CN101203528A

CN101203528A - 对核苷类似物敏感性降低的乙型肝炎病毒变异体及其用途

Info

Publication number: CN101203528A
Application number: CNA2006800085287A
Authority: CN
Inventors: M·博兹达伊
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 2005-03-15
Filing date: 2006-03-14
Publication date: 2008-06-18
Also published as: AU2006224789A1; US7422848B2; ES2494840T3; EP1858916A1; AU2006224789B2; PT1858916E; EP1858916B1; PL1858916T3; JP2008537483A; NZ562467A; WO2006097285A1; PL1858916T4; US20060234212A1

Abstract

本发明涉及对核苷类似物在体内和体外敏感性均降低的B型肝炎变异。具体地，提供了逆转录酶突变体rtA181S。本发明提供了检测这种突变体的检测方法，该检测法可用于检测抗病毒治疗性药物，并调整患者的治疗方案。也描述了在生物样品中检测HBV变异体存在的诊断试剂盒。

Description

对核苷类似物敏感性降低的乙型肝炎病毒变异体及其用途

本发明涉及对特定药物敏感性降低的乙型肝炎病毒(HBV，也称为HBV病毒)变异体领域。更具体地，本发明涉及诊断HBV样品对用于治疗HBV感染的抗病毒药物的敏感性，涉及一种快速准确检测HBV基因中药物诱导的突变的方法和/或检测方法，以同时表征多个参与耐药性的密码子。

HBV是一种小的包膜DNA病毒，长约3200bp，属于嗜肝DNA病毒家族。在复制策略上，该病毒经RNA中间体通过反转录进行复制(Summers，1982)。HBV基因组比较复杂，含带有重叠开放阅读框(ORFs)的部分双链DNA结构，包括(i)分别编码分泌型e抗原(HBeAg)和核壳体核心蛋白(HBcAg)的preC/C ORF；(ii)编码病毒聚合酶/逆转录酶的P ORF；(iii)分别编码病毒外壳蛋白、大、中、小s抗原(HBsAg)的preSl/preS2/S ORF；及(iv)编码转录反向激活子蛋白、表面、核心、聚合酶和X基因的XORF。

乙型肝炎病毒的基因组具有较大遗传变异性，目前已识别7个HBV基因型(A到G)(Stuyver et al.，2001；Stuyver et al，2000)。病毒可通过感染的血液传播，引起疾病恶化，并可导致急性肝衰竭。虽然多数成年人可不经治疗而抵抗感染，但乙型肝炎可发展为慢性形式。事实上，全世界约4亿人口被HBV慢性感染，约15％到40％慢性HBV携带者可能发展为肝硬化和晚期肝病。不经过治疗，这些患者的预后较差，因此，开发有效的HBV抗病毒治疗是一个非常重要的目标。治疗的主要目标是控制HBV的复制，使肝病症状减轻，从而中断转向肝硬化和肝癌的进程。对那些由于肝细胞损伤而导致患有活动性炎症、丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高及HBV DNA水平(病毒复制水平)高于100.000拷贝/ml的患者进行治疗。

目前批准治疗慢性乙型肝炎的药物有α-干扰素及核苷类似物或这些药物的组合。核苷类似物是化学合成的核苷酸，可在病毒复制过程中作为组件而抑制HBV复制。

已表明干扰素(IFN)治疗仅对小部分携带者部分有效(Lok，1994)，而且由于副作用也受到限制。使用IFN-α治疗慢性HBV感染的相对失败要求治疗性药物和制剂的进一步开发。特别是，已表明多种核苷类似物可通过抑制嗜肝DNA病毒的DNA聚合酶/逆转录酶而抑制嗜肝DNA病毒的复制。其中一些化合物由于毒性(洛布卡韦)或缺乏有效性(法昔洛韦)而退出临床使用(De Clercq，1999；Schinazi，1997；Luscombe etal.，1996)。目前，治疗慢性乙型肝炎最成功的核苷类似物毫无疑问是医学批准的3′-硫胞嘧啶核苷的(-)对映体(3TC或拉米夫定))(Jarviset al，1999)。该药具有较强的抗病毒活性，耐受能力强，副作用较小。但长期使用拉米夫定治疗经常会产生病毒耐药性。其中赋予拉米夫定耐药性，并降低病毒的体外复制效率的一个常见突变是HBV RNA依赖的DNA 204位密码子处的甲硫氨酸到异亮氨酸，或甲硫氨酸到缬氨酸替代(Ling R.et al.，1996；Bartholomew M.et al.，1997；Tipples G.A.et al.，1996)。除了在保守的YMDD元件中Met到Val或到Ile的氨基酸替代(rtM204V/I)外，在逆转录酶基因的其它位点的突变基因型模式也与拉米夫定耐药性有关。特别是，已报道聚合酶B结构域的180位密码子亮氨酸到甲硫氨酸的突变(rtL180M)可部分恢复复制适应性，并增强体外耐药性。拉米夫定耐药性在HBV/HIV共感染的患者中比HBV单重感染的患者中更常见，从而必须改变拉米夫定的治疗方案(Benhamou et al.，2001；Benhamou et al.，2003；Benhamou et al.，2004；Dore GJ.et al.，2004)。

另一个治疗慢性乙型肝炎的核苷类似物是阿德福韦(ADF)的前体药物阿德福韦二匹伏酯。体外和体内研究表明该药可抑制野生型HBV株及具有拉米夫定耐药性的病毒株。因此，ADF可作为发生拉米夫定耐药时，治疗慢性HBV感染的替代药物。目前，ADF已成功通过III期临床试验(Westland CE et al，2003.)。已报道了两个介导对ADF耐药的突变。这些突变位于逆转录酶基因的181位密码子(B结构域)和236位密码子(D结构域)处，产生氨基酸替代Ala到VaI(rtA181V)和Asn到Thr(rtN236T)，(Angus P.et al，2003；Yang H.et al，2003；WO2003/087352；WO 2004/031224)。rtA181V的突变频率约为2.5％，与临床相关性未知，而1.7-2.5％使用阿德福韦治疗的患者表现为耐药突变rtN236T。

最近Perrillo等(2004)及Peters等(2004)发表的研究表明，约85％到92％拉米夫定耐药的患者其HBV DNA降低的水平大于等于接受ADF治疗的患者2个对数级。这表明8-15％的患者在加入ADF进行治疗后没有达到HBV DNA水平显著降低的水平。因此，有一部分具有拉米夫定耐药性的HBV患者对ADF治疗没有病毒学应答。对ADF无病毒应答的原因仍不清楚。

因此，虽然拉米夫定和阿德福韦具有较强的抗病毒作用，但对引起耐药性的突变株的研究仍是慢性HBV感染治疗中的一个重要问题。另外，具有交叉耐药性的HBV突变模式由于可能造成联合治疗的失败而引起了高度关注。虽然已报道了关于不同抗病毒药物对HBV突变株的交叉耐药性的研究试验(Delaney et al.，(2001)，Xiong et al.，(2001))，但迄今仍没有发现对体内和体外阿德福韦和拉米夫定均耐药的突变模式。

从以前的实验表明，需要监测对特定药物敏感性降低的HBV突变株的出现或存在，从而筛选和/或开发和/或设计其它具有适于作为新型治疗药物的特性的药物，根据本发明，发明人鉴定了在HBV DNA聚合酶基因具有突变，从而降低HBV对核苷类似物敏感性的HBV变异体。

发明概述

本发明旨在解决对核苷类似物敏感性降低的HBV变异体出现或存在的监测不充分的问题。

本发明涉及在DNA聚合酶基因中含至少一个核苷酸突变的分离的HBV变异体，其中所述核苷酸突变可在HBV聚合酶中产生至少一个氨基酸替代，其中所述变异体对核苷类似物ADF和/或LAM和/或其组合的敏感性降低。

本发明进一步涉及来自这些HBV变异体的分离的多聚核酸(polynucleic acid)，所述分离的多聚核酸含一个可在聚合酶基因中产生至少一个氨基酸替代和/或缺失的核苷酸突变，该核苷酸突变可导致对核苷类似物ADF和/或LAM和/或其组合的敏感性降低；及含所述核苷酸突变的所述HBV多聚核酸的片段。

本发明进一步涉及来自这些分离核酸及其片段的表达产物。

本发明的另一个方面涉及含本发明的HBV变异体或多聚核酸或表达产物的组合物，优选地应用于监测和/或鉴定HBV变异体。

本发明的另一个方面涉及上述分离的HBV变异体和/或其多聚核酸和/或表达产物和/或组合物在制订临床决策中的用途。具体地，本发明的HBV变异体或多聚核酸或表达产物或组合物可用于筛选至少一种无交叉耐药性的抗HBV药物。具体地，本发明的HBV变异体和/或多聚核酸和/或表达产物和/或组合物可用于检测HBV变异体多聚核酸的方法。

本发明进一步涉及治疗HBV感染的方法，包括给药感染HBV的患者核苷类似物，用所述的HBV变异体测定患者是否感染HBV变异体，如果是，则给药患者至少一种无交叉耐药性的抗HBV药物。

本发明进一步包括在生物样品中检测本发明的HBV变异体存在的方法。所述方法包括检测HBV多聚核酸或其片段存在的步骤。

最后，本发明涉及在生物样品中检测HBV变异体存在和/或检测生物样品中存在的HBV对抗病毒药物的耐药性的诊断试剂盒。另外，提供一种筛选对含上述多聚核酸的HBV有活性的药物。

另外，提供一种可将HBV多聚核酸或其片段中181位新的编码丝氨酸的密码子与181位已知的编码丙氨酸或缬氨酸的密码子进行区分的寡核苷酸。

附图说明

图1.患者病史示意图。

X-轴表示时间。在X轴下是以月(MU/TIW表示一周用3次百万单位的干扰素)表示的HBV感染患者AA的连续治疗。在Y轴左边给出病毒DNA的载量(用美国Digene的液相杂交检测法测定每毫升血清中HBV DNA的pg量)。患者AA血清样品中的HBV DNA水平用黑实线表示。在Y轴右边，给出ALT-水平(丙氨酸氨基转移酶，100IU/mL，100国际单位/ml)。图上方的垂直箭头表示随着病毒反弹的ALT升高。

图2(2a和2b)：从抗病毒治疗开始，在不同时间段HBV DNA聚合酶序列的比对结果。

比对的是来自Genebank登录号为NO X02496，核苷酸序列表示为SEQ ID NO.：1及对应的氨基酸序列表示为SEQ ID NO.：9的HBV DDNA聚合酶/逆转录酶的片段与6个患者AA从抗病毒治疗开始，在不同时间段获得的HBV DNA聚合酶/逆转录酶核苷酸序列及对应的氨基酸序列。这6个核苷酸序列表示为SEQ ID 2和3，对应的氨基酸序列分别为SEQ ID 10和11。采血日期表示为XX/YY，其中XX表示采血的月，而YY表示采血的年。从抗病毒治疗开始的时间段表示为MZZ，以月为单位。

图3(3a，3b和3c)：HBV DNA聚合酶序列的比对结果。

比对的是图2所述的HBV DNA聚合酶/逆转录酶片段与7个在第42个月获得的来自患者AA的HBV DNA聚合酶/逆转录酶的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列。采血时间是06/02。这7个核苷酸序列表示为SEQID 4到8，对应的氨基酸序列为SEQ ID 12到14。

图4：HBV在瞬时转染的Huh7细胞系的细胞培养上清中的产生。

Y轴上的HBV产生的拷贝数的Log值根据X轴上用含A181S+M204I突变模式的全长HBV基因组克隆转染后下检测培养基中的天数作图。0天表示转染Huh7细胞系之前。

发明详述

根据本发明，发明人在慢性HBV感染患者中鉴定出HBV变异体，所述的感染的HBV对ADF或含ADF的治疗和/或LAM或含LAM的治疗和/或这些抗HBV药物的组合无应答。分离的HBV DNA的序列分析表明在HBV聚合酶中出现了新型的核苷酸多态性。所述多态性的发生与病毒在核苷类似物治疗中的反弹是一致的，强烈表明耐受阿德福韦的HBV变异体的发生/存在。体外研究表明这些HBV突变体对阿德福韦和拉米夫定是耐药的，甚至使用高浓度核苷类似物治疗时仍是耐药的。

更具体地，本发明提供一种诊断HBV样品对用于治疗HBV感染的抗病毒药物的敏感性的改进方法，和/或一种快速准确检测HBV基因中药物诱导的突变的方法和/或改进检测法，可同时对参与耐药性的多个密码子进行表征，所述的密码子包括新型的核酸多态性。

在本发明中引用了以下多个参考文献。所述文献的内容作为参考引入本发明中。所述文献用于详细描述本发明涉及的技术。

本发明的第一个方面涉及在DNA聚合酶基因中含至少一个核苷酸突变的分离的HBV变异体，其中所述核苷酸突变可在聚合酶基因的B结构域中产生至少一个氨基酸替代，其中所述变异体对核苷类似物和/或其它针对HBV的抗病毒药物的敏感性降低。优选的HBV变异体含至少一个核苷酸突变，可导致聚合酶基因的第181位丙氨酸密码子处发生的至少一个氨基酸替代，更具体地，至少含一个核苷酸突变，其可导致聚合酶基因的第181位密码子所编码的丙氨酸替代为丝氨酸，也表示为rtA181S。根据本发明的分离的HBV变异体优选地对核苷类似物的敏感性降低，具体地核苷类似物是阿德福韦和/或拉米夫定。

