ddCTP渗入均显示跟dNTP或ddNTP互补的碱基占有了靶DNA上的潜在SNP或点突变位。假设延伸发生于缺乏dNTP的对照组，这代表延伸碱基跟ddCTP互补，所以该靶核苷酸应该是G，在这种情况下，引物只作单一而非二重碱基延伸。

反应混合物内含二或三类dNTPs和特定的ddNTP，能够初步鉴定靶SNP或点突变位上的碱基是否跟ddNTP或其中一类dNTP互补。这种实验设计对一些特别的应用会有用。

在另一些实例中，一些或全部反应可在固态下进行。在固态模式下进行的典型程序主要包括如下步骤：模板扩增、退火/纯化、引物固定、引物延伸、再退火/纯化及检测，但是在某些情况下每一步骤可变更和简化。

以上原理将详述如下：

例1：靶多核苷酸分子可以是单倍体或纯合双倍体或杂合双倍体人类基因组DNA序列的部分，如图1所示。图1的示意绘图显示本发明的一个方面；有3’部分和5’部分的一个核酸分子与有3’部分和5’部分的一个互补的寡核苷酸引物杂交；靶核苷酸，或是与寡核苷酸引物3’氢氧基紧接的SNP。图1的靶多核苷酸显示一个具有核苷酸碱基A的SNP(注：为易于描述，把靶多核苷酸上的SNP位称作靶核苷酸)。虽然图1的靶核苷酸是A，但在人群中在此同一地址上其它核苷酸碱基C、G及T亦会出现，只是发生率依人群而异。此外，就该靶核苷酸例子而言，在靶核苷酸两侧的核苷酸碱基是已知的，且频率不像靶核苷酸或SNP那样改变。  因而，就例子的目的而言，起始物质是双链基因组DNA分子，它具有称作靶核苷酸(即A)的SNP，和靶核苷酸碱基A，在任何给定的基因组DNA分子中成为G，T，或C的频率可以不同，但靶两侧的核苷酸在频率上并不按比例变更。目标是应用本发明去识别在例子中未知的靶核苷酸。下面各段描述如何应用本发明在未知的DNA例子中在特定位置上去识别靶核苷酸。

过程的第一步是纯化人类基因组DNA及将其从其它诸如细胞残骸等污染物质分离；这些纯化方法已为人们所熟知，此处不作进一步讨论。当纯化DNA后，按本发明，在图1中显示的引物则用作检测。该引物含有一个序列，它与紧接SNP 3’旁的靶DNA片段互补。在此特例中，为简单起见，图1仅显示了包抄SNP两侧的两个碱基，靶DNA上其它碱基及引物上它们的互补碱基则分别用Y及X表示。在本例子中，2碱基TT紧接SNP 3’端。为便于描述，以五基引物作为例子，它含有如图1、2、3所示的序列3’-AAXXX-5’。图2的表格显示如何通过在图1显示的反应中的寡核苷酸引物延伸的链长度分析，利用此表去确定在单倍体靶核苷酸中SNP的本体。表中直列标题表示适合延伸寡核苷酸引物的反应条件；横栏标题表示具有潜在置换SNP的核酸序列；在直列标题和横栏标题交汇处的每一方框内列出延伸了的寡核苷酸引物的预报长度。通过在图1显示的反应中的寡核苷酸引物延伸的链长度分析，可利用图3的表格去确定在双倍体靶核苷酸中SNP的本体。表中直列标题表示适合延伸寡核苷酸引物的反应条件；横栏标题表示在纯合或杂合SNP地址具有潜在的靶核苷酸置换的核酸序列；而在直列标题和横栏标题交汇处的每一方框内列出延伸了的寡核苷酸引物的预报长度。

在延伸/终止反应中，引物延伸是需要适当的聚合酶加上适合的反应条件，像适当的辅因子，如DNA聚合酶反应只可在Mg⁺⁺存在下才可进行。图2及3显示了三个反应混合物内的成分，每个载有不同的dNTP，但没有显示辅因子及反应条件。要进行链延伸，适合的反应条件是必需的，实验标准可参考分子克隆实验手册(第二版，著者J.Sambrook等人，出版社Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年)一书。因SNP点5’紧接着的核苷酸是G，所以采用了跟G配对的双脱氧核苷酸ddCTP。图2第一行显示三个反应混合物A-Mix、T-Mix及G-Mix，都载有ddCTP、引物、靶DNA及依次分别含有一种脱氧核糖核苷酸dATP、dTTP或dGTP(不同于dCTP)。这样，它们各自含有不同于C的独特碱基的dNTP核苷酸。

双倍体生物体包含两个拷贝的大部分基因，要测试其基因型，首先要确定生物体含有两个拷贝的基准性对偶基因(基准型纯接合体)，还是各一拷贝基准性及相异性对偶基因(杂接合体)，或两拷贝相异性对偶基因(相异型纯接合体)。此项发明方法可应用于进行基因型分析，检测单一变异位。通常SNP由对偶构成，而样品亦包含两拷贝靶核苷酸，若样品为杂接合体，将形成两个标记了的延伸产物。

