JP2009213465A - B型肝炎ウイルス薬剤耐性株検出用核酸プライマーセット、アッセイキットおよびb型肝炎ウィルスの薬剤耐性株の検出方法 - Google Patents
B型肝炎ウイルス薬剤耐性株検出用核酸プライマーセット、アッセイキットおよびb型肝炎ウィルスの薬剤耐性株の検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009213465A JP2009213465A JP2008275200A JP2008275200A JP2009213465A JP 2009213465 A JP2009213465 A JP 2009213465A JP 2008275200 A JP2008275200 A JP 2008275200A JP 2008275200 A JP2008275200 A JP 2008275200A JP 2009213465 A JP2009213465 A JP 2009213465A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- probe
- primer
- polynucleotide
- complementary strand
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
Abstract
【解決手段】プライマーセットを用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせ、B型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程とを具備するB型肝炎ウィルスの薬剤耐株の検出方法。
【選択図】なし
Description
肝臓、47巻11号、499-502(2006) Int.J.Med.Sci.2005 2(1)
本発明は、
プライマーセットを用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物と、B型肝炎ウイルスの薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび/または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせ、B型肝炎ウィルスの薬剤耐性株または非薬剤耐耐性株を検出する工程とを具備するB型肝炎ウィルスの薬剤耐株または非薬剤耐性株の検出方法であって、
前記プライマーセットは、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーを具備し、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の181位および204位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための、
FIPプライマーが配列番号3、BIPプライマーが配列番号4、F3プライマーが配列番号27、B3プライマーが配列番号28で示されるプライマーセット1、および
FIPプライマーが配列番号5、BIPプライマーが配列番号6、F3プライマーが配列番号29、B3プライマーが配列番号30で示されるプライマーセット2、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の204位および236位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための、
FIPプライマーが配列番号7、BIPプライマーが配列番号8、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号32で示されるプライマーセット3、および
FIPプライマーが配列番号9、BIPプライマーが配列番号10、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号32で示されるプライマーセット4、
FIPプライマーが配列番号7、BIPプライマーが配列番号121、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号123で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット11、
FIPプライマーが配列番号9、BIPプライマーが配列番号122、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号124で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット12
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の236位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための
FIPプライマーが配列番号15、BIPプライマーが配列番号16、F3プライマーが配列番号33、B3プライマーが配列番号34で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット5、
FIPプライマーが配列番号17、BIPプライマーが配列番号18、F3プライマーが配列番号35、B3プライマーが配列番号36で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット6、
FIPプライマーが配列番号19、BIPプライマーが配列番号20、F3プライマーが配列番号37、B3プライマーが配列番号38で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット7、および
FIPプライマーが配列番号21、BIPプライマーが配列番号22、F3プライマーが配列番号39、B3プライマーが配列番号40で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット8
並びに、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の181位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための
FIPプライマーが配列番号23、BIPプライマーが配列番号24、F3プライマーが配列番号41、B3プライマーが配列番号42で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット9、
FIPプライマーが配列番号25、BIPプライマーが配列番号26、F3プライマーが配列番号43、B3プライマーが配列番号44で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット10;
からなる群より少なくとも1が選択されることを特徴とするB型肝炎ウィルス薬剤耐性株または非薬剤耐株の検出方法である。
以下にLAMP法の概要を説明する。なお、本明細書では、塩基多型の検出に供される核酸を検体核酸と称する。また、本発明に従うLAMP増幅プライマーにより増幅されるHBVのポリメラーゼ領域の181位、204位、または236位のアミノ酸をコードする領域を含む核酸を標的核酸と称する。また、LAMP法によって得られた産物を増幅産物と称する。また、増幅の対象となるHBVを含む溶液を試料溶液と称する。
核酸プローブは、多型部位を含むFP領域またはBPc領域と結合するように設計する。即ち、核酸プローブは、FP領域またはBPc領域のうち、多型部位を含む領域の配列と相補的な配列を有する。
核酸プローブは、これに限定されないが、基体上に固定化して用いることができる。核酸プローブ固定化基体は、DNAチップ、DNAマイクロアレイと称されるそれ自身公知の装置を利用しても良い。
核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションは適切な条件下で行う。適切な条件は、増幅産物の種類や構造、検出配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブの種類によって異なる。例えば、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。反応溶液中には、ハイブリダーゼション促進剤である硫酸デキストラン、並びにサケ精子DNA、牛胸腺DNAやEDTAおよび界面活性剤などを添加しても良い。反応温度は、例えば10℃〜90℃の範囲で行い、攪拌や振盪などで反応効率を高めても良い。反応後の洗浄には、例えばイオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いればよい。
前記基体に固定化されたプローブと増幅産物とがハイブリダイズすると2本鎖核酸が生じる。この2本鎖核酸は、電気化学的にまたは蛍光により検出することができる。
電気化学的に2本鎖核酸を検出する方法を説明する。この方法では、2本鎖核酸を特異的に認識する2本鎖認識体を用いる。2本鎖認識体の例には、例えば、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーターなどが含まれるが、これらに限定されない。更に、これらの物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾することも可能である。
蛍光によって2本鎖核酸を検出する方法を説明する。予め、プライマーを蛍光学的に活性な物質で標識しておく。または、蛍光学的に活性な物質で標識した2次プローブを用いて検出する。或いは、複数の標識を使用してもよい。蛍光学的に活性な物質は、これらに限定されないが、FITC、Cy3、Cy5、もしくはローダミンなどの蛍光色素を含む。蛍光物質は、例えば蛍光検出器を用いて検出される。標識の種類に応じた適宜の検出装置を用い、標識された検出配列または2次プローブを検出する。
図5に示すように、問題の塩基多型部位をB1cとB2cの間、すなわちBPc領域に位置させる場合、BIPプライマーは、B2c領域と相補的な配列、および、B1c領域と同じ配列を有するプライマーである。したがって、このB2c領域とB1c領域とが、問題の塩基多型部位を挟んで位置する限り、様々な種類のプライマーを設計し、目的の増幅産物を得ることが可能である。
以上を踏まえて、本発明に従うLAMP増幅用核酸プライマーおよびその増幅産物を検出するための核酸プローブの塩基配列の設定は、以下のように行った。まず、基準配列をデータベースを基に設定した。まず、遺伝子配列情報データベースであるGenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov./Genbank/index.html)から、B型およびC型のHBVの配列情報を入手した。図8および図9に、当該設定に使用した配列の受諾番号(Accession No.)を示す(図8および図9)。
[FIPプライマー(1)とBIPプライマー(3)]
まず、FIPプライマーとBIPプライマーを決定した。表1に、HBV薬剤耐性株検出用の12種の核酸プライマーセットのFIPプライマーおよびBIPプライマーを示す。
F3およびB3プライマーは、F2領域の5’末端より上流の領域、B2c領域の3’末端より下流の領域に結合する配列を有するものであればよい。表1に示す各プライマーセットに対して表2に記載する配列を、F3 および B3プライマーセットとして使用する。
図10および図11に示した各々の基準配列を元にプローブの設計を行なった。四角で囲んだ3塩基がそれぞれ変異部位である181位、204位、または236位のアミノ酸をコードするコドン領域の位置である。塩基変異に基づいて四角で囲んだ3塩基の配列は当然異なったものとなる。本発明で使用される核酸プローブは、B型、C型の181位、204位、または236位の対象アミノ酸に対応するプローブをその希望する検出対象に応じて選択して用いる。
当該プライマーセット1〜12を用いて検体核酸をLAMP増幅する際には、検出を行なうジェノタイプや多型塩基の種類に応じて、プライマーセット1〜12を単独で、または、プライマーセット1〜12から選択される複数のプライマーセットを組み合わせて混合して、増幅を実施しても良い。
(A)プライマーセット1と2(検出対象:B型、C型、181位、204位)の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得(第1の増幅産物)、また別個にプライマーセット3と4(検出対象:B型、C型、204位、236位)の混合プライマーを用いて検体核酸に対してLAMP増幅反応を実施して増幅産物を得(第2の増幅産物)、さらに第1および第2の増幅産物を混合し、この混合物を、B型、C型の181位、204位、および236位検出用プローブとのハイブリダイゼーションに供する。
本発明に従うLAMP増幅用核酸プライマーセットの例およびプローブセットの例を以下に示す。
当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーからなり、二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号3で示されるプライマー、配列番号5で示されるプライマー、配列番号7で示されるプライマーおよび配列番号9で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号4で示されるプライマー、配列番号6で示されるプライマー、配列番号8で示されるプライマーおよび配列場号10で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号27で示されるプライマー、配列番号29で示されるプライマーおよび配列番号31で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号28で示されるプライマー、配列番号30で示されるプライマーおよび配列番号32で示されるプライマーを含む
プライマーセットであってよい。