本发明也包括除了rtA181S外，在HBV聚合酶的其它位点含其它突变基因型模式的分离的HBV变异体。优选地，另外的突变可导致聚合酶基因的任何不同结构域的氨基酸序列改变。这些改变包括已知的与耐药性相关的氨基酸改变。因此，本发明包括含聚合酶基因B结构域rtA181S替代和至少另一个编码氨基酸替代的突变的分离的HBV变异体，所述另外的突变可选自180位亮氨酸的替代、204位甲硫氨酸的替代和236位天冬酰胺的替代。具体地，分离的变异体含有rtA181S和rtM204I、或rtA181S和rtM204V、或rtA181S和rtM204S、或rtA181S和rtL180M、或rtA181S和rtN236T替代。

本发明也包括除了rtA181S外，在HBV聚合酶基因C结构域还含其它突变的基因型模式的分离的HBV变异体。更具体地，核苷酸替代可导致聚合酶基因C结构域204位甲硫氨酸密码子发生替代。特别是包括在DNA聚合酶基因含至少两个核苷酸突变的分离的HBV变异体，其中所述核苷酸突变导致至少两个氨基酸替代，一个为聚合酶B结构域181位丙氨酸密码子的替代，另一个为聚合酶C结构域204位甲硫氨酸密码子的替代。204位甲硫氨酸密码子的替代是指用除甲硫氨酸外的任何氨基酸进行替代，优选地替代氨基酸选自异亮氨酸、缬氨酸和丝氨酸。

示例的HBV变异体在HBV聚合酶B结构域含有rtA181S替代，在HBV聚合酶C结构域含有rtM204I替代。本发明的分离的HBV变异体对针对HBV的抗病毒药物，优选地对核苷类似物的敏感性降低。

术语“突变”具有最宽的含义，包括多种突变。应理解本发明包括在DNA聚合酶基因中含至少一个和/或两个和/或三个和/或四个和/或五个和/或六个核苷酸突变的分离的HBV变异体，其中所述核苷酸突变可导致至少一个和/或两个和/或三个和/或四个和/或五个和/或六个氨基酸替代，一个是聚合酶基因B结构域181位丙氨酸密码子替代为除丙氨酸以外的任何氨基酸，优选地为丙氨酸替代为丝氨酸。

“分离的”当用于本发明的HBV变异体和/或HBV多聚核酸和/或表达产物时是指变异体或多聚核酸进行了至少一个纯化步骤，使其区别于天然的体液和/或组织，或是指其不存在于天然环境中。可选择地，变异体可保持在分离的体液和/或组织中，或以多聚核酸形式存在。典型地，这表示病毒变异体或多聚核酸不含有至少一种宿主蛋白和/或宿主核酸。通常，分离的病毒变异体或多聚核酸存在于体外环境中。“分离的”并不表示病毒变异体或多聚核酸必需是纯的或均质的，虽然这种制备物确实包括在该术语的范围内。“分离的”仅表示具有一定的纯度，一定程度上需要去除在权利要求范围之外的天然产物和其它物质。“分离的”既可以是包括任何直接来源于感染的人也可以是动物或培养(富集)后的任何生物材料。“生物材料”可以包括例如任何类型的痰、支气管肺灌洗液、血液、皮肤组织、活组织切片、精液、淋巴血培养物、集落、液体培养物、粪便样品、尿液等。“生物材料”也可以是人工感染细胞培养物或其液体形式。

对核苷类似物的敏感性“降低”或“下降”包括对核苷类似物完全或基本上耐药，及部分耐药，是指复制速率或复制效率在存在核苷类似物时高于野生型。在一个方面中，是指在治疗时病毒载量增加，或可选择地，在治疗时HBV DNA病毒载量与治疗前其HBV DNA水平没有实质性降低(即对治疗无应答)。优选地，“降低的敏感性”是针对ADF。可选择地，“降低的敏感性”针对LAM。可选择地，“降低的敏感性”是针对LAM和ADF。可选择地，“降低的敏感性”是针对ADF和/或LAM和/或其它核苷类似物和/或其它针对HBV的抗病毒药物。有多种针对HBV的抗病毒药物(HBV抗病毒药物)是已知的，包括：洛布可韦、喷昔洛韦、或泛昔洛韦、拉米夫定(3TC；β-L-(-)-2′，3′-双脱氧-3′-硫胞嘧啶核苷)、干扰素-α、阿德福韦二匹伏酯(Bis-POM-PMEA)或阿德福韦(PMEA；9-(2-膦酰甲氧基)-腺苷)、恩替卡韦(BMS 200475)、恩曲他滨[(-)FTC；(-)-β-L-2′，3′-双脱氧-5-氟-3′-硫胞嘧啶核苷]、DXG[(-)-β-D-2，6-二氨基嘌呤二噁茂烷]、DAPD(二氨基嘌呤二噁茂烷)、克拉夫定(L-FMAU；2’-氟-5-甲基-β-L-阿糖呋喃脲嘧啶)、L-dT(β-L-胸苷)、L-Fd4C(2′，3′-双脱氧-2′，3′-双氧氢-β-L(-)-5-氟胞嘧啶)、膦甲酸、卡波韦、racivir、更昔洛韦、泰诺夫韦、奈韦拉平、(-)BCH189(Ono et al.，2001)、QYL865(Fu et al.，2000)、胸腺肽-α和抗HBsAg抗体HBIg。可将两种或多种HBV抗病毒药物组合使用。

由于在末端蛋白和蛋白的催化部分的接头或间隔区结构域中存在插入或缺失，因此并不是所有的HBV基因组都有相同的长度，同样，聚合酶也不相同。为了克服这个问题，研究者针对聚合酶开发了不依赖于基因型的计数方案。在HBV聚合酶基因中表示突变密码子的可能方式根据Stuyver等(2001)所述，其中聚合酶催化C结构域YMDD位点的甲硫氨酸(M)计数为rtM204，而不是539、549、550或552。该计数体系应用于本发明中。因此，HBV DNA聚合酶基因中与慢性乙型肝炎核苷类似物治疗相关的突变在B结构域中描述为rtL180M和rtA181V，C结构域中为rtM204I和rtM204V，D结构域中为rtN236T。

本发明的另一个方面涉及编码本发明的HBV变异体的分离的多聚核酸。这些分离的多聚核酸含有可导致HBV聚合酶中至少一个氨基酸替代和/或缺失的核苷酸突变。特别是本发明涉及在聚合酶基因181位密码子含有核苷酸突变的分离的多聚核酸，具体地含有至少一个导致聚合酶181位丙氨酸密码子替代的核苷酸突变。更具体地，分离的多聚核酸含有导致rtA181S氨基酸替代的核苷酸突变。

本发明也包括除rtA181S外，在HBV聚合酶的其它位点含其它突变的基因型模式的分离的多聚核酸。优选地，其它的突变可导致聚合酶基因的任何不同结构域的氨基酸序列发生改变。这些突变包括与耐药相关的已知氨基酸改变。因此，本发明包括在聚合酶B结构域含rtA181S替代，及至少一个其它的选自rtL180M、rtM204I或rtM204V或rtM204S和rtN236T的氨基酸替代的突变的分离的多聚核酸。

本发明也包括除编码rtA181S外，在聚合酶C结构域含其它突变的基因型模式的分离的多聚核酸。更优选地，其它的核苷酸突变可导致聚合酶基因C结构域204位甲硫氨酸密码子发生替代。具体地，包括在DNA聚合酶基因中至少含两个核苷酸突变的分离的HBV变异体，其中所述核苷酸突变可导致至少两个氨基酸替代，一个是聚合酶基因B结构域181位丙氨酸密码子的替代，一个是聚合酶基因C结构域204位甲硫氨酸密码子的替代。204位甲硫氨酸密码子的替代是指包括除甲硫氨酸外的任何其它氨基酸，优选地替代为异亮氨酸和/或缬氨酸和/或丝氨酸。

示例的多聚核酸在DNA聚合酶基因中含有编码聚合酶基因B结构域的rtA181S替代，和例如聚合酶基因C结构域的rtM204I替代的核苷酸突变。在特定技术方案中，所述分离的HBV多聚核酸含有选自SEQ IDNO.：2、SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：5、SEQ ID NO.：6和SEQ ID NO.：7的序列。更具体地，所述分离的HBV多聚核酸定义为选自SEQ IDNO.：2、SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：5、SEQ ID NO.：6和SEQ ID NO.：7的序列。

本发明的另一个方面涉及上述分离的多聚核酸的片段，其中片段含有所述的导致对核苷类似物和/或其它抗HBV药物的敏感性降低的核苷酸突变。这些片段中至少含有导致rtA181S替代的基因型模式。

在另外的技术方案中，所述的分离HBV多聚核酸可以是DNA或RNA、或其中T被U替代的RNA、或是合成的多聚核酸。

编码本发明的变异体的多聚核酸长度可有不同，可因选择突变残基密码子旁侧的碱基而不同。多聚核酸的长度不进行严格定义，可根据目的不同而被识别为乙型肝炎病毒序列的一部分。在病毒基因组中存在大量序列变异，因此变异位点旁侧的核苷酸序列甚至在天然存在的序列中也具有多种变化。所需的大量多聚核酸仅是为了提供编码变异体的序列的新颖性和有用性，而选择的密码子旁侧的序列长度并不重要。典型地，序列长度(包括变异的密码子)可为任何整数，从9到200bp，通常为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24到25bp。也包括足够长的编码整个变异体和下述片段的序列。

本发明的“分离的多聚核酸或其片段”是指直接从样品获得的或复制、增殖或扩增后获得的单链多聚核酸、双链多聚核酸或三聚体形式的多聚核酸。在本文中的“获得的”是指从生物样品中分离和/或纯化和/或扩增所述多聚核酸。“样品”可以是任何直接从感染的人或动物或培养(富集)后获得的生物材料。“复制、增殖或扩增”是指任何通过任何核酸扩增方法，包括任何测序技术产生的任何核酸。因此，应理解产生含任何所述的，或所述的核酸多态性组合的核酸分子的任何测序技术包括在术语“复制、增殖或扩增”中。

术语“合成的多聚核酸”此处是指单链多聚核酸、双链多聚核酸或三聚体形式多聚核酸。可通过核苷酸序列扩增方法在体外合成多聚核酸。如果这种扩增的多聚核酸是双链的，可通过合适的外切酶获得单链分子，只要所需的单链多聚核酸能被所述的外切酶活性所保护即可。可选择地，多聚核酸可来源于含包括相应的多核苷酸序列插入的重组质粒，如果需要，用合适的核酸酶通过从克隆的质粒上切割后者并进行回收，例如，根据分子量进行分离。其它体外产生合成的多聚核酸的方法包括任何核酸测序方法。因此测序反应的产物包含在术语“合成的多聚核酸”中。根据本发明的多聚核酸也可以是化学合成的，例如通过传统的磷酸三酯或亚磷酰胺化学法合成。

“核苷酸序列(DNA或RNA)扩增”是指包括所有可扩增靶核苷酸序列拷贝数目的方法。核苷酸序列扩增方法包括聚合酶链反应(PCR；DNA扩增)、链替代扩增(SDA；DNA扩增)、基于转录的扩增系统(TAS；RNA扩增)、自动维持序列复制(3SR；RNA扩增)、基于核酸序列的扩增(NASBA；RNA扩增)、转录介导的扩增(TMA；RNA扩增)、Qβ-复制酶扩增及失控转录。

此处所用术语“多核苷酸”、“多聚核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸分子”、“寡核苷酸”、“探针”或“引物”是指任何长度或任何形状(例如分支DNA)的以多聚形式存在的核苷酸，或者是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、肽核苷酸或锁定核苷酸，或其组合。所述术语进一步包括双链(ds)和单链(ss)多核苷酸和三链多核苷酸。所述术语也包括已知的核苷酸修饰，例如甲基化、环化及“加帽”及一个或多个天然存在的核苷酸替代为类似物，例如次黄嘌呤或非扩增单体，例如HEG(乙二醇己醚)。

核糖核苷酸定义为NTPs、脱氧核糖核苷酸为dNTPs，双脱氧核糖核苷酸为ddNTPs。

核苷酸通常进行放射性、化学、荧光、磷光或红外染料或表面增强的Raman标记或等离子共振颗粒(PRP)标记。

核苷酸的修饰包括增加吖啶或其衍生物Acrydite^TM、胺、生物素、BHQ-1^TM、BHQ-2^TM、BHQ-3^TM、硼烷dNTPs、碳间隔区(例如C₃、C₆、C₇、C₉、C₁₂或C₁₈)、cascade blue、胆固醇、香豆素或其衍生物

DABCYL、丹磺酰氯、地高辛、二硝基苯基、二生物素、EDANS、6-FAM、荧光素、3′-甘油基、HEX、IAEDANS、反向dA、反向dG、反向dC、反向dG、IRD-700、IRD-800、JOE、La JollaBlue、金属簇，例如金纳米颗粒、苯硼酸、磷酸补骨脂素、3′-或5′-磷酸芘、3′核糖腺苷、3′核糖鸟苷、3′核糖胞嘧啶、(LC)Red640、(LC)Red705、罗丹明、ROX、硫醇(SH)、间隔区、TAMRA、TET、