此项快速基因型分析的发明，提供了有效基因分析及疾病易感性测定的工具。若一个体的带病对偶基因是纯接合体，那他比具杂接合体或其它对偶基因纯接合体的个体，患病的风险会更高。不过，此杂接合体仍然是一个带病载体。此知识对产前检查及其它医学和遗传学上的辅导都非常有用。因此，若靶DNA是单倍性基因(如X或男性特有的Y染色体)或纯合双倍性基因的部分，那SNP旁就只有单一的序列。像图2或图3最后一列的横栏二至五显示了于SNP位四个可能出现的碱基，以及包抄SNP两侧的碱基(如图1所示)，在方框内的碱基就是SNP位。图2顶横栏(及图3、4、5、8、9、10、11和图12的反应2)亦显示了欠缺dNTP的对照反应，此对照可自由选择是否包括在引物延伸实验之内。

如上所述，未知单倍体或纯合双倍体DNA样品的SNP碱基是A，所以图2及图3横栏二T-Mix中的dTTP能朝着SNP碱基A进行引物延伸，而ddCTP则于SNP 5’旁的G残基引发终止，产生二重碱基引物延伸，但A-Mix、G-Mix和对照-Mix均没有碱基延伸。

为充分地说明此项发明的用途，图2及图3横栏三至五显示了各反应的预计链延伸结果，而每一横栏展示出每个反应中碱基渗入引物的数目及延伸引物的序列。以横栏三为例，靶核苷酸的碱基是T，所以A-Mix内引物会进行二重碱基延伸，产生七基聚合体(7-mer)，而T-Mix和G-Mix均没有碱基延伸。若靶核苷酸含有一个碱基C，二重碱基延伸(即7-mer的产生)会在G-Mix中发生，而A-Mix和T-Mix均没有碱基延伸，引物依旧是五基聚合体(5-mer)。最后，像图2及图3横栏五所显示，若靶核苷酸含有一个碱基G，那A-Mix、T-Mix和G-Mix中均会产生六基聚合体(6-mer)，即单一碱基延伸。因反应混合物内SNP核苷酸的不同，令预报引物延伸(即零、单一或二重碱基延伸)亦有差异，其不同的延伸型式，将有助鉴定SNP的特质。实际上，从A-Mix、T-Mix和G-Mix中任选其二作为引物延伸长度的审查亦已足够。

图3最后一列的横栏六至十一显示，当包含SNP核苷酸的双倍体靶DNA属杂合性，SNP旁便会有两种不同的序列。横栏十的A-Mix、横栏八的T-Mix和横栏十一的G-Mix各从这些杂合性基因上两种模板序列(SNP旁)获得两种链延伸，而横栏六至十一内的其它培养只获得无延伸(零碱基延伸)、单一碱基延伸或二重碱基延伸。从A-Mix、T-Mix和G-Mix中观察到的四种延伸组合结果(即零、单一、二重及单一加二重碱基延伸)，可辨别出六类SNP杂合性组合体(即横栏六的A/T、横栏七的A/C、横栏八的A/G、横栏九的T/C、横栏十的T/G和横栏十一的C/G)及四类SNP纯合性组合体(如横栏二到五所示)。例如没有一个纯合性的A/A、T/T、C/C和G/G预计会于多过一个反应混合物内作二重碱基延伸，而所有杂合性的A/T、A/C和T/C会于两个反应混合物内作二重碱基延伸。还有，如横栏六的A/T组合体预计会于A-Mix和T-Mix中作二重碱基延伸。相反地，横栏七的A/C组合体预计会于T-Mix和G-Mix中作二重碱基延伸，而横栏九的T/C组合体预计会于A-Mix和G-Mix中作二重碱基延伸。剩下的三类杂合性组合体A/G、T/G和C/G，以及横栏五的纯合性G/G预计会于A-Mix、T-Mix和G-Mix中作单一碱基延伸。可是，横栏八的A/G只会于T-Mix中作二重碱基延伸，横栏十的T/G只会于A-Mix中作二重碱基延伸，而横栏十一的C/G只会于G-Mix中作二重碱基延伸。相反地，纯合性G/G不会于A-Mix、T-Mix和G-Mix中作二重碱基延伸，所以利用三个(或事实上只利用其中两个)反应混合物中发生的零、单一、二重及单一加二重碱基延伸型式已能鉴定靶DNA中杂合双倍体的SNP组合。