当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーからなり、二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号3で示されるプライマー、配列番号5で示されるプライマー、配列番号15で示されるプライマーおよび配列番号17で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号4で示されるプライマー、配列番号6で示されるプライマー、配列番号16で示されるプライマーおよび配列場号18で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号27で示されるプライマー、配列番号29で示されるプライマー、配列番号33で示されるプライマーおよび配列番号35で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号28で示されるプライマー、配列番号30で示されるプライマー、配列番号34で示されるプライマーおよび配列番号36で示されるプライマーを含む
プライマーセットであってよい。
当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーからなり、二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号3で示されるプライマー、配列番号5で示されるプライマー、配列番号19で示されるプライマーおよび配列番号21で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号4で示されるプライマー、配列番号6で示されるプライマー、配列番号20で示されるプライマーおよび配列場号22で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号27で示されるプライマー、配列番号29で示されるプライマー、配列番号37で示されるプライマーおよび配列番号39で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号28で示されるプライマー、配列番号30で示されるプライマー、配列番号38で示されるプライマーおよび配列番号40で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーからなり、二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号3で示されるプライマー、配列番号5で示されるプライマー、配列番号7で示されるプライマーおよび配列番号9で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号4で示されるプライマー、配列番号6で示されるプライマー、配列番号121で示されるプライマーおよび配列場号122で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号27で示されるプライマー、配列番号29で示されるプライマー、および配列番号31示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号28で示されるプライマー、配列番号30で示されるプライマー、配列番号123で示されるプライマーおよび配列番号124で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーからなり、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号7で示されるプライマー、配列番号9で示されるプライマー、配列番号23で示されるプライマーおよび配列番号25で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号8で示されるプライマー、配列番号10で示されるプライマー、配列番号24で示されるプライマーおよび配列場号26で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号31で示されるプライマー、配列番号41で示されるプライマーおよび配列番号43で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号32で示されるプライマー、配列番号42で示されるプライマーおよび配列番号44で示されるプライマーを含み
プライマーセットである。
当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーからなり、二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号23で示されるプライマー、配列番号25で示されるプライマー、配列番号7で示されるプライマーおよび配列番号9で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号24で示されるプライマー、配列番号26で示されるプライマー、配列番号121で示されるプライマーおよび配列場号122で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号41で示されるプライマー、配列番号43で示されるプライマー、および配列番号31示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号42で示されるプライマー、配列番号44で示されるプライマー、配列番号123で示されるプライマーおよび配列番号124で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
当該プライマーセットは、B型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号3で示されるプライマーおよび配列番号7で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号4で示されるプライマーおよび配列番号8で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号27で示されるプライマーおよび配列番号31で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号28で示されるプライマーおよび配列番号32で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
配列番号50で示されるプローブ、配列番号51で示されるプローブ、配列番号52で示されるプローブ、配列番号53で示されるプローブ、配列番号54で示されるプローブ、配列番号55で示されるプローブ、配列番号56で示されるプローブ、配列番号57で示されるプローブ、配列番号58で示されるプローブ、配列番号59で示されるプローブ、配列番号60で示されるプローブ、配列番号61で示されるプローブ、配列番号62で示されるプローブ、配列番号63で示されるプローブ、配列番号76で示されるプローブ、配列番号77で示されるプローブ、配列番号78で示されるプローブ、配列番号79で示されるプローブ、配列番号80で示されるプローブ、配列番号81で示されるプローブ、配列番号82で示されるプローブおよび配列番号83で示されるプローブ、配列番号132で示されるプローブ、配列番号133で示されるプローブ、配列番号134で示されるプローブ、配列番号135で示されるプローブ、配列番号136で示されるプローブであってよい。またはこれらのプローブの相補鎖であってもよい。
当該プライマーセットは、C型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号5で示されるプライマーおよび配列番号9で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号6で示されるプライマーおよび配列場号10で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号29で示されるプライマーおよび配列番号31で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号30で示されるプライマーおよび配列番号32で示されるプライマー含むプライマーセットであってよい。
配列番号84で示されるプローブ、配列番号85で示されるプローブ、配列番号86で示されるプローブ、配列番号87で示されるプローブ、配列番号88で示されるプローブ、配列番号89で示されるプローブ、配列番号90で示されるプローブおよび配列番号91で示されるプローブ、配列番号132で示されるプローブ、配列番号133で示されるプローブ、配列番号134で示されるプローブ、配列番号135で示されるプローブ、配列番号136で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であっても良い。
当該プライマーセットは、B型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号3で示されるプライマー、配列番号15で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号4で示されるプライマー、配列番号16で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号27で示されるプライマー、配列番号33で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号28で示されるプライマー、配列番号34で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
当該プライマーセットは、C型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号5で示されるプライマー、配列番号17で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号6で示されるプライマー、配列番号18で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号29で示されるプライマー、配列番号35で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号30で示されるプライマー、配列番号36で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
当該プライマーセットは、B型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号3で示されるプライマー、配列番号19で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号4で示されるプライマー、配列番号20で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号27で示されるプライマー、配列番号37で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号28で示されるプライマー、配列番号38で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
当該プライマーセットは、C型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号5で示されるプライマー、配列番号21で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号6で示されるプライマー、配列番号22で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号29で示されるプライマー、配列番号39で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号30で示されるプライマー、配列番号40で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
当該プライマーセットは、B型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号3で示されるプライマーおよび配列番号7で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号4で示されるプライマーおよび配列番号121で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号27で示されるプライマーおよび配列番号31で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号28で示されるプライマーおよび配列番号123で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
配列番号50で示されるプローブ、配列番号51で示されるプローブ、配列番号52で示されるプローブ、配列番号53で示されるプローブ、配列番号54で示されるプローブ、配列番号55で示されるプローブ、配列番号56で示されるプローブ、配列番号57で示されるプローブ、配列番号58で示されるプローブ、配列番号59で示されるプローブ、配列番号60で示されるプローブ、配列番号61で示されるプローブ、配列番号62で示されるプローブ、配列番号63で示されるプローブ、
配列番号76で示されるプローブ、配列番号77で示されるプローブ、配列番号78で示されるプローブ、配列番号79で示されるプローブ、配列番号80で示されるプローブ、配列番号81で示されるプローブ、配列番号82で示されるプローブおよび配列番号83で示されるプローブ、配列番号132で示されるプローブ、配列番号133で示されるプローブ、配列番号134で示されるプローブ、配列番号135で示されるプローブ、配列番号136で示されるプローブであってよい。またはこれらのプローブの相補鎖であってもよい。
当該プライマーセットは、C型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号5で示されるプライマーおよび配列番号9で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号6で示されるプライマーおよび配列場号122で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号29で示されるプライマーおよび配列番号31で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号30で示されるプライマーおよび配列番号124で示されるプライマー含むプライマーセットであってよい。
