CN101861402B

CN101861402B - 引物序列内包含无碱基部分的、用于pcr扩增的引物

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Publication number: CN101861402B
Application number: CN200880116493.8A
Authority: CN
Inventors: 金铉培; 金成烈; 吉埈模; 朴海埻; 朴翰悟
Original assignee: Bioneer Corp
Current assignee: Bioneer Corp
Priority date: 2007-10-05
Filing date: 2008-10-02
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2028-10-02
Also published as: EP2195464B1; KR101110013B1; JP2010539971A; JP5518719B2; KR20090035298A; EP2195464A2; EP2195464A4; US20110008845A1; US8513399B2; WO2009045067A3; CN101861402A; WO2009045067A2

Abstract

本发明涉及引物序列内包含无碱基部分的、用于PCR扩增的引物，还涉及使用该引物进行PCR扩增的方法。更确切地说，本发明涉及能够扩增不同模板、并且具有与模板DNA的突变位点或多态性位点互补的无碱基部分的引物；本发明还涉及一种用于PCR扩增的方法，所述方法包括下述步骤：将包含所述引物的用于PCR扩增的组合物与核酸模板混合；以及用所述混合物进行PCR。本发明所述用于PCR扩增的引物在其核苷酸序列中包含无特定编码信息的无碱基部分，从而使其能同时扩增具有突变位点的不同模板。

Description

引物序列内包含无碱基部分的、用于PCR扩增的引物

技术领域

本发明涉及引物以及使用该引物进行PCR扩增的方法。更确切地说，本发明涉及能够扩增不同模板、并且具有与模板DNA的突变位点或多态性位点互补的无碱基部分(abasicparts)的引物，本发明还涉及使用该引物进行PCR扩增的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(以下称为“PCR”)是使用最为广泛的核酸扩增方法，所述方法由重复的循环组成，所述循环包括：双链DNA的变性；将寡聚核苷酸引物退火至DNA模板；以及通过DNA聚合酶将引物进行延伸(Mullis等人，美国专利No.4,683,195、No.4,683,202和No.4,800,159；Saiki等人，1985)。将用于PCR的寡聚核苷酸引物设计成使其退火至DNA的相反链(oppositestrand)，将由DNA聚合酶形成的引物延伸产物作为另一引物的模板。PCR扩增使得DNA序列的数目以指数方式增加，并且所扩增的DNA序列长度可通过寡聚核苷酸引物的5′端决定。

核酸扩增的成功，特别是PCR扩增的成功，取决于引物的靶特异性退火。因此，优化分子间的相互作用非常重要。其取决于退火温度，所述退火温度使得引物退火只进入其完全互补体，或进入在核苷酸序列中有一处或多处错配的序列。通常，随着退火温度升高，引物退火至与所述引物完全匹配的特异性模板的机率也增加，这表明只扩增靶序列的机率在增加。当退火温度较低时，会产生模板和引物之间的错配容许量(tolerance)，从而导致非靶序列扩增的增加。因此，通过调节退火温度，可以控制模板和引物之间的配对特异性。举例来说，如果只用一种引物进行扩增的对照组生成了不同的PCR产物，这表明该单个引物退火进入模板的一个或多个区域。在这种情况下，优选升高退火温度。考虑到升高退火温度对于引物的退火特异性的影响，可通过温度来调节引物的退火，并且需要开发退火调节引物系统，所述系统有利于改进引物的退火特异性，而不考虑引物的设计。

对于引物的退火特异性，不仅要考虑退火温度，还应考虑其他的引物参数，例如引物长度、GC含量以及PCR产物的长度。当使用满足所述参数的引物时，由于克服了背景(background)问题以及引物生成非特异性产物的问题，引物的退火具有特异性，靶DNA扩增的退火特异性得以改进。适当设计的引物不仅解决了非特异性退火问题和背景问题，还促使从RNA-PCR的基因组模板中区分出cDNA。

许多情况下，引物序列不必与模板序列完全互补。要求与模板完全匹配的区域为3′端，因为这一区域正是通过DNA聚合酶进行延伸的区域。也就是说，所述区域对于确保退火至靶序列的特异性最为重要。引物的5′端对于退火至靶序列的特异性而言是次要的，为了传递另外的非互补序列(例如限制酶位点和启动子序列)，可改变引物的5′端。

在体外诊断中，分子诊断测试或核酸测试是发展最为迅速的领域，其在世界市场中显示出大约20％的年增长率。在2003年，分子诊断测试占体外诊断市场总额的8％，达到3万亿韩元的规模。但在2008年，其占到13％，并显示出至少5万亿韩元的销售额，表明其年增长率为19％。分子诊断测试是一种对致病性病毒、细菌和真菌进行检验的PCR。更准确地说，其通过使用寡聚核苷酸(引物、探针)来检验病原体造成的感染，所述寡聚核苷酸与特异性病原体基因的核苷酸序列互补。根据这一通过PCR对病原体感染进行诊断的方法，将靶模板基因特异性引物用于只对所述靶基因进行筛选，从而判断其是阳性还是阴性，这比使用ELISA(酶联免疫吸附分析)进行的抗原-抗体分析在灵敏度和经济效率方面更有优势。

多重PCR是另外一种PCR，其便于使用一个或多个引物组从反应物同时扩增一个或多个靶序列。由于这一方法在1988年首次提出(Chamberlain等人，DeletionScreeningoftheDuchennemusculardystrophylocusviamultiplexDNAAmplification，NucleicAcidsRes.，16，11141-11156，1988)，其已经广泛地应用于DNA分析的各种领域，所述分析包括基因缺失分析(匿名，DiagnosisofDuchenneandBeckermusculardystrophiesbypolymerasechainreaction，Amulticenterstudy，JAMA267，2609-2615，1992；Henegariu等人，RapidscreeningoftheYchromosomeinidiopathicsterilemen，diagnosticfordeletionsinAZF，ageneticYfactorexpressedduringspermatogenesis，Andrologia，26，97-106，1994)、突变和多态性分析(Shuber等人，Efficient12-mutationtestingintheCFTRgene：ageneralmodelforcomplexmutationanalysis，Hum.Mol.Geenet.，2，153-158，1993；Mutirangura等人，MultiplexPCRofthreedinucleotiderepeatsinthePrader-Willi/Angelmancriticalregion(15q11-q13)：moleculardiagnosisandmechanismofuniparentaldisomy，Hum.Mol.Genet.，2，143-151，1993)、定量分析(Zimmermann等人，QuantitativemultiplexcompetitivePCRofHIV-1DNAinasinglereactiontube，BioTechniques21，480-484，1996)、以及RNA检测(Zou等人，IdentificationofnewinfluenzaBvirusvariantsbymultiplexreversetranscription-PCRandtheheteroduplexmobilityassay，J.Clin.Microbiol.，36，1544-1548，1998)。特别地，在诊断传染性疾病方面，这一方法对于鉴定病毒、细菌、真菌和/或寄生虫很有价值且十分重要。

