JP2009268370A - 標的核酸の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】洗浄工程における異常を検知する方法を開発し、類似した配列を識別しなければならない標的核酸であっても精度良く検出できる検査方法を提供することを目的とする。
【解決手段】洗浄工程が正常に行われたかどうかを検査する工程を具備する標的核酸の検出方法を提供する。本発明の態様では、洗浄レベルモニタリング用核酸プローブが用いられる。該プローブは、前記標的核酸の洗浄に最適な最適洗浄温度範囲及びその近傍の温度範囲で洗浄温度を変化させた洗浄により、該プローブから得られるシグナル強度が変化するプローブである。
【選択図】なし
【解決手段】洗浄工程が正常に行われたかどうかを検査する工程を具備する標的核酸の検出方法を提供する。本発明の態様では、洗浄レベルモニタリング用核酸プローブが用いられる。該プローブは、前記標的核酸の洗浄に最適な最適洗浄温度範囲及びその近傍の温度範囲で洗浄温度を変化させた洗浄により、該プローブから得られるシグナル強度が変化するプローブである。
【選択図】なし
Description
本発明は、洗浄工程の異常を検査する工程を含む標的核酸の検出方法に関する。
標的核酸の検出にはマイクロアレイを用いることができる。マイクロアレイには、核酸プローブが固定化されている。標的核酸はこの固定化された核酸プローブとハイブリダイズされる。一般に、マイクロアレイを用いた標的核酸の検出では、ネガティブコントロールプローブ及びポジティブコントロールプローブが用いられる。ネガティブコントロールプローブはバックグラウンド値(基準値)を決定するために用いられる。ポジティブコントロールプローブは、標的核酸の抽出、増幅及び検出の一連の工程、または一部の工程の異常を検査するために用いられる。
ポジティブコントロールプローブからのシグナル強度が所定の値以上で検出された場合には、検査が正常に行われたと判断される。一方、ポジティブコントロールプローブからのシグナル強度が十分に検出されない場合には、何れかの工程に異常があったと判定される(例えば、特許文献1)。
しかし、標的核酸と核酸プローブは非特異的にハイブリダイゼーションすることがある。特に、一塩基置換(SNP)や数塩基の挿入又は欠失を有する標的核酸は野性型と変異型の配列が類似しているため非特異的な反応が生じやすい。例えば、野生型の標的核酸は野生型検出用プローブに特異的にハイブリダイゼーションすると同時に、変異型検出用プローブにも非特異的にハイブリダイゼーションし得る。同様に、変異型の標的核酸は変異型検出用プローブに特異的にハイブリダイゼーションすると同時に、野生型検出用プローブにも非特異的にハイブリダイゼーションし得る。このような非特異的なハイブリッドが生じると、ホモ型がヘテロ型と誤判定される恐れがある。
同様に、近縁種の生物、細菌、ウィルスなどを検出する場合にも、非特異的なハイブリッドが生じ、陰性のものが陽性と誤判定される恐れがある。
このような非特異的なハイブリッドは、通常、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄によって除去される。しかし、不具合が生じて洗浄が正常に行われないことがある。しかしながら、洗浄工程の異常は上記のようなポジティブコントロールで発見することはできない。よって、従来は洗浄工程が正常に行われなかった検体であっても除外されず、誤判定を引き起こしてしまうという課題があった。
特表2007-506402号公報
洗浄レベルは、洗浄時の温度、塩濃度が主に影響を与える。一般に、温度が高く、塩濃度が低い条件では洗浄レベルは強くなる。反対に、温度が低く、塩濃度が高い条件では洗浄レベルは弱くなる。pHについては、5~9の範囲ではそれ程影響を与えない。
洗浄工程の異常は、装置の温度制御に不具合が生じ、設定温度より低い温度で洗浄される場合が考えられる。この場合、洗浄レベルが弱くなり、非特異的なハイブリッドの除去が不十分になる。しかしながら、従来、このような不具合を検知する方法は存在しなかった。
そこで本発明では、洗浄工程における異常を検知する方法を開発し、配列が類似する標的核酸であっても精度良く検出できる検査方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明では、洗浄が正常に行われたか否かを示す洗浄レベルモニタリング用核酸プローブとそれと相補的な配列を含む洗浄レベルモニタリング核酸とを用いる。洗浄レベルモニタリング用核酸プローブは、標的核酸にとって最適な洗浄条件において感受性の高いプローブである。該プローブは、洗浄液の温度のわずかな変化によってハイブリダイゼーションの程度が変化する。即ち、プローブとその相補鎖とにより形成されるハイブリッドが増減し、該ハイブリッドから検出されるシグナル強度が変化する。この洗浄レベルモニタリング用核酸プローブは、標的核酸検出用プローブと共に例えば同一基体上に固定化されて標的核酸の検出に用いられる。
本発明では、予め洗浄レベルモニタリング核酸と、洗浄レベルモニタリング用プローブとをハイブリダイゼーションさせた後、適切な洗浄条件で洗浄した場合における洗浄レベルモニタリング用核酸プローブからのシグナル強度を測定し、適切なシグナル強度範囲(最適洗浄シグナル強度範囲)を決定しておく。標的核酸の検出を行なう際、標的核酸と共に洗浄レベルモニタリング核酸を、同時に標的核酸検出用プローブと洗浄レベルモニタリング用核酸プローブを含む検出系に供給する。その際、洗浄レベルモニタリング用核酸プローブから検出されるシグナル強度が前記最適洗浄シグナル強度範囲内である場合には、洗浄工程が正常に行われたことを保証できる。一方、検出されたシグナル強度が前記最適洗浄シグナル強度範囲外である場合には、洗浄工程に異常があると判定できる。
従って、本発明は、標的核酸の検出方法であって、前記標的核酸と、前記標的核酸の標的配列及びその相補的な配列とハイブリダイズしない配列である洗浄レベルモニタリング核酸を準備する工程と、前記標的配列と相補的な配列を含む標的核酸用核酸プローブ、及び、前記洗浄レベルモニタリング核酸と相補的な配列を含む洗浄レベルモニタリング用核酸プローブに、前記標的核酸と前記洗浄レベルモニタリング核酸を供給し、前記標的核酸と前記標的核酸用核酸プローブ、及び、前記洗浄レベルモニタリング核酸と洗浄レベルモニタリング用核酸プローブ、のそれぞれをハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション工程と、前記ハイブリダイゼーション工程において生じた非特異的なハイブリッドを除去する洗浄工程と、前記洗浄工程後に、前記標的核酸用核酸プローブからのシグナル強度及び前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブからのシグナル強度をそれぞれ測定する検出工程と、前記洗浄工程が正常に行われたかどうかを判定する検査工程とを具備し、前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブは、前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブと前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブとをハイブリダイズさせた後、前記標的核酸の洗浄に最適な最適洗浄温度範囲及びその近傍の温度範囲で洗浄温度を変化させた洗浄により、該プローブから得られるシグナル強度が変化するプローブであり、予め、前記洗浄レベルモニタリング核酸と前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブとをハイブリダイズさせた後、前記最適洗浄温度範囲で洗浄したときの、該洗浄レベルモニタリング用プローブからのシグナル強度から上限値及び下限値を有する最適洗浄シグナル強度範囲が決定されており、