配列番号64で示されるプローブ、配列番号65で示されるプローブ、配列番号66で示されるプローブ、配列番号67で示されるプローブ、配列番号68で示されるプローブ、配列番号69で示されるプローブ、配列番号70で示されるプローブ、配列番号71で示されるプローブ、配列番号72で示されるプローブ、配列番号73で示されるプローブ、配列番号74で示されるプローブ、配列番号75で示されるプローブ、
配列番号84で示されるプローブ、配列番号85で示されるプローブ、配列番号86で示されるプローブ、配列番号87で示されるプローブ、配列番号88で示されるプローブ、配列番号89で示されるプローブ、配列番号90で示されるプローブおよび配列番号91で示されるプローブ、配列番号132で示されるプローブ、配列番号133で示されるプローブ、配列番号134で示されるプローブ、配列番号135で示されるプローブ、配列番号136で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であっても良い。
当該プライマーセットは、B型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号7で示されるプライマー、配列番号23で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号8で示されるプライマー、配列番号24で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号31で示されるプライマー、配列番号41で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号32で示されるプライマー、配列番号42で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
当該プライマーセットは、C型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号9で示されるプライマー、配列番号25で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号10で示されるプライマー、配列番号26で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーセットが、配列番号31で示されるプライマー、配列番号33で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーセットが、配列番号32で示されるプライマー、配列番号44で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
当該プライマーセットは、B型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号23で示されるプライマーおよび配列番号7で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号24で示されるプライマーおよび配列番号121で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号41で示されるプライマーおよび配列番号31で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号42で示されるプライマーおよび配列番号123で示されるプライマーを含む
プライマーセットである。
配列番号50で示されるプローブ、配列番号51で示されるプローブ、配列番号52で示されるプローブ、配列番号53で示されるプローブ、配列番号54で示されるプローブ、配列番号55で示されるプローブ、配列番号56で示されるプローブ、配列番号57で示されるプローブ、配列番号58で示されるプローブ、配列番号59で示されるプローブ、配列番号60で示されるプローブ、配列番号61で示されるプローブ、配列番号62で示されるプローブ、配列番号63で示されるプローブ、
配列番号76で示されるプローブ、配列番号77で示されるプローブ、配列番号78で示されるプローブ、配列番号79で示されるプローブ、配列番号80で示されるプローブ、配列番号81で示されるプローブ、配列番号82で示されるプローブおよび配列番号83で示されるプローブ、配列番号132で示されるプローブ、配列番号133で示されるプローブ、配列番号134で示されるプローブ、配列番号135で示されるプローブ、配列番号136で示されるプローブであってよい。またはこれらのプローブの相補鎖であってもよい。
当該プライマーセットは、C型のHBVの薬剤耐性を検出するものであってもよい。当該プライマーセットは、ポリメラーゼ領域の181位、204位、236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するために、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーとを含み、
二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域およびF1領域とし、他方の一本鎖核酸の3’末端側から順にB3c領域、B2c領域およびB1c領域とした場合に、
前記FIPプライマーセットが、配列番号25で示されるプライマーおよび配列番号9で示されるプライマーを含み、
前記BIPプライマーセットが、配列番号26で示されるプライマーおよび配列場号122で示されるプライマーを含み、
前記F3プライマーが、配列番号43で示されるプライマーおよび配列番号31で示されるプライマーを含み、
前記B3プライマーが、配列番号44で示されるプライマーおよび配列番号124で示されるプライマー含むプライマーセットであってよい。
配列番号84で示されるプローブ、配列番号85で示されるプローブ、配列番号86で示されるプローブ、配列番号87で示されるプローブ、配列番号88で示されるプローブ、配列番号89で示されるプローブ、配列番号90で示されるプローブおよび配列番号91で示されるプローブ、配列番号132で示されるプローブ、配列番号133で示されるプローブ、配列番号134で示されるプローブ、配列番号135で示されるプローブ、配列番号136で示されるプローブである。またはこれらのプローブの相補鎖であっても良い。
本発明のアッセイキットは、本発明に従うプライマーセット、任意にループプライマー、本発明に従うプローブを具備する。また、任意に、LAMP法に必要な試薬を具備してもよく、当該プローブを基体に固定化した状態で具備してもよい。
対象からの血液、血清および臓器を試料として、上述の何れかのLAMP増幅用核酸プライマーセットとプローブを用いて、HBVからの標的核酸が薬剤耐性であるか、非薬剤耐性であるかを調べる。
以下、プライマーセット1〜12を用いた増幅試験について記載する。
LAMP反応に必要な酵素、dNTP、緩衝溶液を含むLAMP反応溶液に、表1に記載のプライマーセット1〜12をそれぞれ含む12本のLAMP反応溶液を調製した。63℃にてLAMP増幅を行い、LAMP増幅の立ち上がり時間を濁度計によって検出し、比較した。ここで、「立ち上がり時間」とは、増幅反応に伴い増加する濁度が濁度計で最初に検出される時間である。
12種類のプライマーセットから得られるLAMP増幅の立ち上がり時間を表6に示した。
例11で決定されたより好ましいプライマーセットそれぞれについて、各アミノ酸を検出するためのプローブ配列を決定した。
鋳型配列として、以下の8種類の配列を合成した。
テンプレート3は、上述のテンプレート1の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「ATG」が「ATT」である塩基配列である;
テンプレート4は、上述のテンプレート1の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「ATG」が「ATA」である塩基配列である;
テンプレート5は、上述のテンプレート1の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「ATG」が「GTG」である塩基配列である;
テンプレート6は、上述のテンプレート1の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「ATG」が「GTC」である塩基配列である;
テンプレート7は、上述のテンプレート1の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「ATG」が「GTT」である塩基配列である;
テンプレート8は、上述のテンプレート1の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「ATG」が「GTA」である塩基配列である。
表1、表2に記載のプライマーセット1(FIP, BIPを40pmol, F3, B3を5pmol)、および表3に記載のループプライマー19(20pmol)、およびLAMP反応に必要な酵素(Bst-DNPポリメラーゼ[NEB社製]1μL)、dNTP、LAMP反応用緩衝溶液を含むLAMP反応溶液を8本調製した。調製した8本それぞれに対し、テンプレート1からテンプレート8をそれぞれ終濃度1E+03copies/reactionとなるように添加し、63℃で1時間反応させた。それぞれに得られた反応液の一部分について電気泳動を行い、LAMP産物が得られたことを確認した。
本実施例ではDNAプローブの支持体として金電極を使用した。核酸プローブを固定する作用極、電気化学測定に必要な対極と参照極、さらにこれらの電極と配線されている電極パッドが一枚のガラス基板上に複数配置されているDNAチップ用基板を作製した。
上記で調製した標的核酸溶液1〜8、を上記核酸プローブ固定化電極上に添加後、45℃で10分間反応することで、標的核酸を核酸プローブにハイブリダイズさせた。その後、非特異的に吸着または結合している標的核酸を除去するために、0.2×SSC溶液を添加し、各温度(35、37、39℃)で20分間反応させることで洗浄を行った。洗浄用緩衝液を除去したあと、核酸に結合する挿入剤としてヘキスト33258を添加した。その後、リニアスイープボルタンメトリーを行い、得られたボルタモグラムからヘキスト33258の酸化に由来するピーク電流値を算出した。
本例は、プローブと標的核酸の一部が完全に相補的である組み合わせ、およびプローブと標的核酸の一部が1塩基だけ異なる組み合わせを選択し、各核酸プローブ固定化電極から得られる電流値をバックグラウンド電流値に対する割合(S/B比)として表7〜14に示した。
以下、プライマーセット11、12を用いてLAMP増幅を行い、B型およびC型肝炎ウィルスのポリメラーゼ領域の236位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出する例を記載する。
鋳型配列として、以下の9種類の配列を合成した。
テンプレート17は、上述のテンプレート15の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「AAC」が「ACC」である塩基配列である。
テンプレート20は、上述のテンプレート18の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GAAC」が「GACC」である塩基配列である;
テンプレート21は、上述のテンプレート18の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GAAC」が「AAAC」である塩基配列である;
テンプレート22は、上述のテンプレート18の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GAAC」が「AAAT」である塩基配列である;
テンプレート23は、上述のテンプレート18の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GAAC」が「AACC」である塩基配列である。
表1、表2に記載のプライマーセット11、12(FIP, BIPを各40pmol, F3, B3を各5pmol)、および表3に記載のループプライマー125、126(各20pmol)、およびLAMP反応に必要な酵素(Bst-DNPポリメラーゼ[NEB社製]2μL)、dNTP、LAMP反応用緩衝溶液を含むLAMP反応溶液を9本調製した。調製した9本それぞれに対し、テンプレート15からテンプレート23をそれぞれ終濃度1E+03copies/reactionとなるように添加し、63℃で1時間反応させた。それぞれに得られた反応液の一部分について電気泳動を行い、LAMP産物が得られたことを確認した。
本実施例ではDNAプローブの支持体として金電極を使用した。核酸プローブを固定する作用極、電気化学測定に必要な対極と参照極、さらにこれらの電極と配線されている電極パッドが一枚のガラス基板上に複数配置されているDNAチップ用基板を作製した。
上記で調製した標的核酸溶液15〜23を上記核酸プローブ固定化電極上に添加後、45℃で10分間反応することで、標的核酸を核酸プローブにハイブリダイズさせた。その後、非特異的に吸着または結合している標的核酸を除去するために、0.2×SSC溶液を添加し、各温度(35、37、39℃)で10分間反応させることで洗浄を行った。洗浄用緩衝液を除去したあと、核酸に結合する挿入剤としてヘキスト33258を添加した。その後、リニアスイープボルタンメトリーを行い、得られたボルタモグラムからヘキスト33258の酸化に由来するピーク電流値を算出した。
本例は、プローブと標的核酸の一部が完全に相補的である組み合わせ、およびプローブと標的核酸の一部が1塩基または2塩基だけ異なる組み合わせを選択し、各核酸プローブ固定化電極から得られる電流値をバックグラウンド電流値に対する割合(S/B比)として表A〜28に示した。
鋳型配列として、以下の15種類の配列を合成した。
テンプレート26は、上述のテンプレート24の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCA」である塩基配列である;