SE、

Marina

Oregon

Pacific

QSY7^TM、罗丹明

罗丹明

Rhodol

四甲基罗丹明、Texas

Uni-Link NH₂-修饰物、放射性标记(例如¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、¹⁴C、³²P、³³P、³H)和纳米颗粒。

多核苷酸骨架和碱基修饰进一步包括2′-脱氧芒霉素(2′-deoxyaristeromecyin)、磷酸甲基酯、2′-OMe磷酸甲基酯RNA、2′-O-(2-甲氧乙基)、硫代磷酸酯(phosphorothiorate)、烷基硫代磷酸酯(alkylphosphorothiate)、亚磷酰胺、RNA，2′-OMeRNA，2-氨基-dA，2-氨基嘌呤、3′-(ddA)、3′dA(虫草菌素)、7-脱氮-dA、8-Br-dA、8-氧-dA、N⁶-Me-dA、非碱基位点(dSpacer)、生物素-dT、2′-OMe-5Me-C、2′-OMe-丙炔基-C、3′-(5-Me-dC)、3′-(ddC)、5-Br-dC、5-I-dC、5-Me-dC、5-F-dC、羧基-dT、可转换的dA、可转换的dC、可转换的dG、可转换的dT、可转换的dU、7-脱氮-dG、8-Br-dG、8-氧-dG、O⁶-Me-dG、S6-DNP-dG、4-甲基-吲哚、5-硝基吲哚、2′-OMe-肌苷、2′-dI、O⁶-苯基-dI、4-甲基-吲哚、2′-脱氧水粉蕈素、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、dP(嘌呤类似物)、dK(嘧啶类似物)、3-硝基吡咯、2-硫代-dT、4-硫代-dT、生物素-dT、羧基-dT、O⁴-Me-dT、O⁴-三氮唑dT、2′-OMe-丙炔基-U、5-Br-dU、2′-dU、5-F-dU、5-I-dU、O⁴-三氮唑dU。

多核苷酸的其它修饰包括半抗原或蛋白标记。半抗原包括，例如生物素和地高辛，而蛋白包括酶，例如大豆或辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、谷光甘肽S-转移酶或二氢叶酸还原酶，或由异源抗原决定簇组成，例如(组氨酸)6标签、蛋白A、甘露糖结合蛋白、标签100抗原决定簇(EETARFQPGYRS；SEQ ID NO.：15)、c-myc抗原决定簇(EQKLISEEDL；SEQ ID NO.：16)、

抗原决定簇(DYKDDDK；SEQ ID NO.：17)、lacZ、CMP(钙调素蛋白结合肽)、HA抗原决定簇(YPYDVPDYA；SEQ ID NO.：18)、蛋白C抗原决定簇(EDQVDPRLIDGK；SEQ ID NO.：19)和VSV抗原决定簇(YTDIEMNRLGK；SEQ ID NO.：20)。其它蛋白包括组蛋白、单链结合蛋白(ssB)和天然或人工荧光蛋白，例如绿色、红色、蓝色、黄色花青素荧光蛋白。交联部分可包括例如香豆素类、呋喃香豆素类或苯并二吡喃酮、或其任何衍生物。

在进一步的技术方案中，所述术语“多核苷酸”、“多聚核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸分子”、“寡核苷酸”、“探针”或“引物”也包括肽核酸(PNAs)，它是一种DNA类似物，其中骨架是由N-(2-氨基乙烷基)-氨基乙酸单元而不是糖组成的假肽。PNAs可模拟DNA的行为，与互补核酸链结合。PNA的中性骨架可导致比通常情况下的结合更强烈，特异性更高。另外，PNA独特的化学、物理和生物特性使其可用作有用的生物分子工具、反义和反基因试剂、分子探针和生物传感器。PNA探针通常比DNA探针更短，通常长度为6到20个碱基，更优选地是12到18个碱基长度(Nielsen，2001)。

在另外的技术方案中，所述术语进一步包括锁定核酸(LNAs)，它是RNA衍生物，其中核糖环被2′-氧和4′-碳之间的亚甲基连接所限制。LNA核苷酸可以是寡聚的，包括嵌和或混合嵌和的LNA/DNA或LNA/RNA分子。LNAs可能对培养细胞是无毒的(Oram et ah，2001；Wahlestedt et al.，2000)。通常，DNA、RNA、PNA和LNA的嵌和子或混合物中胸腺嘧啶被尿嘧啶替代。

术语“核酸多态性”或“核苷酸序列多态性”是指通过研究与之相关的一个或多个参考核酸的一级核苷酸序列而得到的核酸一级核苷酸序列中的任何差异。最简单的核酸多态性是单核苷酸引起的多态性，即单核苷酸多态性或SNP。核酸多态性进一步包括通过研究与之相关的一个或多个参考核酸的一级核苷酸序列而得到的核酸一级核苷酸序列中任何数量的连续和/或不连续差异。上述解释也用于术语“多态性变异体”中。

对潜在的病毒变异体的评估对筛选合适的治疗方案是非常重要的。这种评估在计算机软件程序的协助下会更方便。因此，在另一个技术方案中，所述分离的HBV多聚核酸序列或其片段，或其衍生的氨基酸序列可以单字节、双字节或多字节方式作为ASCII-、十六进制-或UNICODE代码，或作为二元代码。在另外的技术方案中，所述以单字节、双字节或多字节方式作为ASCII-、十六进制或UNICODE代码或作为二元代码的序列可被计算机识别。在另一个技术方案中，所述以单字节、双字节或多字节方式作为ASCII-、十六进制或UNICODE代码或作为二元代码的序列可被计算机读取载体记录，或整合在计算机识别数据库中。在另一个技术方案中包括含以单字节、双字节或多字节方式作为ASCII-、十六进制或UNICODE代码或作为二元代码的所述序列的计算机识别载体。在本发明的另一个技术方案中，展望了含以单字节、双字节或多字节方式作为ASCII-、十六进制或UNICODE代码或作为二元代码的所述序列的计算机识别载体。在另一个技术方案中，所述以单字节、双字节或多字节方式作为ASCII-、十六进制或UNICODE代码或作为二元代码的序列用于比较序列或进行序列比对的算法中。

在本发明的另一个方面中，包括含本发明的分离的HBV多聚核酸或其片段的载体。在一个具体实施方案中，所述载体是表达载体。在另一个具体实施方案中，所述载体是病毒或逆转录病毒载体。

在另一个技术方案中，所述载体是通用克隆载体，例如pUC-系列或pEMBL-系列载体，或克隆载体，例如需DNA拓扑异构酶反应进行克隆的克隆载体，TA-克隆载体和基于重组的克隆载体，例如那些用于门控系统的载体(InVitrogen)。载体包括质粒、噬菌粒、粘粒或穿梭质粒(杆状病毒载体)。载体可仅仅作为克隆工具和/或载体或可另外含有调控序列，例如启动子、增强子和终止子或多聚腺苷信号。所述调控序列可表达所含的克隆在载体中的具有所述调控序列的目标DNA片段的信息。表达可产生RNA分子或mRNA分子，及可选择地，产生其蛋白分子。表达可通过引入到目标DNA 5′-或3′-端的病毒聚合酶启动子(例如，SP6、T7或T3)来产生RNA分子。

表达可以是瞬时表达或稳定表达，或可选择地，为调控表达。调控表达包括诱导表达，例如用四环素调控启动子、胁迫诱导(例如，人hsp70基因启动子)、金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子或黄体酮启动子。启动子进一步包括HBV启动子，例如核心启动子和异源启动子，例如细胞巨化病毒(CMV)中间体早期(IE)启动子。

启动子也可优选地可在肝肿瘤细胞中启动表达，例如，α-甲胎蛋白基因的启动子和增强子。表达载体是本领域公知的可在细菌(例如，大肠杆菌、链球菌种)、真菌(例如，酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、毕赤酵母、曲霉种、汉逊酵母、粗糙脉孢菌)、昆虫细胞(草地贪夜蛾细胞，Sf9细胞)、植物细胞(例如，马铃薯病毒基于X的表达载体，参见例如Vance等1998在WO 98/44097中所述)和哺乳动物细胞(例如，CHO或COS细胞、Vero细胞、来自HeLa细胞系的细胞)中介导表达的载体。本发明中特别合适的宿主细胞是哺乳动物，例如人、原代肝细胞、肝肿瘤细胞系(例如，HepG2、HepT1、HepT3、Huh6、Huh7)、Chang肝细胞、灵长类肝细胞、人肝细胞或其它哺乳动物，例如人、宿主细胞或细胞系。

载体或表达载体可在宿主细胞中自主复制，或是整合载体，即载体完全或部分稳定地整合在宿主细胞的基因组中。如果所述第一DNA片段旁侧带有例如位点特异的重组位点或转座子典型的重复序列，则任何第一DNA片段，例如载体或其片段在任何第二DNA片段，例如宿主细胞的基因组中的整合均可以逆转。可选择地，所述位点特异的重组位点或转座子重复序列包含在所述的第二DNA片段中，且在所述第一DNA片段的旁侧。在另一个选择中，所述第一DNA片段可通过同源重组引入到合适的第二DNA片段中，同样的过程可用于通过另外合适的DNA片段交换所述第一DNA片段。

将载体或表达载体引入到宿主细胞中可通过任何本领域中公知的可获得的适于所述宿主细胞的转化或转染技术进行。这种转化或转染技术包括热休克介导的转化(例如大肠杆菌)、接合DNA转移、电穿孔、PEG介导的DNA吸收、脂质体介导的DNA吸收、脂质转染法、磷酸钙DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、通过例如微注射或颗粒轰击直接导入，或通过病毒、病毒体或病毒粒子导入。

通常，用HBV病毒(例如来自患者血清或细胞培养)不能感染例如HepG2细胞培养物，但可通过用二甲基亚砜(DMSO；(Paran et al.，2001))预处理宿主细胞而刺激发生感染。可选择地，用V8蛋白酶消化HBV可产生感染性HBV病毒(Lu et al.，1996)。用相同的蛋白酶修饰至少一种其它的嗜肝病毒，例如woodchuck肝炎病毒(WHV)，同样可产生能感染人肝母细胞瘤细胞的WHV病毒(Lu et al.，2001)。已报道HBV基因在肝母细胞瘤细胞中的表达可通过降低温育温度从37℃到32℃而显著增加(Kosovsky et al.，2000)。

适于检测病毒复制效率，更具体地检测HBV复制效率的载体包括病毒载体或含至少一个单位(全长)HBV基因组的载体，优选地多于1个单位HBV基因组，例如1.1-4个，具体为1.1、1.2、1.28、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0或4.0倍HBV基因组。可进行HBV病毒复制的病毒载体系统的一个例子是杆状病毒系统，例如，如Isom和Harriet在国际专利出版物WO 99/37821或Delaney等(Delaney et al.，1999)中所述。病毒复制的程度可通过测定或检测一个或多个以下物质而进行监测：(i)HBV抗原(HBsAg或HBeAg)的分泌，(ii)HBV转录物的表达(3.5kb-、2.4kb-、2.1kb-、0.7kb-转录物)，(iii)HBV复制中间体的量(松弛的环状DNA、双链DNA或单链DNA)，(iv)HBV超螺旋环状(ccc)DNA的量，(v)分泌的胞外HBV DNA的量，(vi)胞外产生的HBV颗粒的量，(vii)产生的HBcAg蛋白的量，(viii)产生的HBV DNA聚合酶/逆转录酶蛋白的量，和(ix)产生的HBV X蛋白的量。可进行HBV病毒复制的病毒载体系统的另一个例子是包括指示基因(例如选择标记基因或筛选标记基因；例如Capon和Petropoulos在美国专利US 6242187中所述)的载体系统，其表达可作为病毒复制程度的指示。

可进行HBV病毒复制的病毒载体系统适于比较野生型HBV病毒的复制效率和突变型HBV病毒的复制效率。突变型HBV病毒是在一个或多个HBV ORFs和/或HBV调控序列(例如启动子、增强子、终止子或多聚腺苷信号、ε-环、重复序列、包装信号、内部核糖体进入位点)中含突变或多聚核酸多态性的HBV病毒。

本发明的另一个方面涉及含本发明的HBV多聚核酸或其片段，或含本发明的HBV DNA聚合酶/逆转录酶蛋白或其片段，或含本发明的HBV变异体，或含本发明的载体的宿主细胞。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物肝细胞或哺乳动物肝细胞瘤，如上所述。

本发明进一步涉及分离的多聚核酸的表达产物。这些表达产物可来自上述任何多聚核酸和/或其片段的表达。

所述表达产物包括蛋白、多肽、寡肽、RNA或mRNA。此处所用术语“蛋白”、“肽”、“寡肽”是指任何长度的多聚体形式的氨基酸。所述术语也包括已知的氨基酸修饰，例如二硫键形成、半胱氨酸化、氧化、谷光甘肽化、甲基化、5-乙酰化、法尼基化、生物素化、十八烷酰化、甲酰化、硫锌酸增加、磷酸化、硫酸化、泛素化、十四酰化、棕榈酰化、牦牛儿基化、环化(例如焦谷氨酸形成)、脱氧化、脱酰化、脱氢化、糖基化(例如戊糖、己糖胺、N-乙酰己糖胺、脱羟己糖、己糖、唾液酸等)和酰化，及非天然存在的氨基酸残基，L-氨基酸残基和D-氨基酸残基。可进行多种所述的本领域技术人员掌握的氨基酸修饰作为翻译后修饰。其它的修饰包括对蛋白、肽或寡肽的一个或多个氨基酸增加化学基团。所述化学基团包括例如生物素。蛋白、肽或寡肽通常是放射性、化学发光、荧光、磷光、红外染料或表面增强的拉曼标记或等离子共振颗粒标记的。

