CN104185683A - 用以检测突变的方法与引物组 - Google Patents

Abstract

在此揭示以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR)为基础的方法，此方法可用以检测样本中目标基因之一所选区域中是否发生插入/缺失变异(相较于一参考序列)。目标基因具有一模板股与一编码链。此方法运用包含一抑制引物以及一正向引物的引物组。所用的抑制引物与正向引物部分序列重叠，但具有不同的解链温度，且抑制引物的3’端经修饰而能够防止抑制引物在PCR过程中延伸。因此，在特定的PCR条件下，能检测到PCR产物意味着在所选区域中发生了插入/缺失突变，而未检测到PCR产物意味着在所选区域中并未发生插入/缺失突变。

Description

用以检测突变的方法与引物组

(1)技术领域

本发明是关于用以检测变异的方法与引物组。具体来说，本发明是关于插入和/或缺失变异的检测。

(2)背景技术

基因突变(gene mutation)系指一特定基因或调控序列的核苷酸序列相较于天然(或正常)核苷酸序列有所改变。突变可以是点突变(point mutation；即，单一核苷酸置换)、一或多个核苷酸的缺失(deletion)或插入(insertion)、多个核苷酸的置换(substitution)或在染色体层级的互换(crossing-over)。

近年来，用以检测点突变或染色体互换的技术发展迅速。举例来说，可利用桑格式直接测序法(Sanger’s direct sequencing)来对目标序列测序，以得知发生突变的一或多个核苷酸。然而此种直接测序的灵敏度不高，因而限制了此技术在临床与研究领域等的应用。或者是可采用专一的引物和/或探针，以正向检测目标序列上的点突变或互换。然而，运用上述方法来检测插入突变与缺失突变的相关报导并不多见。传统上，在设计用以检测插入/缺失突变的引物或探针时，必须先知道突变部位的序列。当目标基因中带有超过一个的插入和/或缺失核苷酸时，必须使用多个引物才能确保所有突变序列都能被检测。此外，传统方法极易发生检测错误，部分是因为以引物或探针和目标基因进行杂交(hybridization)时，突变部位可能形成环圈(looped out)，因此引物或探针仍可和具有突变核苷酸之目标基因发生非特异性的杂交(unspecific hybridization)。更有甚者，这些习知检测方法之检测灵敏度(detection sensitivity)通常较低，因而需要使用大量的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，简称DNA)和/或经过更多次的反应循环，使得整个反应耗时费力。在某些情形中，必须使用实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，简称RTQ-PCR)和/或RTQ-PCR专用的设备才能够进行检测。因而，为了确保得到正确的检测结果，习知方法可能需要花费较多时间或成本来优化反应参数。以上种种因素限制了这些技术在临床试验以及基础研究等领域的应用。

有鉴于上述问题，相关领亟需提出一种能够正确地检测插入和/或缺失突变的方法。

(3)发明内容

发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。

本发明至少部分是基于一种新颖的引物设计方案，此种设计方案使得样本中，带有变体序列(相较于参考序列)的目标基因能够被扩增，且因而能够检测到此种具有突变的目标基因。具体来说，所述目标基因具有模板链以及和此模板链互补的编码链，而本发明提出的引物组及方法是针对该模板链中一段选定区域来进行设计。此处所述的选定区域可能带有或不带有至少一变异核苷酸，此变异核苷酸可能是被插入到参考核苷酸序列中，或自参考核苷酸序列中被移除。于一实施例中，参考序列可为野生型(正常)序列，此时变体序列可带有插入和/或缺失突变。或者是，参考序列可以是一种已知的突变序列，此时所谓的变体序列可以是野生型序列或任何其它突变序列。

有鉴于此，本发明的第一方面是关于根据此引物设计方案的引物组。当可注意到，在根据此种方案设计特定引物组时，不需要事先知道经插入或删除之序列(相对于参考序列)；不过，本发明当然亦可用来检测已知的变体序列。相对应地，此处所教示的单一种引物组能够检测位于选定区域内的多种变异。因而，在本说明书中有时亦会将此处提出的能够扩增这些突变序列的方法称为通用插入/缺失聚合酶链式反应(universal insertion/deletion PCR，Unidel-PCR)或简称为“PCR”。

根据本发明一实施方式，可用于此处所述之PCR式方法的引物组包含一抑制引物及一正向引物。抑制引物经设计能够阻止参考序列在PCR过程中被扩增。为了达到此一目的，抑制引物的序列与模板链之选定区域的参考序列以及紧接于模板链之选定区域前的至少一核苷酸残基相同，且抑制引物的3’端经修饰以防止该抑制引物于该PCR过程中延伸。正向引物的序列与位于模板链选定区域上游(upstream)之多个核苷酸残基相同，且正向引物3’端的至少最后一个核苷酸残基与抑制引物5’端的至少第一个核苷酸残基相同。