テンプレート27は、上述のテンプレート24の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCG」である塩基配列である;
テンプレート28は、上述のテンプレート24の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GTT」である塩基配列である。
テンプレート31は、上述のテンプレート29の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCA」である塩基配列である;
テンプレート32は、上述のテンプレート29の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCG」である塩基配列である;
テンプレート33は、上述のテンプレート29の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GTT」である塩基配列である。
テンプレート36は、上述のテンプレート34の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCA」である塩基配列である;
テンプレート37は、上述のテンプレート34の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GCG」である塩基配列である;
テンプレート38は、上述のテンプレート34の配列中の四角で囲まれた部分の配列、即ち、「GCT」が「GTT」である塩基配列である。
表1、表2に記載のプライマーセット1、2(FIP, BIPを各40pmol, F3, B3を各5pmol)、および表3に記載のループプライマー46(各20pmol)、およびLAMP反応に必要な酵素(Bst-DNPポリメラーゼ[NEB社製]2μL)、dNTP、LAMP反応用緩衝溶液を含むLAMP反応溶液を9本調製した。調製した9本それぞれに対し、テンプレート24からテンプレート38をそれぞれ終濃度1E+03copies/reactionとなるように添加し、63℃で1時間反応させた。それぞれに得られた反応液の一部分について電気泳動を行い、LAMP産物が得られたことを確認した。
本実施例ではDNAプローブの支持体として金電極を使用した。核酸プローブを固定する作用極、電気化学測定に必要な対極と参照極、さらにこれらの電極と配線されている電極パッドが一枚のガラス基板上に複数配置されているDNAチップ用基板を作製した。
上記で調製した標的核酸溶液24〜38を上記核酸プローブ固定化電極上に添加後、45℃で10分間反応することで、標的核酸を核酸プローブにハイブリダイズさせた。その後、非特異的に吸着または結合している標的核酸を除去するために、0.2×SSC溶液を添加し、各温度(35、37、39℃)で10分間反応させることで洗浄を行った。洗浄用緩衝液を除去したあと、核酸に結合する挿入剤としてヘキスト33258を添加した。その後、リニアスイープボルタンメトリーを行い、得られたボルタモグラムからヘキスト33258の酸化に由来するピーク電流値を算出した。
本例は、プローブと標的核酸の一部が完全に相補的である組み合わせ、およびプローブと標的核酸の一部が1塩基または2塩基だけ異なる組み合わせを選択し、各核酸プローブ固定化電極から得られる電流値をバックグラウンド電流値に対する割合(S/B比)として表J〜43に示した。
Claims (18)
- FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーを具備し、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の181位および204位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための、
FIPプライマーが配列番号3、BIPプライマーが配列番号4、F3プライマーが配列番号27、B3プライマーが配列番号28で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット1、および
FIPプライマーが配列番号5、BIPプライマーが配列番号6、F3プライマーが配列番号29、B3プライマーが配列番号30で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット2、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の204位および236位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための、
FIPプライマーが配列番号7、BIPプライマーが配列番号8、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号32で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット3、および
FIPプライマーが配列番号9、BIPプライマーが配列番号10、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号32で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット4、
FIPプライマーが配列番号7、BIPプライマーが配列番号121、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号123で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット11、および
FIPプライマーが配列番号9、BIPプライマーが配列番号122、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号124で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット12、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の236位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための
FIPプライマーが配列番号15、BIPプライマーが配列番号16、F3プライマーが配列番号33、B3プライマーが配列番号34で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット5、
FIPプライマーが配列番号17、BIPプライマーが配列番号18、F3プライマーが配列番号35、B3プライマーが配列番号36で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット6、
FIPプライマーが配列番号19、BIPプライマーが配列番号20、F3プライマーが配列番号37、B3プライマーが配列番号38で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット7、および
FIPプライマーが配列番号21、BIPプライマーが配列番号22、F3プライマーが配列番号39、B3プライマーが配列番号40で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット8、並びに、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の181位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための
FIPプライマーが配列番号23、BIPプライマーが配列番号24、F3プライマーが配列番号41、B3プライマーが配列番号42で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット9、および
FIPプライマーが配列番号25、BIPプライマーが配列番号26、F3プライマーが配列番号43、B3プライマーが配列番号44で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット10:
からなる群より少なくとも1セットが選択されることを特徴とするB型肝炎ウィルスの薬剤耐性株および非薬剤耐性株を検出するためのLAMP増幅用核酸プライマーセット。 - 更に、ループプライマーとして、前記プライマーセット1または2に対して、配列番号45、配列番号46、および配列番号47のうち、少なくとも1の配列で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーを具備し、前記プライマーセット3または4に対して、配列番号48および配列番号49のうち少なくとも1の配列で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーを更に具備し、前記プライマーセット11または12に対して、配列番号125および配列番号126のうち少なくとも1の配列で示されるプライマーを更に具備することを特徴とする請求項1記載のプライマーセット。
- プライマーセットを用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物と、B型肝炎ウイルスの薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび/または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせ、B型肝炎ウィルスの薬剤耐性株または非薬剤耐性株を検出する工程とを具備するB型肝炎ウィルスの薬剤耐株または非薬剤耐性株の検出方法であって、
前記プライマーセットは、FIPプライマーと、F3プライマーと、BIPプライマーと、B3プライマーを具備し、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の181位および204位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための、
FIPプライマーが配列番号3、BIPプライマーが配列番号4、F3プライマーが配列番号27、B3プライマーが配列番号28で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット1、および
FIPプライマーが配列番号5、BIPプライマーが配列番号6、F3プライマーが配列番号29、B3プライマーが配列番号30で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット2、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の204位および236位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための、
FIPプライマーが配列番号7、BIPプライマーが配列番号8、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号32で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット3、および
FIPプライマーが配列番号9、BIPプライマーが配列番号10、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号32で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット4、
FIPプライマーが配列番号7、BIPプライマーが配列番号121、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号123で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット11、および
FIPプライマーが配列番号9、BIPプライマーが配列番号122、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号124で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット12、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の236位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための
FIPプライマーが配列番号15、BIPプライマーが配列番号16、F3プライマーが配列番号33、B3プライマーが配列番号34で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット5、
FIPプライマーが配列番号17、BIPプライマーが配列番号18、F3プライマーが配列番号35、B3プライマーが配列番号36で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット6、
FIPプライマーが配列番号19、BIPプライマーが配列番号20、F3プライマーが配列番号37、B3プライマーが配列番号38で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット7、および
FIPプライマーが配列番号21、BIPプライマーが配列番号22、F3プライマーが配列番号39、B3プライマーが配列番号40で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット8、並びに、
B型肝炎ウイルスのポリメラーゼ領域の181位のアミノ酸をコードする塩基配列を含む塩基配列領域を増幅するための
FIPプライマーが配列番号23、BIPプライマーが配列番号24、F3プライマーが配列番号41、B3プライマーが配列番号42で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット9、および
FIPプライマーが配列番号25、BIPプライマーが配列番号26、F3プライマーが配列番号43、B3プライマーが配列番号44で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット10;