本发明包括在聚合酶基因中至少含一个氨基酸替代和/或缺失的表达产物。具体地，本发明涉及在聚合酶基因181位密码子处含氨基酸替代的表达产物，更具体地，该替代可导致聚合酶基因181位丙氨酸密码子替代为丝氨酸。更具体地，表达产物含氨基酸替代rtA181S。

本发明也包括除rtA181S外，在聚合酶C结构域处含其它氨基酸替代的表达产物。更优选地，聚合酶C结构域204位甲硫氨酸密码子发生替代。具体地，在DNA聚合酶中至少含两个氨基酸替代的表达产物，一个是聚合酶基因B结构域181位丙氨酸密码子替代为丝氨酸，另一个是聚合酶基因C结构域204位甲硫氨酸密码子发生替代。204位甲硫氨酸密码子的替代是指除甲硫氨酸外的任何氨基酸，优选地替代为异亮氨酸或缬氨酸或丝氨酸。

本发明也包括除rtA181S外，在HBV聚合酶其它位点含其它氨基酸替代的表达产物，优选地至少一个氨基酸替代选自rtL180M、rtM204I或rtM204V或rtM204S和rtN236T。其中204位密码子的不同突变用两次“或”表示。

示例的表达产物在聚合酶B结构域含rtA181S替代，可选择地，在聚合酶C结构域含rtM204I替代。在一个具体实施方案中，所述分离的HBV表达产物含选自SEQ ID NO.：10、SEQ ID NO.：11、SEQ ID NO.：13和SEQ ID NO.：14的序列。更具体地，所述分离的HBV多聚核酸定义为选自SEQ ID NO.：10、SEQ ID NO.：11、SEQ ID NO.：13和SEQ ID NO.：14的序列。

本发明的另一个方面涉及上述表达产物的片段，该片段含有所述导致对核苷类似物和/或其它抗HBV药物敏感性降低的氨基酸替代。这些片段至少含rtA181S替代。

表达产物包括至少含突变残基或位点的全长乙肝病毒聚合酶和/或逆转录酶及其片段的多肽，和/或与异源多肽融合的多肽。

表达包括产生含所述突变基因型模式的RNA分子或mRNA分子。此处所用“异源的”是指多聚核酸或蛋白序列与天然或已知旁侧序列不相同。异源序列包括其它HBV、人、动物或微生物序列、多聚His或其它亲和标签，或完全构建的序列。片段典型地包括变异残基和至少4个位于突变残基一侧或两侧的旁侧残基，通常总长度为10到20个残基。

本发明进一步包括可区分本发明的HBV多聚核酸或其片段中HBV逆转录酶结构域编码丝氨酸的第181位密码子与HBV逆转录酶结构域181位丙氨酸或缬氨酸的密码子的寡核苷酸部分。

此处所用术语“寡核苷酸”是指引物或探针，可以是单链的或双链的，或是三聚体形式多聚核酸的一部分。可通过体外核苷酸扩增方法制备寡核苷酸。如果这种扩增的寡核苷酸是双链的，则可通过合适的外切酶将其转化为单链分子，只要所需的单链寡核苷酸被所述的外切酶活性所保护即可。可选择地，寡核苷酸可来源于含包括对应的核苷酸序列的插入子的重组质粒，如果需要，可用合适的核酸酶从克隆的质粒中切割后者，并根据分子量，例如，通过分馏进行回收。根据本发明的寡核苷酸可以是合成的，即化学合成，例如，通过传统的磷酸三酯或亚磷酰胺化学法合成。寡核苷酸可进一步在玻璃基片上通过固相寡核苷酸合成或通过光照蚀刻合成法进行原位合成(Beaucage，2001)。

在另一个具体实施方案中，根据本发明的寡核苷酸进一步包括修饰，以使所述寡核苷酸固定在固体支持物上。所述修饰可以是，例如，寡核苷酸的氨基-、巯基-、3′-丙醇胺或Acrydite-修饰，或包括对寡核苷酸增加均聚物尾(例如，通过末端转移酶酶学增加或合成增加寡聚(dT)尾)。如果所述均聚物尾位于寡核苷酸的3’末端，或如果任何其它抑制酶学延伸的3’末端修饰整合在寡核苷酸中，则寡核苷酸的基本功能可能会降低或消失。其它修饰在例如(Beaucage，2001)中描述。显然，根据本发明，作为DNA、RNA、PNA或LNA，或其任何嵌和体的寡核苷酸包括在本发明中。其它包括含至少一种本发明的寡核苷酸的组合物。

“杂交”是基本同源的互补核苷酸序列互相结合的过程。杂交过程可完全在溶液中发生，即两个互补的核酸均在溶液中。依赖于该过程的分子生物学工具包括PCR、减法杂交及DNA序列测定。杂交过程也可以在其中一个互补的核酸固定在基质上例如磁珠、葡聚糖珠或任何其它树脂或其它类型的珠子上来进行。依赖于该过程的分子生物学工具包括多聚(A)mRNA的分离。杂交过程也可以在其中一条互补核酸固定在固相支持物，例如硝酸纤维素或尼龙膜、玻片或融合硅(石英)玻片(后者已知作为核酸阵列或微阵列或核酸芯片)、金膜、聚吡咯膜、光学纤维或，例如在聚丙烯酰胺胶或微板孔中进行。依赖于该过程的分子生物学工具包括RNA和DNA凝胶印迹分析、克隆杂交、斑点杂交、反向杂交和微阵列杂交。为了使杂交发生，核酸分子通常进行热、化学(例如通过NaOH)或电化学变性，以熔化双链为单链和/或除去发卡或“分子信标”探针(单链双元标记)或其它单链核酸中的二级结构。

本发明的核酸序列可进一步与外部引导序列(EGS)或短外部引导序列(SEGS)连接。所述与靶序列连接的引导序列具有作为底物被RNAse P酶识别的最小结构(Werner and George，US Patent No US5,877,162)。本发明的与EGS或SEGS连接的核酸序列具有治疗HBV感染患者的治疗用途。

本发明的另一个方面是检测生物样品中HBV病毒存在的方法；和/或检测生物样品中HBV病毒对抗病毒药物耐药性存在的方法；和/或检测生物样品中HBV病毒的HBV逆转录酶结构域中编码丝氨酸的第181位密码子，或编码丝氨酸的第181位密码子和选自编码甲硫氨酸的180位密码子、编码异亮氨酸的第204位密码子、编码缬氨酸的第204位密码子、编码丝氨酸的第204位密码子和编码苏氨酸的第236位密码子存在的方法。

“密码子”是指3个连续的核苷酸的组合，根据遗传密码子可编码氨基酸。本发明的“密码子”进一步包括单链(正义或反义)或双链多聚核酸。对从反义链衍生的氨基酸序列而言，需要用对应的正义链(反向互补)来翻译相应的氨基酸序列。

可使用多种检测核苷酸序列和核苷酸序列多态性(例如突变)的方法。一些检测法是基于物理方法，而其它使用酶学方法。

“物理检测方法”是指在该核苷酸序列多态性检测方法中，需要一个或多个物理过程进行检测，但在通过PCR扩增含一个或多个核苷酸序列多态性的靶DNA序列之前不排除酶学方法。所述物理过程包括电泳、色谱、光学信号传感及波谱。

物理的核苷酸序列多态性检测方法包括电泳方法，例如单链构象多态性(SSCP)、恒定变性毛细管电泳(CDCE)和恒定变性凝胶电泳(CDGE)，参见例如Kristensen et al.，2001；变性梯度凝胶电泳(DGGE)、双梯度毛细管电泳(DGCE)、毛细管区带电泳(CZE)也称为自由溶液毛细管电泳(FSCE)、非对称CZE、或热梯度毛细管电泳(TGCE)、二维基因扫描(TDGS)、构象敏感凝胶电泳(CSGE)，参见例如Korkko et al.，1998，微板阵列对角线凝胶电泳(MADGE)，参见例如Day et al.，1998，和双链构象分析(DSCA)，参见例如(Arguelloet al.，1998)。同样的技术称为HMA(异源双链迁移分析法)，但检测DNA双螺旋依赖于DNA的凝胶染色(Delwart et al.，1993)。在HTA(异源双链跟踪分析法)中，放射性标记的探针与PCR产物退火，然后通过凝胶电泳将探针-PCR产物异源双链分离。多位点特异的HTA也被描述(Resch et al.，2001；Delwart et al.，1994)。

双链构象分析色谱方法包括变性高效液相色谱(DHPLC)。物理核苷酸序列多态性检测方法对鉴定已知的或新的突变是有效的，可通过变性电泳分离同源和异源双链靶DNA分子后，通过直接DNA测序方法进行验证。所述分离可通过变性液相色谱进行，其中温度决定灵敏度。DHPLC进一步可通过设置阵列相同的单电路毛细管柱进行。基于荧光的检测方法可与质谱在线联合进行检测。可通过在靶DNA片段末端增加GC夹来提高DHPLC检测核苷酸多态性的效率(Huber et al.，2001；Narayanaswami et al.，2001；Xiao et al.，2001)。

MALDI-TOF MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)成功用作100bp以下的DNA片段的直接DNA测序工具和检测单核苷酸多态性的工具。等位基因特异的PNA寡聚体(肽核酸)与单链靶DNA的杂交是一种与MALDI-TOF MS分析可比的方法((Griffin et al.，2000)，此处进行参考)。

被认为测定核苷酸序列多态性的“金牌标准”仍然是例如由Maxam和Gilbert(Maxam et al.，1977)设计的直接DNA测序法。最常用的DNA测序法是基于Sanger反应或双脱氧核苷酸链终止反应(Sanger et al.，1977)。可对测序引物进行标记以检测末端链，或对延伸产物进行内部标记。其它DNA测序方法包括焦磷酸微测序(参见例如Williams，2000)和循环测序(Yager et al.，1999；Ruano et al.，1991)。

在不久将来，可能会实现nanopore测序(Meller et al.，2000)。其它DNA测序方法包括分子共振测序和诊断测序，通过特异切割DNA与片段的质谱分析相结合来进行(参见例如，Stanssens and Zabeau 2000-WO 00/66771)。

测定核苷酸序列变异的另一个方法包括双脱氧核苷酸测序(Sanger反应)，其中常规dNTPs被修饰的dNTPs(例如α-硫代dNTPs)和其它变异体替代(Dahlhauser 2000-US 6150105)。

另一个DNA测序方法是SBH或杂交测序，它是通过所有可能的n-核苷酸寡聚体(n-mers)的阵列来鉴定未知DNA样品中的n-mers(Drmanac et al.，1993)。

所述高密度寡核苷酸阵列或DNA芯片省略了设计在相同条件下与一组多态性核苷酸序列特异杂交的一组寡核苷酸的需要。后者通过仔细调整寡核苷酸探针中错配核苷酸的长度、极性和位置而应用于传统的反向印迹检测法中(Saiki et al.，1989)。但传统的反向印迹杂交检测法可进行基因分型和检测核苷酸序列多态性，已成功的以例如LiPA(线性探针检测法)形式进行商品化(Innogenetics，Ghent，Belgium)。(Stuyveret al.，1997；Sruyver et al.，1996)。

本领域技术人员应理解多种变异及组合可存在于上述核苷酸序列及核苷酸序列多态性检测方法中。这些也整合在本发明中。

上述根据本发明的寡核苷酸可进行调整，使其用于任何上述检测核苷酸序列或多态性的方法中。

因此，在本发明的另外的技术方案中，本发明的寡核苷酸进一步包括末端延伸和/或发卡或“分子信标”探针结构，其中所述的延伸和/或发卡结构整合在所述寡核苷酸的一个或两个末端。所述的末端延伸可用于例如与另一个核酸分子特异杂交，和/或利于将所述寡核苷酸固定在固相支持物上，和/或通过酶、核酶或脱氧核酶修饰所述加尾的寡核苷酸。

在本发明的另一个技术方案中，根据本发明的寡核苷酸包括在引物末端整合的可与靶DNA退火后连接的挂锁探针或发夹结构。

在另一个技术方案中，对本发明的寡核苷酸进行修饰，从而可检测和/或捕获所述的寡核苷酸。检测和/或捕获所述的寡核苷酸进一步可检测和/或捕获与其杂交的靶核酸。所述寡核苷酸和所述靶核酸的相互作用可通过在所述寡核苷酸和/或所述靶核酸间引入交联修饰而通过交联进行稳定。

在另一个技术方案中，本发明的寡核苷酸包括3’末端错配核苷酸，可选择地，3’临近错配核苷酸。所述寡核苷酸特别用于进行多态性特异的PCR和LCR(连接酶链反应)或GAP-LCR中。