由此可见，采用三组并行的延伸/终止反应及对照反应(没有加入ddNTP的混合物)，并根据各组的引物延伸长度，可迅速鉴定单倍体基因、纯合双倍性和杂合双倍性基因的单核苷酸多态性，而链长度分析可利用诸如电泳法或质谱等技术。引物的长度取决于许多因素，包括碱基序列的构成成分(影响溶解温度Tm)、反应温度和进行杂交的条件等。检测方面可应用没标记双脱氧核苷酸或同位素标记双脱氧核苷酸，如以色谱分析作检测，则可用荧光或酶标记的双脱氧核苷酸。就放射性同位素系统而言，可先把单一及二重碱基延伸产物作凝胶分离，进一步采用放射自动显影证实延伸显像结果。如采用质谱或毛细管电泳法作链长度分析，可用没标记的双脱氧核苷酸。另外，荧光标记亦可和凝胶或毛细管电泳法一道运用。

如果标记测量法是采用标记了的链终止核苷酸进行而没有完成链长度分析去分辨单一或二重碱基延伸，则所得结果会指示在已知反应混合物中标记了的核苷酸渗入到引物的量，而不考虑引物延伸的实际长度。图4显示了采用标记链终止核苷酸进行寡核苷酸引物延伸反应(如图1所示)，不须作引物延伸长度分析，以标记渗入量鉴定单倍体靶核苷酸是否SNP；图表中的0代表没标记渗入，而2x代表因引物延伸的标记渗入；表中直列标题表示寡核苷酸引物延伸反应的条件；横栏标题则表示具有可能置换SNP的核酸序列；在直列标题和横栏标题交汇处的每一方框内列出延伸了的寡核苷酸引物的预报标记量。像图4所示的四个可能的单倍体SNP基因结果，显示了此项发明不须作引物延伸长度分析，只须根据A-Mix、T-Mix和G-Mix三个反应混合物内不同(“0”和“2x”)标记渗入型式的预报，就能取得SNP检测结果。利用适当的反应条件，标记终止核苷酸渗入引物量会随着模板的多少而改变，有助分辨是由单倍体/半组(1x)或双倍体/全组(2x)模板上进行的引物延伸。采用此反应条件，以标记链终止核苷酸进行寡核苷酸引物延伸(如图1所示)，能获得如图5所示的十个可能的双倍体SNP基因结果。这显示了此项发明不须作实际的引物延伸长度分析，而以标记渗入量鉴定双倍体靶核苷酸是否SNP；图表中的0代表没标记渗入；1x代表从半组DNA模板(即单一SNP对偶基因)复印出的延伸引物的半量标记渗入；2x则代表从全组DNA模板(即整对SNP对偶基因)复印出的延伸引物的全量标记渗入；图表中直列标题表示寡核苷酸引物延伸反应的条件；横栏标题则表示具有可能置换纯合或杂合SNP位置的靶核苷酸的核酸序列；在直列标题和横栏标题交汇处的每一方框内列出延伸了的寡核苷酸引物的预报同位素标记量。另外，根据三个反应混合物中不同(“0”、“1x”和“2x”)标记渗入型式的预报，可完全辨别每一个组合(四个纯合性和六个杂合性)。

利用含已知SNP的靶多核苷酸作为预报标准，跟DNA样品并排一起进行测试，能清晰及有效地辨别“0”、“1x”和“2x”标记渗入量(如图4和5所采用的)。例如A/A多核苷酸标准就是含纯合性A/A SNP的双倍体DNA，而G/G多核苷酸标准就是含纯合性G/G SNP的双倍体DNA。A/A多核苷酸会于A-Mix和G-Mix带来零碱基渗入，但是可于T-Mix中带来2x渗入。G/G多核苷酸则于三个反应混合物中获得2x渗入。当A/A多核苷酸与G/G多核苷酸混合，结果会是跟A/G杂合DNA相同，于T-Mix中带来2x渗入，但A-Mix和G-Mix中则只有1x渗入。渗入量的差异说明了所采用的测试条件能有效地分辨“0”、“1x”和“2x”标记渗入量。

图4和5的结果清晰地说明了不同的标记链终止核苷酸渗入引物量能鉴定靶单倍性或双倍性多核苷酸上的SNP核苷酸，不管引物是否作单一、二重或单一加二重碱基延伸，亦不须依赖链长度测定。不但如此，这些结果跟图2和3能够互相补足，从图4和5辨认到的SNP核苷酸，可利用图2和3作进一步确定，反过来亦成。

例2：例2和例1是相类似的，只是于SNP测试中，在延伸/终止反应之前会进行扩增反应。从受试者身上分离出极少量的靶双链基因组DNA，继而采用两组引物(引物1及引物2)进行聚合酶链式反应把DNA样品扩增。图6和7显示了此项发明的示意图解，采用寡核苷酸扩增引物1及2以聚合酶链式反应把靶核苷酸分子上的3’部分及5’部分(或于引物1与2之间的SNP)作扩增。此核酸分子扩增物会再跟第三互补寡核苷酸引物、靶核苷酸或与寡核苷酸引物3’氢氧基末端部分紧接的SNP进行杂交。如图6所示，引物1及引物2分别跟靶DNA上序列1和序列2C以及它的反义DNA链互补。