からなる群より少なくとも1セットが選択されることを特徴とするB型肝炎ウィルス薬剤耐性株または非薬剤耐株の検出方法。 - 前記薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび/または前記非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブが、
配列番号50で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号51で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号52で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号53で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号54で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号55で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号56で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号57で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブからなる群より少なくとも1種選択されたプローブを具備するプローブ群1、
配列番号58で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号59で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号60で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号61で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号62で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号63で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号64で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号65で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号66で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号67で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号68で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号69で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号70で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号71で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号72で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号73で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号74で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号75で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブからなる群より少なくとも1種選択されたプローブを具備するプローブ群2、並びに
配列番号76で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号77で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号78で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号79で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号80で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号81で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号82で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号83で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号84で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号85で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号86で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号87で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号88で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号89で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号90で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号91で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号132で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号133で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号134で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号135で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号136で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブからなる群より少なくとも1種選択されたプローブを具備するプローブ群3、
からなる群より、用いるプライマーセットに応じて、少なくとも1選択されるプローブ群であり、前記各々のプローブが全長15塩基以上45塩基以下であることを特徴とする請求項3記載の方法。 - 前記プライマーセットが、
FIPプライマーが配列番号3、BIPプライマーが配列番号4、F3プライマーが配列番号27、B3プライマーが配列番号28で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット1、
FIPプライマーが配列番号5、BIPプライマーが配列番号6、F3プライマーが配列番号29、B3プライマーが配列番号30で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット2、
FIPプライマーが配列番号7、BIPプライマーが配列番号121、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号123で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット11、および
FIPプライマーが配列番号9、BIPプライマーが配列番号122、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号124で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット12
からなる群より少なくとも1選択されたプライマーセットであり、
前記薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび/または前記非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブが、
配列番号93で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号96で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号99で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号105で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号108で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号113で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号117で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号119で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号147で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号149で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号152で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号155で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号157で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号158示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号161で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号164で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号167で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号169で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号171で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号173で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号174で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号176で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号179示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号181で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号183で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号184示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号186で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号188で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号190示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号192で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号193で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、および配列番号195で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブからなる群より少なくとも1種選択されたプローブを具備するプローブ群であることを特徴とする請求項4記載の方法。 - 前記増幅産物を得る工程は、前記プライマーセット1およびプライマーセット2を同時に用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し第1の増幅産物を得る工程と、
前記プライマーセット3およびプライマーセット4を同時に用いて試料溶液中のHBV核酸をLAMP増幅し、第2の増幅産物を得る工程を備え、
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程は、前記第1および第2の増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを有するプローブおよび/または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを有するプローブとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項3記載の方法。 - 前記増幅産物を得る工程は、前記プライマーセット1およびプライマーセット2を同時に用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し第1の増幅産物を得る工程と、
前記プライマーセット5およびプライマーセット6を同時に用いて試料溶液中のHBV核酸をLAMP増幅し、第2の増幅産物を得る工程を備え、
