CN101570793A - 检测靶核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测靶核酸的方法，其包括检查洗涤步骤是否已经正常进行的步骤。在本发明的一个方面，使用用于监测洗涤水平的监测核酸探针。通过在洗涤靶核酸的最佳温度范围内和在洗涤的最佳温度范围附近的温度范围内的不同洗涤温度进行洗涤，所述探针显示出信号强度的变化。

Description

检测靶核酸的方法
发明背景
本发明涉及一种检测靶核酸的方法，其包括下述步骤：检查洗涤步骤中的异常。
为了检测靶核酸，可以使用微阵列。将核酸探针固定化在微阵列上。使靶核酸与该固定化的核酸探针杂交。一般而言，将阴性对照探针和阳性对照探针用于使用微阵列的靶核酸检测。阴性对照探针用于测定背景值(标准值)。阳性对照探针用于检查包括靶核酸的提取、扩增和检测在内的一系列步骤中的异常、或这些步骤中的一部分的异常。
当在不低于预定值的水平检测到来自阳性对照探针的信号强度时，判定实验正常进行。另一方面，当来自阳性对照探针的信号强度不足以检测到时，判定在所述步骤的任一个中存在异常(例如，JP-A2007-506402(KOKAI))。
但是，在靶核酸和核酸探针之间可能发生非特异性的杂交。具体而言，具有单核苷酸多态性(SNP)或几个碱基的插入或缺失的靶核酸容易发生非特异性反应，因为它的野生型序列和突变型序列彼此相似。例如，野生型靶核酸不仅可以与用于野生型检测的探针特异性地杂交，而且可以与用于突变型检测的探针非特异性地杂交。类似地，突变型靶核酸不仅可以与用于突变型检测的探针特异性地杂交，而且可以与用于野生型检测的探针非特异性地杂交。当它们之间产生这样的非特异性杂种时，会将同质的误判作异质的。
类似地，当要检测密切相关的生物、微生物或病毒时，可能产生非特异性杂种，造成将阴性的误判作阳性的。
通常，通过杂交反应后的洗涤，去除这样的非特异性杂种。但是，由于某些困难，不能正常地进行洗涤。但是，用上述的阳性对照不能发现洗涤步骤中的异常。因此，已经常规地存在的一个问题是，没有消除未正常洗涤的样品，从而造成误判。
发明内容
洗涤强度的水平主要受洗涤过程中的温度和盐浓度的影响。一般而言，在高温和低盐浓度条件下，会提高洗涤水平。另一方面，在低温和高盐浓度条件下，会降低洗涤水平。关于pH，洗涤水平在pH 5-9范围内不受显著影响。
由于装置的温度控制的困难，在低于预定温度的温度洗涤时，可能发生洗涤步骤中的异常。在该情况下，洗涤水平会降低，造成非特异性杂种的去除不充分。但是，迄今为止没有出现检测这样的困难的方法。
因此，必须开发检测洗涤步骤中的异常的方法，从而开发甚至在存在类似序列情况下能正确检测靶核酸的检测方法。
根据本发明的第一个方面，提供了一种方法，其中使用监测核酸探针和监测核酸来监测洗涤水平，以指示洗涤是否正常进行。监测核酸包含与监测核酸探针互补的序列。监测核酸探针是在最佳洗涤条件下对靶核酸高度敏感的探针。由于洗涤液的温度的轻微改变，探针的杂交程度会变化。也就是说，在探针和它的互补链之间形成的杂种会增加或减少，从而改变从该杂种检测到的信号强度。该监测核酸探针固定化在例如与用于靶核酸检测的探针所固定化的同一基质上。在下文中，用于靶核酸检测的探针称作核酸探针。
在本发明中，使监测核酸与监测核酸探针杂交，然后在合适的洗涤条件下洗涤，再测量从产生的杂种得到的信号强度，以确定合适的信号强度范围(洗涤的最佳信号强度范围)。为了检测靶核酸，将靶核酸和监测核酸同时提供给含有核酸探针和监测核酸探针的检测系统。当从监测核酸探针检测到的信号强度是在洗涤的最佳信号强度范围内时，可以确定洗涤步骤正常进行。另一方面，当这样检测到的信号强度是在洗涤的最佳信号强度范围外时，可以判定在洗涤步骤中存在异常。