然而，多重PCR经常由于扩增中涉及的人为因素而产生复杂的结果，造成错误。因此，所得到的结果包括由反应失败造成的“假阴性”以及因假产物的扩增而产生的“假阳性”。产生假阳性结果的原因是引物退火至完全不同的序列，即使该序列与最初识别的序列有关。在多重PCR中，必须对引物的杂交动力学进行设计，使其类似于另一种不同引物的杂交动力学，所述另一种引物也用于同样的多重反应物。在一定程度上可对退火温度和引物浓度进行计算，而其他用于多重反应的一般条件则凭经验进行确定。随着引物组数目的增加，非特异性引发(priming)的机率也增加。因此，无论什么时候加入每个引物组，都需要改变条件。此外，在多重PCR中，由与反应物竞争而产生的人为因素(例如引物耗尽)会增加，并且随着循环的重复，不同等地扩增的产物之间的产率差异会变大。因此，多重PCR反应条件的优化会花费大量时间和劳动。每种多重PCR需要各不相同的唯一的反应条件，从而使得新型诊断方法的开发需要较高的成本。

单核苷酸多态性(以下称为“SNP”)是指在染色体的核苷酸序列中，根据种族、年龄或性别，核苷酸多态性中一个不同的核苷酸对(nucleotidepair)会引起个体差异，这大多在DNA核苷酸序列多态性中被发现。通常，在人类基因中，每1,000个核苷酸会有一个发生突变。即使在患有相同疾病的患者中也观察到了个体差异，其原因似乎是SNP的差异。目前为止开发出的SNP分析方法例如有SSCP法(单链构象多态性法)、PCR-RELP法(限制性片断长度多态性法)、等位基因特异性PCR法(AS-PCR法)、使用GC尾部引物的Tm-shift基因分型法、DASH法(动态等位基因特异性杂交法)、荧光偏振法、Taqman法(5′-外切核酸酶分析法)、分子信标法(MolecularBeacons)、OLA法(寡聚核苷酸连接酶分析法)、焦磷酸测序法、单核苷酸延伸法、以及MALDI-TOF法(基质辅助激光解析/电离-飞行时间法)等。这些方法使用模板特异性寡聚核苷酸或荧光标记的探针寡聚核苷酸进行SNP分析。

当靶基因以含有突变基因座的多个多态性基因形式存在于基因序列中时，需要根据多态性的种类将引物设计为具有所对应的突变基因座的互补序列。为此，必须对所有基因特异性多态性序列进行鉴定。如果没有鉴定出多态性基因，则不能完成对全部靶基因的检测。因此，在特异性核苷酸序列包含有限的突变或多态性的情况下，需要一种使用一对引物就能简便地扩增所述突变基因座的方法。

发明内容

本发明的目的是克服常规PCR方法存在的问题。因此，本发明的目的是：提供用于PCR扩增的引物，其中靶基因的不同多态性位点被无碱基部分取代；以及提供便于共同扩增不同的核酸模板的PCR方法，所述模板在其核苷酸序列中具有突变基因座或多态性基因座。

具体实施方式

为实现上述目的，本发明提供了用于PCR扩增的引物，所述引物在其引物序列内包含无碱基部分。

在本发明中，“无碱基部分”表示不包含具体编码信息的核苷。由于其不含有编码信息，相应模板DNA的核苷酸可为任意的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。本文所述的无碱基部分优选位于对应于引物序列的突变位点和/或多态性位点的区域中。本发明所述的引物为包含无碱基部分的、用于PCR扩增的引物，所述无碱基部分选自于由dSpacer(5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′2′-二脱氧核糖-3′-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、1′-甲氧基-dSpacer(5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′-甲氧基-2′-二脱氧核糖-3′-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、PCSpacerPhosphoamidite([4-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)丁酰胺基甲基)-1-(2-硝基苯基)-乙基]-2-氰乙基-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺)、rSpacerCEPhosphoamidite(5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′-脱氧核糖-2′-O-三异丙基甲硅氧基甲基-3′-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、SpacerC12CEPhosphoamidite(12-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)-十二烷基-1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、SpacerPhosphoamidite18(18-O-二甲氧基三苯甲基六甘醇，1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、SpacerPhosphoamidite9(9-O-二甲氧基三苯甲基-三甘醇，1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)以及SpacerPhosphoamiditeC3(3-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)所组成的组，但不总限于此。即使一种引物是由另一种结构变化很小的亚磷酰胺合成而得，只要其在所述引物序列内包含相同的无碱基部分，那么该引物也可包含于本发明的标准中。

在所述引物序列插入无碱基部分便于用一个引物组对一个基因中具有不同多态性位点的模板进行扩增。对引物中无碱基部分的数目没有限制，但优选在3′端、内部序列(internalsequence)和5′端有1-10个无碱基部分，并且更优选在3′端、内部序列(internalsequence)和5′端中有1-3个无碱基部分。如果无碱基部分的数目大于10，引物的Tm会显著变低，从而造成退火至模板DNA序列失败，这意味着PCR反应失败。倘若如此，则无法实现本发明的同等地扩增具有突变位点的不同模板的目的。

本发明还提供一种用于PCR扩增的组合物，所述组合物包含反应缓冲液、4种不同的dNTP、DNA聚合酶、探针以及所述用于PCR扩增的引物。

可适当改进常规的PCR反应缓冲液(包含Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、MgCl₂等)用于制备本发明所述反应缓冲液。所述4种不同的dNTP为dATP、dTTP、dGTP和dCTP。DNA聚合酶不限于具体的酶。在本发明优选的实施方式中，使用TaqDNA聚合酶、KlenTaqDNA聚合酶或PfuDNA聚合酶进行PCR。本发明所述用于PCR扩增的引物的浓度为1-50pmol/20μlPCR反应混合物。所述引物的浓度可由本领域技术人员确定。

为了方便实验、防止PCR反应产物造成的污染、使DNA聚合酶和dNTP保持稳定以及改进反应性，本发明的用于PCR扩增的组合物可另外包含染料和/或稳定剂。所述染料选自于由溴酚蓝、二甲苯青、溴甲酚红和甲酚红所组成的组，但不总限于此。所述稳定剂可选自于由明胶、牛血清白蛋白、Thesit、PEG-8000和多元醇所组成的组，但不总限于此。所述组合物中染料的含量为0.0001-0.01wt％，优选0.001-0.005wt％，更优选0.001-0.003wt％。所述组合物中稳定剂的含量为2-1,000mM，优选100-500mM，更优选100-300mM。