序列1是位于靶SNP核苷酸的3’下游，序列2C则位于互补核酸链上，而序列2(跟引物2一样)是位于SNP的5’上游，且与序列2C互补。为方便说明，引物的相对位置只依据双链核酸的其中一链(靶DNA链)，即依据序列1和序列2。每当要以聚合酶链式反应把信号扩增，两组引物定要与对向核酸双链互补，此条件已是熟悉的。

进行PCR扩增反应后，采用传统方法如体积排除色谱，从未起反应的引物1和2中净化扩增产物(如图6步骤2所示)，亦可利用核酸外切酶I(ExoI)和小虾碱性磷酸酶把扩增引物及dNTPs去除。

在延伸/终止反应进行中(如图7步骤3所示)，包含重要SNP的扩增产物(或称作扩增靶DNA)会与引物3杂交，而引物3跟靶SNP核苷酸3’邻近的序列(序列3)是互补的。为方便说明，序列3上只显示了SNP3’旁的两个碱基(TT)，其余的碱基则用Y代表，而引物3上的X碱基跟相对的Y碱基是互补的。正如此例，靶核苷酸位上的碱基是A，另外靶SNP 5’旁的碱基是C，所以用于链终止的双脱氧核糖核苷酸必须是ddGTP，再利用三组混合物的并行反应以取得全面的结果(像图8所示的这些为单倍体靶DNA作反应的混合物A-Mix、T-Mix和C-Mix)。图8还显示了以第三链寡核苷酸引物延伸长度分析(如图7)来鉴定单倍体靶核苷酸上的SNP，表中直列标题表示第三链寡核苷酸引物延伸反应的条件；横栏标题则表示可能的SNP置换；在直列标题和横栏标题交汇处的每一方框内列出延伸了的寡核苷酸引物的预报长度。延伸/终止反应可与那些在例1描述的作比较，第三直列显示了发生于T-Mix(包含ddGTP和dTTP)内的延伸/终止反应。既然靶核苷酸是A，dTTP将会给加上引物3的3’末端，紧接着是ddGTP。当加上双脱氧核糖核苷酸后，链终止便会发生，结果是二重碱基延伸。把双脱氧核糖核苷酸ddGTP以32P放射物标记，渗入于二重碱基延伸引物中使其发亮，并采用凝胶电泳法和放射自动显影将其分离及检测。

为进一步阐明此项发明能应用于分析含不同SNP碱基的单倍体靶DNA序列，图8显示三个反应混合物A-Mix、T-Mix和C-Mix内的预期结果。此分析与图2所示是大同小异，每组混合物内均个别放置了跟其ddNTP不同碱基的dNTP，在表最右直列便显示了单倍体靶DNA上的SNP及两侧包抄部分，而三个混合物A-Mix、T-Mix、C-Mix(或加上对照-Mix)中的预计引物延伸长度，以及其序列亦显示于每个反应混合物下的空格内。简单地说，含dTTP的T-Mix会产生二重碱基引物延伸，表示靶核苷酸是A，含dCTP的C-Mix若产生二重碱基延伸，这表示SNP核苷酸是G，若二重碱基延伸发生于含dATP的A-Mix中，则靶核苷酸是T。但若所有反应混合物均发生单一碱基延伸，靶核苷酸便会是C。

另外，标记ddGTP渗入引物量可用于量度一个特定反应混合物中延伸引物链的数目，不需使用链长度分析来辨别单一或二重碱基延伸，图10所显示的预计结果可与图4所示的作比较。这些数据足以鉴定单倍体靶多核苷酸上的SNP，因为不同SNP核苷酸会得出不一样的“0”和“2x”标记渗入量型式的预报。

若包含SNP地址的靶多核苷酸是属双倍体而不是单倍体DNA序列的一部分，此SNP地址便可能由两个相同(纯合性)或是不一样(杂合性)的SNP核苷酸所组成。这十类双倍体SNP组合，其中四类是纯合性组合，另外六类是杂合性组合，它们从A-Mix、T-Mix和G-Mix中均得出不一样的引物延伸型式，即零、单一、二重及单一加二重碱基延伸。采用(如图7)第三链寡核苷酸引物延伸长度分析，图9可应用于鉴定双倍体靶核苷酸上的SNP，表直列标题表示第三链寡核苷酸引物延伸反应的条件；横栏标题则表示具有潜在纯合或杂合SNP的核酸序列；在直列标题和横栏标题交汇处的每一方框内列出延伸了的寡核苷酸引物的预报长度。同样地，利用标记ddNTP终止物，十类双倍体SNP组合将会得出不一样的“0”、“1x”及“2x”标记渗入量型式的预报((如图11所示)。

因此，根据图8、图9、图10和图11中三组含不同dNTP反应混合物的引物延伸长度或标记ddNTP渗入量的结果比较，能够辨别所有单倍体SNP以及全部十类双倍体SNP组合。亦可包括无dNTP的对照混合物(对照-Mix)作进一步确定实验结果之用。