根据本发明的第二个方面，提供了一种检测靶核酸的方法，其包含：
制备靶核酸和用于监测洗涤水平的监测核酸，所述靶核酸包含靶序列，且所述监测核酸包含不与靶序列或靶序列的互补序列杂交的序列，
将所述靶核酸和监测核酸提供给包含靶序列的互补序列的核酸探针和监测核酸探针，以监测洗涤水平，所述监测核酸探针包含监测核酸所含的序列的互补序列，从而使靶核酸与核酸探针杂交，且使监测核酸与监测核酸探针杂交；
洗涤在上述步骤中产生的杂种，以去除非特异性杂种，
分别测量来自与靶核酸杂交的核酸探针的信号强度和来自与监测核酸杂交的监测核酸探针的信号强度，和
检查洗涤步骤是否正常进行；
其中所述监测核酸探针显示出与监测核酸杂交且随后在洗涤的最佳温度范围和该范围附近的改变的洗涤温度洗涤后信号强度的变化，
预先基于从已经与监测核酸杂交且随后在洗涤的最佳温度范围洗涤的监测核酸探针得到的信号强度，确定具有上下限的洗涤的最佳信号强度范围，且
所述检查步骤包含作出下述判断：当从监测核酸探针得到的信号强度是在洗涤的最佳信号强度范围内时，洗涤已经正常进行，和当所述信号强度是在洗涤的最佳信号强度范围外时，洗涤步骤中存在异常。
在下面的描述中将阐述本发明的其它目的和优点，其中一部分可以从描述中明白，或可以通过实现本发明来学习。借助于在下文中特别指出的手段和组合，可以实现和获知本发明的目的和优点。
附图简述
引入并构成本说明书的一部分的附图，示例说明了本发明的实施方案，且与上面给出的一般描述和下面给出的实施方案的详述一起，用于解释本发明的原理。
图1的示意图显示了探针固定化的基质的一个实例；
图2的示意图显示了探针固定化的基质的另一个实例；
图3A是显示实施例1的结果的图(在44℃和45℃)；
图3B是显示实施例1的结果的图(在46℃和47℃)；
图3C是显示实施例1的结果的图(在48℃和49℃)；
图3D是显示实施例1的结果的图(在50℃和51℃)；
图3E是显示实施例1的结果的图(在52℃)；
图4A是显示实施例1的结果的散布图(G型)；
图4B是显示实施例1的结果的散布图(A型)；
图4C是显示实施例1的结果的散布图(G/A型)；
图5是显示实施例2的结果的图；
图6A是显示实施例3的结果的图(SEQ ID NO：34)；
图6B是显示实施例3的结果的图(SEQ ID NO：16)；
图6C是显示实施例3的结果的图(SEQ ID NO：35)；
图6D是显示实施例3的结果的图(SEQ ID NO：36)；
图7A是显示实施例4的结果的图，在48.5℃洗涤，且洗涤液正常送出；
图7B是显示实施例4的结果的图，在44℃洗涤，且洗涤液正常送出；和
图7C是显示实施例4的结果的图，在48.5℃洗涤，且洗涤液没有正常送出。
发明详述
本文使用的术语“核酸”用于通称诸如DNA、RNA、LNA、S-寡聚物和甲基膦酸酯寡聚物、其部分结构可以用核苷酸结构表示的物质。
在本发明中，术语“靶核酸”是指要通过本发明的方法检测的核酸。
在本发明中，术语“靶序列”是指在靶核酸中包含的序列。靶序列用于检测靶核酸。
在本发明中，术语“核酸探针”是指用于靶核酸检测的探针。核酸探针包含靶序列的互补序列。核酸探针与靶核酸形成杂种。
在本发明中，术语“监测核酸”是指为监测洗涤强度水平而制备的核酸。监测核酸包含不与靶序列或靶序列的互补序列杂交的序列。不与例如序列X杂交的序列，称作与序列X具有低同源性的序列。
在本发明中，术语“监测核酸探针”是指包含监测核酸所含序列的互补序列的核酸探针。在使用DNA微阵列的情况下，其中所述核酸探针固定化在基质上，监测核酸探针固定化在同一基质上。监测核酸探针与监测核酸形成杂种。