根据本发明另一实施方式，抑制引物3’端经过磷酸基(phosphate group)、磷酸酯(phosphate ester)、反向3’-3’连接(inverted3’-3’linkage)、2’,3’-二脱氧核苷(2’,3’-dideoxynucleoside)或3’脱氧核苷(3’-deoxynucleoside)的修饰。

在非必要的实施方式中，正向引物的解链温度(melting temperature，Tm)不同于抑制引物的解链温度。根据某些实施方式，抑制引物与正向引物的解链温度皆分别高于或等于50℃。在一非必要的实施方式中，抑制引物的解链温度为约65-75℃，而正向引物的解链温度为约50-60℃。

根据本发明另一实施方式，抑制引物的长度为10-100个核苷酸。根据本发明又一实施方式，正向引物的长度为10-30个核苷酸。根据本发明再一实施方式，正向引物3’端的至少最后5-10个核苷酸和抑制引物5’端的至少前5-10个核苷酸相同。

在一实施例中，选定区域的序列如SEQ ID NO：1所示，抑制引物的序列如SEQID NO：2所示，且正向引物的序列如SEQ ID NO：3所示。在另一实施例中，选定区域的序列如SEQ ID NO：4所示，抑制引物的序列如SEQ ID NO：5所示，且正向引物的序列如SEQ ID NO：6所示。在又一实施例中，选定区域的序列如SEQ ID NO：7所示，抑制引物的序列如SEQ ID NO：8所示，且正向引物的序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明的第二种方面是关于一种用以检测一样本中目标基因之PCR式方法，其中上述目标基因的一选定区域内可能带有或不带有至少一变异核苷酸(相较于正常序列)，所述的目标基因具有模板链以及与该模板链互补的编码链。下文的实验结果显示，本方法在检测插入/缺失变异方面展现了极高的灵敏度(sensibility)。此外，本方法能够检测未知序列的此种插入或缺失型的变异核苷酸。

根据本发明一实施方式，此PCR式方法包含以下步骤。将带有目标基因的样本与根据本发明上述实施方式所述的引物组混合，以得到反应混合物。接着，对混合物进行PCR，其依序包含以下步骤：变性(denaturing)、退火(annealing)与延伸(extension)。在退火步骤中，退火温度使得正向引物和抑制引物能够彼此竞争而与模板链退火。其后，决定经过PCR过程后是否得到PCR产物。在本实施方式中，当可检测到PCR产物时，表示样本中目标基因选定区域内有一或多插入或缺失变异；而当无法检测到PCR产物时，表示样本中目标基因选定区域内没有插入或缺失变异。

根据本发明另一实施方式，混合物中抑制引物与正向引物的摩尔比为约1：1至10：1；且较佳为3：1至10：1。

在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明之基本精神及其它发明目的，以及本发明所采用之技术手段与实施方式。

(4)附图说明

为让本发明的上述与其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式之说明如下：

第1图为示意图，概要地说明根据本发明实方式的引物设计方案；以及

第2图为照片，呈现出根据本发明一实施例来检测插入/缺失突变之电泳结果。

(5)具体实施方式

为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方面与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇之含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。同时，在此处“至少一”以及“一或多”等词汇当包含一、二、三或更多种。

虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数界是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施方式的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常系指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其它相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。

“核苷酸”(nucleic acid)一词在此处系指由杂环碱基(heterocyclic base)、糖类(sugar)与一或多个磷酸基(phosphate group)所组成的化合物。最常见的核苷酸是以嘌呤(purine)或嘧啶(pyrimidine)的衍生物作为碱基，而糖类则是五碳脱氧核糖(pentose deoxyribose)或五碳核糖(pentose ribose)。常见的嘌呤有腺嘌呤(adenine，A)与鸟嘌呤(guanine，G)；而常见的嘧啶有胞嘧啶(cytosine，C)、胸腺嘧啶(thymine，T)与尿嘧啶(uracil，U)。“核苷酸序列”(nucleotide sequence)一词在此系指在一单链核酸(nucleic acid)中的寡核苷酸(oligonucleotide)或聚核苷酸(polynucleotide)之核苷酸排序。除非另有说明，单链核苷酸序列的左手端为5′端；而右手端为3′端。“下游”(downstream)一词系指位于所述核苷酸序列之3′方向的一核苷酸序列；而“上游”(upstream)一词则是指位于所述核苷酸序列之5′方向的一核苷酸序列。

在本说明书中，“目标基因”(target gene)一词系指欲用以探究其“选定区域”(selected region)内是否带有或不带有插入/缺失变异的一种核苷酸序列。一般来说，目标基因为双链DNA的形式，其系由一模板链(template strand)以及与该模板链互补的一编码链(coding strand)所组成。根据本领域的习惯，模板链的序列由5’至3’方向呈现(由左到右)；而编码链则是由3’至5’方向呈现(由左到右)。根据本发明之方面与实施方式，抑制引物与正向引物经设计能够和编码链中的一特定序列杂交(hybridize)或退火(anneal)。