例3：例3和例2是相类似的，只是引物3的5’末端是固定于固体基质上。在聚合酶链式扩增反应后(如例2所述)，利用核酸外切酶I(ExoI)和小虾碱性磷酸酶或是凝胶电泳法把反应混合物中多余的扩增引物及dNTPs去除，然后将扩增靶DNA变性及跟固定引物3结合。这样采用相同或不同的固定引物排列，就可进行大量多样性标本测试。

无论有否dNTP延伸物，当把合适的双脱氧核苷酸加进混合物中，便能启动延伸/终止反应。如图7所示，因为于SNP5’旁的碱基是C，所以ddGTP便成为反应混合物中的终止物。为着要完全地知悉单倍体或是双倍体靶DNA上四个可能出现的SNP核苷酸，延伸反应须于不同的核苷酸组合下进行。反应混合物内载有聚合酶反应物、固定引物3、链终止物ddGTP及链延伸物(dNTP)，固定引物延伸长度及链终止物渗入量的预报型式和非固定引物(如图8、图9、图10和图11所述)的预报结果是完全一样的。

对于固定引物，较不易分析及辨别单一和二重碱基延伸，因此图10和图11的预报结果比图8和图9更容易应用。然而其优点在于能够使用同一引物跟不同的混合物进行接连的反应。图12的双培育方法亦是依据此优点。

将双培育方法应用在图7中的引物3，反应1内靶DNA部分跟固定引物3结合，随即加进聚合酶和标记终止核苷酸ddGTP，但并没加dNTP。图7中的SNP是A，在这情况下，标记ddGTP没被编入固定引物。同样地，如果SNP是T或G，标记渗入亦不会发生。另一方面，如SNP是C，标记ddGTP便可被编入，示意该SNP核苷酸是C。

为发现C以外的SNP核苷酸，需进行反应2。把靶多核苷酸另一部分跟反应1所用的固定引物结合，加进聚合酶和没标记ddGTP作预培育，让任何具SNP核苷酸C的靶多核苷酸作引物延伸，并将此杂交物(引物/靶多核苷酸)洗涤，去掉余量的聚合酶及没标记ddGTP，其后再加入聚合酶与标记ddGTP，还有dATP、dTTP或dCTP到各自的A-Mix、T-Mix和G-Mix中作主培育。

在反应2的预培育时期，具核苷酸C的SNP位会引发引物延伸，没标记终止ddGTP会被编入，但若SNP位是A、T或G，引物延伸便不会发生。可是，若SNP位是A，于随后的主培育中(含标记ddGTP和dTTP的T-Mix)，引物会作二重碱基延伸及编入标记。这样的情况亦发生在SNP位是T和A-Mix(含标记ddGTP和dATP)中，以及SNP位是G和混合物C-Mix(含标记ddGTP和dCTP)中。

从反应1及反应2主培育(载有标记ddGTP的A-Mix、T-Mix和G-Mix)中所得到的结果，已足够辨别那四个单倍体SNP以及全部十类双倍体SNP组合(如图12所示)。

[0069]要根据图12分辨出所有单倍体SNP及双倍体SNP组合，仅需辨别实验中在“0”和“1x”或“0”和“2x”间的标记渗入量，而不需辨别在“1x”和“2x”间的标记渗入量。因在采用固定引物的情况下，“1x”和“2x”的标记渗入量将难于辨别。如图12，T/T双倍体SNP经过反应2中的主培育后，T-Mix和C-Mix混合物中会得到“0”标记渗入而A-Mix则获得“2x”渗入。若双倍体SNP是T/C，T-Mix和C-Mix会得到“0”标记渗入而A-Mix则获得“1x”渗入。但若只须辨别T/T和T/C，则不用依靠反应2中的A-Mix主培育结果，而可直接从反应1(T/T得“0”而T/C得“1x”标记渗入)得知。要实现上述的识别方法，可采用荧光标记链终止物ddGTP，并使用感光探测器(如荧光点阵扫描仪或是读数器)监测固定引物中的荧光标记渗入。把对照混合(对照-Mix)纳入图12的分析，可进一步确定实验结果。

此项发明可应用到许多反应组合，并不限于以上所提及的例子，它们只作引证说明。在没有偏离其精神及范围下，通过现有的技术，要改变与修改此项发明是可行的。为便于解说，在例子中所用的引物长度极短，但可按使用者需要而变更。

例2中，PCR扩增以后，须把引物与扩增产物分离。应理解若能使引物1及2有别于引物3，便可省略此纯化步骤，如所采用的引物1和引物2比引物3长很多(甚至像图7步骤3所示的二重碱基延伸引物3)。在这情况下，即使DNA扩增后没有纯化，而引物1和2仍然存在，也能把那些引物及其延伸产物分辨。一般来说，若要以聚合酶延伸产物大小作识别，引物3则须少于50碱基，因大多数质谱测试方法仅对少于50碱基的DNA片断有效。毛细管电泳法对少于100碱基的引物长度分析则更有利。因此，最佳的引物3长度是取决于测试方法。作为非限制性的例子，延伸/终止反应中使用的引物可以是在15-55碱基之间。