在本发明中，术语“样品溶液”是指其中可能存在靶核酸的溶液。对样品溶液进行本发明的检测方法。
在本发明中，术语“基质”是指核酸探针所固定化的支持物。基质与固定化在它上面的核酸探针一起构成一种装置，例如DNA微阵列。
在下文中，将详细描述本发明的实施方案。
在本发明中使用的监测核酸探针在洗涤靶核酸的最佳温度范围(洗涤的最佳温度范围)和在洗涤的最佳温度范围附近的温度范围显示出信号强度变化。
将监测核酸探针固定化在基质上，并与监测核酸杂交。从这样形成的杂种得到的电流是上述信号，并测量它的强度。
一般而言，在杂交后进行洗涤，从而在一定程度上使杂种分离。由此降低信号强度。随着洗涤温度的升高，解离的杂种的量增加。因此，当在盐浓度和pH保持恒定的条件下改变洗涤温度时，会改变信号强度的降低速率。也就是说，信号强度的降低随着洗涤温度的升高而增加。
如后文所述，洗涤的最佳温度范围是洗涤的允许温度范围，它用于在本发明的检测方法的洗涤步骤中洗涤靶核酸。首先，使作为监测核酸探针的候选物的探针与它的互补链杂交，然后在洗涤的最佳温度范围和该范围附近的温度洗涤，测量来自探针形成的杂种的信号强度。在许多不同的洗涤温度进行该测量。基于测量结果，选择其信号强度变化依赖于洗涤温度变化的探针作为监测核酸探针。具体而言，选择其信号强度在洗涤的最佳温度范围的边缘温度附近显著变化的探针。
解链温度(Tm)容易影响核酸信号强度的变化，后者归因于洗涤温度的变化。当在低温洗涤时，具有低解链温度(Tm)的探针会改变它的信号强度。另一方面，具有高解链温度(Tm)的探针会在高温改变它的信号强度。因此，Tm值可以是选择的指标。
Tm值也随核酸中的GC含量而变化。但是，一般而言，链越短的核酸具有越低的Tm值，而链越长的核酸具有越高的Tm值。可以例如通过使用Wallace方法计算相对短的核酸的Tm值。在Wal ace方法中，假定鸟嘌呤和胞嘧啶之间的键合力是4℃，且腺嘌呤和胸腺嘧啶之间的键合力是2℃，计算Tm值。
在本发明的一个优选实施方案中，选择在上述温度范围具有高信号强度变化速率的探针作为监测核酸探针。随着信号强度变化速率的变高，可以更准确地检测出由洗涤水平的微小变化导致的信号强度的不同。
核酸的扩增效率、在生产芯片的过程中探针在基质上的固定化、杂交和洗涤随操作而异，因而检测核酸的方法的总效率在检测实验之间不同。这称作检测实验之间的变化。一般而言，通过考虑在检测实验步骤中包含的所有因素，将检测实验之间的变化计算为变化速率。
当检测实验之间的变化是显著的时候，具有低信号强度变化速率的探针难以正确地鉴别出洗涤步骤中的异常。因此，在本发明的一个优选实施方案中，优选使用具有高信号强度变化速率的探针。
可以如下计算信号强度变化速率：
首先，使监测核酸探针与监测核酸杂交。不经洗涤，测量从上面产生的杂种得到的信号强度。它的测量值假定为100。然后，将具有恒定盐浓度和恒定pH的洗涤液用于在不同温度的洗涤，然后测量信号强度。将这样在各个温度测定的信号强度相对地表示为信号强度比，其中上述不经洗涤的测量值假定为100。
随着洗涤温度逐渐升高，信号强度在开始阶段逐渐降低。但是，在某些时间点，信号强度快速降低。当在图中将该信号强度的变化速率表达为信号强度比相对于温度的函数时，可以在信号强度显著降低的范围内绘制出一条近似直线。从该近似直线的倾斜度，可以计算出信号强度变化速率。
在一个实施方案中，以下述方式制备近似直线。首先，选择在信号强度比达到50时的洗涤温度±2℃的洗涤温度范围内的4个点测定的信号强度。然后，根据在这4个点上的值形成近似直线。
在本发明的一个优选实施方案中，当检测实验之间的变化小于20％时，使用信号强度变化速率为13或更高(优选15或更高)的监测核酸探针。在另一个优选实施方案中，当检测实验之间的变化不小于30％时，使用信号强度变化速率为18或更高的监测核酸探针。
