JP2004337042A - 核酸アレイ - Google Patents
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- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
【課題】効率よく解析することができ、さらにアミノ酸の変異をより少ないアレイ数で、全ての場合の発現の数を予測することができる核酸アレイを提供する。
【解決手段】アミノ酸コードに対応する第3番目の塩基が、塩基を持たない糖リン酸バックボーンから成る単位を有するオリゴヌクレオチドを基板上に固定化した、核酸アレイを提供する。
【選択図】 図1
【解決手段】アミノ酸コードに対応する第3番目の塩基が、塩基を持たない糖リン酸バックボーンから成る単位を有するオリゴヌクレオチドを基板上に固定化した、核酸アレイを提供する。
【選択図】 図1
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明はゲノムの多様性、遺伝子多型、SNPs等、変異またはミスマッチ塩基、特にmRNAの発現に関することなどを調べるための、いわゆる核酸アレイに関するものである。
【0002】
【従来の技術】
従来、mRNAの発現量の解析には、特に配列に限定された方法はなく、過去の技術的蓄積によって得られたcDNA断片を固相化したマイクロアレイや、データベース上のESTやSTSを参考にしたもの、あるいはユーザにはまったく公開されてないものまで、さまざまである。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらmRNAを、対応するアミノ酸側から眺めてみれば、1つのアミノ酸に対して、塩基は1〜6通りのトリプレットが対応するために、個体間での解析をいっそう複雑にしている。
【0004】
以上のような状況に鑑み、本発明の目的は、効率よく解析することができ、さらにアミノ酸の変異をより少ないアレイ数で、全ての場合の発現の数を予測することができる核酸アレイを提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
各アミノ酸に対応するトリプレットの第1番目と第2番目の塩基に注目したところ、これらの2つの塩基を確定することにより、1つのアミノ酸を表現する塩基の組合せを、1通りまたは2通りに限定できることに本発明者は着眼した。この場合のトリプレットの第3番目の塩基は、単にハイブリダイズする相手側と鎖長を調整することのみを目的とするもので、塩基を持たない(abasicな)糖リン酸バックボーンとすることにより、例えばmRNA上でたった3個のアミノ酸を表現するためには、理論上は最も多い場合6×6×6=216通りあることに対して、各アミノ酸を第1番目と第2番目の塩基の組合せで表現した際に2通りの組合せがある最も組合せの多い場合を例としても、2×2×2=8通りで表現できるというように、解析上非常に有利となる。
【0006】
従って、上記の目的を達成することのできる、本発明の一実施態様にかかる核酸アレイは、1つのアミノ酸を規定するトリプレット(コドン)の第3番目の位置がabasicである配列を有するオリゴヌクレオチドを基板上に固定化したことを特徴とする。
【0007】
また、上記の目的を達成することのできる、本発明の一実施態様にかかる、アミノ酸変異を予測する方法は、上記核酸アレイを用いることにより効率よく全ての場合のアミノ酸変異を伴わない核酸変異を、abasicである配列を有するオリゴヌクレオチドに集約することによって、アミノ酸変異を伴うものとそうでないものの核酸配列をハイブリダイゼーションで識別することを特徴とする。
【0008】
本発明によれば、効率よく解析することができ、更にアミノ酸の変異をより少ないアレイ数で全ての場合の数を予測することができる核酸アレイを提供することができる。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明にかかる核酸アレイは、異なる塩基配列を有する2以上のオリゴヌクレオチドを基板上に固定した構成を有し、各オリゴヌクレオチドが、abasicサイトを有するものである。本発明にかかる核酸アレイは、例えば、多数のオリゴヌクレオチドを各オリゴヌクレオチドごとに区分して、例えば各オリゴヌクレオチドのスポットとして、高密度に所望とする配置で配置したマイクロアレイとして好適に利用することができる。
【0010】
オリゴヌクレオチドのそれぞれにプローブとしての機能を持たせることで、本発明にかかる核酸アレイを、特定のDNA配列やRNA配列の検出や、既知のDNA配列やRNA配列が有する変異の検出のために利用することができる。
【0011】
以下、DNAマイクロアレイとした場合について説明する。図1は本発明の実施形態であるDNAマイクロアレイの一部分の構成を模式的に示したものであり、支持体1の上に、複数のオリゴヌクレオチドのスポットが形成されている。
【0012】
支持体1の材質はガラス、プラスチックなどの有機系高分子材料など、プローブDNAまたはRNAの固相表面を形成するものであれば、何れも用いることができる。また、支持体1の形状は、読取装置に応じて、マイクロプレートリーダであればウェル状、マイクロアレイスキャナであれば板状、フローサイトメータのような装置であれば粒状、のように適宜応用することができる。
【0013】
このDNAアレイは、abasicサイトを有するオリゴヌクレオチドを支持体1の上に固相化したものである。
【0014】