“参考序列”(reference sequence)一词在此系指一种受到关注的特定序列。参考序列可以是“野生型”(wild-type)、“非突变”(non-mutated)或“正常”(normal)序列，这些序列中不带有插入/缺失或其它突变。或者是，参考序列可以是一种突变的序列。

在此处，“变体”(variant)一词系指一参考(reference)核酸分子的一或多个核苷酸发生了改变。当参考核酸分子是未经突变的野生型核酸分子时，变体序列可以是任何具有插入和/或缺失突变的突变序列。当参考序列是一种已知的突变序列时，变体序列包括野生型序列以及其它突变序列。

“插入变体”(insertion variant)一词系指改变是由于在参考核酸分子中出现了一或多个额外的核苷酸；因此，插入变体包含了插入突变。此外，基因剪接(gene splicing)序列也可视为插入突变，因为在DNA股中加入了额外的碱基。“缺失变体”一词则是指由参考核酸分子中移除一或多个核苷酸所导致的变体，且包括缺失突变。在本说明书中交替使用“插入和/或缺失变体”以及“插入/缺失变体”等用语可交替指称插入变体或缺失变体或同时带有插入与缺失两种变体之情形。举例来说，可将互换(crossing-over)序列视为包含插入突变与缺失突变的序列。。

“正向引物”(forward primer)在此系指一种单链核苷酸序列，其序列和欲复制的一单链核酸的序列相同。当正向引物处于适当的环境(如具有适当缓冲液、盐类、温度和/或pH值)下且环境中存有核苷酸以及用于核酸聚合的成分(如，DNA聚合酶(polymerase)或RNA聚合酶)，正向引物能够作为一引物延伸产物的合成起始点。具体来说，“正向引物”能够和与模板链5’端互补的序列杂交(或退火)。在此处，“抑制引物”为单链核苷酸序列，其可和至少与选定区域5’端互补之序列杂交(或退火)，且一如其名地，抑制引物不会引发(initiate)与之结合的核苷酸序列之扩增。

“杂交”一词系指具有足够互补性的二核苷酸序列经由华森-克李克(Watson-Crick)碱基配对或其它非正规的配对而形成了复合物(complexes)或杂交体(hybrid)。杂交作用可能发生在两股DNA之间、两股RNA之间或一股DNA与一股RNA之间。杂交作用会在分子生物学领域中习知的多种适当条件(如温度、pH值、盐类浓度等)下发生。

在此处，“扩增”(amplification)一词系指能够增加样本中特定核苷酸序列含量的方法或过程。聚合酶链式反应(PCR)是相关领域熟知的扩增反应，下文将进一步详述此处所用的PCR过程。在此处，“反应混合物”(reaction mixture)与“混合物”(mixture)等词是用来指称可用于后续聚合酶链式反应中的组成物。

参照第1图来描述此处提出的引物设计方案，以利了解本发明之内容。当可注意到第1图中所示的序列是为了说明本发明且仅为例示；因此申请专利范围不受这些序列的限制。

如第1图所示，目标基因是内皮生长因子受体外显子19(epidermal growthfactor receptor(EGFR)exon19)，此目标基因的模板链包含EGFR外显子的第2214至2261个核苷酸，其序列为5’-TAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAA-3’(SEQ ID NO：10)，而与模板链互补的编码链包含以下序列3’-ATTTTA AGGGCAGCGATAGTTCCTTAATTCTCTTCGTTGTAGAGGCTT-5’(SEQ IDNO：11)。在本说明书的公开内容中，在模板链中选定了一区域以探究此选定区域中是否带有或不带有一或多插入/缺失变异。在本实施例中，模板链中的选定区域之序列为TAAGAGAAGC(SEQ ID NO：1，即EGFR外显子的第2240至2249个核苷酸)。

理论上，欲探究的选定区域的核苷酸长度并无特殊限制。根据本发明的非必要实施方式，选定区域最多可带有99个核苷酸。举例来说，选定区域的长度可为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99个核苷酸。