本发明进一步包括含至少一种上述寡核苷酸的组合物。

本领域技术人员应理解，任何上述检测核苷酸序列和多态性的方法可用于检测生物样品中HBV病毒的存在；和/或检测生物样品中HBV病毒对抗病毒药物耐药性存在的方法；和/或检测生物样品中HBV病毒的HBV逆转录酶结构域中编码丝氨酸的第181位密码子，或编码丝氨酸的第181位密码子和选自编码甲硫氨酸的180位密码子、编码异亮氨酸的第204位密码子、编码缬氨酸的第204位密码子、编码丝氨酸的第204位密码子和编码苏氨酸的第236位密码子存在的方法。

因此，下述包括这些检测方法和基于这些检测方法，例如线性探针检测法的诊断试剂盒的方面可另外包括在本发明中。

本发明的一个方面涉及检测生物样品中HBV病毒存在的方法，和/或检测生物样品中存在的HBV病毒对抗病毒药物的耐药性的方法，所述方法包括检测本发明的HBV多聚核酸或其片段存在的步骤。具体实施方案包括所述方法，包括以下步骤：

a.从所述生物样品中获得靶HBV多聚核酸，其中推定所述靶HBV多聚核酸在HBV逆转录酶结构域含编码丝氨酸的第181位密码子，可选择地，含选自HBV病毒的HBV逆转录酶结构域中编码甲硫氨酸的180位密码子、编码异亮氨酸的第204位密码子或编码缬氨酸的第204位密码子或编码丝氨酸的第204位密码子和编码苏氨酸的第236位密码子的一个或多个密码子；

b.获得(a)中靶HBV多聚核酸的核酸序列；

c.从(b)中获得的核酸序列推测所述HBV逆转录酶结构域编码丝氨酸的第181位密码子，及可选择地，选自(a)中所述的组中的一个或多个密码子的存在，从而推测所述生物样品中所述HBV病毒的存在，和/或所述生物样品中存在的HBV病毒对抗病毒药物耐药性的存在。

另一个具体实施方案包括所述方法，包括：

a.从所述生物样品中获得HBV的多聚核酸，和/或获得其核苷酸序列；

b.在合适条件下，对(a)获得的多聚核酸进行部分或完全变性或酶学修饰；

c.在合适条件下，将(b)中获得的变性的多聚核酸重新复性，优选地在至少存在一个可区分HBV多聚核酸或其片段中HBV逆转录酶结构域编码丝氨酸的第181位密码子和HBV逆转录酶结构域中181位丙氨酸或缬氨酸密码子的寡核苷酸的条件下复性，如果需要，包括对所述寡核苷酸进行酶学修饰，例如延伸的步骤；

d.在合适条件下，对(b)中获得的部分或完全变性的HBV多聚核酸，和/或步骤(c)中形成的杂合子，和/或步骤(b)和/或(c)中获得的酶学修饰物进行检测；

e.从以下组中的一个或多个数据，即步骤(d)中检测的所有物质，包括部分或完全变性的多聚核酸、杂合子、酶学修饰物，及(a)中获得的核苷酸序列推测所述HBV在所述生物样品中是否存在，和/或所述生物样品中对抗HBV病毒药物的耐药性是否存在。

在另一个具体实施方案中，所述方法包括：

a.从所述生物样品中获得靶HBV多聚核酸，其中推定所述靶HBV多聚核酸在HBV逆转录酶结构域中含编码丝氨酸的第181位密码子，可选择地，同时含一个或多个选自HBV的HBV逆转录酶结构域编码甲硫氨酸的180位密码子、编码异亮氨酸的第204位密码子或编码缬氨酸的第204位密码子或编码丝氨酸的第204位密码子和编码苏氨酸的第236位密码子的密码子；

b.将(a)中的靶HBV多聚核酸与可区分编码丝氨酸的第181位密码子和181位丙氨酸或缬氨酸密码子，及可选择地，也可区分一个或多个选自180位亮氨酸密码子和编码甲硫氨酸的180位密码子，编码异亮氨酸的第204位密码子和204位甲硫氨酸、缬氨酸或丝氨酸酸密码子，及236位天冬酰胺密码子和编码苏氨酸的第236位密码子的寡核苷酸接触；

c.从(b)中获得的区分信号推测所述HBV逆转录酶结构域中编码丝氨酸的第181位密码子的存在，及可选择地，所述HBV逆转录酶结构域中所述编码甲硫氨酸的180位密码子或所述编码异亮氨酸的第204位密码子或所述236位天冬酰胺密码子的存在，从而推测所述生物样品中所述HBV病毒的存在，和/或所述生物样品中存在的HBV病毒对抗病毒药物耐药性的存在。

在后面方法中，(b)中所述区分通常基于杂交，(c)中所述区分信号是杂交信号。

“可区分多聚核酸中编码氨基酸X1的密码子(任何氨基酸)与编码氨基酸X2(任何不同于X1的氨基酸)的寡核苷酸”是指该寡核苷酸与含所述编码氨基酸X1的密码子的多聚核酸接触时产生信号，但与含编码氨基酸X2的多聚核酸接触时不产生信号。所述信号，也称为“区分信号”是任何通过用所述寡核苷酸在任何上述可检测核苷酸序列和核苷酸多态性的检测方法中获得的任何信号。所述信号包括，例如荧光信号、(Chemi)化学发光信号、放射性信号、杂交信号、质谱信号、色谱信号、电信号、电子信号、电泳信号、实时PCR信号、PCR信号、LCR信号、CFLP-检测信号和侵入性检测信号。

“将寡核苷酸与多聚核酸接触”或反之通常是指所述寡核苷酸与所述核酸退火，或所述寡核苷酸与所述多聚核酸杂交。“将寡核苷酸与多聚核酸接触”可进一步包括所述寡核苷酸的酶学修饰，其中所述修饰可发生在所述寡核苷酸末端和/或所述寡核苷酸的核苷酸序列的内部。寡核苷酸酶学修饰的例子如此处所述的可检测核苷酸序列和核苷酸序列多态性的检测方法。

在本发明的另一个技术方案中，所述方法进一步包括，在应用时，将获得的核酸序列与数据库中含有的一组HBV核酸序列进行比对和/或比较。

“数据库”在本文中是指核酸或氨基酸序列，更具体地为HBV核酸或氨基酸序列的集合。应理解数据库包含至少一个核酸或至少一个氨基酸序列。数据库可记录在多种载体上。这种载体包括计算机可读取的载体。

本发明的另一个方面涉及在生物样品中检测HBV病毒存在，和/或检测生物样品中存在的HBV病毒对抗病毒药物耐药性的诊断试剂盒，所述试剂盒含有至少一种检测本发明中的HBV多聚核酸存在的方法。

具体的技术方案包括所述诊断试剂盒含有：

a.一种从在HBV逆转录酶结构域推定含编码丝氨酸的第181位密码子，可选择地，同时含一个或多个选自HBV逆转录酶结构域编码甲硫氨酸的180位密码子、编码异亮氨酸的第204位密码子和236位天冬酰胺密码子的密码子的靶多聚核酸的核酸序列推测，所述HBV逆转录酶结构域含编码丝氨酸的第181位密码子，可选择地，同时含一个或多个选自HBV逆转录酶结构域编码甲硫氨酸的180位密码子、编码异亮氨酸的第204位密码子和236位天冬酰胺密码子的密码子的存在，从而推测在所述生物样品中所述HBV的存在的手段(means)，及可选择地，

b.一种获得靶多聚核酸的核酸序列的手段。

在另一个具体实施方案中，所述诊断试剂盒含可区分所述HBV多聚核酸中编码丝氨酸的第181位密码子和181位丙氨酸或缬氨酸密码子的寡核苷酸，及另外可区分所述HBV多聚核酸中编码甲硫氨酸的180位密码子和180位亮氨酸密码子的寡核苷酸。

在另一个具体实施方案中，所述诊断试剂盒含有可区分所述HBV多聚核酸中编码丝氨酸的第181位密码子和181位丙氨酸或缬氨酸密码子，同时区分编码甲硫氨酸的180位密码子和180位亮氨酸密码子的寡核苷酸。

在另一个具体实施方案中，所述诊断试剂盒含有可区分所述HBV多聚核酸中编码丝氨酸的第181位密码子和181位丙氨酸或缬氨酸密码子的寡核苷酸，及至少一个，优选地至少两个，更优选地至少三个另外的选自以下组的寡核苷酸：区分编码苏氨酸的第236位密码子和236位天冬酰胺密码子的寡核苷酸；区分所述HBV多聚核酸中编码异亮氨酸的第204位密码子和204位甲硫氨酸或缬氨酸或丝氨酸密码子的寡核苷酸。

在另一个技术方案中，所述诊断试剂盒另外包括检测由所述HBV多聚核酸与所述寡核苷酸或寡核苷酸组接触而获得区分信号的手段。

另外包括的是所述诊断试剂盒，其中所述寡核苷酸或寡核苷酸组结合或固定在固相支持物上。

另一个具体实施方案包括所述诊断试剂盒含有：

a.一种从所述生物样品中获得靶HBV多聚核酸和/或获得其核苷酸序列的手段；

b.在合适条件下，至少一对寡核苷酸适于扩增本发明的靶HBV多聚核酸；

c.在合适条件下，一种变性核酸的手段；

d.在合适条件下，至少一个本发明的寡核苷酸；

e.在合适条件下，一种可修饰双链或单链核酸分子的酶；

f.在合适条件下，一种杂交缓冲液，或配制所述缓冲液必需的组分；

g.在合适条件下，一种洗涤液，或配制所述溶液必需的组分；

h.在合适条件下，一种检测部分或完全变性的多聚核酸的手段，和/或一种检测前述杂交中形成的杂合子的手段，和/或一种检测核酸的酶学修饰的手段；

i.在合适条件下，一种将寡核苷酸结合在固相支持物的已知位置的手段；

j.一种从(h)中检测的所有物质，包括部分或完全变性的多聚核酸，和/或从杂合子，和/或从酶学修饰物，和/或从(a)获得的核苷酸序列推测所述生物样品中所述HBV病毒存在的手段。

“一种从核酸序列推测编码氨基酸X(X表示氨基酸)的密码子Y(Y表示数字)存在”是指任何技术或方法，以(i)在所述核酸序列中定位所述密码子Y，(ii)将所述密码子Y翻译为密码子Y所编码的氨基酸，及(iii)由(ii)推测由所述密码子Y编码的氨基酸与所述氨基酸X是相同的或是不同的。所述方法包括其中(i)到(iii)都通过手工和/或计算机进行操作的方法。所述方法包括将获得核酸序列与数据库中含有的一组核酸序列进行比对和/或比较。所述方法进一步包括以报告形式存在的(i)到(iii)的结果，其中所述报告可为纸版形式，电子版形式、或存在于计算机可读的载体或介质上。所述方法进一步包括搜索(核酸和/或氨基酸)序列数据库和/或创建(核酸和/或氨基酸)序列比对，其结果可包括或不包括在所述报告中。

另一个技术方案包括任何本发明的上述方法，其特征是所述方法基于检测核酸序列。

另一个技术方案包括任何本发明的上述方法，其特征是所述方法基于杂交检测法。

另一个技术方案包括任何本发明的上述方法，其特征是所述方法基于反向杂交检测法。

另一个技术方案包括任何本发明的上述诊断试剂盒，其特征是所述诊断试剂盒基于测定核酸序列。

另一个技术方案包括任何本发明的上述诊断试剂盒，其特征是所述诊断试剂盒基于杂交检测法。

另一个技术方案包括任何本发明的上述诊断试剂盒，其特征是所述诊断试剂盒基于反向杂交检测法。

另一个技术方案包括任何本发明的上述诊断试剂盒，其特征是所述诊断试剂盒基于线性探针检测法。

本发明进一步提供一种检测生物样品中存在的HBV病毒对抗病毒药物耐药性的方法，所述方法包括检测本发明的HBV DNA聚合酶/逆转录酶蛋白或片段存在的步骤。所述检测包括测定HBV DNA聚合酶/逆转录酶蛋白，或从其获得的部分，例如蛋白酶消化并通过色谱和/或电泳方法分离后得到的蛋白片段的氨基酸序列的步骤。电泳后，可在测序前切除并从凝胶中最终洗脱蛋白片段。可选择地，蛋白凝胶电泳与印迹结合，从而将蛋白转移到膜载体(例如，硝酸纤维素膜、PVDF、尼龙膜)上。待测序的蛋白或蛋白片段可在后一种情况下从膜载体上切除下来。可选择地，本发明的HBV DNA聚合酶/逆转录酶蛋白用特异识别HBV逆转录酶结构域181位丝氨酸的抗体进行检测。具体地，所述抗体不识别181位丙氨酸或缬氨酸。在另一个选择中，本发明的HBV DNA聚合酶/逆转录酶是通过表型进行检测的，即，所述HBV DNA聚合酶/逆转录酶可表现出与含181位丙氨酸或缬氨酸的HBV DNA聚合酶/逆转录酶不同的独特的抗病毒药物的敏感性图谱。因此，本发明的HBV DNA聚合酶/逆转录酶的表型检测包括，例如，测定生物样品中存在的HBV病毒的HBV DNA聚合酶/逆转录酶对抗病毒药物板的活性的灵敏度。可选择地，生物样品中存在的，推定含本发明的多聚核酸的HBV病毒的HBVDNA聚合酶/逆转录酶可通过重组系统产生，其对抗病毒药物的敏感性可通过测定重组表达HBV DNA聚合酶/逆转录酶的活性而测定。