本发明提供了一种用于PCR扩增的方法，所述方法使用在引物序列内包含无碱基部分的所述PCR引物。

所述方法包括：将用于PCR扩增的组合物与模板DNA混合的步骤，所述组合物含有在引物序列内包含无碱基部分的所述引物；以及用所述混合物进行PCR扩增的步骤。

本发明所述用于PCR扩增的方法用于共同扩增不同的核酸模板，所述模板在其核苷酸序列中具有突变位点和/或多态性位点，但不总限于此。本文所述的用于PCR扩增的引物均可含有本发明的无碱基部分。或者，所述引物之一可含有无碱基部分，而另一引物可为不含有无碱基部分的正常引物。

PCR通过重复变性、退火和延伸的循环而进行，这一PCR扩增机理是本领域技术人员所公知的。变性、退火和延伸分别优选在85-95℃进行1-60秒、在40-70℃进行1-60秒、在50-75℃进行1-60秒。可适当地调节温度范围和反应时间。在本发明优选的实施方式中，当引物在其序列中含有一个无碱基取代时，熔解温度(以下称为“Tm”)降低大约8℃，特别地，当引物在其3′端含有一个无碱基取代时，Tm降低大约1.5℃。为补偿由无碱基部分所降低的Tm，向所述引物的两端均加入与所述模板互补的核苷酸，从而可调节PCR反应性。当向3′端加入互补核苷酸时，每加入2个核苷酸，Tm增加大约0.5℃。当引物在内部序列中含有1个、2个或3个无碱基部分取代，并且同时向3′端加入5个互补核苷酸时，Tm分别降低约4℃、10℃和18℃。Tm可随DNA聚合酶种类、引物长度、引物核苷酸以及反应条件发生变化。当引物被设计成在其序列中具有突变位点时，温度等效性(temperatureequivalence)条件可通过Tm调控来确定。可通过导入无碱基部分并延伸引物的长度来控制PCR的特异性。因此，通过只使用一对引物，即可共同扩增序列中具有突变位点的不同模板。

在本发明的优选实施方式(实施例1和实施例2)中，使用不同的DNA聚合酶，并使用人基因组DNA作为模板，用具有无碱基取代的引物进行PCR。结果，当使用TaqDNA聚合酶并且有1个核苷酸被取代时，Tm降低了大约3-6℃。当使用PfuDNA聚合酶并且有1个核苷酸被取代时，Tm降低了大约6℃。当使用KlenTaqDNA聚合酶并且有1个核苷酸被取代时，尽管没有影响PCR反应，Tm大约降低了1-2℃。因此证实，包含无碱基部分的引物可与不同种类的DNA聚合酶一起使用。适当的以及最佳的无碱基引物条件可根据每种DNA聚合酶进行测定。因此，考虑到测定条件，可建立可确保温度等效性的、具有突变位点的引物构建条件。

在本发明优选的实施方式(实施例4)中，与对照引物组相比，当在引物3′端有1个核苷酸被无碱基部分取代时，Tm降低了大约1.5℃。当在内部序列中有1个核苷酸被取代时，Tm降低大约8℃。与此同时，与对照引物组相比，当在内部序列中有1个核苷酸被取代并且向3′端加入5个与模板互补的核苷酸时，Tm降低了大约4℃。当在内部序列中有2个核苷酸被取代并且向3′端加入5个与模板互补的核苷酸时，Tm降低了大约10℃。当在内部序列中有3个核苷酸被取代并且向3′端加入5个与模板互补的核苷酸时，Tm降低了大约18℃。当在内部序列中有1个核苷酸被取代并且向3′端加入1个与模板互补的核苷酸时，Tm降低了大约5℃。当在内部序列中有1个核苷酸被取代并且向3′端加入3个与模板互补的核苷酸时，Tm降低了大约4.5℃。当在内部序列中有1个核苷酸被取代并且向3′端加入5个与模板互补的核苷酸时，Tm降低了大约4℃。上述结果如表1所示。

表1

此时再次对上述结果进行总结。与在每个末端有1个核苷酸被取代的情形相比，当在内部序列中有1个核苷酸被取代时，Tm进一步降低了大约6.5℃。当在内部序列中有1个、2个和3个核苷酸被取代、并且向每个3′端加入5个互补核苷酸时，核苷酸的数目每增加一个，Tm降低大约6℃-8℃。当在内部序列中有1个核苷酸被取代、并且每次向3′端加入2个互补核苷酸(例如加入1个、3个和5个互补核苷酸)时，每加入两个互补核苷酸，Tm提高大约0.5℃。

基于上述结果，可在引物设计期间在每种引物中建立可实现温度等效性的引物构建条件。在构建核苷酸序列期间，将无碱基部分插入引物中，可使Tm的波动幅度(margin)最小化。因此，可改进PCR反应的特异性。

如同上文所解释的那样，本发明所述用于PCR扩增的引物在其引物序列内包含无碱基部分，通过使用一对引物，在所述引物序列中导入无碱基部分，能够同时扩增核苷酸序列中具有突变位点的不同模板。

附图说明

本发明中优选实施方式的应用参考附图可以得到更好的理解，其中：

图1为显示聚合酶链式反应(以下称为“PCR”)扩增结果的电泳照片，所述PCR扩增使用TaqDNA聚合酶并用含有无碱基部分的p55/p53引物组进行。

图2为显示PCR扩增结果的电泳照片，所述PCR扩增使用KlenTaqDNA聚合酶并用含有无碱基部分的p55/p53引物组进行。

图3为显示PCR扩增结果的电泳照片，所述PCR扩增使用TaqDNA聚合酶并用含有无碱基部分的p63/p55引物组进行。

图4为显示PCR扩增结果的电泳照片，所述PCR扩增使用PfuDNA聚合酶并用含有无碱基部分的p63/p55引物组进行。

图5为显示使用KlenTaqDNA聚合酶进行PCR的结果的电泳照片，所述PCR分别使用下述引物组进行：对照引物组、在3′端有1个核苷酸被无碱基部分取代的引物组、在内部序列中有1个核苷酸被无碱基部分取代的引物组、以及在内部序列中有2个核苷酸被无碱基部分取代并且向3′端加入5个互补核苷酸的引物组。

图6为显示使用KlenTaqDNA聚合酶进行PCR的结果的电泳照片，所述PCR分别使用下述引物组进行：对照引物组、在内部序列中有3个核苷酸被无碱基部分取代并且向3′端加入5个互补核苷酸的引物组、在内部序列中有1个核苷酸被无碱基部分取代并且向3′端加入1个互补核苷酸的引物组、在内部序列中有1个核苷酸被无碱基部分取代并且向3′端加入3个互补核苷酸的引物组、以及在内部序列中有1个核苷酸被无碱基部分取代并且向3′端加入5个互补核苷酸的引物组。