前記検査工程は、前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブから得られたシグナル強度が、前記最適洗浄シグナル強度範囲の範囲内にある場合には前記洗浄工程が正常に行われたと判定し、前記最適洗浄シグナル強度範囲の範囲外である場合には前記洗浄工程に異常があったと判定することを特徴とする、標的核酸の検出方法を提供する。
前記検査工程は、前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブから得られたシグナル強度が、前記最適洗浄シグナル強度範囲の範囲内にある場合には前記洗浄工程が正常に行われたと判定し、前記最適洗浄シグナル強度範囲の範囲外である場合には前記洗浄工程に異常があったと判定することを特徴とする、標的核酸の検出方法を提供する。
本発明によれば、洗浄工程の異常が検知できるため、誤判定を回避することができるため、検出精度を向上させることができる。
本発明によれば、洗浄レベルモニタリング用核酸プローブを用いることにより、洗浄工程における異常を検知することができ、洗浄工程の異常による誤判定を回避することができる。よって、配列が類似する標的核酸の検出精度を向上させることができる。
[定義]
本発明で使用される「核酸」という用語は、DNA、RNA、PNA、LNA、S-オリゴ、メチルホスホネートオリゴなど、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質を総括的に示すものである。
本発明で使用される「核酸」という用語は、DNA、RNA、PNA、LNA、S-オリゴ、メチルホスホネートオリゴなど、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質を総括的に示すものである。
本発明において「標的核酸」とは、本発明の方法によって検出される核酸を意味する。
本発明において「標的配列」とは、標的核酸に含まれる配列を意味する。標的配列は、標的核酸を検出するために使用される。
本発明において「標的配列」とは、標的核酸に含まれる配列を意味する。標的配列は、標的核酸を検出するために使用される。
本発明において「標的核酸用核酸プローブ」とは、標的配列と相補的な配列を有するプローブを意味する。標的核酸用核酸プローブは標的核酸とハイブリッドを形成する。
本発明において「洗浄レベルモニタリング核酸」とは、洗浄レベルをモニタリングするために用意される核酸を意味する。洗浄レベルモニタリング核酸は、上記標的配列及びその相補的な配列とハイブリダイズしない配列を有する。ここでハイブリダイズしない配列とは、相同性の低い配列を意味する。
本発明において「洗浄レベルモニタリング用核酸プローブ」とは、上記洗浄レベルモニタリング核酸の配列と相補的な配列を有する核酸プローブである。基体上に標的核酸用核酸プローブが固定化されたDNAマイクロアレイの場合、該プローブは上記標的核酸用核酸プローブと同じ基体に固定化される。該プローブは洗浄レベルモニタリング核酸とハイブリッドを形成する。
本発明において「試料溶液」とは、標的核酸が存在する可能性のある溶液である。該試料溶液が本発明の検出方法に供される。
本発明において「基体」とは、核酸プローブが固定化される支持体である。該基体は、固定化された核酸プローブとともに、例えばDNAマイクロアレイのようなデバイスを構成する。
[実施様態]
以下、本発明の実施態様について説明する。
本発明で用いる洗浄レベルモニタリング用核酸プローブは、標的核酸の洗浄に最適な温度範囲(最適洗浄温度範囲)及びその近傍を含む温度範囲において、該プローブから得られるシグナル強度が変化するプローブである。
以下、本発明の実施態様について説明する。
本発明で用いる洗浄レベルモニタリング用核酸プローブは、標的核酸の洗浄に最適な温度範囲(最適洗浄温度範囲)及びその近傍を含む温度範囲において、該プローブから得られるシグナル強度が変化するプローブである。
洗浄レベルモニタリング用核酸プローブを基体に固定し、洗浄レベルモニタリング核酸とハイブリダイゼーションさせる。これによって形成されたハイブリッドから得られる信号がシグナルであり、その強度が測定される。
一般に、ハイブリダイゼーション後に洗浄を行うことによって、ハイブリッドがある程度解離する。これによりシグナル強度が減少する。洗浄液の温度が高いほど、ハイブリッドが多く解離する。よって、塩濃度及びpHが一定の条件下で洗浄液の温度を変化させると、シグナル強度の減少率が変化する。即ち、洗浄液の温度が高い程、シグナル強度の減少が大きくなる。
最適洗浄温度範囲とは、後述するように、本発明の検出方法の洗浄工程で用いられる標的核酸の洗浄時に洗浄液の許容される温度範囲である。まず、洗浄レベルモニタリング用核酸プローブの候補となるプローブとその相補鎖のハイブリダイゼーションを行なった後、前記最適洗浄温度範囲及びその近傍の温度範囲内の温度において洗浄を行ない、プローブからのシグナル強度を測定する。測定は洗浄温度を変えて複数の洗浄温度に対して行なう。その測定結果に基づいて、洗浄温度の変化に対してシグナル強度が変化するプローブを洗浄レベルモニタリング用核酸プローブとして選択する。特に、該最適洗浄温度範囲の境界値の近傍においてシグナル強度が大きく変化するプローブが選択される。
融解温度(Tm)が塩基配列の洗浄温度の変化に対するシグナル強度の変化に影響がある傾向がある。融解温度(Tm値)が低いプローブは、低い温度で洗浄したときにシグナル強度が変化する。一方、Tm値が高いプローブは、高い温度でシグナル強度が変化する。よって、Tm値が選択の目安となる。
Tm値は、核酸に含まれるGC含量によっても異なる。しかし、一般的には、鎖長の短い核酸はTm値が低く、長い核酸はTm値が高い。比較的短い核酸のTm値は、例えばWallace法を用いて算出することができる。Wallace法はグアニン、シトシンの結合力を4℃、アデニン、チミンの結合力を2℃としてTm値を計算する方法である。
本発明の好ましい態様において、上記温度範囲内のシグナル強度の変化率が大きいプローブが洗浄レベルモニタリング用核酸プローブとして選択される。シグナル強度変化率が大きいほど、微小な洗浄レベルの違いを精度よく検出することができる。
核酸増幅効率、チップ製造工程でのプローブ固定化効率、ハイブリダイゼーション効率及び洗浄効率等は実施の度に相違するため、核酸検出方法の全体的な効率は検出試験毎に相違する。これを、検出試験間のばらつきと称する。一般に、検出試験間のばらつきは、検出試験の工程に含まれる全ての要素について考慮し、ばらつき率として算出される。
検出試験間のばらつきが大きい場合、シグナル強度変化率が小さいプローブでは、洗浄工程の以上を精度良く識別することが困難である。よって、本発明の好ましい態様において、シグナル強度変化率が大きいプローブが好適に用いられる。
シグナル強度の変化率は以下のように算出することができる。