本领域技术人员应理解，可进行HBV病毒复制或产生HBV编码蛋白或其功能部分的载体系统适于检测或测定抗病毒药物对HBV病毒复制或HBV编码蛋白(或其部分)功能的效果。具体地，可用本发明中突变的HBV多聚核酸，或本发明的突变的HBV DNA聚合酶或突变的HBsAg蛋白进行检测。这种检测的结果可与用野生型HBV多聚核酸或野生型HBV蛋白或其功能部分进行相同检测的结果进行比较。

本领域技术人员应理解，HBV DNA聚合酶/逆转录酶具有多个可识别的生物/生化功能，包括引发酶活性、逆转录酶活性(RNA依赖的DNA聚合酶活性)、DNA聚合酶活性(DNA依赖的DNA聚合酶活性)和RNAse(RNAse H)活性，进一步包括与核心抗原蛋白(HBcAg的相互作用和病毒DNA的包装。可从患者血清中分离HBV颗粒的野生型或突变型HBV DNA聚合酶，或通过例如稳定转化的肝细胞瘤细胞系产生。可选择地，所述HBV DNA聚合酶可在异源系统(例如酿酒酵母)中，或通过杆状病毒表达系统、线粒体翻译系统(例如美国专利6,100,068中所述)，或在无细胞系统，例如耦联转录-翻译系统的兔网织红细胞裂解物(Li et al.，1999)中表达和产生。突变的HBV DNA聚合酶的DNA序列可通过体外突变产生。产生的HBV DNA聚合酶/逆转录酶的基本纯化通过例如在所述HBV DNA聚合酶/逆转录酶中引入或融合异源抗原决定簇(例如，上述FLAG抗原决定簇，cfr)来完成。所述抗原决定簇可使HBV DNA聚合酶/逆转录酶通过例如含固定化的抗异源抗原决定簇的抗体(例如，抗FLAG M2单克隆抗体)的亲和柱进行纯化。可选择地，重组HBV聚合酶/逆转录酶是融合蛋白的一部分，所述融合蛋白进一步包括例如组氨酸标签、碳水化合物结合区(例如凝集素、甘露糖结合蛋白)或β-半乳糖苷酶。所述融合蛋白的基本纯化通过例如金属离子亲和色谱(在组氨酸存在的情况下)、碳水化合物亲和色谱(在碳水化合物结合区存在的情况下)或通过针对与HBV DNA聚合酶/逆转录酶融合的蛋白，例如β-半乳糖苷酶的抗体进行免疫亲和色谱而完成。可选择地，所述融合蛋白用合适的蛋白酶(例如，蛋白酶因子Xa)切割，从而使HBV DNA聚合酶/逆转录酶从融合蛋白的其它部分分离，例如通过上述另一轮纯化。可选择地，通过技术例如亲和捕获(例如通过参考下文中针对HBV病毒表面抗原的抗体或通过针对所述表面抗原的蛋白受体或针对所述蛋白受体的抗独特型抗体)或梯度离心从生物样品中分离HBV病毒颗粒。对通过以上或其它方法获得的HBV病毒颗粒进行进一步分析，例如HBV DNA聚合酶/逆转录酶或HBV核酸。

在另一个选择中，从感染的肝细胞中纯化多蛋白复制核心复合体或胞内复制核心，获得的含HBV DNA聚合酶/逆转录酶的制备物用于检测HBV DNA聚合酶/逆转录酶的功能和活性(Urban et al.，2000)。显然，所述病毒颗粒或复制核心复合体的纯化可用于从含本发明的突变或多个突变的HBV变异体感染的细胞中获得所述颗粒或核心复合体。

已描述改进的测定病毒逆转录酶活性的条件(Bird和Chang-Yeh在美国专利5,817,457中所述)，包括酸性pH和升高温度。已由例如Yoon等在美国专利6,071,734中描述检测来源于HBV DNA聚合酶/逆转录酶的RNAse H活性的反应条件。已由Li等描述体外测定HBV DNA聚合酶/逆转录酶或其片段产生的引发酶-、聚合酶-、和逆转录酶活性的检测条件(Li et al.，1999)。测定蛋白-蛋白相互作用，例如HBV DNA聚合酶/逆转录酶和HBcAg的相互作用的检测方法包括二、三杂合子检测法和实时生物分子相互作用分析(BIA)(Bartel et al.，1997及美国专利5,928,868)。

本发明的另一个其它方面包括测定抗病毒药物对本发明的突变HBsAg的作用的检测方法。本领域技术人员应理解，HBV的HBsAg具有多个可识别的生物/生化功能，包括病毒的附着/进入宿主细胞(即HBV的感染性)、病毒颗粒包装和病毒颗粒分泌的功能。另外，HBsAg是宿主免疫系统的靶，但已报道了“逃逸的”突变体。在进行肝移植的患者中，针对HBsAg、HBIg的抗体通常是被动免疫方式。可通过上述方式获得HBV DNA聚合酶的野生型或突变型HBsAg。可选择地，可通过HBsAg的抗体或HBsAg受体或所述HBsAg受体蛋白的抗独特型抗体通过亲和相互作用回收HBsAg，所述报道的受体蛋白包括单价和多价人白蛋白(Eibl等，美国专利5,576,175和Machida et al.，1984)和内膜素II/膜联蛋白V(Yap，欧洲专利EP 0672136)。可通过技术例如亲和捕获，例如通过HBV病毒表面抗原的抗体或通过HBV病毒表面抗原的受体或抗独特型的抗体从生物样品中分离HBV和HDV(δ肝炎病毒)病毒颗粒。

在本发明的另一方面，包括本发明的突变HBV DNA聚合酶/逆转录酶在内的HBV DNA聚合酶/逆转录酶的活性，或其对抗病毒组合物的敏感性是在内源性DNA聚合酶发生条件突变的宿主细胞中测定的。因此，HBV DNA聚合酶/逆转录酶的表达可能使所述突变宿主细胞在限制性条件下生长。可通过测定所述突变宿主细胞在限制性条件下，在存在抗病毒化合物时的生长程度来测定HBV DNA聚合酶/逆转录酶对抗病毒化合物的敏感性。然后将所述生长情况与所述宿主细胞在限制性条件下，在不存在所述抗病毒化合物时的生长情况进行比较。

在本发明的另一个方面中，包括含本发明的突变DNA的HBV颗粒在内的突变HBV颗粒在感染作为人HBV感染模型或评估抗HBV化合物、治疗和预后的模型的非人动物中的用途。已知所述非人动物模型，例如Reisner的美国专利5,849,987和5,858,328中所述。许多针对HBV(HBV抗病毒药物)的抗病毒药物如前所述。

因此，在本发明的另一个方面中包括一种筛选有效地针对含本发明的多聚核酸或含本发明的HBV DNA聚合酶/逆转录酶的HBV病毒的药物的方法，所述方法包括：

a.在缺乏所述药物的情况下测定所述HBV的复制；

b.在存在所述药物时测定所述HBV的复制；

c.从(a)和(b)中推测所述药物在HBV复制中所起的抑制作用。

在一个具体实施方案中，所述方法进一步包括用野生型HBV病毒进行步骤(a)、(b)和(c)，并比较所述药物对所述野生型HBV病毒复制的抑制作用与所述药物对所述含本发明的多聚核酸的HBV病毒复制的抑制作用的差异。在另一个技术方案中，所述方法进一步包括从生物样品中获得所述HBV病毒。

在本发明的另一个技术方案中，包括筛选针对含本发明的多聚核酸，或含本发明的HBV DNA聚合酶/逆转录酶的HBV病毒的药物的方法，所述方法包括：

a.在不存在所述药物时测定所述HBV病毒的DNA聚合酶/逆转录酶活性；

b.在存在所述药物时测定与(a)中所述HBV病毒相同的DNA聚合酶/逆转录酶活性；

c.从(a)和(b)推测所述药物对所述HBV病毒的所述DNA聚合酶/逆转录酶活性的抑制作用。

在一个具体的技术方案中，所述方法进一步包括，用野生型HBV病毒进行步骤(a)、(b)和(c)，并比较所述药物对所述野生型HBV病毒的DNA聚合酶/逆转录酶活性的抑制作用与所述药物对含本发明的多聚核酸的HBV病毒的DNA聚合酶/逆转录酶活性的抑制作用的差异。在另一个具体实施方案中，所述方法进一步包括从生物样品中获得所述HBV病毒。“DNA聚合酶/逆转录酶活性”是指上述的HBV DNA聚合酶/逆转录酶的生物或生化活性。

本发明进一步包括针对所述分离的HBV变异体和/或所述分离的HBV小病毒表面抗原、或其所述部分，和/或所述HBV中型和/或大病毒抗原的抗体和抗独特型抗体。在一个具体的技术方案中，所述抗体是单克隆抗体。在另一个具体实施方案中，所述抗体是人源化单克隆抗体。

本发明另外包括所述抗体在检测生物样品中所述HBV变异体和/或所述HBV小病毒表面抗原、或其所述部分，和/或所述HBV中型和/或大病毒抗原的免疫方法中的用途。在一个具体实施方案中，所述抗体用于诊断HBV感染的方法。在另一个技术方案中，所述抗体是检测HBV感染的诊断试剂盒的一部分。

在本发明的另一个技术方案中包括本发明的方法或本发明的诊断试剂盒在跟踪HBV感染进程中的应用。

另一个技术方案包括本发明的方法或本发明的诊断试剂盒在监测对抗病毒药物的耐药性发生方面的应用。

另一个技术方案包括本发明的方法或本发明的诊断试剂盒在由于发生对抗病毒药物的耐药性而调整针对HBV感染的治疗方案中的应用。

“抗体”包括单克隆、多克隆、合成的或重链骆驼抗体及抗体片段，例如Fab、Fv或scFv片段。单克隆抗体可通过例如Liddle等(Liddle etal.，5 1991)所述技术进行制备，包括将鼠骨髓瘤细胞与来源于免疫动物的肾细胞融合。另外，针对分子或其片段的抗体或其片段可通过如Harlow等(Harlow et al.，1988)所述方法获得。对针对小肽例如本发明的蛋白片段的抗体而言，所述肽在免疫动物前通常与载体蛋白连接。这种蛋白载体包括匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白和破伤风毒素。载体蛋白可增强动物的免疫应答，并提供对T细胞受体结合位点的抗原决定簇。术语“抗体”进一步包括其衍生物，例如标记抗体。抗体通常是放射性、化学发光、荧光、磷光、5’红外染料或表面增强的拉曼标记或等离子共振颗粒标记的。抗体标记包括碱性磷酸酶、PKH2、PKH26、PKH67、荧光素(FITC)、Hoecst 33258、R-藻红蛋白(PE)、罗丹明(TRITC)、Quantum Red、Texas Red、Cy3、生物素、琼脂糖、过氧化物酶和金颗粒。依赖于蛋白抗体的分子生物学工具包括蛋白凝胶印迹分析、进行基因鉴定的表达库的筛选，蛋白定量方法包括ELISA(酶联免疫吸收检测法)、RIA(放射性免疫检测法)和LIA(线性免疫检测法)、蛋白的免疫亲和纯化、蛋白的免疫沉淀和蛋白的免疫定位。

根据本发明，第一次发现一种对拉米夫定和阿德福韦同时具有交叉耐药性的新型突变模式，A181S+M204I。该突变模式是通过直接测序血清样品中在阿德福韦处理前和后提取的HBV DNA而检测到的，表明该交叉耐药性突变模式对阿德福韦基本无应答(图2)。

虽然拉米夫定和阿德福韦具有强的抗病毒作用，但引起耐药性的变异体的发展成为治疗慢性HBV感染的治疗中的重要问题。另外，具有交叉耐药性图谱的HBV突变模式的存在由于可能使联合治疗失败而引起重点关注。阿德福韦通常被认为是治疗由于耐药HBV而使拉米夫定治疗失败的较好的治疗选择。

但根据本发明，阿德福韦二匹伏酯和拉米夫定的联合使用在治疗中既不能抑制HBV的复制，也不能降低血清ALT水平(具体参见图1)，这表明A181S和A181S+M204I变异体在体内对阿德福韦和拉米夫定具有交叉耐药性。在从第28月，即在病毒学和生化反弹之前开始抗病毒治疗，所有获得的血清样品中均检测到A181S突变。另一方面，M204I在第28月获得的第一份血清样品中未检测到，但在3个月后，即第31月在反弹后出现。

体外分析确定该HBV突变体对阿德福韦耐药，甚至在高浓度，例如10μM阿德福韦二匹伏酯处理时(具体参见表2)也是耐药的。同样，该变异体在体外对所有检测浓度的拉米夫定均是耐药的，这与以前报道的在YMDD区的突变耐药谱是一致的(Bozdayi et al.，2003；Seta et al.，2000)。综合上述数据表明，A181S+M204I变异体在体内和体外具有对阿德福韦和拉米夫定的交叉耐药性。

看来联合治疗不能抑制、但可延缓新型耐药突变体的发生。无论如何，在目前的临床实践中，对抗HBV的最佳选择仍然是不同耐药谱的抗病毒药物的联合治疗。

以下实施例仅用于进一步说明本发明。这些实施例并不对本发明的范围进行限定。

实施例

实施例1：在3TC治疗中的一种在HBV株中演变的新型突变模式表现出对阿德福韦二匹伏酯治疗的交叉耐药性

病例研究

在产生本发明的研究工作中，发明者鉴定到一名慢性感染HBV的患者。该患者为43岁，高加索人种，男性，命名为患者AA，从1990年起已知具有HBV感染，在常规检查中被诊断出来。1999年的肝活组织检查表明，具有根据Knodell等的组织学活性系数为6的慢性活性肝炎(CAH)。该患者是HbeAg阳性，抗Hbe阴性，HBV DNA为阳性。通过商品化液相杂交检测法(Digene，Maryland，US)测定HBV DNA的水平，该方法的检测最低限是5pg/mL病毒DNA。