图7为显示引物对的熔解曲线的图，所述引物对的无碱基部分位置不同，其通过实时基因扩增仪进行分析。图8为显示引物对的熔解曲线的图，所述引物对在内部序列中的无碱基部分数目不同，其通过实时基因扩增仪进行分析。图9显示引物对的熔解曲线的图，所述引物对在内部序列中有1个核苷酸被无碱基部分取代，并且加入到3′端的核苷酸数目不同。在图7-图9中，每张图中紫红色的线表示随温度(X轴)增加时荧光水平(Y轴)的降低。

图10为显示在引物的对应于乙型肝炎病毒S基因的多态性位点的内部序列中有1个核苷酸被无碱基部分取代的图。

图11和图12为显示实时PCR结果的图，所述实时PCR用下述引物以及探针进行：在内部序列中有1个核苷酸被dSpacer取代的引物(dS)、有1个核苷酸被1′-甲氧基-dSpacer取代的引物(Me-dS)、或包含正常核苷酸(Reg)的引物。每条线表示具有不同浓度的三种标准样品随PCR循环数增加时的荧光水平。

实施例

在下面的实施例中，对本发明实用的和现有的优选实施方式进行说明。

但是，可以理解的是，在考虑本发明所公开的内容后，本领域技术人员可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。

实施例1：使用包含无碱基部分的p55/p53引物进行PCR扩增的功效的检验

通过用TaqDNA聚合酶(Bioneer，以下称为“Taq”)和KlenTaqDNA聚合酶(Bioneer，以下称为“KlenTaq”)进行PCR，研究了使用无碱基引物进行的核酸扩增的反应性和特异性，所述无碱基引物由p55/p53引物组构建。用人基因组DNA作为模板DNA，并使用下述三对引物：对照引物组(扩增长度：211bp，15pmol/20μl反应混合物)，由p55引物(核苷酸序列：5′-CTCTTCCTGCAGTACTCCCCTGC-3′，序列编号1)和p53引物(核苷酸序列：5′-GCCCCAGCTCACCATCGCTA-3′，序列编号2)组成；第一样品组引物组(15pmol/20μl反应混合物)，由No2-1F(序列编号3)和No2-1R(序列编号4)组成，所述No2-1F通过将p55引物从5′端起第10个核苷酸的“C”用“N”取代(dSpacer，GlenResearch，产品目录No.10-1914-xx)而制备，所述No2-1R通过将p53引物从5′端起第9个核苷酸的“T”用“N”取代(dSpacer)而制备；第二样品组引物组(15pmol/20μl反应混合物)，由No2-2F(序列编号5)和No2-2R(序列编号6)组成，所述No2-2F通过将p55引物从5′端起第10个和第11核苷酸的“CA”用“NN”取代(dSpacer)而制备，所述No2-2R通过将p53引物从5′端起第9个和第10个核苷酸的“TC”用“NN”取代(dSpacer)而制备。

使用TaqDNA聚合酶(1U/20μl反应混合物)或KlenTaqDNA聚合酶(Bioneer，以下称为“KlenTaq”)(0.4U/20μl反应混合物)作为用于PCR的酶。此外，加入dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP，每种2.5mM)作为用于所述反应的添加剂(2μl/20μl反应混合物)。加入100mM的Tris-HCl、400mM的KCl以及15mM的MgCl₂(pH9.0，2μl/20μl反应混合物)作为用于Taq或KlenTaq聚合酶的10x反应缓冲液。

按下述步骤进行PCR。当使用Taq时，按下述步骤进行扩增：在94℃预变性5分钟；在94℃变性30秒；在45℃-59℃退火50秒；在72℃延伸50秒；从变性到延伸进行38个循环；以及在72℃最终延伸5分钟。当使用KlenTaq时，按下述步骤进行扩增：在37℃进行非特异性反应5分钟；在94℃预变性5分钟；在94℃变性30秒；在45℃-59℃退火50秒；在72℃延伸50秒；从变性到延伸进行38个循环；以及在72℃最终延伸5分钟。PCR的结果用含有2.0％琼脂糖的0.5xTBE缓冲液(Trizma核苷酸、硼酸和0.5M的EDTA，pH8.0)通过电泳进行证实。

图1显示出对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果，所述PCR使用Taq分别用下述引物组进行：对照引物组、第一样品组引物组以及第二样品组引物组。1-10道、11-20道和21-30道表示使用不同的引物所获得的结果，所述引物分别为对照引物组、第一样品组引物组和第二样品组引物组。此时，退火温度分别为45.1℃、45.3℃、46.3℃、47.7℃、49.4℃、51.4℃、53.3℃、55.3℃、57.6℃和59.0℃。此处的M表示100～2,000bpDNA长度的标记物(Bioneer)。这一DNA长度的标记物含有下述13个双链DNA片段：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1,000bp、1,200bp、1,600bp以及2,000bp长度的片段。在对照组的情况下，观察到两个明显(strong)的条带。上方条带为目标条带，下方条带表示引物二聚体条带。表示非特异性产物的条带是位于所述目标条带上方留下拖尾痕迹的条带。

如图1所示，当使用第一样品组引物组和第二样品组引物组时，非特异性反应和二聚体模式减少。特别地，第一样品组引物组比第二样品组引物组在减少非特异性反应和二聚体模式方面更为有效。此外，证实了高特异性PCR产物。

对每个Tm进行比较。在对照组(1-10道)中，在45.1℃、45.3℃、46.3℃、47.7℃、49.4℃、51.4℃、53.3℃、55.3℃、57.6℃和59.0℃的退火温度下，模板全部得以扩增。与此同时，当使用第一样品组引物组(11-20道)时，模板只在55.3℃的退火温度下得以扩增(18道)。因此，ΔTm＝59.0℃-55.3℃＝3.7℃。与此同时，当使用第二样品组引物组(21-30道)时，模板只在51.4℃的退火温度下得以扩增(26道)。因此，ΔTm＝59.0℃-51.4℃＝7.6℃。

图2为显示用PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳结果的电泳照片，所述PCR在KlenTaq的存在下使用下述引物组进行：对照引物组、第一样品组引物组以及第二样品组引物组。1-30道和M的说明与实施例1中相同。如图2所示，当使用第一样品组引物组和第二样品组引物组时，非特异性反应和二聚体模式减少。

以与图1中所描述的相同的方式对每个Tm进行比较。第一样品组引物组的ΔTm为1.4℃，第二样品组引物组的ΔTm为5.7℃。

上述结果表明，内部序列中有1个核苷酸被取代的第一样品组引物在Taq和KlenTaq的存在下减少了非特异性反应，而内部序列中有2个核苷酸被取代的第二样品组引物在Taq和KlenTaq的存在下也减少了非特异性反应。也就是说，无碱基部分的引入没有增加非特异性反应，而是减少了非特异性反应。因此，本发明所述的引物被证实作为引物保持了反应特异性，其中本发明所述的引物包含不与模板互补的无碱基部分。当样品组引物的特定核苷酸被无碱基部分(dSpacer)取代时，PCR的退火温度有所降低，而与DNA聚合酶的种类无关。