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程は、前記第1および第2の増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび/または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項3記載の方法。 - 前記増幅産物を得る工程は、前記プライマーセット1およびプライマーセット2を同時に用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し第1の増幅産物を得る工程と、
前記プライマーセット7およびプライマーセット8を同時に用いて試料溶液中のHBV核酸をLAMP増幅し、第2の増幅産物を得る工程を備え、
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程は、前記第1および第2の増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび/または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項3記載の方法。 - 前記増幅産物を得る工程は、前記プライマーセット3およびプライマーセット4を同時に用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し第1の増幅産物を得る工程と、
前記プライマーセット9およびプライマーセット10を同時に用いて試料溶液中のHBV核酸をLAMP増幅し、第2の増幅産物を得る工程を備え、
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程は、前記第1および第2の増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび/または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項3記載の方法。 - 前記増幅産物を得る工程は、前記プライマーセット1およびプライマーセット2を同時に用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し第1の増幅産物を得る工程と、
前記プライマーセット11およびプライマーセット12を同時に用いて試料溶液中のHBV核酸をLAMP増幅し、第2の増幅産物を得る工程を備え、
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程は、前記第1および第2の増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび/または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項3記載の方法。 - 前記増幅産物を得る工程は、前記プライマーセット9およびプライマーセット10を同時に用いて試料溶液中のB型肝炎ウイルス核酸をLAMP増幅し第1の増幅産物を得る工程と、
前記プライマーセット11およびプライマーセット12を同時に用いて試料溶液中のHBV核酸をLAMP増幅し、第2の増幅産物を得る工程を備え、
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐株を検出する工程は、前記第1および第2の増幅産物と、薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび/または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項3記載の方法。 - 請求項1または2のいずれかに記載のプライマーセットと、
B型肝炎ウィルスの薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび/または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブとを具備することを特徴とするB型肝炎ウィルスの薬剤耐性株または非薬剤耐性株を検出するためのアッセイキット。 - 前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび/または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブが、
配列番号50で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号51で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号52で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号53で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号54で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号55で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号56で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号57で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブからなる群より少なくとも1種選択されたプローブを具備するプローブ群1、
配列番号58で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号59で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号60で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号61で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号62で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号63で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号64で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号65で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号66で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号67で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号68で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号69で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号70で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号71で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号72で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号73で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号74で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号75で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブからなる群より少なくとも1種選択されたプローブを具備するプローブ群2、および
配列番号76で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号77で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号78で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号79で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号80で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号81で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号82で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号83で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号84で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号85で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号86で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号87で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号88で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号89で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号90で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号91で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号132で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号133で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号134で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、配列番号135で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ、および配列番号136で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブからなる群より少なくとも1種選択されたプローブを具備するプローブ群3、
からなる群より、前記で選択されたプライマーセットに応じて、少なくとも1選択されるプローブ群を具備し、前記各々のプローブが全長15塩基以上45塩基以下であることを特徴とする請求項10記載のアッセイキット。 - 前記プライマーセットが、
FIPプライマーが配列番号3、BIPプライマーが配列番号4、F3プライマーが配列番号27、B3プライマーが配列番号28で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット1、および
FIPプライマーが配列番号5、BIPプライマーが配列番号6、F3プライマーが配列番号29、B3プライマーが配列番号30で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット2、
FIPプライマーが配列番号7、BIPプライマーが配列番号8、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号32で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット3、および
FIPプライマーが配列番号9、BIPプライマーが配列番号10、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号32で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット4
FIPプライマーが配列番号7、BIPプライマーが配列番号121、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号123で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット11、および
FIPプライマーが配列番号9、BIPプライマーが配列番号122、F3プライマーが配列番号31、B3プライマーが配列番号124で示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット12
からなる群より少なくとも1選択されたプライマーセットであり
前記B型肝炎ウィルスの薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブおよび/または非薬剤耐性株由来のポリヌクレオチドを含むプローブが、