随着来自监测核酸探针的信号强度的变化速率的增加，可以正确地检测分钟上不同的洗涤水平，无论检测实验之间的变化。
对于如上所述选择的监测核酸探针，测定最佳信号强度范围(洗涤的最佳信号强度)。最佳信号强度范围是指，当在洗涤的最佳温度范围进行洗涤时得到的信号强度范围。如上所述，在盐浓度和pH保持恒定的条件下在洗涤的最佳温度范围中的不同温度洗涤后得到的信号强度的基础上，测定最佳信号强度范围。具体而言，优选在上述温度范围的边缘温度洗涤得到的信号强度的基础上测定该范围。
在一个实施方案中，将在洗涤的最佳温度范围的上限温度洗涤后得到的信号强度视作洗涤的最佳信号强度范围的下限。将在洗涤的最佳温度范围的下限温度洗涤后得到的信号强度视作洗涤的最佳信号强度范围的上限。
监测核酸探针应当是在洗涤的最佳温度范围的上限和下限温度处都具有高信号强度变化速率的探针。可以使用单个探针，只要它可以满足该条件。当没有满足该条件的探针时，可以使用至少2个探针的集合，也就是说，可以同时使用在上述温度范围的上限温度处具有高信号强度变化速率的探针和在上述温度范围的下限温度处具有高信号强度变化速率的探针。备选地，可以使用多个在上述温度范围和其附近的任意温度具有高信号强度变化速率的探针。
在本发明中，洗涤的最佳温度范围是指选择性地去除通过靶核酸和核酸探针之间的杂交产生的非特异性杂种时的温度。实际上，基于洗涤后产生来自非特异性杂种和特异性杂种的信号强度的彼此不同的温度，可以确定温度范围。优选地，基于使两个强度彼此明显不同的温度、更优选使来自非特异性杂种的信号强度几乎与阴性对照相同时的温度，确定温度范围。
该温度范围随要辨别的靶序列和靶核酸的结构和类型而变化。一般而言，随着要辨别的序列(例如野生型和突变型序列)之间的相似性的增加，更容易产生非特异性杂种，因而最佳温度范围变得更窄。当待测对象是具有单个碱基置换、插入或缺失的核酸时，最佳温度范围最窄。作为实例，当检测对象是具有单核苷酸多态性的核酸时，在恒定盐浓度和恒定pH条件下、仅改变温度时，最佳温度范围在实验上的宽度是约2至6度。也存在最佳温度范围的宽度是约2至3度的核酸。在这种情况下，在例如使用自动检查装置的检测中，洗涤液的温度应当严格控制在离最佳温度范围中心1至1.5度内。
如上所述，洗涤的最佳温度范围随待测靶核酸而异。因此，执行根据本发明的检测核酸的方法的人员，可以任意测定洗涤的最佳温度范围。
在本发明中，在洗涤的最佳温度范围附近的温度是指在最佳温度范围中和周围的温度，例如在洗涤的最佳温度范围的上限和下限温度±3°的温度。温度范围的上限和下限温度意在包括在温度范围的边缘温度处和其周围的温度。
现在，将详细描述在本发明中使用的监测核酸。所述核酸可以是与靶核酸相同的核酸，或可以是不同于靶核酸的核酸。监测核酸可以是人工生产的核酸类似物，或可以是根据需要从个体的基因组DNA、基因组RNA或mRNA扩增的核酸。可以检索和使用完全不同于靶核酸的来源活体的活体基因。
当监测核酸是与靶核酸相同的核酸时，监测核酸序列包含在不同于靶序列的区域。当监测核酸是不同于靶核酸的核酸时，可以通过在同一个罐中同时扩增来制备两种核酸。备选地，可以分开制备各个核酸。在该情况下，将监测核酸加入样品溶液。基于靶核酸的浓度，可以任意测定加入的核酸的浓度。扩增后靶核酸的饱和浓度大致恒定。固定化在基质上的探针的数目和量也是大致恒定。因此，加入的核酸的浓度也可以大致恒定。
现在，将详细描述根据本发明的检测靶核酸的方法的步骤。
首先，制备靶核酸的核酸探针(它包含靶核酸序列的互补序列)、监测核酸和监测核酸探针。然后，将核酸探针和监测核酸探针固定化在基质上。为了方便，具有固定化在它上面的核酸探针的基质在本文中称作探针固定化的基质。在检测实验之前，可以预先制备各个核酸和探针固定化的基质。