实施例2：使用包含无碱基部分的p63/p55物进行PCR扩增的功效的检验

通过用TaqDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶(Bioneer，以下称为“Pfu”)进行PCR，研究了使用无碱基引物进行的核酸扩增的反应性和特异性，所述无碱基引物由p63/p55引物组构建。用人基因组DNA作为模板DNA，并使用下述三对引物：对照引物组(扩增长度：447bp，15pmol/20μl反应混合物)，由p55引物(核苷酸序列：5′-CTCTTCCTGCAGTACTCCCCTGC-3′，序列编号1)和p63引物(核苷酸序列：5′-GGCCACTGACAACCACCCTTACC-3′，序列编号7)组成；第一样品组引物组(15pmol/20μl反应混合物)，由No2-1F和No3-1R(序列编号8)组成，所述No3-1R通过将p63引物从5′端起第10个核苷酸的“C”用“N”取代(dSpacer)而制备；第二样品组引物组(15pmol/20μl反应混合物)，由No2-2F和No3-2R(序列编号9)组成，所述No3-2R通过将p63引物从5′端起第10个和第11个核苷酸的“CA”用“NN”取代(dSpacer)而制备。

使用Taq或Pfu聚合酶(1U/20μl反应混合物)作为用于PCR的酶。此外，加入dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP，每种2.5mM)作为用于所述反应的添加剂(2μl/20μl反应混合物)。加入100mM的Tris-HCl、400mM的KCl和15mM的MgCl2作为用于Taq聚合酶的10x反应缓冲液(pH9.0，2μl/20μl反应混合物)。加入200mM的Tris-HCl、100mM的KCl、100mM的(NH₄)₂SO₄、20mM的MgSO₄、1％TritonX-100以及1mg/ml乙酰化的BSA作为用于Pfu聚合酶的10x反应缓冲液(pH8.8，2μl/20μl反应混合物)。

按下述步骤进行PCR：在37℃进行非特异性反应5分钟；在94℃预变性5分钟；在94℃变性30秒；在45℃-59℃退火50秒；在72℃延伸50秒；从变性到延伸进行38个循环；以及在72℃最终延伸5分钟。PCR的结果用含有2.0％琼脂糖的0.5xTBE缓冲液通过电泳进行证实。

图3为显示用PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳结果的电泳照片，所述PCR在Taq的存在下使用下述引物组进行：对照引物组、第一样品组引物组以及第二样品组引物组。1-30道和M的说明与实施例1中相同。如图3所示，当使用第一样品组引物组和第二样品组引物组时，非特异性反应和二聚体模式减少。特别地，第一样品组引物组比第二样品组引物组在减少非特异性反应和二聚体模式方面更为有效。ΔTm分别为5.7℃和7.6℃。

图4为显示用PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳结果的电泳照片，所述PCR在Pfu的存在下使用下述引物组进行：对照引物组、第一样品组引物组以及第二样品组引物组。1-30道和M的说明与实施例1中相同。如图4所示，当使用第一样品组引物组和第二样品组引物组时，非特异性反应和二聚体模式减少。特别地，第一样品组引物组比第二样品组引物组在减少非特异性反应和二聚体模式方面更为有效。ΔTm分别为5.7℃和7.6℃。

上述结果表明，在Taq和Pfu的存在下，第一样品组引物和第二样品组引物增加了PCR反应性并减少了非特异性反应。因此证实，无碱基引物对于PCR反应性和特异性具有功效。当样品组引物的特定核苷酸被无碱基部分(dSpacer)取代时，PCR的退火温度有所降低，而与DNA聚合酶的种类无关。

实施例3：DNA聚合酶对于无碱基引物构建条件的功效

用对照引物组通过下述方式构建无碱基引物：在3′端取代1个核苷酸(样品2)、在内部序列中取代1个核苷酸(样品3)、在内部序列中取代2个核苷酸并向3′端加入5个互补核苷酸(样品4)、在内部序列中取代3个核苷酸并向3′端加入5个互补核苷酸(样品5)、在内部序列中取代1个核苷酸并向3′端加入1个互补核苷酸(样品6)、在内部序列中取代1个核苷酸并向3′端加入3个互补核苷酸(样品7)、以及在内部序列中取代1个核苷酸并向3′端加入5个互补核苷酸(样品8)。

用人基因组DNA作为模板DNA。以12-40pmol/20μl反应混合物的浓度使用每个引物组。样品1为对照引物组(扩增长度：127bp)，其包含F_AP_CONT引物(核苷酸序列：5′-CGTGTTTGTGCCTGTCCTGG-3′，序列编号10)和R_AP_CONT引物(核苷酸序列：5′-CCGCTTCTTGTCCTGCTTGC-3′，序列编号11)。样品2为通过在3′端取代1个核苷酸、由对照引物组制备的引物组，其包含F_AP_CONT_3-1N引物(核苷酸序列：5′-CGTGTTTGTGCCTGTCCTGN-3′，序列编号12)和R_AP_CONT_3-1N引物(核苷酸序列：5′-CCGCTTCTTGTCCTGCTTGN-3′，序列编号13)。样品3为通过在内部序列中取代1个核苷酸、由对照引物组制备的引物组，其包含F_AP_CONT_I-1N引物(核苷酸序列：5′-CGTGTTTGTGCNTGTCCTGG-3′，序列编号14)和R_AP_CONT_I-1N引物(核苷酸序列：5′-CCGCTTCTTGTNCTGCTTGC-3′，序列编号15)。样品4为通过在内部序列中取代2个核苷酸并向3′端加入5个互补核苷酸、由对照引物组制备的引物组，其包含F_AP_CONT_I-2N_3+5M引物(核苷酸序列：5′-CGTGTTTNTGCNTGTCCTGGGAGAG-3′，序列编号16)和R_AP_CONT_I-2N_3+5M引物(核苷酸序列：5′-CCGCTTNTTGTNCTGCTTGCTTACC-3′，序列编号17)。样品5为通过在内部序列中取代3个核苷酸并向3′端加入5个互补核苷酸、由对照引物组制备的引物组，其包含F_AP_CONT_I-3N_3+5M引物(核苷酸序列：5′-CGTGTTTNTGCNTGTNCTGGGAGAG-3′，序列编号18)和R_AP_CONT_I-3N_3+5M引物(核苷酸序列：5′-CCGCTTNTTGTNCTGNTTGCTTACC-3′，序列编号19)。样品6为通过在内部序列中取代1个核苷酸并向3′端加入1个互补核苷酸由对照引物组制备的引物组，其包含F_AP_CONT_I-1N_3+1M引物(核苷酸序列：5′-CGTGTTTGTGCNTGTCCTGGG-3′，序列编号20)和R_AP_CONT_I-1N_3+1M引物(核苷酸序列：5′-CCGCTTCTTGTNCTGCTTGCT-3′，序列编号21)。样品7为通过在内部序列中取代1个核苷酸并向3′端加入3个互补核苷酸由对照引物组制备的引物组，其包含F_AP_CONT_I-1N_3+3M引物(核苷酸序列：5′-CGTGTTTGTGCNTGTCCTGGGAG-3′，序列编号22)和R_AP_CONT_I-1N_3+3M(核苷酸序列：5′-CCGCTTCTTGTNCTGCTTGCTTA-3′，序列编号23)。样品8为通过在内部序列中取代1个核苷酸并向3′端加入5个互补核苷酸由对照引物组制备的引物组，其包含F_AP_CONT_I-1N_3+5M引物(核苷酸序列：5′-CGTGTTTGTGCNTGTCCTGGGAGAG-3′，序列编号24)和R_AP_CONT_I-1N_3+5M引物(核苷酸序列：5′-CCGCTTCTTGTNCTGCTTGCTTACC-3′，序列编号25)。