まず、洗浄レベルモニタリング用核酸プローブと洗浄レベルモニタリング核酸とハイブリダイズさせる。次いで、洗浄せずに洗浄レベルモニタリング用核酸プローブのシグナル強度を測定する。この測定値を100とする。次いで、塩濃度及びpHが一定で温度が異なる洗浄液を用いて洗浄し、シグナル強度を測定する。上記洗浄なしの測定値を100とし、各温度におけるシグナル強度を相対的に表したものがシグナル強度比である。
まず、洗浄レベルモニタリング用核酸プローブと洗浄レベルモニタリング核酸とハイブリダイズさせる。次いで、洗浄せずに洗浄レベルモニタリング用核酸プローブのシグナル強度を測定する。この測定値を100とする。次いで、塩濃度及びpHが一定で温度が異なる洗浄液を用いて洗浄し、シグナル強度を測定する。上記洗浄なしの測定値を100とし、各温度におけるシグナル強度を相対的に表したものがシグナル強度比である。
洗浄温度を徐々に上昇させると、はじめは徐々にシグナル強度が減少する。しかし、ある時点で急激にシグナル強度が減少する。これを、温度とシグナル強度比の関数としてグラフ化すると、シグナル強度が大きく減少する範囲において近似直線を引くことができる。この近似直線の傾きから、シグナル強度変化率を算出することができる。
一つの態様において、該近似直線は次のように作成される。まず、シグナル強度比が50となる洗浄温度を中心に、その洗浄温度から±2℃以内の洗浄温度における4点のシグナル強度比を選択する。次いで、その4点の値から近似直線を作成する。
本発明の好ましい態様において、検出試験間のばらつきが20%未満の場合、シグナル強度変化率が13以上、より好ましくは15以上の洗浄レベルモニタリング核酸用プローブが用いられる。他の好ましい態様において、検出試験間のばらつきが30%以上の場合、シグナル強度変化率が18以上の洗浄レベルモニタリング核酸用プローブが用いられる。
洗浄レベルモニタリング用核酸プローブのシグナル強度変化率が大きいほど、検出試験間のばらつきに関わらず、微小に異なる洗浄レベルを精度良く検出することができる。
以上のように選択された洗浄レベルモニタリング用核酸プローブについては、最適なシグナル強度範囲(最適洗浄シグナル強度)が決定される。最適なシグナル強度範囲とは、洗浄が最適洗浄温度範囲で行われた場合に得られるシグナル強度の範囲である。該範囲は、上記のように塩濃度及びpHが一定の条件下、洗浄液の温度を変化させて洗浄したとき、上記最適洗浄温度範囲での洗浄後に得られたシグナル強度に基づいて決定される。特に好ましくは、該範囲は、上記温度範囲の境界値の温度で洗浄したときのシグナル強度に基づいて決定される。
一つの態様において、洗浄に最適洗浄温度範囲の上限値での洗浄後に得られたシグナル強度が最適洗浄シグナル強度範囲の下限値とされる。また、該温度範囲の下限値での洗浄後に得られたシグナル強度が最適洗浄シグナル強度範囲の上限値とされる。
なお、洗浄レベルモニタリング用核酸プローブは、上記洗浄温度範囲の上限値及び下限値の両方においてシグナル強度変化率が大きいプローブである必要がある。この条件を満たすプローブであれば、単一のプローブを用いることができる。しかし、そのような条件を満たすプローブが無い場合、温度範囲の上限値においてシグナル強度変化率が大きいプローブと、下限値においてシグナル強度変化率が大きいプローブの少なくとも2つのプローブを同時に用いてもよい。またさらに、上記温度範囲内及びその近傍の任意の温度においてシグナル強度変化率が大きいプローブを複数用いてもよい。
本発明において、最適洗浄温度範囲とは、標的核酸と標的核酸用核酸プローブとのハイブリダイゼーションによって生じた非特異的なハイブリッドが選択的に除去される温度を意味する。実際には、非特異的なハイブリッドと特異的なハイブリッドによるシグナル強度が、洗浄後に相違する温度範囲とすることができ、好ましくは、それらの強度が明確に相違する温度範囲である。より好ましくは、非特異的なハイブリッドからのシグナル強度が、ネガティブコントロールとほぼ同程度の値になる範囲である。
この温度範囲は、識別すべき標的配列、標的核酸の構造、種類などに依存して相違する。一般に、識別すべき配列、例えば野生型と変異型の配列の類似性が高い程、非特異的なハイブリッドが生じやすくなるため、最適温度範囲は狭くなる。検出対象が一塩基の置換、挿入、欠失を有する核酸である場合に温度範囲は最も狭い。一つの例として、検出対象が一塩基置換を有する核酸である場合、実験上では、塩濃度及びpHが一定の条件下で温度のみを変化させていくと、最適な温度範囲は2〜6度程度である。最適な温度範囲が2〜3度である核酸もある。このような場合、例えば自動検査装置による検出では、最適温度範囲の中心から1〜1.5度以内の厳密な温度制御が求められる。
このように、最適洗浄温度範囲は検出対象の標的核酸によって異なる。よって、最適洗浄温度範囲は、本発明の核酸検出方法を実施する者が任意に決定してよい。
なお、本発明において、最適洗浄温度範囲の近傍とは、該範囲及びその前後の温度を示す。例えば、最適洗浄温度範囲±3℃以内の範囲を示す。また、温度範囲の上限値及び下限値は、その境界値とその前後の温度を包含する値を指すよう意図される。
次に、本発明で用いられる洗浄レベルモニタリング核酸について説明する。該核酸は、標的核酸と同一の核酸であってもよい。或いは、標的核酸とは異なる核酸であってもよい。洗浄レベルモニタリング核酸は、人工的に製造した核酸類似物であってもよく、個体のゲノムDNA、ゲノムRNA、mRNAを必要に応じて増幅した核酸であってもよい。標的核酸が由来する生物とは全く違う生物の遺伝子を探索して用いてもよい。
洗浄レベルモニタリング核酸が標的核酸と同一の核酸である場合、洗浄レベルモニタリング核酸の配列は、標的配列とは異なる領域の配列である。洗浄レベルモニタリング核酸が標的核酸とは異なる核酸である場合、両方の核酸を同一容器中で同時に増幅して調製してもよい。或いは、それぞれの核酸を別個に調製してもよい。この場合は、洗浄レベルモニタリング用核酸を試料溶液中に添加する。添加濃度は標的核酸の濃度に基づいて任意に決定すればよい。標的核酸の増幅後の飽和濃度は略一定である。また、基体に固定化されるプローブの数量も略一定である。よって、添加濃度も略一定とすることができる。
次に、本発明の核酸検出方法の工程を説明する。
まず、標的核酸の配列と相補的な配列を含む標的核酸用核酸プローブ、洗浄レベルモニタリング核酸、及び洗浄レベルモニタリング用核酸プローブを準備する。次いで、標的核酸用核酸プローブと洗浄レベルモニタリング用核酸プローブを基体に固定化する。ここでは、核酸プローブが固定化された基体を便宜上、プローブ固定化基体と称する。なお、上記それぞれの核酸とプローブ固定化基体は、検出試験に先立って予め用意されていてもよい。
まず、標的核酸の配列と相補的な配列を含む標的核酸用核酸プローブ、洗浄レベルモニタリング核酸、及び洗浄レベルモニタリング用核酸プローブを準備する。次いで、標的核酸用核酸プローブと洗浄レベルモニタリング用核酸プローブを基体に固定化する。ここでは、核酸プローブが固定化された基体を便宜上、プローブ固定化基体と称する。なお、上記それぞれの核酸とプローブ固定化基体は、検出試験に先立って予め用意されていてもよい。
また、核酸検出試験に供する試料溶液が調製される。該試料溶液は、標的核酸を含有する可能性を有し、且つ、洗浄レベルモニタリング核酸を含有する。標的核酸及び洗浄レベルモニタリング核酸は、個体から抽出されたものであってよい。個体は特に限定されるものでなく、ヒト、ヒト以外の動物及び植物、並びにウィルス、細菌、バクテリア、酵母およびマイコプラズマなどの微生物あってもよい。これらの核酸は、例えば採取した血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等から得ることができる。核酸の抽出方法は特に限定される物ではないが、例えば、市販の核酸抽出方法QIAamp(QIAGEN社製)、スマイテスト(住友金属社製)等を利用することも可能である。