为便于解说，例1和例2中都用上了短引物，但引物长度可因应不同的杂交条件而变更，如图6所示，序列1及序列2分别跟SNP位相距仅七个及六个碱基。但实际上，序列1和序列2可以是SNP位3’下游及5’上游任何位置。只要SNP 5’旁的碱基可扩增，而扩增了的产物长度足够跟图7的引物3结合并于随后的延伸/终止反应中让聚合酶转录。序列2跟SNP应最小相距100碱基，但多过100碱基会更好，图6序列1连同序列1与SNP位之间插入的序列的长度应与引物3是可比较的。

PCR可以是对称性的，即反应内两组扩增引物的摩尔浓度大约相等，或者可以是非对称的，就是其中一组扩增引物的摩尔浓度比另一组要多出100倍。

[0074]例1显示了若能从来源物质上取得足够DNA，不用作扩增，便可直接进行延伸/终止反应。同样地，若采用高敏度引物侦察技术，所需用的DNA量将更小且无须预先扩增。此外，若采用高特性引物进行高特性扩增反应，则DNA纯化是不必要的。

在以上例子中用了DNA以及运用了dNTP和ddNTP。所用的聚合酶可以是DNA聚合酶或别的可利用的核酸延伸剂，其原理也许能应用于把RNA聚合酶作为终止核苷酸，此RNA聚合酶有合适的3’脱氧NTP或2’，3’双脱氧NTP。不同的核酸延伸剂最好有不同的核苷酸作链延伸及链终止。要提供合适的核苷酸辅因子和反应条件用于链延伸及合适的链终止核苷酸用于链终止。因此，本专利要求中的延伸剂核苷酸意指用于链延伸的核苷酸，但不一定局限于2’-脱氧核苷-5’-三磷酸((dNTP)。

有时候不需要找到在SNP多态性中的所有四个碱基。所以，当某特定多态性只包含两个碱基时，就有可能减少提供全面数据结果所需的并行反应数目。

例如，若只要取得某特定碱基出现于SNP位置上的频率，如碱基G及其5’紧接着的碱基C，基本上含dCTP和ddGTP的单一反应已足够提供所需结果。不过，亦可包括含dATP加上ddGTP、dTTP加上ddGTP或只含ddGTP的并行反应以作进一步确定。亦可省略其中一个延伸/终止反应混合物，从而节省成本而又不影响结果。例如图4的A-Mix便可删除，仅依靠T-Mix及G-Mix已能够分辨那四个SNP核苷酸。又例如只须在多态性位置上对预示某一重大疾病的特定碱基的出现作“是”或“否”的判断。在此情况下，并行反应的数目亦可减少，从而减低筛选成本。

以固定探针为例，把大量的(96或384)探针固定于固体基质上个别的特定位置。每一个延伸反应能以模板-引物结合和链延伸的单一循环，或以散布式的复合性热循环，利用范本-引物杂交的热融解提高敏感性来完成。但是，图12反应2的模板-引物杂交在预培育步骤后不能融解。

采用小虾或小牛肠碱性磷酸酶进行延伸后处理，把每个热循环后没渗入的ddNTP去掉。这样的处理方法，适合于使用毛细管电泳法监测荧光标记ddNTP的渗入，因没渗入的荧光标记ddNTP会跟延伸引物交迭，造成干扰。以磷酸酶去除5’磷酸基，可改变没渗入荧光标记ddNTP的游移速度，从而减少干扰。这样的处理不须于每个热循环中进行，仅在侦察延伸产物之前便可。

此项发明提供了SNP筛选方法。把多样的探针固定于一个芯片上，这样，可同时筛选从不同个体得到的遗传物质及代表不同多态性的SNP。

据上述所示，此项发明具有许多优点：

宁可采用一种而不是四种ddNTP进行单一碱基引物延伸有助减低标记ddNTP的成本，从而对大规模测试及荧光标记测试有利。此特点亦适用于其它只容纳一种标记的侦察方法，如大多数的放射性或与酶关联的有色标记。

渗入检测只需使用一种链终止核苷酸，因此是项多至二重碱基延伸分析为基础的发明比其它需要四种标记ddNTP作单一碱基延伸的方法更广为应用。像这样，上述的二重碱基延伸方法可用于未能同时侦察多样信号的技术平台，如不同的荧光标记。这样的平台包括固体基质上的检测(像96孔板或基因芯片)，及液态中延伸探针与没延伸的分离步骤，如采用高效液相色谱法或毛细管电泳法。此项发明中的反应混合物能够迅速地实现于这些环境。