使用KlenTaq聚合酶(0.4U/20μl反应混合物)作为用于PCR的酶。此外，加入dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP，每种2.5mM)作为用于所述反应的添加剂(2μl/20μl反应混合物)。加入100mM的Tris-HCl、400mM的KCl和15mM的MgCl₂作为用于KlenTaq聚合酶的10x反应缓冲液(pH9.0，2μl/20μl反应混合物)。

按下述步骤进行PCR：在94℃预变性5分钟；在94℃变性30秒；在55℃-70℃或46℃-61℃退火50秒；在72℃延伸50秒；从变性到延伸进行40个循环；以及在72℃最终延伸5分钟。所述PCR的结果用含有2.0％琼脂糖的0.5xTBE缓冲液通过电泳进行证实。

图5和图6为显示用PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳结果的电泳照片，所述PCR在KlenTaq的存在下，使用8种不同的引物组进行。M的说明与实施例1中相同。

在图5中，1-8道表示通过使用样品1引物组在不同的退火温度下得到的结果，所述退火温度为59.4℃、61.4℃、63.3℃、65.3℃、67.6℃、69℃、69.7℃和70.2℃。9-16道表示通过使用样品2引物组在不同的退火温度下得到的结果，所述退火温度为55.5℃、56.3℃、57.1℃、59.4℃、61.4℃、63.3℃、65.3℃和67.6℃。17-24道表示通过使用样品3引物组在不同的退火温度下得到的结果，所述退火温度为46.1℃、46.5℃、47.3℃、48.7℃、50.4℃、52.4℃、54.3℃和56.3℃。25-32道表示通过使用样品4引物组在不同的退火温度下得到的结果，所述退火温度为48.7℃、50.4℃、52.4℃、54.3℃、56.3℃、58.6℃、60℃和60.7℃。M表示100bpDNA长度的标记物。

在图6中，1-8道表示通过使用样品5引物组在不同的退火温度下得到的结果，所述退火温度为46.1℃、46.5℃、47.3℃、48.7℃、50.4℃、52.4℃、54.3℃和56.3℃。9-16道表示通过使用样品6引物组在不同的退火温度下得到的结果，所述退火温度为46.1℃、46.5℃、47.3℃、48.7℃、50.4℃、52.4℃、54.3℃和56.3℃。17-24道表示通过使用样品7引物组在不同的退火温度下得到的结果，所述退火温度为46.1℃、46.5℃、47.3℃、48.7℃、50.4℃、52.4℃、54.3℃和56.3℃。25-32道表示通过使用样品8引物组在不同的退火温度下得到的结果，所述退火温度为48.7℃、50.4℃、52.4℃、54.3℃、56.3℃、58.6℃、60℃和60.7℃。

如图5和图6所示，样品1引物组在直至63.3℃的退火温度下扩增出PCR产物。样品2引物组在61.4℃～63.3℃的退火温度范围内扩增出PCR产物。样品3引物组、样品5引物组和样品6引物组被证实无PCR产物。样品4引物组在直至52.4℃的退火温度下扩增出PCR产物。样品7引物组在直至47.3℃的退火温度下扩增出PCR产物。样品8引物组在直至52.4℃的退火温度下扩增出PCR产物。

上述结果表明，通过在3′端取代1个核苷酸由对照引物组制备的引物(样品2)、以及在内部序列中取代2个核苷酸并向3′端加入5个互补核苷酸由对照引物组制备的引物(样品4)可诱导PCR扩增，并且与对照引物组相比，此时反应温度降低了大约2℃和11℃。通过在内部序列中取代1个核苷酸并向3′端加入3个互补核苷酸由对照引物组制备的引物(样品7)以及在内部序列中取代1个核苷酸并向3′端加入5个互补核苷酸由对照引物组制备的引物(样品8)可诱导PCR扩增，并且与对照引物组相比，此时反应温度降低了大约16℃和11℃。

实施例4：通过解离对无嘌呤引物构建条件进行熔解曲线检验

通过熔解曲线测定在实施例3中确定的8个无嘌呤(apurine)引物组的每个Tm。将0.3nmol/20μl反应混合物的互补反向引物(核苷酸序列：5′-GGTAAGCAAGCAGGACAAGAAGCGG-3′，序列编号26)分别加入下述引物：实施例3中样品1的正向引物0.3nmol(核苷酸序列：5′-CGTGTTTGTGCCTGTCCTGG-3′，序列编号10)、样品2的正向引物0.5nmol(核苷酸序列：5′-CGTGTTTGTGCCTGTCCTGN-3′，序列编号12)、样品3的正向引物1.0nmol(核苷酸序列：5′-CGTGTTTGTGCNTGTCCTGG-3′，序列编号14)、样品4的正向引物0.5nmol(核苷酸序列：5′-CGTGTTTGTGCNTGTCCTGGGAGAG-3′，序列编号16)、样品5的正向引物1.0nmol(核苷酸序列：5′-CGTGTTTNTGCNTGTNCTGGGAGAG-3′，序列编号18)、样品6的正向引物1.0nmol(核苷酸序列：5′-CGTGTTTGTGCNTGTCCTGGG-3′，序列编号20)、样品7的正向引物1.0nmol(核苷酸序列：5′-CGTGTTTGTGCNTGTCCTGGGAG-3′，序列编号22)、以及样品8的正向引物0.5nmol(核苷酸序列：5′-CGTGTTTGTGCNTGTCCTGGGAGAG-3′，序列编号24)。加入10x反应缓冲液(100mM的Tris-HCl、400mM的KCl、50mM的MgCl₂，pH9.0)(2μl/20μl反应混合物)和2μl的10xSYBRGreen作为用于所述反应的添加剂。SYBRGreen为嵌入双链DNA链小沟中的荧光染料。如果温度较低，双链会大量形成，此时所述荧光染料被大量嵌入，从而产生高荧光。相反，如果温度较高，双链解开为单链，因而所述荧光染料不容易嵌入其间，从而造成难以测定荧光。通过实时基因扩增仪(Exicycler^TM，Bioneer公司)绘制熔解曲线。此时的反应条件如下：在94℃诱导预变性5分钟，并在20℃保持5分钟。然后，当将温度以1摄氏度的步幅从30℃升高到97℃时，将所述混合物在每个温度保持10秒。