抽出された核酸は、必要に応じて公知の増幅技術により増幅される。例えば、Polymerase chain reaction法(PCR法)、Loop mediated isothermal amplification法(LAMP法)、Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids (ICAN法)、Nucleic acid sequence-based amplification法(NASBA法)、Strand displacement amplification (SDA法)、Ligase chain reaction(LCR法)、Rolling Circle Amplification法(RCA法)などの方法を用いることができる。得られた増幅産物は、必要に応じて断片化されるか、1本鎖化される。1本鎖化する手段としては、例えば、熱変性、ビーズや酵素等を用いる方法、T7 RNAポリメラーゼを用いて転写反応を行う方法がある。LAMP法やICAN法などによって増幅され、産物中に1本鎖領域が存在し、この1本鎖領域を標的配列とする場合には、そのままハイブリダイゼーション工程に供することができる(例えば、特開2005-143492号公報を参照)。
さらに、上記の準備とは別に、洗浄レベルモニタリング用核酸プローブについての最適洗浄シグナル強度範囲を決定しておく。該決定は上記で詳細に記載したように行えばよい。
次に、上記のように調製された試料溶液をプローブ固定化基体に供し、ハイブリダイゼーションを行う。このハイブリダイゼーション工程において、上記のプローブ固定化基体上で、標的核酸と標的核酸用核酸プローブ、及び、洗浄レベルモニタリング核酸と洗浄レベルモニタリング用核酸プローブのそれぞれをハイブリダイズさせる。次いで、該ハイブリダイゼーション工程において生じた非特異的なハイブリッドを除去するために洗浄する。
洗浄後、標的核酸用核酸プローブからのシグナル強度及び洗浄レベルモニタリング用核酸プローブからのシグナル強度をそれぞれ測定する。
本発明の方法ではさらに、上記洗浄工程が正常に行われたかどうかを判定する検査工程を具備する。この検査工程では、上記検出工程において洗浄レベルモニタリング用核酸プローブから得られたシグナル強度が、予め決定されたシグナル強度範囲(最適洗浄シグナル強度範囲)の範囲内にある場合に、洗浄工程が正常に行われたと判定する。一方、得られたシグナル強度が、該シグナル強度範囲の範囲外である場合、洗浄工程に異常があったと判定する。特に、得られたシグナル強度が上記シグナル強度範囲の上限値を超える場合に、洗浄工程に異常があったと判定する。
従来の核酸検出方法では、洗浄温度の変化によってシグナル強度が変化しないポジティブコントロールが用いられている。従来は、ポジティブコントロールのシグナル強度が所定の値以上であれば検査が正常に行われたと判断されていた。従って、通常はシグナル強度の下限しか設定されず、シグナル強度が高すぎることは問題にされていなかった。
しかしながら本発明の核酸検出方法では、従来方法とは異なり、最適洗浄温度範囲内における洗浄によって、シグナル強度が大きく変化するプローブを用いる。このようなプローブは、最適洗浄温度範囲外ではシグナル強度があまり変化しない。例えば、洗浄温度が最適洗浄温度範囲より低い場合はシグナル強度が高いままである。これにより、所定のシグナル強度範囲を超える高いシグナル強度が検出された場合には、洗浄レベルが設定よりも弱かったと判定することができる。一方、所定のシグナル強度範囲よりも低いシグナルが検出された場合には、洗浄レベルが設定よりも強かったと判定することができる。
なお、核酸検出方法に用いられる塩濃度について、洗浄時はハイブリダイゼーション時よりも低い塩濃度で行うのが一般的である。よって、ハイブリダイゼーション後、洗浄を行う工程において、洗浄が正常に行われず、例えば高い塩濃度であるハイブリダイゼーション溶液のまま洗浄工程が行われてしまった場合には非特異的なシグナルが残存し、異常な結果となる。本願発明の洗浄レベルモニタリング用核酸プローブは温度に対するシグナル強度の変化に基づいて選択されたものであるが、このような塩濃度の異常を検知することが可能である。
<核酸プローブ>
標的核酸検出用核酸プローブおよび洗浄レベルモニタリング用核酸プローブの鎖長は、特に限定されるものではないが、5〜50塩基の範囲が好ましく、10〜40塩基の範囲がより好ましく、15〜35塩基の範囲がさらに好ましい。
標的核酸検出用核酸プローブおよび洗浄レベルモニタリング用核酸プローブの鎖長は、特に限定されるものではないが、5〜50塩基の範囲が好ましく、10〜40塩基の範囲がより好ましく、15〜35塩基の範囲がさらに好ましい。
また、核酸プローブは、未修飾のものであってもよいし、基体に固定化させるためにアミノ基、カルボキシル基、ヒドロシル基、チオール基、スルホン基などの反応性官能基、アビジン、ビオチン等の物質で修飾したものであってもよい。官能基とヌクレオチドの間にスペーサーを導入することも可能である。スペーサーには、例えばアルカン骨格、エチレングリコール骨格などを用いることができる。
核酸プローブを固定する基体は、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、マイクロタイタープレート、ガラス、シリコン、電極、磁石、ビーズ、プラスチック、ラテックス、合成樹脂、天然樹脂、又は光ファイバーなどによって構成されてよいが、これらに限定されない。
<プローブ固定化基体>
プローブ固定化基体の一つの実施例として、核酸マイクロアレイの模式図を図1に示す。本実施例のマイクロアレイは、基体1に固定化領域2を具備する。核酸プローブは該固定化領域2に固定化される。このような核酸マイクロアレイは、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体1に配置される固定化領域2の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。1つの基体に固定化される標的核酸用核酸プローブの種類は、単一であっても複数であってもよく、任意に選択することができる。本実施例のような核酸マイクロアレイは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられる。
プローブ固定化基体の一つの実施例として、核酸マイクロアレイの模式図を図1に示す。本実施例のマイクロアレイは、基体1に固定化領域2を具備する。核酸プローブは該固定化領域2に固定化される。このような核酸マイクロアレイは、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体1に配置される固定化領域2の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。1つの基体に固定化される標的核酸用核酸プローブの種類は、単一であっても複数であってもよく、任意に選択することができる。本実施例のような核酸マイクロアレイは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられる。