从是项发明衍生出的方法，因其简易的监测及标记成本下降，有可能发展成广为应用的基因分型工具。

二重碱基延伸方法能易于应用到易于发生量误差的SNP对偶基因出现率及集合的DNA的联系研究。因只用一种ddNTP作二重碱基延伸，ddNTP渗入量的量化比起那些采用具交迭光谱的多至四种不同的荧光染料，会出现较少实验变化。

因含不同dNTP的反应是单独进行(如独立试管)的，二重碱基延伸方法中所采用的分离技术亦较简单，只须分离一种而不是四种没渗入ddNTP(像在单一碱基延伸进行的情况下)便可。

荧光异向性或质谱等方法可应用到引物延伸的检测，无须任何分离。荧光异向性能迅速分析如是项发明中的单一荧光标记，比采用四种不同荧光标记(像在单一碱基延伸进行的情况下)更为实用。

质谱测量法是利用离子化、分离和测量等技术，并根据分子离子的质量对电荷比率(mass-to-charge ratio，m/z)，提供有关分子重量甚至结构上的数据。质谱仪在无机、有机及生物有机化学品的分析应用上是关键性的，此外，随着质谱法的改进及提升，其应用更广。

Claims (28)

1.一种检测靶核苷酸的方法，在核酸分子中有一个3’末端和一个5’末端，而该靶核苷酸是位于此核酸分子的3’末端和5’末端之间，该方法包含：

(a)在众多的反应容器内将寡核苷酸引物与核酸分子混合，在其中寡核苷酸引物有一个自由氢氧基部分在紧邻靶核苷酸3’端的核酸分子上杂交成一互补序列；

(b)供给每一容器相应的链终止核苷酸，在其中紧接靶核苷酸5’端的一个相邻核苷酸与相应的链终止核苷酸互补；

(c)加入独特的链延伸核苷酸至每一反应容器中，在其中每一反应容器有相同的相应链终止核苷酸，但独特的链延伸核苷酸在每一反应容器中则不相同；

(d)寡核苷酸引物延伸是通过加入聚合酶反应混合物到每一反应容器中，并取决于模板；

(e)检测渗入到延伸引物的核苷酸，在其中靶核苷酸本体取决于延伸引物的大小。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中靶核苷酸包含单核苷酸多态性(“SNP”)，或包含一个点突变。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中核酸分子包含一个孤立的基因组的脱氧核糖核酸(“DNA”)分子，或包含一个聚合酶链反应(PCR)扩增了的DNA分子。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中寡核苷酸引物有一长度在约15至55核酸残基的范围内，或包含一个附着于固体表面的5’部分。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中链终止核苷酸包含一个在化学上标记了的核苷酸，该在化学上标记了的核苷酸是从包括有放射性同位素，荧光部分及可发出色彩信号的酶的组合中挑选出来，或其中链终止核苷酸包含一个双脱氧核苷三磷酸(“ddNTP”)化合物。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中链延伸核苷酸包含一个脱氧核苷三磷酸(“dNTP”)化合物。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中聚合酶链反应混合物包含一个核酸聚合酶和一个缓冲剂。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中识别在核酸分子中的靶核苷酸包含用相应的预测要渗入到延伸引物的在化学上标记了的核苷酸，该在化学上标记了的核苷酸是从包括有放射性同位素，荧光部分及可发出色彩信号的酶的组合中挑选出来；或其中识别在核酸分子中的靶核苷酸包含对延伸引物用相应的预测长度图表去选配延伸引物在实验上确定的长度。

9.一种识别靶核苷酸的方法，在核酸分子中有一个3’末端和一个5’末端，而该靶核苷酸是位于此核酸分子的3’末端和5’末端之间，该方法包含：

a)在众多的反应容器中固定一个寡核苷酸引物到一个固体表面上，从而形成一个固化引物；

b)加入核酸分子到众多的带有固化引物的反应容器中，在其中固化引物有一互补于3’的氢氧基部分在紧邻靶核苷酸3’端的核酸分子上杂交成一互补序列；

c)供给每一容器第一个相应的链终止核苷酸，在其中第一个相应的链终止核苷酸与靶核苷酸互补；

d)当众多预培养反应容器存在预培养聚合酶反应混合物时，会得到预培养引物；

e)清洗众多的反应容器，去除预培养聚合酶反应混合物和第一个相应的链终止核苷酸；

f)供给每一容器第二个相应的链终止核苷酸，在其中第二个相应的链终止核苷酸与紧邻靶核苷酸5’端的相邻核酸互补；

g)加入独特的链延伸核苷酸至每一反应容器中，在其中每一反应容器有相同的第二个相应链终止核苷酸，但独特的链延伸核苷酸在每一反应容器中则不相同；

h)寡核苷酸引物延伸是通过加入聚合酶反应混合物到每一反应容器中，并取决于模板；

i)检测渗入到延伸引物的核苷酸，在其中靶核苷酸本体取决于延伸引物的大小。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中靶核苷酸包含单核苷酸多态性(“SNP”)，或包含一个点突变。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中核酸分子包含一个孤立的基因组的脱氧核糖核酸(“DNA”)分子，或包含一个聚合酶链反应(PCR)扩增了的DNA分子。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中固化引物有一长度在约15至55核酸残基的范围内。