如图1所示，进行IFN治疗，9MU/TIW(百万单位/一周三次)，共治疗9个月(1999年)。该患者未表现出ALT降低或病毒学应答(HBVDNA水平在IFN治疗后为396pg/ml)。由于病毒载量在该阶段没有降低，因此患者在治疗9个月后停止IFN治疗，开始拉米夫定(LAM)治疗，100mg/天。在LAM治疗期间，对ALT水平和HBV的复制抑制效率进行标准化。在LAM治疗19个月后，发生了临床反弹，其特征是ALT突然升高，并通过杂交方法检测到HBV DNA。在发生临床反弹后继续使用拉米夫定，当产生血清转化现象(抗hbe出现，HbeAg消失)后，加入IFN(9MU/TIW)再治疗6个月。但联合治疗并未使肝脏的酶正常化，HBV DNA水平在这段时间仍保持很高。在加入IFN6个月后，在发生持续的血清转化后又停止IFN。在初始抗病毒治疗第44个月，IFN停止3个月后，向拉米夫定单一治疗中加入Hepsera^TM(阿德福韦二匹伏酯)，10mg/天。在更长的14个月的治疗过程中施用了Hepsera；但并没有抑制HBV的复制，也没有使ALT正常化。

抗病毒治疗效果

LAM治疗最初是成功的。ALT水平是正常化的，而且HBV的复制被抑制。在LAM治疗19个月后发生临床反弹。向拉米夫定单一治疗中加入Hepsera^TM并未抑制HBV复制和ALT正常化。根据常规生化程序进行了血液计数和肝功能检测(丙氨酸和天冬氨酸氨酰转移酶)(Olympus AU 2700自动分析仪，日本)。

HBV DNA的分离和测序

从抗病毒治疗开始，在不同阶段对患者采血(28、31、42、51、57、61月)。每次均从患者血清中用Qiamp DNA试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)根据说明书分离HBV-DNA。通过PCR扩增HBV DNA聚合酶基因。简要来说，将5微升DNA样品加到50μL含10mM Tris HCl，pH：8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、2mM dNTP、25pmol/μL正义和反义引物及2.5单位Taq DNA聚合酶(RocheDiagnostic，Penzberg，Germany)的PCR混合物中。为了扩增HBV聚合酶基因，用热循环仪(Gene Amp PCR system 9700，PE，Applied Biosystems，Foster City，CA；US)进行35个循环，包括94℃变性1min，45℃退火1min，聚合反应2min。第二轮PCR的条件与第一轮相同，以5μL第一轮PCR样品为模板。可选择地，使用两组巢式引物对扩增HBV聚合酶基因。外侧引物为5’CAC CTG CAG CCT CAT TTT GTG GGT CAC CAT A3’(SEQ ID NO：21)和5’CAT AAG CTT CAC AAT TCG TTG ACA TAC TTT CCA AT3’(SEQ ID NO：22)，和内侧引物为5’GTG CTG CAG TTT GTG GGT CAC CAT ATT CTT G3’(SEQ ID NO：23)和5’GAC AAG CTT TTG ACA TAC TTT CCA ATC AAT AG3’(SEQ ID NO：24)(Ogata etat，1999；在每个序列的核苷酸4到9是Pst I和Hind III的酶识别位点)。扩增产物进行2％凝胶电泳，用溴化乙锭染色。对扩增的PCR产物直接进行测序分析。通过商品化PCR纯化试剂盒(Nucleospin Extract kit，Macherey-Nagel，Düren，Germany)根据说明书对PCR产物进行纯化。用进行PCR的引物和大染料末端循环测序试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，US)对PCR产物进行直接测序反应。对每个测序反应，不仅使用正义内侧引物，而且使用反义内侧引物，以验证序列。反应产物在ABI 310(PE，Applied Biosystems，Foster City，CA，US US)自动测序仪上进行检测。结果如图2所示。

然后将从在第42个月(2002年6月)采集的血清中获得的PCR产物根据常规克隆程序克隆在TA载体(Topo TA克隆试剂盒，Invitrogen，Carlsbad，CA，US)中。在9个克隆中，对7个克隆进行测序。结果如图3所示。在克隆4中发现的突变模式D205G再次进行测序验证。

核苷酸变化

图2的序列结果表明，在所有在不同时期从患者采集的样品中，都存在导致氨基酸替代rtA181S和rtM204I的核苷酸突变。因此，在发展为拉米夫定耐药后，在所有获得的样品中均检测到与rtA181S一起存在的rtM204I突变。到目前为止rtA181有两个突变模式，但rtA181S是一个新模式。

从第42个月获得的血清中扩增的克隆PCR产物的序列信息如图3所示。序列结果表明，在7个克隆中有2个克隆含可导致氨基酸替代rtL180M和rtM204S的核苷酸突变。这些突变与LAM耐药性相关。其它7个克隆中有5个克隆含可导致氨基酸替代rtA181S和rtM204I的核苷酸突变。1个克隆含可导致氨基酸替代rtA181S、rtM204I和rtD205G的核苷酸突变。

RtA181S是一个在测序结果中普遍发现的突变模式。本结果(不抑制HBV复制，ALT水平在第14个月未有波动)使我们认为在拉米夫定治疗中产生的突变模式rtA181S可对阿德福韦二匹伏酯表现出交叉耐药性。更具体而言，突变模式rtA181S联合rtM204I可表现出对阿德福韦二匹伏酯的交叉耐药性。

因此认为在拉米夫定治疗中筛选到的具有新型突变模式的耐药株对阿德福韦二匹伏酯是交叉耐药的。

实施例2：新型突变HBV株耐药性的体外验证

从血清样品中分离HBV DNA及扩增全长HBV基因组

用高纯度病毒核酸试剂盒(Roche，Indianapolis，USA)根据说明书从200μl血清样品中提取DNA。如Gunther等报道扩增全长HBV DNA基因组，所用PCR体系含50mM KCl、1.5mM MgCl₂、0.35mM Tris-HCl(pH 8.3)、200μM dNTP、5U Taq DNA聚合酶和0.3μM下述每种引物：[P1，5′-CCGGA AAGCTT GAGCTC TTCTTTTT CACCTC TGCCT AATCA-3′(核苷酸1821-1841；SEQ ID NO.：25)；P2，5′-CCGGA AAGCTT GAGCTCTTCAAAAA GTTGC ATGGTG CTGG-3′(核苷酸1823-1806；SEQ ID NO.：26)]和2μl提取的DNA，总体积为50μl，PCR反应在″Eppendorf MastercyclerPersonal″中进行40个循环，94℃变性40s，60℃退火1.5min，68℃延伸3min，在每10个循环后增加2min。

全长HBV基因组的直接测序

对从血清样品中直接提取的扩增产物和用″Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒″(Applied Biosystems，Fostercity，USA)根据说明书获得的TA克隆构建体在″ABI PRISM 310基因分析仪″(Perkin Elmer，Foster City，USA)上进行直接DNA测序反应。在测序前用″Qiaquick PCR纯化试剂盒″(Quiagen，Hilden，Germany)纯化PCR产物。在直接测序中所用引物列在表1中。

表1全长HBV DNA直接测序所用的引物

引物	结合区(bp)	DNA序列	SEQ IDNO
引物	结合区(bp)	DNA序列	SEQ IDNO	HBV(676-699)	676-699	5’TTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTG3’^*	27
HBV(66-90)：	66-90	5’GCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCC3’^*	28	HBV(676-699)	676-699	5’TTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTG3’^*	27
HBV(66-90)：	66-90	5’GCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCC3’^*	28	HBV(2796-2826)	2796-2826	5’CACCTGCAGCCTCATTTTGTGGGTCACCATA3’^*	29
HBV(2357-2380)	2357-2380	5’GGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACT3’^*	30	HBV(2796-2826)	2796-2826	5’CACCTGCAGCCTCATTTTGTGGGTCACCATA3’^*	29
HBV(2357-2380)	2357-2380	5’GGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACT3’^*	30	HBV(2432-2408)	2432-2408	5’ATTGAGATCTTCTGCGACGCGGCGA3’^*	31
HBVCP11	1694-1717	5’GACCTTGAGGCATATTTCAAAGAC3’^**	32	HBV(2432-2408)	2432-2408	5’ATTGAGATCTTCTGCGACGCGGCGA3’^*	31
HBVCP11	1694-1717	5’GACCTTGAGGCATATTTCAAAGAC3’^**	32	HBVCP13	2069-2047	5’CTGAGTGCTGTATGGTGAGGTGA3’^**	33

^*Gtinther et al，1995

^**Bozdayi et al，2001

全长HBV基因组的TA克隆和通过PCR和测序验证HBV基因组

将扩增的全长HBV基因组用″Topo-XL PCR克隆试剂盒″(Invitrogen，California，USA)根据说明书克隆到TA载体上。然后对构建体测序。对克隆中含A181S+M204I突变模式的全长HBV基因组进一步如前所述进行扩增。也对含野生型HBV基因组的克隆进行相同的程序。

用于直接转染的HBV DNA的制备

用″QIAquick凝胶回收试剂盒″(QUIAGEN，Basel，Switzerland)根据试剂盒提供的说明书对扩增子进行凝胶纯化。然后对每μg DNA用5UsapI限制性内切酶进行消化，释放具有sapI粘性末端，但没有载体和异源引物序列的线性HBV基因组。

用于抗病毒敏感性实验的HBV DNA的转染和体外复制

通过瞬时转染到Huh7细胞系中来测定全基因组HBV DNA的体外复制能力。在24孔板中加入含GFP的质粒，用于通过Fugene转染试剂(Roche Diagnostics)测定转染效率。转染8小时后，单独用检测复制效率的新鲜培养基培养细胞，或用单独含0.1μM、1μM、10μM拉米夫定或阿德福韦的培养基检测抗病毒药物的敏感性。每天收集仅用新鲜培养基培养的细胞上清，共收集5天，而在第五天收集用含抗病毒药物的培养基培养的细胞上清。用″QIAamp DNA Mini试剂盒″(QUIAGEN，Basel，Switzerland)根据说明书提取病毒DNA。通过实时PCR方法用″快速起始DNA杂交试剂盒″(Roche Diagnostics，GmbH，Indianapolis，ABD)根据Bozkaya等(2005)的流程测定HBV DNA。

HBV在瞬时转染的HUH7细胞系中的复制

对全长HBV基因组的复制能力进行体外分析。对每天上清提取的HBV复制子进行的实时PCR分析表明，细胞培养液中测定的总HBV产量在第五天达到拷贝数的对数约为5(图4)。该结果表明转染的HBVDNA在体外是复制活性的。

拉米夫定和阿德福韦对野生型和突变型(A181S+M204I)病毒作用的分析

用增加浓度的拉米夫定(0.1μM、1μM、10μM)或阿德福韦(0.1μM、1μM、10μM)通过3个独立实验检测181S+M204I突变模式对药物的敏感性，参见表2。

表2.通过实时PCR分析的HBV体外产量

n.d.未检测

携带A181S+M204I突变模式的HBV基因组对拉米夫定和阿德福韦均是耐药的，甚至在抗病毒药物的浓度很高时仍是耐药的。而用10μM拉米夫定和阿德福韦处理样品没有检测到野生型HBV DNA，对突变型HBV测定的log拷贝数分别为4.68±0.82和4.12±0.98。

实施例3：在另一个患者中HBV株中的突变模式的验证

一个33岁的男性是HBsAg(+)和Anti-HBe(+)患者。该患者在1998年发现是HBsAg阳性。在2003年，该患者用IFN 9 MIU每周2次治疗12个月(通过在开始IFN治疗前测定液相杂交(Digene，美国)检测的结果是ALT：242IU/L，AST：155IU/L，HBV DNA：3260pg/mL)。由于不完全应答，在2004开始使用拉米夫定(Zeffix，100mg/天)治疗。在拉米夫定治疗后，ALT正常化，HBV DNA水平小于5pg/mL。但在lam治疗的第20个月，发生了以ALT突然升高和进行HBV复制为特征的临床反弹(ALT：199IU/mL，AST：145IU/mL和HBV DNA：6540pg/mL)。提取两份在lam治疗开始后和临床反弹开始后的血清样品，并根据Gunther等(1995)所述方法对这两份提取的物质扩增HBV DNA的全基因组。然后将PCR产物克隆在TA载体上，对每个序列的8个克隆通过循环测序方法在310ABI(美国)上进行测序。4个属于拉米夫定治疗开始后的克隆的序列是野生型序列。但所有8个在临床反弹后获得的克隆均具有A181S+M204I模式(在第181位密码子处GCT变为TCT，在第204位密码子处ATT变为ATC)。

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序列表

<110>INNOGENETICS N.V.