プローブ固定化基体の他の実施例を図2に示す。図2の核酸マイクロアレイは、基体11に電極12を具備する。核酸プローブは該電極12に固定化される。電極12は、パット13に接続される。電極12からの電気的情報はパット13を介して取得される。このような核酸マイクロアレイは、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体11に配置される電極12の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。1つの基体に固定化される標的核酸用核酸プローブの種類は、単一であっても複数であってもよく、任意に選択することができる。さらに、本実施例の核酸マイクロアレイは、必要に応じて、参照電極及び対極を具備してもよい。
電極は、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム又はタングステンのような金属単体及びそれらの合金、或いは、グラファイト、グラシーカーボンのような炭素又はそれらの酸化物又は化合物を用いることができるが、それらに限定されない。
本実施例のような核酸マイクロアレイは、電気化学的な検出方法のために好適に用いられる。
<ハイブリダイゼーション条件>
ハイブリダイゼーションは、ハイブリッドが十分に形成される適切な条件下で行う。特異的なハイブリッドが非特異的なハイブリッドよりも優勢に形成し得る条件が好ましい。適切な条件は、標的核酸の種類及び構造、標的配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブの種類によって異なる。例えば、イオン強度が0.01〜5の範囲であり、pH5〜9の範囲の緩衝液中でハイブリダイゼーションを行う。反応温度は10℃〜90℃の範囲であってよい。攪拌や振盪などにより、反応効率を高めても良い。反応溶液中には、硫酸デキストラン、サケ精子DNA、及び牛胸腺DNAのようなハイブリダーゼション促進剤、EDTA、又は界面活性剤などを添加しても良い。
ハイブリダイゼーションは、ハイブリッドが十分に形成される適切な条件下で行う。特異的なハイブリッドが非特異的なハイブリッドよりも優勢に形成し得る条件が好ましい。適切な条件は、標的核酸の種類及び構造、標的配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブの種類によって異なる。例えば、イオン強度が0.01〜5の範囲であり、pH5〜9の範囲の緩衝液中でハイブリダイゼーションを行う。反応温度は10℃〜90℃の範囲であってよい。攪拌や振盪などにより、反応効率を高めても良い。反応溶液中には、硫酸デキストラン、サケ精子DNA、及び牛胸腺DNAのようなハイブリダーゼション促進剤、EDTA、又は界面活性剤などを添加しても良い。
<洗浄条件>
洗浄液は、イオン強度が0.01〜5の範囲であり、pH5〜9の範囲の緩衝液が好適に用いられる。洗浄液は塩及び界面活性剤などを含むことが好ましい。例えば、塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウムを用いて調製したSSC溶液、Tris-HCl溶液、Tween20溶液、又はSDS溶液などが好適に用いられる。洗浄温度は上記のように、最適洗浄温度範囲に設定する。洗浄液は、プローブ固定化基体の表面又は核酸プローブを固定化した領域に通過又は滞留させる。或いは、洗浄液中にプローブ固定化基体を浸漬させてもよい。この場合、洗浄液は温度制御可能な容器中に収容されることが好ましい。
洗浄液は、イオン強度が0.01〜5の範囲であり、pH5〜9の範囲の緩衝液が好適に用いられる。洗浄液は塩及び界面活性剤などを含むことが好ましい。例えば、塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウムを用いて調製したSSC溶液、Tris-HCl溶液、Tween20溶液、又はSDS溶液などが好適に用いられる。洗浄温度は上記のように、最適洗浄温度範囲に設定する。洗浄液は、プローブ固定化基体の表面又は核酸プローブを固定化した領域に通過又は滞留させる。或いは、洗浄液中にプローブ固定化基体を浸漬させてもよい。この場合、洗浄液は温度制御可能な容器中に収容されることが好ましい。
<検出方法>
ハイブリダイゼーション工程により生じたハイブリッドの検出は、蛍光検出方式及び電気化学的検出方式を利用することができる。
ハイブリダイゼーション工程により生じたハイブリッドの検出は、蛍光検出方式及び電気化学的検出方式を利用することができる。
(a)蛍光検出方式
蛍光標識物質を用いて検出する。核酸の増幅工程で用いるプライマーをFITC、Cy3、Cy5、又はローダミンなどの蛍光色素のような、蛍光学的に活性な物質で標識してもよい。或いは、それらの物質で標識したセカンドプローブを用いてもよい。複数の標識物質を同時に使用してもよい。検出装置により、標識された配列または2次プローブ中の標識を検出する。使用する標識に応じて適切な検出装置を用いる。例えば、蛍光物質を標識として用いた場合、蛍光検出器を用いて検出する。
蛍光標識物質を用いて検出する。核酸の増幅工程で用いるプライマーをFITC、Cy3、Cy5、又はローダミンなどの蛍光色素のような、蛍光学的に活性な物質で標識してもよい。或いは、それらの物質で標識したセカンドプローブを用いてもよい。複数の標識物質を同時に使用してもよい。検出装置により、標識された配列または2次プローブ中の標識を検出する。使用する標識に応じて適切な検出装置を用いる。例えば、蛍光物質を標識として用いた場合、蛍光検出器を用いて検出する。
(b)電気化学的検出方式
当該分野で周知の2本鎖認識物質を用いる。二本鎖認識物質は、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター及びポリインターカレーターから選択してよい。更に、これらの二本鎖認識物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾してもよい。
当該分野で周知の2本鎖認識物質を用いる。二本鎖認識物質は、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター及びポリインターカレーターから選択してよい。更に、これらの二本鎖認識物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾してもよい。
二本鎖認識物質は、種類によって異なるが、一般的には1ng/mL~1mg/mLの範囲の濃度で使用する。また、イオン強度が0.001〜5の範囲であり、pH5〜10の範囲の緩衝液が好適に用いられる。
測定は、例えば2本鎖認識物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、2本鎖認識物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で印加するか、或いは、パルスで印加するか、或いは、定電位を印加してもよい。ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、及びファンクションジェネレーターのような装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。電気化学的検出は、当該分野で周知の方法によって実施することができる。例えば、特開平10-146183号公報に記載の方法を用いることができる。
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。