abasicサイトとしては、アミノ酸をコードするトリプレットの第3番目の塩基を挙げることができる。なお、abasicサイトの糖としては、DNAの場合はデオキシリボースを、RNAの場合はリボースを好適に用いることができる。例えば、ヌクレオシドを構成するデオキシリボースまたはリボースをそのまま用いることができる。
【0015】
第3番目をabasicな単位とした場合のDNAマイクロアレイについて、以下に更に説明する。
【0016】
図1に示すように、糖リン酸バックボーン3に対して、塩基が欠落しているabasicサイト2を持ったオリゴヌクレオチドを固相化する。表1に、アミノ酸と対応するコドンの関係を示す。例えば「Gly Ile Val Glu」のようなアミノ酸配列を有するものが、サンプルのmRNAから抽出され、かつターゲットである場合について説明する。アミノ酸コードに対する第3番目の塩基がabasicな単位に置換されたオリゴヌクレオチドを固定化する例を示すと、表1に示すコドンの二文字目までを考慮して、「GG−AT−GT−GA」の相補鎖、即ち「CC−TA−CA−CT」(塩基欠落部位を−記号で示した)をプローブとして基板上に固定する。こうすることにより、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列は、各アミノ酸を3つの塩基の組合せで表現した場合、理論上は4×3×4×2=96通りあるのに対して、本発明に従って第3番目の塩基を欠落させることで、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列は2×2×2×2=16通りで済む。すなわち、合計で16種の異なる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを予め設定された配置で基板上に固定すれば、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を特定することができる。
【0017】
また、核酸部分は、ミスマッチ識別能力が高いとする、LNA(Locked
Nucleic Acid)であってもよい。
【0018】
【表1】
【0019】
なお、上記プローブを固相化する方法は何れの方法を用いることができるが、例えば特開平11−187900号公報に記載の方法を用いるとよい。
【0020】
【実施例】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【0021】
NCBI(National Centre for Biotechnology Information,Bethesda、Maryland、米国)のデータベースから、HLA−DRAのプロテインシークエンスを入手することにより、具体的に説明する。
【0022】
【表2】
【0023】
上記シークエンスを先頭から12個単位で区切り、計21個の骨格となる、プローブアレイに置き換えた。上記骨格には、アミノ酸コドンの3文字目をabasicとしても、二通りの可能性を持っているものが含まれている。それらは、R(アルギニン)、L(ロイシン)、S(セリン)、Y(チロシン)、C(システイン)であることが解っている。表3に、本実施例においてそれぞれの区切られた21の骨格を示す。さらに表3には、アミノ酸コドンの3文字目をabasicとした時の、各骨格をコードする塩基配列の検出に必要なプローブ数を示す。なお、1通りのみの場合は特に記載していない。
【0024】
【表3】
【0025】
例えば、1つの骨格の塩基配列の検出に必要となるプローブアレイに、上記2通りの可能性持つものが、4つ含まれている場合、2×2×2×2=16で、その骨格に対しすべての場合の数(16通り)のプローブのアレイを作るものとして、同様の操作をすべての骨格に対し施し、計180種の異なる所定の配列のプローブを基板上に固定してDNAアレイを作った。尚、この基本骨格の配列に対し、各プローブのTm値をなるべくそろえるために、両端の塩基を数個単位で伸ばす又は削るなどの調整を図っても良い。
【0026】
コドンの3番目の塩基をabasicな単位に置換した計180個のプローブは、固相側の末端にSH基を導入したものとしてすべてオリゴヌクレオチド合成メーカーより入手した。本実施例における上記プローブの固相は、特開平11−187900号公報の実施例に従い、行った。
【0027】
MHC−DRAは、電気泳動レベルではすべての人でほぼ同じ位置に泳動されるために、アミノ酸レベルで変異が発生しているか分からないが、実施例のようなabasicなプローブアレイのDNAチップを作ることで、ハイブリダイゼーションでミスマッチが発生したときの蛍光強度の違いから、アミノ酸の変異を、より少ないアレイ数で、すべての場合の数を予測できる。
【0028】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、abasicな配列を有するオリゴヌクレオチドを基板上に固定化した核酸アレイを用いると、効率よく解析することができ、さらにアミノ酸の変異をより少ないアレイ数で全ての場合の発現の数を予測することができる。また、本発明のDNAプローブアレイを用いると、ハイブリダイゼーションでミスマッチが発生した時のアミノ酸の変異を、より少ないアレイ数で効率よく、全ての場合のミスマッチの発現の数を予測する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施形態におけるDNAマイクロアレイの一部分を示したものである。
【符号の説明】
1 支持体
2 abasicサイト