为了检测选定区域内的插入/缺失变异，设计了两种引物(即，抑制引物及正向引物)，其分别可结合至模板链的不同但重叠部分。下文将详细说明这两种引物。

抑制引物

抑制引物的序列和模板链之选定区域的参考序列以及紧接在该模板链选定区域上游的至少一核苷酸残基相同，因此在适当的杂交环境下，抑制引物可退火至一与选定区域以及至少一相邻核苷酸互补的序列。非必要地，抑制引物更包含紧接在选定区域上游的至少5至20个连续的核苷酸残基。同样非必要地，抑制引物可包含紧接在该选定区域下游的至少一核苷酸残基。相似地，上述紧接在选定区域下游的核苷酸残基可为至少5至20个核苷酸残基。举例来说，如第1图所示，一例示的抑制引物之序列为CGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTC C(SEQ ID NO：2，选定区域以斜体标记)。如第1图所示，此抑制引物包含了紧接在选定区域上游的15个连续核苷酸残基(CGCTATCAAGGAAT)以及紧接在选定区域下游的9个连续核苷酸残基(AACATCTCC)。本发明所属技术领域中具有通常知识者当可理解，由于此抑制引物涵盖了整个所选区域，当所选区域中没有插入/缺失突变时，抑制引物可形成相对较稳定的杂交体。相反地，当所选区域中带有插入/缺失之核苷酸时，抑制引物和编码链在所选区域的部分会出现无法对齐(misalignment)的现象，而使得其中抑制引物或编码链其中之一形成环圈(loop)，而得到较不稳定的杂交体(见第1图)。或者是，当插入/删除之核苷酸位于所选区域的前端或尾端时，抑制引物与编码链无法对齐，因而在该端点处形成一分岔(fork)，而得到较不稳定的杂交体(图中未绘示)。

顾名思义，抑制引物可以阻止此引物在PCR过程中延伸。要达到此一目的，可在一般引物的3’端加上非核苷阻断物(non-nucleosidic blocker)，如磷酸基或磷酸酯。譬如由3’-间隔物(3’-Spacer)C3胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(C3cytosine-phosphate-guanine，简称C3-CPG)形成的3’-丙基磷酸酯(3’-propylphosphate)就是一种很有效的3’端非核苷阻断物。在3’位置上形成反向的3’-3’连接也能够有效地防止聚合酶将核苷酸延伸，因为在其3’位置上没有可用的羟基可供起始合成反应。另一种避免聚合酶在3’端进行延伸的方法是利用核苷阻断物(nucleosidic blocker)，如2’,3’-二脱氧核苷(如2’,3’-ddC-CPG)或3’脱氧核苷(如3’-dA-CPG、3’-dC-CPG、3’-dG-CPG或3’-dT-CPG)。当然，亦可采用可用以修饰抑制引物3’端的其它等效技术，而这些其它技术亦属于本发明之范围。

根据本发明的原理与精神，抑制引物应涵盖整个选定区域以及至少一个额外的核苷酸残基。因而，根据某些实施方式，本发明的抑制引物之长度为至少10-100个核苷酸。本发明所属技术领域中具有通常知识者当可理解，抑制引物的确切长度取决于欲探究的选定区域之长度以及该引物适用的反应条件，如退火温度与离子强度(ionic strength)。举例来说，第1图所示的抑制引物长度为33个核苷酸残基。

根据本发明某些实施方式，抑制引物的解链温度大于等于约50℃。在非必要且较佳的情形中，抑制引物的解链温度约为55-85℃；且更加为约65-75℃。具体来说，抑制引物的解链温度可为约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85℃。SEQ ID NO2的抑制引物之解链温度为约69℃。

正向引物

本发明的正向引物经特殊设计，而使得其3’端和抑制引物的5’端重叠。如此一来，在杂交环境下，抑制引物可和正向引物竞争重叠部分的一或多核苷酸残基，以便与模板链的互补序列(即，编码链)杂交。具体来说，正向引物的序列与位于选定区域上游的多个核苷酸残基相同，且该正向引物3’端的至少最后一个核苷酸残基与该抑制引物5’端的至少第一个核苷酸残基相同。非必要地，正向引物3’端的至少5、10或15个连续核苷酸残基和抑制引物5’端的至少5、10或15个连续核苷酸残基相同。第1图中例示的正向引物序列为AATTCCCGTCGCTATCAA(SEQ IDNO：3)，此序列最后9个连续残基(即CGCTATCAA)与抑制引物的前9个连续残基相同。

根据某些实施方式，正向引物的长度为10-30个核苷酸。根据本发明的原理与精神，正向引物的确切长度取决于其和抑制引物的重叠核苷酸残基数目以及该引物适用的反应条件，如退火温度与离子强度。举例来说，第1图所示的正向引物长度为18个核苷酸残基。

根据本发明某些实施方式，正向引物的解链温度大于等于约50℃。在非必要且较佳的情形中，正向引物的解链温度约为50-70℃；且更加为约55-60℃。具体来说，正向引物的解链温度可为约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70℃。SEQ ID NO3的正向引物之解链温度为约55℃。

当注意到，在非必要的实施方式中，抑制引物的解链温度可和正向引物的解链温度不同。如此一来，可将含有这两种引物的PCR反应混合物分别置于不同的退火温度下，而分别控制这两种引物和编码链之杂交。一般来说，抑制引物解链温度与正向引物的解链温度差为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15℃。以第1图所示的引物对为例，两种引物的解链温度差约为14℃。

检测插入/缺失变异的方法

在详细介绍了此处提出的引物设计方案以及例示的引物组之后，接着说明利用此种引物组的PCR式检测方法。

根据本发明一实施方式，将带有目标基因的样本与此处提出的引物组混合，以得到可用于后续PCR处理的混合物。所述的目标基因是双链DNA，具有模板链以及与模板链互补之模板链。