[実施例1]
標的核酸の洗浄に最適な温度の決定方法を示す実施例を詳述する。本実施例では、一塩基置換(SNP)を有する核酸の検出を行った。標的核酸はNAT2遺伝子の一塩基置換G590Aを含む核酸である。標的核酸はLAMP法により増幅した。
(1)プライマー
標的核酸の増幅に用いた合成DNAオリゴプライマーを表1に示した。
標的核酸の洗浄に最適な温度の決定方法を示す実施例を詳述する。本実施例では、一塩基置換(SNP)を有する核酸の検出を行った。標的核酸はNAT2遺伝子の一塩基置換G590Aを含む核酸である。標的核酸はLAMP法により増幅した。
(1)プライマー
標的核酸の増幅に用いた合成DNAオリゴプライマーを表1に示した。
(3)核酸の増幅
増幅のテンプレートとして、G型、A型、G/A型の3種類のヒトゲノムを用いた。増幅は63℃で1時間行った。その後、80℃、2分間で酵素を失活させた。ヒトゲノムの代わりに滅菌水を添加し、ネガティブコントロールを作製した。反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供した結果、LAMP産物に特徴的なラダー状のパターンが現れ、増幅が確認された。ネガティブコントロールの反応溶液では増幅は確認されなかった。
増幅のテンプレートとして、G型、A型、G/A型の3種類のヒトゲノムを用いた。増幅は63℃で1時間行った。その後、80℃、2分間で酵素を失活させた。ヒトゲノムの代わりに滅菌水を添加し、ネガティブコントロールを作製した。反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供した結果、LAMP産物に特徴的なラダー状のパターンが現れ、増幅が確認された。ネガティブコントロールの反応溶液では増幅は確認されなかった。
ネガティブコントロール用の核酸プローブは、NAT2遺伝子配列とは無関係な配列を有するプローブである。表3において、590Gプローブは野生型の核酸を検出するための核酸プローブである。590Aプローブは変異型の核酸を検出するためのプローブである。これら3種のプローブは、電極に固定化するために、3’末端側をチオール修飾した。
(5)マイクロアレイの作製
金電極を具備する基体を用いた。チオールと金との強い結合性を利用して、核酸プローブを金電極に固定化した。まず、上記のように末端をチオール修飾したプローブを含む溶液を、金電極上にスポットし、25℃で1時間静置した。その後、0.2×SSC溶液で洗浄した。次いで、超純水で洗浄し、風乾した。同一プローブを4電極に固定化した。作製したマイクロアレイは専用のカセットにセットした。このカセットは、核酸プローブ固定化部位のみに溶液が流れる流路を備えるものである。
金電極を具備する基体を用いた。チオールと金との強い結合性を利用して、核酸プローブを金電極に固定化した。まず、上記のように末端をチオール修飾したプローブを含む溶液を、金電極上にスポットし、25℃で1時間静置した。その後、0.2×SSC溶液で洗浄した。次いで、超純水で洗浄し、風乾した。同一プローブを4電極に固定化した。作製したマイクロアレイは専用のカセットにセットした。このカセットは、核酸プローブ固定化部位のみに溶液が流れる流路を備えるものである。
(6)ハイブリダイゼーション
上記(3)で得られたLAMP産物を含む反応溶液に、2×SSCの塩を添加した。この溶液を上記(5)で作製したマイクロアレイカセットに注入した。次いで、該カセットを核酸自動検査装置(Rinsho Byori. 55 216-23, 2007を参照)にセットした。ハイブリダイゼーション、洗浄、及び検出工程は、自動検査装置で行った。ハイブリダイゼーションは55℃で20分行った。洗浄は、検査装置内にセットした0.2×SSC溶液をカセット内に送液し、44〜52℃で20分間静置して行った。検出は、同じく装置内にセットした50μMのヘキスト33258溶液を含むリン酸緩衝液を送液し、10分滞留させた。その後、ヘキスト33258の酸化電流応答を検出した。実験は、洗浄温度を上記範囲で1℃づつ変化させて、9種類の洗浄温度にて洗浄した場合についてそれぞれ行なった。
上記(3)で得られたLAMP産物を含む反応溶液に、2×SSCの塩を添加した。この溶液を上記(5)で作製したマイクロアレイカセットに注入した。次いで、該カセットを核酸自動検査装置(Rinsho Byori. 55 216-23, 2007を参照)にセットした。ハイブリダイゼーション、洗浄、及び検出工程は、自動検査装置で行った。ハイブリダイゼーションは55℃で20分行った。洗浄は、検査装置内にセットした0.2×SSC溶液をカセット内に送液し、44〜52℃で20分間静置して行った。検出は、同じく装置内にセットした50μMのヘキスト33258溶液を含むリン酸緩衝液を送液し、10分滞留させた。その後、ヘキスト33258の酸化電流応答を検出した。実験は、洗浄温度を上記範囲で1℃づつ変化させて、9種類の洗浄温度にて洗浄した場合についてそれぞれ行なった。
(7)結果
結果を図3に示した。図3において、洗浄温度が46℃から45℃に低下するにつれて、G型標的核酸においては非特異的なA型プローブからのシグナルが高く、A型標的核酸においては非特異的なG型プローブからのシグナルが徐々に高くなった。洗浄温度が44℃では、非特異的なシグナルが更に高く、G型ホモ及びA型ホモと、ヘテロ型との識別が困難であった。一方、洗浄温度が51℃以上では、特異的なシグナルが低下した。
結果を図3に示した。図3において、洗浄温度が46℃から45℃に低下するにつれて、G型標的核酸においては非特異的なA型プローブからのシグナルが高く、A型標的核酸においては非特異的なG型プローブからのシグナルが徐々に高くなった。洗浄温度が44℃では、非特異的なシグナルが更に高く、G型ホモ及びA型ホモと、ヘテロ型との識別が困難であった。一方、洗浄温度が51℃以上では、特異的なシグナルが低下した。
さらに、図3における4電極の平均値を算出し、プロットしたグラフを図4に示した。図4では、菱形マークがG型プローブからのシグナルを表し、四角マークがA型プローブからのシグナルを表す。図3及び4から、A型、G型、及びヘテロ型を明確に識別するのに最適な洗浄温度は47〜50℃であることが示された。
[実施例2]
洗浄レベルモニタリング核酸プローブの選択方法を示す実施例を詳述する。5種類の鎖長の核酸プローブを用いて、洗浄温度とシグナル強度との関係を調査した。表4に示した合成DNAオリゴプライマーを用い、ヒトゲノムをテンプレートとしてLAMP法を行った。LAMP反応液及び増幅条件は実施例1と同様である。
洗浄レベルモニタリング核酸プローブの選択方法を示す実施例を詳述する。5種類の鎖長の核酸プローブを用いて、洗浄温度とシグナル強度との関係を調査した。表4に示した合成DNAオリゴプライマーを用い、ヒトゲノムをテンプレートとしてLAMP法を行った。LAMP反応液及び増幅条件は実施例1と同様である。
本実施例で用いた5種類の鎖長の核酸プローブを表5に示した。5種のプローブは上記で増幅したLAMP産物中の配列と完全に相補的な配列を示すプローブである。ネガティブコントロールは実施例1と同様のプローブを用いた。
これらのプローブを用いて、実施例1と同様の方法によりマイクロアレイの作製を作成した。
上記で得られたLAMP産物を含む反応溶液をマイクロアレイに供し、実施例1と同様に洗浄温度を変えてハイブリダイゼーションを行った。