<120>对核苷类似物敏感性降低的乙型肝炎病毒变异体及其用途

<130>171 PCT

<140>PCT/EP 2006/002352

<141>2006-03-14

<150>EP 05101997.4

<151>2005-03-15

<150>US 60/661,484

<151>2005-03-15

<160>33

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>126

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>1

ctcagcccgt ttctcctggc tcagtttact agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct 60

ttcccccact gtttggcttt cagttatatg gatgatgtgg tattgggggc caagtctgta 120

cagcat 126

<210>2

<211>126

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>2

ctcagcccgt ttctcctgtc tcagtttact agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct 60

ttcccccact gtttggcttt cagttatatg gatgatgtgg tattgggggc caagtctgta 120

cagcat 126

<210>3

<211>126

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>3

ctcagcccgt ttctcctgtc tcagtttact agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct 60

ttcccccact gtttggcttt cagttataty gatgatgtgg tattgggggc caagtctgta 120

cagcat 126

<210>4

<211>126

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>4

ctcagcccgt ttctcatggc tcagtttact agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct 60

ttcccccact gtttggcttt cagttatagc gatgatgtgg tattgggggc caagtctgta 120

cagcat 126

<210>5

<211>126

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>5

ctcagcccgt ttctcctgtc tcagtttact agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct 60

ttcccccact gtttggcttt cagttatatt gatgatgtgg tattgggggc caagtctgta 120

cagcat 126

<210>6

<211>126

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>6

ctcagcccgt ttctcctgtc tcagtttact agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct 60

ttcccccact gtttggcttt cagttatatc gatgatgtgg tattgggggc caagtctgta 120

cagcat 126

<210>7

<211>126

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>7

ctcagcccgt ttctcctgtc tcagtttact agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct 60

ttcccccact gtttggcttt cagttatatc ggtgatgtgg tattgggggc caagtctgta 120

cagcat 126

<210>8

<211>126

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>8

ctcagcccgt ttctcatggc tcagtttact agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct 60

ttcccccact gtttggcttt cagttatagc gatgatgtgg tattgcgggc caagtctgta 120

cagcat 126

<210>9

<211>42

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>9

Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Va1

1 5 10 15

Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp

20 25 30

Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His

35 40

<210>10

<211>42

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>10

Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ser Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val

1 5 10 15

Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp

20 25 30

Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His

35 40

<210>11

<211>42

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>11

Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ser Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val

1 5 10 15

Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Ile Asp Asp

20 25 30

Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His

35 40

<210>12

<211>42

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>12

Leu Ser Pro Phe Leu Met Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val

1 5 10 15

Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Ser Asp Asp

20 25 30

Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His

35 40

<210>13

<211>42

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>13

Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ser Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val

1 5 10 15

Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Ile Gly Asp

20 25 30

Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His

35 40

<210>14

<211>42

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>14

Leu Ser Pro Phe Leu Met Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val

1 5 10 15

Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Ser Asp Asp

20 25 30

Val Val Leu Arg Ala Lys Ser Val Gln His

35 40

<210>15

<211>12

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<220>

<223>Tag·100表位

<400>15

Glu Glu Thr Ala Arg Phe Gln Pro Gly Tyr Arg Ser

1 5 10

<210>16

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>c-myc表位

<400>16

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210>17

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>FLAG-表位

<400>17

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys

1 5

<210>18

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>HA表位

<400>18

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210>19

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白质C表位

<400>19

Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys

1 5 10

<210>20

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VSV表位

<400>20

Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

1 5 10

<210>21

<211>30

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>21

cacctgcagc ctcattttgt gggtcaccat 30

<210>22

<211>35

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>22

cataagcttc acaattcgtt gacatacttt ccaat 35

<210>23

<211>31

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>23

gtgctgcagt ttgtgggtca ccatattctt g 31

<210>24

<211>32

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>24

gacaagcttt tgacatactt tccaatcaat ag 32

<210>25

<211>41

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>25

ccggaaagct tgagctcttc tttttcacct ctgcctaatc a 41

<210>26

<211>40

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>26

ccggaaagct tgagctcttc aaaaagttgc atggtgctgg 40

<210>27

<211>24

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>27

tttactagtg ccatttgttc agtg 24

<210>28

<211>25

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>28

gctccagttc aggaacagta aaccc 25

<210>29

<211>31

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>29

cacctgcagc ctcattttgt gggtcaccat a 31

<210>30

<211>24

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>30

ggcaggtccc ctagaagaag aact 24

<210>31

<211>25

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>31

attgagatct tctgcgacgc ggcga 25

<210>32

<211>24

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>32

gaccttgagg catatttcaa agac 24

<210>33

<211>23

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>33

ctgagtgctg tatggtgagg tga 23

Claims

1.一种分离的HBV变异体，其在DNA聚合酶基因密码子181位至少含一个核苷酸突变，从而导致丙氨酸替换为丝氨酸，即rtA181S。

2.权利要求1的分离的HBV变异体，其中所述变异体对核苷类似物的敏感性降低。

3.权利要求2的分离的HBV变异体，其中所述变异体对核苷类似物阿德福韦和/或拉米夫定的敏感性降低。

4.权利要求1、2或3中任一项的分离的HBV变异体，其在DNA聚合酶基因中至少含另一个核苷酸突变，其中所述的另一个核苷酸突变在聚合酶基因的密码子204位，该突变可导致甲硫氨酸替换为除甲硫氨酸之外的其它氨基酸。

5.权利要求4的分离的HBV变异体，其中所述的另一个核苷酸突变可导致甲硫氨酸替换为异亮氨酸的氨基酸替代。

6.一种来源于权利要求1到5中任一项权利要求中所述的HBV变异体的分离的HBV多聚核酸或其片段，其中，所述的HBV多核酸或其片段包含可导致HBV变异体中的DNA聚合酶基因具有rtA181S氨基酸替代的核苷酸突变。

7.权利要求6的分离的HBV多聚核酸或其片段，其中，所述的分离的HBV多聚核酸或其片段包含另一个核苷酸突变，所述的另一个核苷酸突变可导致HBV变异体的DNA聚合酶基因中第204位密码子编码的甲硫氨酸的替换为除甲硫氨酸之外的其它氨基酸。

8.权利要求7的分离的HBV多聚核酸或其片段，其中，所述的HBV多核酸或其片段包含可导致HBV变异体DNA聚合酶基因的B结构域产生rtA181S替代的核苷酸突变，及可导致HBV变异体DNA聚合酶基因的C结构域产生rtM204I替代的核苷酸突变。

9.权利要求6到8中任一项的分离的HBV多聚核酸，其包含选自SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 5、SEQ ID 6和SEQ ID 7的多聚核酸。

10.一种HBV表达产物，其来源于权利要求6到9中任一项中所述的分离的HBV多聚核酸或其片段。

11.权利要求10的HBV表达产物，其包含选自SEQ ID 10、SEQ ID11、SEQ ID 13和SEQ ID 14的多聚氨基酸。

12.一种组合物，其包含权利要求1到5中任一项所述的分离的HBV变异体。

13.一种组合物，其包含权利要求6到9中任一项中所述的分离的HBV多聚核酸或其片段。

14.一种组合物，其包含权利要求10或11中所述的HBV表达产物。

15.一种权利要求1到5任一项中所述的分离的HBV变异体，或权利要求6到9任一项中所述的分离的HBV多聚核酸，或权利要求10或11中所述的HBV表达产物，或权利要求12或13中所述的组合物在筛选至少一种无交叉耐药性的抗HBV药物中的用途。

16.一种权利要求1到5任一项中所述的分离的HBV变异体，或权利要求6到9任一项中所述的分离的HBV多聚核酸，或权利要求10或11中所述的HBV表达产物，或权利要求12或13中所述的组合物在检测HBV变异体中的用途。

17.一种治疗感染HBV的患者的方法，其包括对所述患者给药核苷类似物，测定患者是否感染权利要求1到5任一项中所述的分离的HBV变异体，如果是，则给药所述患者至少一种无交叉耐药性的抗HBV药物。

18.一种检测生物样品中存在权利要求1到5任一项中所述的HBV变异体的方法，所述方法包括检测权利要求6到9任一项中的多聚核酸或其片段是否存在的步骤。

19.权利要求18的方法，其包括：

a.从所述生物样品中获得靶HBV多聚核酸，其中推定所述HBV多聚核酸在HBV逆转录酶结构域含编码丝氨酸的第181位密码子，可选择地，在HBV病毒的HBV逆转录酶结构域中含一个或多个选自编码甲硫氨酸的180位密码子、编码异亮氨酸的第204位密码子或编码缬氨酸的第204位密码子或编码丝氨酸的第204位密码子，及编码苏氨酸的第236位密码子的密码子；

b.获得(a)中的靶HBV多聚核酸的核酸序列；

c.从(b)中获得的核酸序列推测HBV逆转录酶结构域中是否存在所述的编码丝氨酸的第181位密码子，及可选择地，是否存在(a)中所述的一个或多个密码子，从而推测在所述生物样品中是否存在所述HBV病毒，和/或在所述生物样品中的HBV是否存在对HBV病毒的抗病毒药物的耐药性。

20.权利要求19的方法，该方法包括：

a.从所述生物样品中获得靶HBV多聚核酸和/或获得其核苷酸序列；

b.在合适条件下，将步骤(a)中获得的多聚核酸部分或完全变性、或酶学修饰；

c.在合适条件下，将步骤(b)中获得的变性多聚核酸复性，优选地在存在至少一个可区分HBV多聚核酸或其片段中HBV逆转录酶结构域的编码丝氨酸的第181位密码子和HBV逆转录酶结构域的181位丙氨酸或缬氨酸的寡核苷酸的条件下复性，如果必要对所述的寡核苷酸进行包括延伸在内的酶学修饰的步骤；

d.在合适条件下，检测步骤(b)中获得的部分或完全变性的HBV多聚核酸，和/或步骤(c)中形成的杂合子，和/或步骤(b)和/或(c)中获得的酶学修饰；

e.从以下一个或多个数据，即步骤(d)中所检测的所有部分或完全变性的多聚核酸、杂合子、酶学修饰物，及(a)中获得的核苷酸序列推测在所述生物样品中是否存在所述HBV，和/或在所述生物样品中的HBV是否存在对HBV病毒的抗病毒药物的耐药性。

21.权利要求18的检测HBV变异体存在的方法包括：

a.从所述生物样品中获得靶HBV多聚核酸，其中推定所述靶HBV多聚核酸在HBV逆转录酶结构域含编码丝氨酸的第181位密码子，可选择地，同时含HBV的HBV逆转录酶结构域中一个或多个选自编码甲硫氨酸的180位密码子、编码异亮氨酸的第204位密码子或编码缬氨酸的第204位密码子或编码丝氨酸的第204位密码子，和编码苏氨酸的第236位密码子的密码子；

b.将靶HBV多聚核酸与可区分编码丝氨酸的第181位密码子和181位丙氨酸或缬氨酸密码子，可选择地，也可区分一个或多个选自180位亮氨酸密码子和编码甲硫氨酸的180位密码子、编码异亮氨酸的第204位密码子和204位甲硫氨酸、缬氨酸或丝氨酸密码子、及236位天冬酰胺密码子和编码苏氨酸的第236位密码子的寡核苷酸接触；

c.从(b)中获得的区分信号推测所述HBV逆转录酶的编码丝氨酸的第181位密码子的存在，可选择地，同时存在HBV逆转录酶结构域中所述编码甲硫氨酸的180位密码子或所述编码异亮氨酸的第204位密码子或所述236位天冬氨酸密码子，从而推测所述HBV在所述生物样品中的存在和/或所述生物样品中的HBV对HBV病毒的抗病毒药物的耐药性的存在。

22.一种诊断生物样品中是否存在HBV变异体，和/或检测生物样品中是否存在对抗HBV的抗病毒药物的耐药性的诊断试剂盒，所述试剂盒含检测权利要求6到9任一项中所述的多聚核酸是否存在的手段。

23.权利要求22中的诊断试剂盒包括：

a.一种从含HBV逆转录酶结构域编码丝氨酸的第181位密码子，可选择地，同时含HBV逆转录酶结构域的一个或多个选自编码甲硫氨酸的180位密码子、编码异亮氨酸的第204位密码子和236位天冬氨酸密码子的密码子的靶多聚核酸的核酸序列推测HBV逆转录酶结构域的所述编码丝氨酸的第181位密码子的是否存在、可选择地，一个或多个HBV逆转录酶结构域中选自编码甲硫氨酸的180位密码子、编码异亮氨酸的第204位密码子和236位天冬氨酸密码子是否同时存在，从而推测所述HBV在所述生物样品中存在的手段，及可选择地，

b.获得靶多聚核酸的核酸序列的手段。

24.权利要求22和23任一项中的诊断试剂盒，其含有可区分编码丝氨酸的第181位密码子和181位丙氨酸或缬氨酸密码子的寡核苷酸。

25.一种筛选针对含权利要求6到9任一项中的多聚核酸的HBV有活性的药物的方法，包括，

a.在没有所述药物时测定所述HBV的复制；

b.在有所述药物时测定所述HBV的复制；

c.从(a)和(b)推测所述药物在所述HBV复制中的抑制效果。

26.一种寡核苷酸，其可区分权利要求6到9任一项中所述的HBV多聚核酸或其片段中编码丝氨酸的第181位密码子和181位其它任何氨基酸密码子。

27.权利要求28中的寡核苷酸，其可区分编码丝氨酸的第181位密码子和编码丙氨酸或缬氨酸的第181位密码子。