当可理解，适用于本方法的引物组乃是根据上文所述的方案而设计，且因而在此省略了关于抑制引物与正向引物的详细说明，以求简洁与明了。

根据本发明多种实施方式，在PCR混合物中，抑制引物与正向引物的摩尔比为约1：1至10：1；且较佳为约3：1至10：1。举例来说，两者的摩尔比可为约1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9或1：10。在一实验例中，反应混合物中含有约0.2μM的正向引物与约1μM的抑制引物。

一般来说，模板链(以及编码链)的选定区域内可能带有或不带有一或多插入/缺失变异。根据本发明的原理与精神，本方法适用以检测已知或未知的变体序列。

在某些情形中，欲检测的生物样本中可能同时含有野生型序列与突变序列。譬如，在取自生物体组织的样本中，可能含有某些突变细胞。在此种情形中，突变序列(相较于野生型序列)可能仅占了一小部分。由于本方法在检测插入/缺失突变时展现了极高的灵敏度，因此样本中突变序列含量稀少不会影响检测结果。在一实施例中，当样本同时含有野生型与突变序列时，即便突变序列的量仅有野生型序列的万分之一，本方法都能够检测到突变序列的存在。此外，根据本发明某些实施例，只需10-1000份的目标基因即足以进行检测。

本发明所属技术领域中具有通常知识者当可理解，反应混合物中可更包含其它扩增反应试剂。这些用于PCR的扩增反应试剂可包含，但不限于：缓冲剂(buffers)；反应试剂(reagents)；具有反转录酶(reverse transcriptase)活性、聚合酶(polymerase)和/或外切酶(exonuclease)活性的酵素；酵素辅助因子(enzyme cofactors)，如镁或锰；盐类；以及脱氧三磷酸核苷(deoxyribonucleotide triphosphates，dNTPs)，如脱氧三磷酸腺苷(deoxyadenosine triphosphate，dATP)、脱氧三磷酸鸟苷(deoxyguanosinetriphosphate，dGTP)、脱氧三磷酸胞苷(deoxycytidine triphosphate，dCTP)、脱氧三磷酸胸苷(deoxythymidine triphosphate，dTTP)及脱氧三磷酸尿苷(deoxyuridine triphosphate，dUTP)。本领域技术人员可依据所用的PCR方法来选择适当的扩增反应试剂。

之后对反应混合物进行PCR处理；此处理依序包含变性步骤、退火步骤与延伸步骤；兹分述如下。

在变性步骤中，将由模板链与编码链形成的双链DNA(DNA duplex)变性(即，熔化)。双链DNA确切的变性过程取决于其大小、序列与分子组成(主要是G-C键结相对于A-T键结的比例或G-C％)。在适当的温度下，双链DNA通常会在一秒内就变性，上述温度约介于80℃(一般为G-C％较低且较小的分子)至约95℃(一般为较大的分子，如人类基因组DNA)之间；在某些情形中，变性温度可能更低。

在变性步骤之后，将反应混合物冷却至退火温度，而使得抑制引物和正向引物能够彼此竞争与模板链退火之机会。本领域具有通常知识者当可理解，互相杂交的两序列不必然需要完全互补。因而，抑制引物不但可和带有参考序列的编码链杂交，也会和选定区域内具有插入/缺失变异的编码链杂交。然而，如上文所述，相较于由抑制引物和参考序列编码链所形成的杂交体，由抑制引物和变体序列编码链所形成杂交体较不稳定；因此抑制引物和变体序列编码链所形成的杂交体较易变性，因而使得正向引物有机会退火至此种变异的编码链，并形成相对较稳定的杂交体。因而，在后续的延伸步骤中，能够扩增选定区域中带有变异核苷的目标基因；而带有和抑制引物退火的参考序列之目标基因链则不会扩增。

在非必要的实施方式中，退火步骤包含两个阶段。在第一退火阶段中，所用的第一退火低于(或接近)抑制引物解链温度且高于正向引物解链温度。在这种情形下，只有抑制引物可和编码链杂交，而正向引物则不会和编码链杂交。其后，在第二退火阶段中，进一步将混合物冷却至第二退火温度，此温度低于(或接近)正向引物解链温度，因而使得正向引物可和编码链杂交。然而，在设计时，使得正向引物的3’端和抑制引物的5’端重叠。因而，当抑制引物已经在第一退火阶段中和编码链形成较稳定的杂交体时，在正向引物的3’端会出现分岔结构(参见第1图)，而使得所形成之正向引物与编码链的杂交体相对较不稳定。换句话说，对于选定区域内不具有插入/缺失突变的参考模板链，抑制引物会稳定地退火至参考编码链，且因而可抑制核苷酸在后续步骤中延伸。另一方面，当选定区域内存有变异的核苷酸时，由抑制引物和此变异编码链所形成的杂交体相对较不稳定，而容易变性，因而使得正向引物有机会退火至此种变异的编码链并形成相对稳定的杂交体。因而，在后续延伸步骤中能够扩增选定区域内带有变异核苷的目标基因；而带有和抑制引物退火的参考序列之目标基因则不会扩增。