結果を図5に示した。上記実施例1において決定された最適洗浄温度範囲は47〜50℃である。この温度範囲において、17mer (配列番号14)のプローブは、既にシグナル強度が低かった。また温度による変化も少なかった。上記温度範囲において、30mer (配列番号18)のプローブは、シグナル増加が高いままでほとんど変化しなかった。21mer (配列番号15)、23mer (配列番号16)、24mer (配列番号17)のプローブは、上記温度範囲でシグナル強度が劇的に変化することが示された。よって、これら3種のプローブは洗浄レベルモニタリング用核酸プローブとして使用することができる。
実施例1の結果では、44℃でホモ型とヘテロ型の識別が困難である。一方、52℃ではシグナルが殆ど検出されない。このことから、例えば23mer (配列番号16)のプローブを使用した場合、シグナル強度が5〜40nAの範囲内である場合は、最適温度範囲で洗浄が行われたことが保証できる。一方、シグナル強度が40nA以上の場合には、上記温度範囲より低い温度で洗浄が行われたと判定できる。また、シグナル強度が5nA以下の場合には、上記温度範囲より高い温度で洗浄が行われたと判定できる。
さらに、21mer(配列番号15)プローブ及び24mer(配列番号17)のプローブは、同時に用いることにより、洗浄レベルモニタリング用核酸プローブとして使用することができる。この場合、21merのプローブのシグナル強度が25nA未満であり、且つ、24merのプローブのシグナル強度が15nA以上であれば、上記温度範囲内の温度で洗浄が行われたことが保証できる。一方、21merのプローブのシグナル強度が25nA以上の場合は、上記温度範囲より低い温度で洗浄が行われたと判定できる。また、24merのプローブのシグナル強度が15nA未満の場合、上記温度範囲より高い温度で洗浄が行われたと判定できる。
[実施例3]
シグナル強度変化率と検出試験間のばらつきの関係について検討した。4種類の核酸プローブを用い、最適洗浄温度範囲におけるシグナル強度の変化率を決定した。表4及び表6に示した合成DNAオリゴプライマーを用い、それぞれヒトゲノムをテンプレートとしてLAMP法を行った。LAMP反応液及び増幅条件は実施例1と同様である。
シグナル強度変化率と検出試験間のばらつきの関係について検討した。4種類の核酸プローブを用い、最適洗浄温度範囲におけるシグナル強度の変化率を決定した。表4及び表6に示した合成DNAオリゴプライマーを用い、それぞれヒトゲノムをテンプレートとしてLAMP法を行った。LAMP反応液及び増幅条件は実施例1と同様である。
本実施例で用いた核酸プローブは、表5に示した配列番号16のプローブ、及び表7に示した3種のプローブである。3種のプローブは上記で増幅した3種のLAMP産物中の配列と各々完全に相補的な配列を示すプローブである。ネガティブコントロールは実施例1と同様のプローブを用いた。
これらのプローブを用いて、実施例1と同様の方法によりマイクロアレイの作製を作成した。
上記で得られたLAMP産物を含む反応溶液をマイクロアレイに供し、実施例1と同様にハイブリダイゼーションを行った。
結果を図6に示した。シグナル強度比が50となる洗浄温度を中心に、その温度から±2℃以内の洗浄温度で得られた4点から近似直線を引き、シグナル強度変化率を求めた。
配列番号34、16、35、36の各プローブのシグナル強度変化率は、それぞれ18.4、15.4、13.3、11.1であった。各グラフには、検出試験間のばらつきが10%、20%、30%である場合の誤差範囲を示してある。
検出試験間のばらつきが10%の場合、シグナル強度の変化率が11.1である配列番号36のプローブは、1℃の違いによる測定値が誤差範囲内であるため、1℃の違いを識別するのは困難である。しかし、シグナル強度変化率が13.3、15.4、18.4と大きくなるに従って、1℃の違いを明確に識別できることがグラフから明らかである。
同様に、検出試験間のばらつきが20%の場合、配列番号36のプローブは、2℃の違いによる測定値が誤差範囲内であるため、2℃の違いを識別するのは困難である。しかし、シグナル強度変化率が13.3、15.4、18.4と大きくなるに従って、2℃の違いを明確に識別できることがグラフから明らかである。
さらに、検出試験間のばらつきが30%の場合、シグナル強度変化率が13.3、15.4であるプローブは、2℃の違いを識別するのは困難である。しかし、シグナル強度変化率が18.4である配列番号34のプローブは、2℃の違いを明確に識別できることがグラフから明らかである。
このことから、検出試験間のばらつきが20%未満の場合にはシグナル強度変化率が13以上、検出試験間のばらつきが20%以上の場合にはシグナル強度変化率が18以上のプローブを用いることにより、洗浄工程の異常が検知できることが示された。例えば、本実施例においては、そのようなプローブを用いることにより、実施例1で決定された温度範囲の下限値47℃で洗浄された場合と45℃未満で洗浄された場合を識別することができる。
本実施例では、洗浄温度45〜50℃付近でシグナル強度が急速に変化するプローブを用いた。しかし、標的核酸又は検出条件の違いによって、最適な洗浄温度が異なることは当業者には理解されよう。適切なTm値を有する洗浄レベルモニタリング核酸プローブを適宜選択し用いることは当業者には容易である。
[実施例4]
異常な洗浄条件下における標的核酸の検出を行った。洗浄条件は、自動検査装置を用いて検査を行う際に、洗浄温度が最適温度に達しなかった場合、および洗浄液が正常に送液されなかった場合の不具合を想定した。標的核酸は、実施例1のNAT2 G590AのG型LAMP産物を用いた。洗浄レベルモニタリング用核酸プローブは、実施例2の23mer (配列番号16)のプローブを用いた。
異常な洗浄条件下における標的核酸の検出を行った。洗浄条件は、自動検査装置を用いて検査を行う際に、洗浄温度が最適温度に達しなかった場合、および洗浄液が正常に送液されなかった場合の不具合を想定した。標的核酸は、実施例1のNAT2 G590AのG型LAMP産物を用いた。洗浄レベルモニタリング用核酸プローブは、実施例2の23mer (配列番号16)のプローブを用いた。
結果を図7に示した。図7(a)は、洗浄温度が48.5℃であり、洗浄液が正常に送液された場合の検出結果である。図7(b)は、洗浄温度が44℃であり、洗浄液が正常に送液された場合の検出結果である。図7(c)は、洗浄温度が48.5℃であり、洗浄液が正常に送液されなかった場合の検出結果である。
洗浄液が正常に送液された場合には、塩濃度0.2×SSCで洗浄される。一方、洗浄液が正常に送液されなかった場合には、塩濃度2×SSCで洗浄される。これは、ハイブリダイゼーション用の反応溶液の塩濃度である。
図7(a)では、洗浄レベルモニタリング用核酸プローブからのシグナル強度は24nA程度であった。これは、上記実施例2で決定されたシグナル強度範囲5〜40nAの範囲内であった。G型プローブからは高いシグナルが検出された。A型プローブからはほとんどシグナルが検出されなかった。このことから、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドがほとんど形成されていないことが示された。よって理想的な検出結果であると言える。
一方、図7(b)及び(c)では、洗浄レベルモニタリング用核酸プローブからのシグナル強度は55nA程度であった。これは上記で決定されたシグナル強度範囲5〜40nAの範囲外である。図7(b)及び(c)の結果は共に、A型プローブからのシグナルが高く、非特異的なハイブリッドが存在することが示された。図7(b)及び(c)の検出結果は、ヘテロ型の検出結果と判別が困難であり、誤判定を引き起こす可能性が高い。