备选地，制备进行核酸检测实验的样品溶液。样品溶液可能含有靶核酸，且含有监测核酸。靶核酸和监测核酸可以提取自个体。所述个体包括、但不限于，人、非人动物、植物、病毒和微生物，例如微生物、细菌、酵母和支原体。从例如收集的血液、血清、白细胞、尿、粪便、精液、唾液、组织、活组织检查样品、口腔粘膜、培养细胞、痰等，可以得到它们的核酸。提取方法没有特别限制，也可以使用商业上可得到的核酸提取试剂盒，例如QIAamp(由QIAGEN生产)和Sumaitest(由Sumitomo Metal Industries，Ltd.生产)等。
通过本领域已知的扩增方法，根据需要扩增提取的核酸。可以使用的方法包括，例如，聚合酶链式反应(PCR)，环介导的等温扩增(LAMP)，等温和嵌合引物启动的核酸扩增(ICAN)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，链置换扩增(SDA)，连接酶链反应(LCR)，和滚环扩增(RCA)。根据需要破碎得到的扩增产物，或单链化。使扩增产物单链化的措施包括，例如，热变性，使用珠子、酶等的方法，和使用T7DNA聚合酶的转录反应方法。当单链区域存在于通过LAMP、ICAN等方法扩增的产物中时，该单链区域用作靶序列，它可以直接进行杂交(参见，例如，JP-A 2005-143492(KOKAI))。
与上述制备分开地，测定监测核酸探针的洗涤的最佳信号强度范围。该测定可以如上面所详述地进行。
然后，对如上所述制备的样品溶液进行在探针固定化的基质上的杂交。在该杂交步骤中，在探针固定化的基质上，使靶核酸与靶核酸的核酸探针杂交，使监测核酸核酸与监测核酸探针杂交。然后，通过洗涤，去除在杂交步骤中产生的非特异性杂种。
洗涤后，分别测量来自核酸探针的信号强度和来自监测核酸探针的信号强度。
本发明的方法另外包括判断洗涤步骤是否正常进行的检查步骤。在该检查步骤中，当在测量步骤中从监测核酸探针得到的信号强度是在以前测定的信号强度范围(洗涤的最佳信号强度范围)内时，判断洗涤步骤正常进行。另一方面，当得到的信号强度是在信号强度范围外时，判断洗涤步骤中存在异常。具体而言，当得到的信号强度高于信号强度范围的上限时，判断洗涤步骤中存在异常。
在检测核酸的常规方法中，使用其信号强度不受洗涤温度变化的影响的阳性对照。常规地，当来自阳性对照的信号强度不低于预定值时，判断实验正常进行。因此，仅确定信号强度的下限，不将过高的信号强度视作有问题的。
但是，本发明的核酸检测方法不同于常规方法，使用通过在洗涤的最佳温度范围洗涤会显著改变其信号强度的探针。来自这样的探针的信号强度在洗涤的最佳温度范围外的温度不显著变化。例如，当洗涤温度低于洗涤的最佳温度范围时，信号强度仍然是高的。由此可以判断，当检测到高于预定信号强度范围的信号强度时，洗涤水平低于确定值。另一方面，可以判断，当检测到低于预定信号强度范围的信号强度时，洗涤水平高于确定值。
在检测核酸的方法中使用的盐浓度在洗涤时通常低于在杂交时。随后，当在杂交后的洗涤步骤中没有正常进行洗涤时，例如当用具有高盐浓度的杂交溶液进行洗涤步骤时，产生非特异性信号，从而导致异常结果。基于信号强度随温度的变化，选择本发明的监测核酸探针，且可以检测盐浓度中的这种异常。
<核酸探针>
核酸探针或监测核酸探针的链长没有特别限制，但是优选在5-50个碱基范围内、更优选在10-40个碱基范围内、更优选在15-35个碱基范围内。
核酸探针可以未被修饰，或可以用反应官能团(例如氨基、羧基、羟基、巯基和磺酰基)或诸如抗生物素蛋白和生物素的物质修饰，以用于固定化到基质上。可以将间隔物引入官能团和核苷酸之间。可以将烷烃骨架、乙二醇骨架等用作间隔物。