配列番号93で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号96で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号99で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号105で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号108で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号113で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号117で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号119で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号147で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号149で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号152で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号155で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号157で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号158示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号161で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号164で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号167で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号169で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号171で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号173で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号174で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号176で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号179示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号181で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号183で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号184示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号186で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号188で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号190示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号192で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号193で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、および配列番号195で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブで示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブからなる群であることを特徴とする請求項11記載のアッセイキット。 - 前記プライマーセットは、前記プライマーセット1、3、5、7、9、11のうち少なくとも1セットであり、ジェノタイプがB型であるB型肝炎ウィルスの薬剤耐性を検出するためのものであることを特徴とするための請求項1記載のプライマーセット。
- 前記プライマーセットは、前記プライマーセット2、4、6、8、10,12のうち少なくとも1セットであり、ジェノタイプがC型であるB型肝炎ウィルスの薬剤耐性を検出するためのものであることを特徴とするための請求項1記載のプライマーセット。
- ジェノタイプがB型であるB型肝炎ウィルスの薬剤耐性を検出するためのアッセイキットであり、
請求項10に記載のプライマーセットと、
配列番号50で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号51で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号52で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号53で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号54で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号55で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号56で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号57で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号58で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号59で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号60で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号61で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号62で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号63で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号76で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号77で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号78で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号79で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号80で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号81で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号82で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号83で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号132で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号133で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号134で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、配列番号135で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖、および配列番号136で示されるポリヌクレオチドまたは相補鎖を、それぞれに含み、全長15塩基以上45塩基以下であるプローブ群と
を具備することを特徴とするアッセイキット。 - ジェノタイプがC型であるB型肝炎ウィルスの薬剤耐性を検出するためのアッセイキットであり、
請求項11に記載のプライマーセットと、
配列番号50で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号51で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号52で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号53で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号54で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号55で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号56で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号57で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号64で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号65で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号66で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号67で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号68で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号69で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号70で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号71で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号72で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号73で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号74で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号75で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号84で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号85で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号86で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号87で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号88で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号89で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号90で示されるポリヌクレオチドおよび配列番号91で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号132で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号133で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号134で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列番号135で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、および配列番号136で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖をそれぞれ含み、全長15塩基以上45塩基以下であるプローブ群と
を具備することを特徴とするアッセイキット。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008275200A JP2009213465A (ja) | 2007-10-30 | 2008-10-27 | B型肝炎ウイルス薬剤耐性株検出用核酸プライマーセット、アッセイキットおよびb型肝炎ウィルスの薬剤耐性株の検出方法 |
CN2012102289708A CN102796828A (zh) | 2007-10-30 | 2008-10-30 | 用于检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的核酸引物组、测定试剂盒及检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的方法 |
CN200880104731A CN101790586A (zh) | 2007-10-30 | 2008-10-30 | 用于检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的核酸引物组、测定试剂盒及检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的方法 |
PCT/JP2008/070266 WO2009057829A2 (en) | 2007-10-30 | 2008-10-30 | Nucleic acid primer set for detection of drug-resistant strain of hepatitis b virus, assay kit, and method of detecting drug-resistant strain of hepatitis b virus |
US12/382,733 US20100248210A1 (en) | 2007-10-30 | 2009-03-23 | Nucleic acid primer set for detection of drug-resistant strain of hepatitis B virus, assay kit, and method of detecting drug-resistant strain of hepatitis B virus |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007282279 | 2007-10-30 | ||