3 糖リン酸バックボーン
【発明の属する技術分野】
本発明はゲノムの多様性、遺伝子多型、SNPs等、変異またはミスマッチ塩基、特にmRNAの発現に関することなどを調べるための、いわゆる核酸アレイに関するものである。
【0002】
【従来の技術】
従来、mRNAの発現量の解析には、特に配列に限定された方法はなく、過去の技術的蓄積によって得られたcDNA断片を固相化したマイクロアレイや、データベース上のESTやSTSを参考にしたもの、あるいはユーザにはまったく公開されてないものまで、さまざまである。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらmRNAを、対応するアミノ酸側から眺めてみれば、1つのアミノ酸に対して、塩基は1〜6通りのトリプレットが対応するために、個体間での解析をいっそう複雑にしている。
【0004】
以上のような状況に鑑み、本発明の目的は、効率よく解析することができ、さらにアミノ酸の変異をより少ないアレイ数で、全ての場合の発現の数を予測することができる核酸アレイを提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
各アミノ酸に対応するトリプレットの第1番目と第2番目の塩基に注目したところ、これらの2つの塩基を確定することにより、1つのアミノ酸を表現する塩基の組合せを、1通りまたは2通りに限定できることに本発明者は着眼した。この場合のトリプレットの第3番目の塩基は、単にハイブリダイズする相手側と鎖長を調整することのみを目的とするもので、塩基を持たない(abasicな)糖リン酸バックボーンとすることにより、例えばmRNA上でたった3個のアミノ酸を表現するためには、理論上は最も多い場合6×6×6=216通りあることに対して、各アミノ酸を第1番目と第2番目の塩基の組合せで表現した際に2通りの組合せがある最も組合せの多い場合を例としても、2×2×2=8通りで表現できるというように、解析上非常に有利となる。
【0006】
従って、上記の目的を達成することのできる、本発明の一実施態様にかかる核酸アレイは、1つのアミノ酸を規定するトリプレット(コドン)の第3番目の位置がabasicである配列を有するオリゴヌクレオチドを基板上に固定化したことを特徴とする。
【0007】
また、上記の目的を達成することのできる、本発明の一実施態様にかかる、アミノ酸変異を予測する方法は、上記核酸アレイを用いることにより効率よく全ての場合のアミノ酸変異を伴わない核酸変異を、abasicである配列を有するオリゴヌクレオチドに集約することによって、アミノ酸変異を伴うものとそうでないものの核酸配列をハイブリダイゼーションで識別することを特徴とする。
【0008】
本発明によれば、効率よく解析することができ、更にアミノ酸の変異をより少ないアレイ数で全ての場合の数を予測することができる核酸アレイを提供することができる。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明にかかる核酸アレイは、異なる塩基配列を有する2以上のオリゴヌクレオチドを基板上に固定した構成を有し、各オリゴヌクレオチドが、abasicサイトを有するものである。本発明にかかる核酸アレイは、例えば、多数のオリゴヌクレオチドを各オリゴヌクレオチドごとに区分して、例えば各オリゴヌクレオチドのスポットとして、高密度に所望とする配置で配置したマイクロアレイとして好適に利用することができる。
【0010】
オリゴヌクレオチドのそれぞれにプローブとしての機能を持たせることで、本発明にかかる核酸アレイを、特定のDNA配列やRNA配列の検出や、既知のDNA配列やRNA配列が有する変異の検出のために利用することができる。
【0011】
以下、DNAマイクロアレイとした場合について説明する。図1は本発明の実施形態であるDNAマイクロアレイの一部分の構成を模式的に示したものであり、支持体1の上に、複数のオリゴヌクレオチドのスポットが形成されている。
【0012】
支持体1の材質はガラス、プラスチックなどの有機系高分子材料など、プローブDNAまたはRNAの固相表面を形成するものであれば、何れも用いることができる。また、支持体1の形状は、読取装置に応じて、マイクロプレートリーダであればウェル状、マイクロアレイスキャナであれば板状、フローサイトメータのような装置であれば粒状、のように適宜応用することができる。
【0013】
このDNAアレイは、abasicサイトを有するオリゴヌクレオチドを支持体1の上に固相化したものである。
【0014】
abasicサイトとしては、アミノ酸をコードするトリプレットの第3番目の塩基を挙げることができる。なお、abasicサイトの糖としては、DNAの場合はデオキシリボースを、RNAの場合はリボースを好適に用いることができる。例えば、ヌクレオシドを構成するデオキシリボースまたはリボースをそのまま用いることができる。
【0015】
第3番目をabasicな単位とした場合のDNAマイクロアレイについて、以下に更に説明する。
【0016】