在退火步骤之后，将温度调整到延伸温度，以使得核苷酸能够延伸。理想的延伸温度为本领域所熟知；一般来说，延伸温度约为70-80℃。然而，在考虑相关因素(如所用的聚合酶种类)后，亦可采用其它温度。

之后使反应混合物在变性、退火与延伸等步骤间循环，以持续扩增目标基因(特别是，选定区域中带有变异核苷的目标基因)。此处提出的PCR处理可运用于任何已知的PCR热循环装置(thermocycler)及其均等物。此外，此处提出的PCR式方法兼容于大多数的既有PCR处理。因而，能够将本方法运用于各种PCR技术，包括但不限于非对称聚合酶链式反应(asymmetric PCR)、热启动聚合酶链式反应(hot start PCR)、迷你引物聚合酶链式反应(miniprimer PCR)、多引物聚合酶链式反应(multiplex-PCR)、嵌套式聚合酶链式反应(nested PCR)，实时定量PCR聚合酶链式反应(RT-PCR)、反转录聚合酶链式反应(reverse transcriptionPCR)、固相聚合酶链式反应(solid phase PCR)与递减聚合酶链式反应(touchdownPCR)。

本方法亦包含PCR产物之检测。根据本发明实施方式，存有PCR产物表示目标基因之选定区域内有一或多插入/缺失变异；而没有PCR产物表示目标基因之选定区域内没有插入/缺失变异。

相关领域已有多种技术可用以决定PCR产物存在与否；这些技术包括但不限于：电泳(gel electrophoresis)、荧光共振能量转移(fluorescence resonantenergy transfer)以及标记探针杂交(hybridization to a labeled probe)。所述的标记探针可带有至少一种以下标记：生物素(biotin)、荧光基团(fluorescent moiety)、抗原(antigen)分子量标签(molecular weight tag)以及探针解链温度修饰基(modifier of probe Tm)。此外，亦可在延伸步骤中加入一标记(如，荧光或放射性标记)，以标记PCR产物。所述的检测步骤包含测量荧光强度(fluorescence)、分子量(mass)、电量(charge)和/或化学荧光强度(chemiluminescence)。可在PCR过程中进行此一检测步骤(如RT-PCR)，或可在PCR过程完成后进行检测。

下文举出多种实施例来阐明本发明之部分方面，以使本发明所属技术领域中具有通常知识者能藉以实践本发明。因此不应将这些实施例视为对本发明范围之限制。本发明所属技术领域中具有通常知识者基于此处提的说明，当可在不需过度推衍的情形下运用本发明。此处提及的所有文献，皆视为已完全引用而成为本说明书的一部份。

实施例I

检测EGFR外显子19的插入/缺失突变

由马偕医院(台湾)取得总计134个临床样本，样本采集均经过患者的告知后同意。处理样本以分离其中的核酸分子。在初期实验中，进行Unidel-PCR扩增所用的试剂如下：PCR 2X Master Mix缓冲液(JMR)20μl、0.2μM正向引物(SEQID NO：3)、2μM抑制引物(SEQ ID NO：2)、0.2μM反向引物(AGCAGCTGCCAGACATGAGA；SEQ ID NO：19)、与分离的DNA(野生型或突变株)1μl(105份)或模板DNA 100ng，加水使最终体积为20μl。利用ABI 9700 PCR设备进行PCR，反应中所用的循环条件为：变性温度95℃持续10分钟；之后温度循环为94℃(60秒)、60℃(60秒)与72℃(60秒)，进行45个循环；最后在72℃(10分钟)下进行延伸。

在PCR完成后，自PCR槽中取出一样本，并在洋菜胶上进行电泳分离。样本与对照标记皆以溴化乙锭(ethidium bromide，EtBr)染色并以荧光检测显影，同时以电荷耦合组件相机撷取影像。将洋菜胶上的产物带切下，并对其中所含的核酸测序。测序结果显示利用此处提出的Unidel-PCR方法可以检测到多种EGFR外显子19的变体；表一摘要整理了这些突变株的突变序列、突变位置以及受突变影响的氨基酸残基。野生型EGFR外显子19的序列包含SEQ ID NO：10所示的序列(即EGFR外显子19的第2214至2261个核苷酸)。

表一

交互比较测序结果以及Unidel-PCR的检测结果，可发现在含有插入/缺失突变的34个样本中，本方法皆能正向检测到其中含有插入/缺失突变(表二)。

表二

实施例II

检测灵敏度

选用带有SEQ ID NO：12(E746-A750del)的突变株DNA片段之样本来探究Unidel-PCR的灵敏度。取含有10⁷份DNA片段的样本分别稀释成不同浓度的野生型DNA片段与突变株DNA片段样本，并依预定的比例混合。之后利用实验例I中所述的材料与方法来进行Unidel-PCR扩增，并检测PCR产物，结果如第2图所示。