图7为显示熔解曲线的图，所述熔解曲线根据对照引物组(样品1)中无嘌呤部分(apurinepart)取代的位置作出。线1表示样品1引物组(对照组)的熔解曲线，线2表示样品2引物组的熔解曲线，线3表示样品3引物组的熔解曲线。图8为显示熔解曲线的图，所述熔解曲线根据内部序列中被取代的核苷酸数目作出。线1表示样品1引物组(对照组)的熔解曲线，线2表示样品8引物组的熔解曲线，线3表示样品4引物组的熔解曲线，线4表示样品5引物组的熔解曲线。图9为显示熔解曲线的图，所述熔解曲线根据加入至3′端互补核苷酸的数目以及对照引物组的内部序列中有1个核苷酸被取代而作出。线1表示样品1引物组(对照组)的熔解曲线，线2表示样品8引物组的熔解曲线，线3表示样品7引物组的熔解曲线，线4表示样品6引物组的熔解曲线，线5表示样品3引物组的熔解曲线。

根据上述结果，当在对照引物组的3′端有1个核苷酸被无碱基部分取代时，Tm降低了大约1.5℃。当在内部序列中有1个核苷酸被无碱基部分取代时，Tm降低了大约8℃(参见图7)。同时，与对照引物组相比，当向3′端加入5个互补核苷酸并且在内部序列中有1个、2个或3个核苷酸被无碱基部分取代时，Tm分别降低了4℃、10℃和18℃(参见图8)。当在内部序列中有1个核苷酸被无碱基部分取代并且向3′端加入核苷酸时，每加入2个核苷酸，Tm增加0.5℃(参见图9)。

实施例5：使用无碱基引物进行PCR的功效，所述引物通过在显示乙型肝炎病毒(HBV)S基因多态性的内部序列中取代1个核苷酸进行制备

对使用无碱基引物以及与其相对应的探针进行PCR的功效进行了研究，所述引物通过在显示乙型肝炎病毒S基因的多态性的内部序列中取代1个核苷酸进行制备。还研究了不同种类的dSpacer是否会产生不同的结果。为此，使用dSpacer和1′-甲氧基-dSpacer构建具有相同序列的无碱基引物(参见图10)。所构建的引物和探针的核苷酸序列如表2所示。将所述探针的5′端用FAM荧光染料进行标记，将所述探针的3′端用TAMRA荧光染料进行标记。

表2

使用AppliedBiosystems7500FAST实时PCR系统(AppliedBiosystems，美国)，用所述无碱基引物和探针进行实时PCR。特别地，将1μl正向引物(10pmol)、1μl反向引物(10pmol)、1μl探针(5pmol)以及1U的Taq混合制得20μl反应混合物。此外，还向其中加入1μl的dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP，每种2.5mM)(1μl/20μl反应混合物)。加入200mM的Tris-HCl、350mM的KCl以及15mM的MgCl₂(pH9.0)(2μl/20μl反应混合物)作为用于Taq聚合酶的10x反应缓冲液。按下述步骤进行PCR：(1)在95℃进行12分钟；(2)在95℃进行20秒；(3)在57℃进行40秒；(4)将步骤(2)～(3)进行40个循环。所得结果如图11和图12所示。

如图11所示，内部序列中有1个核苷酸被dSpacer取代的引物和内部序列中有1个核苷酸被1′-甲氧基-dSpacer取代的引物显示出相等的Ct值。如图12所示，内部序列中有1个核苷酸被1′-甲氧基-dSpacer取代的引物和没有被取代的正常引物显示出相等的Ct值。上述结果表明，本发明所述的无碱基引物可有效地用于乙型肝炎病毒的检测。

序列表

在此一并附上序列表。

本领域技术人员将会明了的是，可容易地利用上述说明书中公开的概念和具体实施方式，作为改进或设计实现与本发明用途相同的其他实施方式的基础。本领域技术人员还将明了的是，这类等同的实施方式没有脱离如所附权利要求书中阐明的本发明的精神和范围。

序列表

<110>株式会社百奥尼

<120>引物序列内包含无碱基部分的、用于PCR扩增的引物

<130>2008-opa-4068

<160>33

<170>KopatentIn1.71

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>p55引物

<400>1

ctcttcctgcagtactcccctgc23

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>p53引物

<400>2

gccccagctcaccatcgcta20

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>No2-1F引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>3

ctcttcctgnagtactcccctgc23

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>No2-1R引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>4

gccccagcncaccatcgcta20

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>No2-2F引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(11)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>5

ctcttcctgnngtactcccctgc23

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>No2-2R引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(10)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>6

gccccagcnnaccatcgcta20

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>p63引物

<400>7

ggccactgacaaccacccttacc23

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>No3-1R引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>8

ggccactganaaccacccttacc23

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>No3-2R引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(11)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>9

ggccactgannaccacccttacc23

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F_AP_CONT引物

<400>10

cgtgtttgtgcctgtcctgg20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>R_AP_CONT引物

<400>11

ccgcttcttgtcctgcttgc20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F_AP_CONT_3-1N引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>12

cgtgtttgtgcctgtcctgn20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>R_AP_CONT_3-1N引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>13

ccgcttcttgtcctgcttgn20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F_AP_CONT_I-1N引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>14

cgtgtttgtgcntgtcctgg20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>R_AP_CONT_I-1N引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>15

ccgcttcttgtnctgcttgc20

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F_AP_CONT_I-2N_3+5M引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>16

cgtgtttntgcntgtcctgggagag25

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>R_AP_CONT_I-2N_3+5M引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>17

ccgcttnttgtnctgcttgcttacc25

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F_AP_CONT_I-3N_3+5M引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>18

cgtgtttntgcntgtnctgggagag25

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>R_AP_CONT_I-3N_3+5M引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>19

ccgcttnttgtnctgnttgcttacc25

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F_AP_CONT_I-1N_3+1M引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>20

cgtgtttgtgcntgtcctggg21

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>R_AP_CONT_I-1N_3+1M引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>21

ccgcttcttgtnctgettgct21

<210>22

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F_AP_CONT_I-1N_3+3M引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>22

cgtgtttgtgcntgtcctgggag23

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>R_AP_CONT_I-1N_3+3M引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>23

ccgcttcttgtnctgcttgctta23

<210>24

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F_AP_CONT_I-1N_3+5M引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>24

cgtgtttgtgcntgtcctgggagag25

<210>25

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>R_AP_CONT_I-1N_3+5M引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>25

ccgcttcttgtnctgcttgcttacc25

<210>26

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>共同的反向引物

<400>26

ggtaagcaagcaggacaagaagcgg25

<210>27

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有dSpacer的正向引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>27

tcgtgttacangcggggtttttc23

<210>28

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有1’-甲氧基-dSpacer的正向引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)