図1に示すように、糖リン酸バックボーン3に対して、塩基が欠落しているabasicサイト2を持ったオリゴヌクレオチドを固相化する。表1に、アミノ酸と対応するコドンの関係を示す。例えば「Gly Ile Val Glu」のようなアミノ酸配列を有するものが、サンプルのmRNAから抽出され、かつターゲットである場合について説明する。アミノ酸コードに対する第3番目の塩基がabasicな単位に置換されたオリゴヌクレオチドを固定化する例を示すと、表1に示すコドンの二文字目までを考慮して、「GG−AT−GT−GA」の相補鎖、即ち「CC−TA−CA−CT」(塩基欠落部位を−記号で示した)をプローブとして基板上に固定する。こうすることにより、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列は、各アミノ酸を3つの塩基の組合せで表現した場合、理論上は4×3×4×2=96通りあるのに対して、本発明に従って第3番目の塩基を欠落させることで、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列は2×2×2×2=16通りで済む。すなわち、合計で16種の異なる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを予め設定された配置で基板上に固定すれば、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を特定することができる。
【0017】
また、核酸部分は、ミスマッチ識別能力が高いとする、LNA(Locked
Nucleic Acid)であってもよい。
【0018】
【表1】
【0019】
なお、上記プローブを固相化する方法は何れの方法を用いることができるが、例えば特開平11−187900号公報に記載の方法を用いるとよい。
【0020】
【実施例】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【0021】
NCBI(National Centre for Biotechnology Information,Bethesda、Maryland、米国)のデータベースから、HLA−DRAのプロテインシークエンスを入手することにより、具体的に説明する。
【0022】
【表2】
【0023】
上記シークエンスを先頭から12個単位で区切り、計21個の骨格となる、プローブアレイに置き換えた。上記骨格には、アミノ酸コドンの3文字目をabasicとしても、二通りの可能性を持っているものが含まれている。それらは、R(アルギニン)、L(ロイシン)、S(セリン)、Y(チロシン)、C(システイン)であることが解っている。表3に、本実施例においてそれぞれの区切られた21の骨格を示す。さらに表3には、アミノ酸コドンの3文字目をabasicとした時の、各骨格をコードする塩基配列の検出に必要なプローブ数を示す。なお、1通りのみの場合は特に記載していない。
【0024】
【表3】
【0025】
例えば、1つの骨格の塩基配列の検出に必要となるプローブアレイに、上記2通りの可能性持つものが、4つ含まれている場合、2×2×2×2=16で、その骨格に対しすべての場合の数(16通り)のプローブのアレイを作るものとして、同様の操作をすべての骨格に対し施し、計180種の異なる所定の配列のプローブを基板上に固定してDNAアレイを作った。尚、この基本骨格の配列に対し、各プローブのTm値をなるべくそろえるために、両端の塩基を数個単位で伸ばす又は削るなどの調整を図っても良い。
【0026】
コドンの3番目の塩基をabasicな単位に置換した計180個のプローブは、固相側の末端にSH基を導入したものとしてすべてオリゴヌクレオチド合成メーカーより入手した。本実施例における上記プローブの固相は、特開平11−187900号公報の実施例に従い、行った。
【0027】
MHC−DRAは、電気泳動レベルではすべての人でほぼ同じ位置に泳動されるために、アミノ酸レベルで変異が発生しているか分からないが、実施例のようなabasicなプローブアレイのDNAチップを作ることで、ハイブリダイゼーションでミスマッチが発生したときの蛍光強度の違いから、アミノ酸の変異を、より少ないアレイ数で、すべての場合の数を予測できる。
【0028】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、abasicな配列を有するオリゴヌクレオチドを基板上に固定化した核酸アレイを用いると、効率よく解析することができ、さらにアミノ酸の変異をより少ないアレイ数で全ての場合の発現の数を予測することができる。また、本発明のDNAプローブアレイを用いると、ハイブリダイゼーションでミスマッチが発生した時のアミノ酸の変異を、より少ないアレイ数で効率よく、全ての場合のミスマッチの発現の数を予測する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施形態におけるDNAマイクロアレイの一部分を示したものである。
【符号の説明】
1 支持体
2 abasicサイト
3 糖リン酸バックボーン
Claims (1)
- アミノ酸コードに対応する第3番目の塩基が、塩基を持たない糖リン酸バックボーンから成る単位を有するオリゴヌクレオチドを基板上に固定化したことを特徴とする核酸アレイ。
Priority Applications (3)
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2003
- 2003-05-14 JP JP2003135792A patent/JP2004337042A/ja active Pending
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2004
- 2004-05-13 US US10/556,508 patent/US20070099187A1/en not_active Abandoned
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