在本实验中，反应混合物中野生型DNA片段与突变株DNA片段的比例为100：1或10：1；而第2图的照片显示在反应过程中野生型DNA片段并未扩增(负对照组，N)，而突变DNA片段则被扩增(正对照组，P)。

实施例III

例示引物组

根据此处所提出的引物设计方案，可设计出适用于Unidel-PCR检测方法的各种引物组，此处提出两种例示性质的引物组。

ATP13A2基因负责编码人类ATP酶13A2；ATP13A2基因的外显子16的序列如下：

ACGGGCACCCTCACTGAGGACGGCTTAGACGTGATGGGGGTGGTGCCCCT

GAAGGGGCAGGCATTCCTGCCCCTGGTGCCGCCTGCCTG

GGGGCCCCTGCTCCGAGCACTGGCCACCTGCCATGCCCTCAGCCGGCTCC

AGGACACCCCCGTGGGCGACCCCATGGACTTGAAGATGGTGGAGTCTACTGGCTGGGTGAGGAGGCCAAGCAGGTCA(SEQ ID NO:17)

当欲探究在核苷酸78-88的选定区域(CCCAGAGCCTC)内是否含有插入/缺失突变时，一例示抑制引物可具有以下序列：CTGGTCCCAGAGCCTCGC(SEQ ID NO：5)，其中以粗体与斜体标记与所述选定区域相同的核苷酸残基；而一正向引物可具有以下序列：GCATTCCTGCCCCTGGT(SEQ ID NO：6)，其中正向引物的最后5个核苷酸残基与抑制引物的前5个核苷酸残基序列相同。所用的反向引物序列可为：GTGAGGAGGCCAAGCAGGTCA(SEQ ID NO：20)。

另外，假设一人工参考序列具有以下的模板链：

GACCCAAGAGGCTAGCGTAACCCC

AGTAGTCTAAGAGGTGAGGTATACCGTTAGTCAG

CCGTATTGAGACTGTGCGTCGTCTAAGAGGGTGCAGTGGAGTAGATTCAG

TCGATCTAGCGAAGAGAACCGGCATGATCCGATACTATACATCTACGACA

ATTCCATTGCTTTGTGAGAGCCTTTACCTTTACTCATGGACCCGTGCTGC

TGGTAGCCGCTTATACATATTCATGGGTTCTCCCGGATTCAAAAACAGAGGCAGG(SEQ ID NO：18)

当欲探究在核苷酸25-116的选定区域(以粗体与斜体标记者)内是否含有插入/缺失变异时，一例示抑制引物可具有以下序列：GTAACCCCTTGCGGCGGGTCTTACTCACCTTTTAACTTAAAGAGAACTACGGGTTCACGATGGGGTCAGGATAACAAAAATCTTTGATCTAGAATGCACT(SEQ ID NO：8)，其中以粗体与斜体标记与所述选定区域相同的核苷酸残基；而一正向引物可具有以下序列：AGGCTAGCGTAACCCCT(SEQ ID NO：9)，其中正向引物的最后9个核苷酸残基与抑制引物的前9个核苷酸残基序列相同。所用的反向引物序列可为：TGTATAAGCGGCTACCAGCAG(SEQ ID NO：21)。

虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明之原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明之保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。

Claims (21)

1.一种基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法，用以检测一样本中一目标基因之一选定区域内相对于一参考序列是否有插入或缺失变异，包含以下步骤：

(a)形成一混合物，其包含该样本与一引物组，其中该样本中的该目标基因包含一模板链，以及一编码链其与该模板链互补，且该引物组包含：

(i)一抑制引物，其包含一序列，此序列与该模板链之该选定区域的序列以及紧接于该模板链之该选定区域之前的至少一核苷酸残基相同，其中该抑制引物之3’端经修饰以防止该抑制引物于该PCR过程中延伸；以及

(ii)一正向引物，其包含一序列，此序列与位于该模板链之该选定区域上游之多个核苷酸残基相同，其中该正向引物之3’端的至少最后一个核苷酸残基与该抑制引物之5’端的至少第一个核苷酸残基相同；

(b)对该混合物依序进行以下步骤：一变性步骤、一退火步骤、及一延伸步骤，其中于该退火步骤中，该正向引物与该抑制引物竞争以退火至该编码链；以及

(c)决定经过步骤(a)与(b)后是否得到一PCR产物，其中该PCR产物之存在表示该样本中该目标基因之该选定区域内存有该插入或缺失变异，且该PCR产物的不存在表示该样本中该目标基因之该选定区域内不存有该插入或缺失变异。