13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中第一个链终止核苷酸包含一个双脱氧核苷三磷酸(“ddNTP”)化合物，或包含一个在化学上标记了的核苷酸，该在化学上标记了的核苷酸是从包括有放射性同位素，荧光部分及可发出色彩信号的酶的组合中挑选出来。

14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中第二个链终止核苷酸包含一个脱氧核苷三磷酸(“dNTP”)化合物，或包含一个在化学上标记了的核苷酸，该在化学上标记了的核苷酸是从包括有放射性同位素，荧光部分及可发出色彩信号的酶的组合中挑选出来。

15如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中链延伸核苷酸包含一个脱氧核苷三磷酸(“dNTP”)化合物，或包含一个在化学上标记了的核苷酸，该在化学上标记了的核苷酸是从包括有放射性同位素，荧光部分及可发出色彩信号的酶的组合中挑选出来。

16.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中预培养聚合酶反应混合物包含一个核酸聚合酶和一个缓冲剂。

17.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中聚合酶反应混合物包含一个核酸聚合酶和一个缓冲剂。

18.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中检测渗入到延伸引物的核苷酸包含确定延伸引物的长度。

19.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中识别在核酸分子中的靶核苷酸包含对延伸引物用相应的预测长度图表去选配延伸引物在实验上确定的长度。

20.一种识别靶核苷酸的方法，在核酸分子中有一个3’末端和一个5’末端，而该靶核苷酸是位于此核酸分子的3’末端和5’末端之间，该方法包含：

a)寡核苷酸引物与在溶解液中的核酸分子反应成混合物，在其中寡核苷酸引物有一互补3’氢氧基部分在紧邻靶核苷酸3’端的核酸分子上杂交成一序列；

b)等分混合物容积至第一个，第二个，第三个和对照反应容器；

c)供给第一个，第二个，第三个和对照反应容器一个链终止核苷酸，在其中链终止核苷酸与直接在5’端与靶核苷酸相邻的核苷酸互补；

d)加入独特的链延伸核苷酸至第一，第二和第三反应容器中，在其中独特的链延伸核苷酸包含一个核基，它不同于链终止核苷酸的核基；

e)当存在聚合酶反应混合物时，培养第一，第二，第三和对照反应容器去形成零个-，一个-，二个-互补碱基，它伸展到寡核苷酸引物的3’氢氧基部分上去，从而培养了引物；

f)分析在每一个第一，第二，第三和对照反应容器中培养了的引物的零个-，一个-或二个-互补碱基的延伸长度；和

g)比较在每一个第一，第二，第三和对照反应容器中培养了的引物的零个-，一个-或二个-互补碱基的延伸长度去识别靶核苷酸。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，其中靶核苷酸包含单核苷酸多态性(“SNP”)，或包含一个点突变。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，其中核酸分子包含一个孤立的基因组的脱氧核糖核酸(“DNA”)分子，或包含一个聚合酶链反应(PCR)扩增了的DNA分子。

23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，其中寡核苷酸引物有一长度在约15至55核酸残基的范围内，或包含一个5’端附着于一个固体表面。

24.如权利要求20所述的方法，其特征在于，其中链终止核苷酸包含一个双脱氧核苷三磷酸(“ddNTP”)化合物，或包含一个在化学上标记了的核苷酸碱基。

25.如权利要求20所述的方法，其特征在于，其中链延伸核苷酸包含一个脱氧核苷三磷酸(“dNTP”)化合物。

26.如权利要求20所述的方法，其特征在于，其中聚合酶反应混合物包含一个核酸聚合酶和一个缓冲剂。

27.如权利要求20所述的方法，其特征在于，其中比较在第一，第二，第三和对照反应容器内培养了的引物中加入到零个-，一个-或二个-互补碱基延伸长度的互补碱基延伸长度包含利用培养了的引物在第一，第二，第三和对照反应容器内的预测长度图表，以及，对在培养了的引物中零个-，一个-或二个-互补碱基延伸长度的实际核苷酸碱基配对延伸长度和在培养了的引物中的预测核苷酸碱基配对延伸作比较。

28.如权利要求20所述的方法，其特征在于，其中预测长度图表包含横标题栏展示第一，第二，第三及对照反应容器和单倍体DNA序列，而直标题栏在分开的各行中以四种可能的靶核苷酸的核苷酸碱基组合列出核苷酸序列，且在其中在培养了的引物中的零个-，一个-或二个-互补碱基延伸长度的预测核苷酸延伸数目在展示四种或十种可能的核苷酸碱基的核苷酸序列的横标题栏和直标题栏的交汇处列出。

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