<223>″n″为无碱基部分(1’-甲氧基-dSpacer)

<400>28

tcgtgttacangcggggtttttc23

<210>29

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有正常碱基的正向引物

<400>29

tcgtgttacaggcggggtttttc23

<210>30

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有dSpacer的反向引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)

<223>″n″为无碱基部分(dSpacer)

<400>30

tagaaaantgagagaagtccaccacgag28

<210>31

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有1’-甲氧基-dSpacer的反向引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)

<223>″n″为无碱基部分(1’-甲氧基-dSpacer)

<400>31

tagaaaantgagagaagtccaccacgag28

<210>32

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有正常碱基的反向引物

<400>32

tagaaaattgagagaagtccaccacgag28

<210>33

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针序列

<400>33

tgttgacaagaatcctcacaataccgca28

Claims

1.一种用于PCR扩增的引物在用于同时共同扩增不同的核酸模板中的用途，所述核酸模板在其核苷酸序列中具有突变位点或多态性位点，所述引物包含无碱基位点，所述无碱基位点位于与将要进行杂交的核酸模板的突变核苷酸位点或多态性核苷酸位点相对应的区域中。

2.如权利要求1所述的用途，其中，所述无碱基位点选自于由下列物质组成的组：dSpacer(5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′,2′-二脱氧核糖-3′-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、1′-甲氧基-dSpacer(5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′-甲氧基-2′-二脱氧核糖-3′-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、PCSpacer亚磷酰胺([4-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)丁酰胺基甲基)-1-(2-硝基苯基)-乙基]-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)、rSpacerCE亚磷酰胺(5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′-脱氧核糖-2′-O-三异丙基甲硅氧基甲基-3′-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、SpacerC12CE亚磷酰胺(12-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)-十二烷基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、Spacer亚磷酰胺18(18-O-二甲氧基三苯甲基六甘醇,1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、Spacer亚磷酰胺9(9-O-二甲氧基三苯甲基-三甘醇,1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)以及Spacer亚磷酰胺C3(3-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)。

3.如权利要求1所述的用途，其中，所述引物中的所述无碱基位点的数目为1-10。

4.如权利要求3所述的用途，其中，所述引物中的所述无碱基位点的数目为1-3。

5.如权利要求1所述的用途，其中，向所述引物的末端加入与模板互补的核苷酸，以补偿由无碱基位点所降低的Tm。

6.一种用于PCR扩增的组合物在用于共同扩增不同的核酸模板中的用途，所述核酸模板在其核苷酸序列中具有突变位点或多态性位点，所述组合物包含反应缓冲液、4种dNTP、DNA聚合酶、以及用于PCR扩增的引物，所述引物包含无碱基位点，所述无碱基位点位于与将要进行杂交的核酸模板的突变核苷酸位点或多态性核苷酸位点相对应的区域中。

7.如权利要求6所述的用途，其中，所述无碱基位点选自于由下列物质组成的组：dSpacer(5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′,2′-二脱氧核糖-3′-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、1′-甲氧基-dSpacer(5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′-甲氧基-2′-二脱氧核糖-3′-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、PCSpacer亚磷酰胺([4-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)丁酰胺基甲基)-1-(2-硝基苯基)-乙基]-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)、rSpacerCE亚磷酰胺(5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′-脱氧核糖-2′-O-三异丙基甲硅氧基甲基-3′-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、SpacerC12CE亚磷酰胺(12-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)-十二烷基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、Spacer亚磷酰胺18(18-O-二甲氧基三苯甲基六甘醇,1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、Spacer亚磷酰胺9(9-O-二甲氧基三苯甲基-三甘醇,1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)以及Spacer亚磷酰胺C3(3-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)。

8.如权利要求6所述的用途，其中，所述引物中的所述无碱基位点的数目为1-10。

9.如权利要求8所述的用途，其中，所述引物中的所述无碱基位点的数目为1-3。

10.如权利要求6所述的用途，其中，向所述引物的末端加入与模板互补的核苷酸，以补偿由无碱基位点所降低的Tm。

11.如权利要求6-10中任一项所述的用途，其中，所述组合物进一步包含染料和/或稳定剂。

12.如权利要求11所述的用途，其中，所述染料为选自于由溴酚蓝、二甲苯青、溴甲酚红和甲酚红所组成的组中的一种或多种化合物。

13.如权利要求11所述的用途，其中，所述稳定剂为选自于由明胶、牛血清白蛋白、Thesit、PEG-8000和多元醇所组成的组中的一种或多种化合物。

14.一种用于PCR扩增的方法，所述方法包括下述步骤：

将用于PCR扩增的组合物与核酸模板混合，所述组合物包含用于PCR扩增的引物；以及

用所述混合物进行PCR，

其中，所述方法用于共同扩增不同的核酸模板，所述核酸模板在其核苷酸序列中具有突变位点或多态性位点；所述引物包含无碱基位点，所述无碱基位点位于与将要进行杂交的核酸模板的突变核苷酸位点或多态性核苷酸位点相对应的区域中。

15.如权利要求14所述的用于PCR扩增的方法，其中，所述无碱基位点选自于由下列物质组成的组：dSpacer(5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′,2′-二脱氧核糖-3′-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、1′-甲氧基-dSpacer(5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′-甲氧基-2′-二脱氧核糖-3′-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、PCSpacer亚磷酰胺([4-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)丁酰胺基甲基)-1-(2-硝基苯基)-乙基]-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)、rSpacerCE亚磷酰胺(5′-O-二甲氧基三苯甲基-1′-脱氧核糖-2′-O-三异丙基甲硅氧基甲基-3′-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、SpacerC12CE亚磷酰胺(12-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)-十二烷基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、Spacer亚磷酰胺18(18-O-二甲氧基三苯甲基六甘醇,1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、Spacer亚磷酰胺9(9-O-二甲氧基三苯甲基-三甘醇,1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)以及Spacer亚磷酰胺C3(3-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)。

16.如权利要求14所述的用于PCR扩增的方法，其中，所述引物中的所述无碱基位点的数目为1-10。

17.如权利要求16所述的用于PCR扩增的方法，其中，所述引物中的所述无碱基位点的数目为1-3。

18.如权利要求14所述的用于PCR扩增的方法，其中，向所述引物的末端加入与模板互补的核苷酸，以补偿由无碱基位点所降低的Tm。

19.如权利要求14-18中任一项所述的用于PCR扩增的方法，其中，所述用于PCR扩增的引物中的另一引物为不包含无碱基位点的正常引物。