JP2008033725 | 2008-02-14 | ||
JP2008275200A JP2009213465A (ja) | 2007-10-30 | 2008-10-27 | B型肝炎ウイルス薬剤耐性株検出用核酸プライマーセット、アッセイキットおよびb型肝炎ウィルスの薬剤耐性株の検出方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009213465A true JP2009213465A (ja) | 2009-09-24 |
Family
ID=40409756
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008275200A Pending JP2009213465A (ja) | 2007-10-30 | 2008-10-27 | B型肝炎ウイルス薬剤耐性株検出用核酸プライマーセット、アッセイキットおよびb型肝炎ウィルスの薬剤耐性株の検出方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20100248210A1 (ja) |
JP (1) | JP2009213465A (ja) |
CN (2) | CN102796828A (ja) |
WO (1) | WO2009057829A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012517804A (ja) * | 2009-02-13 | 2012-08-09 | ビッグテック プライベート リミテッド | B型肝炎ウイルスの検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012108961A1 (en) * | 2011-02-09 | 2012-08-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Detection of hepatitis b virus in blood using lamp method |
CN102286635B (zh) * | 2011-07-15 | 2013-05-01 | 广东凯普生物科技股份有限公司 | 乙型肝炎病毒核苷类似物耐药突变检测试剂盒 |
CN103540686B (zh) * | 2013-09-30 | 2015-11-11 | 长沙艾迪康医学检验所有限公司 | 一种检测hbv替比夫定耐药突变的引物、方法和试剂盒 |
CN103710466B (zh) * | 2013-12-30 | 2015-04-08 | 湖南圣维尔医学检验所有限公司 | 一种hbv的ymdd荧光pcr检测试剂盒 |
CN103710465B (zh) * | 2013-12-30 | 2015-02-04 | 湖南圣维尔医学检验所有限公司 | 一种乙型肝炎病毒基因分型pcr检测试剂盒 |
CN103849690B (zh) * | 2014-01-20 | 2015-12-30 | 凯杰生物工程(深圳)有限公司 | 用于检测人乙型肝炎病毒的引物组和探针 |
CN104513786B (zh) * | 2014-12-26 | 2018-03-06 | 中国人民解放军第四军医大学 | 生物反应芯片及其在pcr反应中的应用 |
CN105349526B (zh) * | 2015-11-22 | 2018-10-02 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种采用多重内引物进行恒温扩增核酸的方法及应用 |
CN112779290B (zh) * | 2021-01-27 | 2021-09-28 | 北京安必奇生物科技有限公司 | 乙型肝炎病毒b、c基因型前s1区基因串联重组质粒及其构建方法和应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004031224A2 (en) * | 2002-10-01 | 2004-04-15 | Gilead Sciences, Inc. | Hbv mutations associated with reduced susceptibility to adefovir |
WO2006097285A1 (en) * | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Innogenetics N.V. | Hepatitis-b viral variants with reduced susceptibility to nucleoside analogs and uses thereof |
JP2007000040A (ja) * | 2005-06-22 | 2007-01-11 | Eiken Chem Co Ltd | B型肝炎ウイルスの検出方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ZA973367B (en) * | 1996-04-19 | 1997-11-18 | Innogenetics Nv | Method for typing and detecting HBV. |
AU2003272104A1 (en) * | 2002-10-18 | 2004-05-04 | Genematrix Inc. | Method for detecting mutations |
KR100650162B1 (ko) * | 2003-08-05 | 2006-11-27 | 주식회사 진인 | 품질 관리 프로브 및 음성 조절 프로브를 함유하는 약제내성 b형 간염 바이러스 검출용 마이크로어레이 및 이를이용한 약제 내성 b형 간염 바이러스의 검출 방법 |
JP4410268B2 (ja) * | 2007-03-28 | 2010-02-03 | 株式会社東芝 | メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(mthfr)の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット及び核酸プローブ |
JP4490988B2 (ja) * | 2007-04-26 | 2010-06-30 | 株式会社東芝 | 血清アミロイドa1(saa1)の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット、キット、及び該プライマーセットを用いた検出方法 |
-
2008
- 2008-10-27 JP JP2008275200A patent/JP2009213465A/ja active Pending
- 2008-10-30 WO PCT/JP2008/070266 patent/WO2009057829A2/en active Application Filing
- 2008-10-30 CN CN2012102289708A patent/CN102796828A/zh active Pending
- 2008-10-30 CN CN200880104731A patent/CN101790586A/zh active Pending
-
2009
- 2009-03-23 US US12/382,733 patent/US20100248210A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004031224A2 (en) * | 2002-10-01 | 2004-04-15 | Gilead Sciences, Inc. | Hbv mutations associated with reduced susceptibility to adefovir |
WO2006097285A1 (en) * | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Innogenetics N.V. | Hepatitis-b viral variants with reduced susceptibility to nucleoside analogs and uses thereof |
JP2007000040A (ja) * | 2005-06-22 | 2007-01-11 | Eiken Chem Co Ltd | B型肝炎ウイルスの検出方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6013016405; Biomedical Engineering Applications Basis and Communications, 2007.06, Vol.19, No.3, p.137-144 * |
JPN6013016407; J. Virol. Methods, 2007.06, Vol.143, p.147-152 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012517804A (ja) * | 2009-02-13 | 2012-08-09 | ビッグテック プライベート リミテッド | B型肝炎ウイルスの検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2009057829A3 (en) | 2009-07-30 |
WO2009057829A2 (en) | 2009-05-07 |
CN101790586A (zh) | 2010-07-28 |
US20100248210A1 (en) | 2010-09-30 |
CN102796828A (zh) | 2012-11-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4410268B2 (ja) | メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(mthfr)の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット及び核酸プローブ | |
JP2009213465A (ja) | B型肝炎ウイルス薬剤耐性株検出用核酸プライマーセット、アッセイキットおよびb型肝炎ウィルスの薬剤耐性株の検出方法 | |
JP4528885B1 (ja) | 検体解析方法およびそれに用いるアッセイキット | |
EP1837408A1 (en) | Method of designing primers for use in method of detecting target nucleic acid and assay kit | |
JP5740112B2 (ja) | コロナウイルスのためのlamp増幅用核酸プライマーセット | |
JP4490988B2 (ja) | 血清アミロイドa1(saa1)の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット、キット、及び該プライマーセットを用いた検出方法 | |
JP4410269B2 (ja) | N−アセチルトランスフェラーゼ2(nat2)の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット、キット、及び該プライマーセットを用いた検出方法 | |
US20090099030A1 (en) | Method of detecting mutations in the gene encoding cytochrome P450-2C9 | |
EP2450443A1 (en) | Target sequence amplification method, polymorphism detection method, and reagents for use in the methods | |
JP4516032B2 (ja) | ハイブリダイゼーションによる核酸の検出方法およびアッセイキット | |
JP2009268370A (ja) | 標的核酸の検出方法 | |
JP2008507955A (ja) | チトクロムp450−2c19をコードする遺伝子における突然変異を検出する方法 | |
JP2011004733A (ja) | 複数検体中の標的核酸を検出するマイクロアレイ | |
JP4551917B2 (ja) | ヒトチトクロームp450(cyp)2d6遺伝子変異の検出方法 | |
JP2012060939A (ja) | B型肝炎ウイルスの薬剤耐性に関連する多型配列を増幅するための核酸プライマーセット、当該多型配列を特定するための核酸プローブセットおよびアッセイキット、並びにそれらを用いた薬剤耐性株の検出方法および検出用アッセイキット | |
JP4399024B1 (ja) | N−アセチルトランスフェラーゼ2(nat2)の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット、キット、及び該プライマーセットを用いた検出方法 | |
JP4399025B1 (ja) | N−アセチルトランスフェラーゼ2(nat2)の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット、キット、及び該プライマーセットを用いた検出方法 | |
JP4528889B1 (ja) | 検体解析方法およびそこにおいて使用されるアッセイキット | |
JP2012200223A (ja) | 核酸定量法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110404 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130409 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130806 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20130822 |
|
RD07 | Notification of extinguishment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7427 Effective date: 20140319 |