以上から、洗浄工程に異常がある場合、洗浄レベルモニタリング用核酸プローブからのシグナル強度が最適洗浄シグナル強度範囲外となることが示された。従って、適切な洗浄レベルモニタリング用核酸プローブを用い、そのシグナル強度を測定することにより、洗浄工程が正常に行われたか否かを判定することができる。これにより、洗浄工程の異常によって引き起こされる誤判定を排除することができ、検出精度を向上させることができる。
1,11…基体、2…固定化領域、12…電極、13…パット。
Claims (14)
- 標的核酸の検出方法であって、
前記標的核酸と、前記標的核酸の標的配列及びその相補的な配列とハイブリダイズしない配列である洗浄レベルモニタリング核酸を準備する工程と、
前記標的配列と相補的な配列を含む標的核酸用核酸プローブ、及び、前記洗浄レベルモニタリング核酸と相補的な配列を含む洗浄レベルモニタリング用核酸プローブに、前記標的核酸と前記洗浄レベルモニタリング核酸を供給し、前記標的核酸と前記標的核酸用核酸プローブ、及び、前記洗浄レベルモニタリング核酸と洗浄レベルモニタリング用核酸プローブ、のそれぞれをハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション工程と、
前記ハイブリダイゼーション工程において生じた非特異的なハイブリッドを除去する洗浄工程と、
前記洗浄工程後に、前記標的核酸用核酸プローブからのシグナル強度及び前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブからのシグナル強度をそれぞれ測定する検出工程と、
前記洗浄工程が正常に行われたかどうかを判定する検査工程とを具備し、
前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブは、前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブと前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブとをハイブリダイズさせた後、前記標的核酸の洗浄に最適な最適洗浄温度範囲及びその近傍の温度範囲で洗浄温度を変化させた洗浄により、該プローブから得られるシグナル強度が変化するプローブであり、
予め、前記洗浄レベルモニタリング核酸と前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブとをハイブリダイズさせた後、前記最適洗浄温度範囲で洗浄したときの、該洗浄レベルモニタリング用プローブからのシグナル強度から上限値及び下限値を有する最適洗浄シグナル強度範囲が決定されており、
前記検査工程は、前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブから得られたシグナル強度が、前記最適洗浄シグナル強度範囲の範囲内にある場合には前記洗浄工程が正常に行われたと判定し、前記最適洗浄シグナル強度範囲の範囲外である場合には前記洗浄工程に異常があったと判定することを特徴とする、標的核酸の検出方法。 - 前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブから得られたシグナル強度が、前記最適洗浄シグナル強度範囲の上限値を超える場合に、前記洗浄工程に異常があったと判定されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブが、前記洗浄レベルモニタリング核酸とハイブリダイズさせた後に洗浄せずに検出したシグナル強度を100とし、塩濃度及びpHが一定の条件下で洗浄温度を変化させた洗浄により、1℃あたりのシグナル強度の変化率が13以上であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブが、前記洗浄レベルモニタリング核酸とハイブリダイズさせた後に洗浄せずに検出したシグナル強度を100とし、塩濃度及びpHが一定の条件下で洗浄温度を変化させた洗浄により、1℃あたりのシグナル強度の変化率が15以上であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブが、前記洗浄レベルモニタリング核酸とハイブリダイズさせた後に洗浄せずに検出したシグナル強度を100とし、塩濃度及びpHが一定の条件下で洗浄温度を変化させた洗浄により、1℃あたりのシグナル強度の変化率が18以上であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナル強度の変化率が、塩濃度及びpHが一定の条件下で洗浄したときの、洗浄温度とシグナル強度比の関数における近似直線の傾きであることを特徴とする、請求項3〜5の何れか一項に記載の方法。
- 前記洗浄温度とシグナル強度比の関数における近似直線が、前記シグナル強度比が50となる洗浄温度から±2℃以内の4点から作成された直線であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 前記最適洗浄温度範囲は、前記ハイブリダイゼーション工程において生じた非特異的なハイブリッドと特異的なハイブリッドによるシグナル強度が、前記洗浄工程後に相違する温度範囲である、請求項1〜7の何れか一項に記載の方法。
- 前記洗浄レベルモニタリング核酸が、前記標的核酸と同一の核酸であり、前記洗浄レベルモニタリング核酸として使用される配列が前記標的配列とは異なる配列であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記洗浄レベルモニタリング核酸が前記標的核酸とは異なる核酸であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブが、前記最適洗浄温度範囲の上限値及び下限値の温度範囲内での洗浄後により、該プローブから得られるシグナル強度が変化するプローブである、請求項1〜10の何れか一項に記載の方法。
- 前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブが、前記最適洗浄温度範囲の上限値及びその近傍の温度での洗浄により、該プローブから得られるシグナル強度が変化するプローブ、及び、前記最適洗浄温度範囲の下限値及びその近傍の温度での洗浄により、該プローブから得られるシグナル強度が大きく変化するプローブを含む少なくとも2つのプローブである、請求項1〜10の何れか一項に記載の方法。
- 前記最適洗浄シグナル強度範囲が、前記洗浄レベルモニタリング核酸と前記洗浄レベルモニタリング用核酸プローブとをハイブリダイズさせた後、塩濃度及びpHが一定の条件下、前記最適洗浄温度範囲で洗浄温度を変化させた洗浄により、該プローブから得られるシグナル強度に基づいて決定されることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記最適洗浄温度範囲の上限値での洗浄後に得られたシグナル強度を最適洗浄シグナル強度範囲の下限値とし、前記最適洗浄温度範囲の下限値での洗浄後に得られたシグナル強度を最適洗浄シグナル強度範囲の上限値とすることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
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