2.如权利要求1所述之方法，其中于该混合物中，该抑制引物与该正向引物所用的摩尔比为约1：1至10：1。

3.如权利要求1所述之方法，其中该正向引物之解链温度与该抑制引物之解链温度不同。

4.如权利要求3所述之方法，其中该正向引物与该抑制引物之解链温度分别大于等于50℃。

5.如权利要求1所述之方法，其中该抑制引物的长度为10-100个核苷酸。

6.如权利要求1所述之方法，其中该正向引物的长度为10-30个核苷酸。

7.如权利要求1所述之方法，其中该正向引物之3’端的至少最后5到10个核苷酸残基与该抑制引物之5’端的至少前5-10个核苷酸残基相同。

8.如权利要求1所述之方法，其中该抑制引物之3’端经过一磷酸基、一磷酸酯、一反向3’-3’连接、一2’,3’-二脱氧核苷或一3’脱氧核苷之修饰。

9.如权利要求1所述之方法，其中：

该选定区域之该参考序列为TAAGAGAAGC(SEQ ID NO：1)；

该抑制引物包含一CGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCC序列(SEQ ID NO：2)；以及

该正向引物包含一AATTCCCGTCGCTATCAA序列(SEQ ID NO：3)。

10.如权利要求1所述之方法，其中：

该选定区域之该参考序列为CCCAGAGCCTC(SEQ ID NO：4)；

该抑制引物包含一CTGGTCCCAGAGCCTCGC序列(SEQ ID NO：5)；以及

该正向引物包含一GCATTCCTGCCCCTGGT序列(SEQ ID NO：6)。

11.如权利要求1所述之方法，其中：

该选定区域之该参考序列为TGCGGCGGGTCTTACTCACCTTTTAACTTAAAGAGAACTACGGGTTCACGATGGGGTCAGGATAACAAAAATCTTTGATCTAGAATGCACT(SEQ ID NO：7)；

该抑制引物包含一GTAACCCCTTGCGGCGGGTCTTACTCACCTTTTAACTTAAAGAGAACTACGGGTTCACGATGGGGTCAGGATAACAAAAATCTTTGATCTAGAATGCACT序列(SEQ ID NO：8)；以及

该正向引物包含一AGGCTAGCGTAACCCCT序列(SEQ ID NO：9)。

12.一种引物组，用以经过PCR来检测一目标基因之一选定区域内相对于一参考序列是否有插入或缺失变异，该目标基因具有一模板链以及与该模板链互补的一编码链，该引物组包含：

(i)一抑制引物，其包含一序列，此序列与该模板链之该选定区域的该参考序列以及紧接于该模板链之该选定区域之前的至少一核苷酸残基相同，其中该抑制引物之3’端经修饰以防止该抑制引物于该PCR过程中延伸；以及

(ii)一正向引物，其包含一序列，此序列与位于该模板链之该选定区域上游之多个核苷酸残基相同，其中该正向引物之3’端的至少最后一个核苷酸残基与该抑制引物之5’端的至少第一个核苷酸残基相同。

13.如权利要求12所述之引物组，其中该抑制引物之3’端经过一磷酸基、一磷酸酯、一反向3’-3’连接、一2’,3’-二脱氧核苷或一3’脱氧核苷之修饰。

14.如权利要求12所述之引物组，其中该正向引物之解链温度与该抑制引物之解链温度不同。

15.如权利要求14所述之引物组，其中该正向引物与该抑制引物之解链温度分别大于等于50℃。

16.如权利要求12所述之引物组，其中该抑制引物的长度为10-100个核苷酸。

17.如权利要求12所述之引物组，其中该正向引物的长度为10-30个核苷酸。

18.如权利要求12所述之引物组，其中该正向引物之3’端的至少最后5到10个核苷酸残基与该抑制引物之5’端的至少前5-10个核苷酸残基相同。

19.如权利要求12所述之引物组，其中：

该选定区域之该参考序列为TAAGAGAAGC(SEQ ID NO：1)；

该抑制引物包含一CGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCC序列(SEQ ID NO：2)；以及

该正向引物包含一AATTCCCGTCGCTATCAA序列(SEQ ID NO：3)。

20.如权利要求12所述之引物组，其中：

该选定区域之该参考序列为CCCAGAGCCTC(SEQ ID NO：4)；

该抑制引物包含一CTGGTCCCAGAGCCTCGC序列(SEQ ID NO：5)；以及

该正向引物包含一GCATTCCTGCCCCTGGT序列(SEQ ID NO：6)。

21.如权利要求12所述之引物组，其中：

该选定区域之该参考序列为TGCGGCGGGTCTTACTCACCTTTTAACTTAAAGAGAACTACGGGTTCACGATGGGGTCAGGATAACAAAAATCTTTGATCTAGAATGCACT(SEQ ID NO：7)；

该抑制引物包含一GTAACCCCTTGCGGCGGGTCTTACTCACCTTTTAACTTAAAGAGAACTACGGGTTCACGATGGGGTCAGGATAACAAAAATCTTTGATCTAGAATGCACT序列(SEQ ID NO：8)；以及

该正向引物包含一AGGCTAGCGTAACCCCT序列(SEQ ID NO：9)。