在其上固定化核酸探针的基质可以由下述材料组成：包括，但不限于，硝酸纤维素膜，尼龙膜，微量滴定板，玻璃，硅，电极，磁体，珠子，塑料，乳胶，合成树脂，天然树脂，和光纤。
<探针固定化的基质>
作为探针固定化的基质的一个实例，核酸微阵列的示意图如图1所示。给该实例的微阵列提供在基质1上的固定化区域2。将核酸探针固定化在固定化区域2上。通过本领域已知的方法，可以生成这样的核酸微阵列。本领域技术人员根据需要，可以适当设计和改变在基质1上的固定化区域2的数目和排列。可以将一种或多种类型的核酸探针固定化在一个基质上，可以任意选择探针的数目和类型。该实例所示的核酸微阵列优选地用于荧光检测方法中。
探针固定化的基质的另一个实例如图2所示。上给图2中的核酸微阵列提供在基质11的电极12。将核酸探针固定化在电极12上。将电极12连接至垫13。通过垫13，获取来自电极12的电信息。通过本领域已知的方法，可以生成这样的核酸微阵列。本领域技术人员根据需要，可以适当设计和改变在基质11上的电极12的数目和排列。可以将一种或多种类型的靶核酸的核酸探针固定化在一个基质上，可以任意选择探针的数目和类型。根据需要，可以给该实例所示的核酸微阵列提供参比电极和对电极。
可以用于电极中的材料包括、但不限于，金、金合金、银、铂、水银、镍、钯、硅、锗、镓和钨和它们的合金，碳例如石墨和玻璃碳和其氧化物和化合物。
该实例所示的核酸微阵列优选地用于电化学检测方法中。
<杂交条件>
在充分形成杂种的合适条件下进行杂交。所述条件优选是形成的特异性杂种明显胜过非特异性杂种的条件。所述合适的条件随靶核酸的类型和结构、靶核酸所含的碱基的类型和核酸探针的类型而异。例如，在离子强度在0.01-5范围内且pH在5-9范围内的缓冲液中进行杂交。反应温度可以在10-90℃的范围内。通过搅拌或摇动，可以提高反应效率。反应溶液可以含有杂交促进剂例如硫酸葡聚糖，鲑精DNA或牛胸腺DNA，以及EDTA或表面活性剂。
<洗涤条件>
使用的洗涤液优选是离子强度在0.01-5范围内且pH在5-9范围内的缓冲液。洗涤液优选地含有盐和表面活性剂。可以优选使用的洗涤液的实例包括SSC溶液，Tris-HCl溶液，吐温20溶液和SDS溶液。洗涤温度设定在如上所述的洗涤的最佳温度范围内。使洗涤液穿过或保留在探针固定化的基质表面上或核酸探针固定化的区域上。备选地，可以将探针固定化的基质浸渍在洗涤液中。在该情况下，洗涤液优选地装在能温度控制的容器中。
<检测方法>
在检测在杂交步骤中形成的杂种时，可以使用荧光检测系统和电化学检测系统。
(a)荧光检测系统
用荧光标记的物质检测杂种。可以用荧光活性的物质(例如荧光染料例如FITC，Cy3，Cy5或罗丹明)标记在该扩增核酸的步骤中使用的引物。备选地，可以使用用这样的物质标记的第二探针。也可以同时使用多种标记物质。用检测器检测在标记的序列中或在第二探针中的标记。根据使用的标记，使用合适的检测器，例如，使用荧光检测器。
(b)电化学检测系统
使用本领域已知的双链识别物质。双链识别物质可以选自Hoechst 33258，吖啶橙，喹纳克林，道诺霉素，金属插入剂，双插入剂例如双吖啶，三插入剂和多插入剂。可以用电化学活性金属络合物例如二茂铁或紫罗碱修饰双链识别物质。
双链识别物质的浓度尽管随它的类型而异，但通常在1ng/mL至1mg/mL的范围内使用。在该情况下，优选使用离子强度在0.001-5范围内且pH在5-10范围内的缓冲液。
如下进行测量：至少应用双链识别物质可以电化学地反应的电势，然后测量源自双链识别物质的反应电流。通过在恒定速率或以脉冲方式摆动，可以施加电势。备选地，可以施用恒定电势。通过恒电位器、数字多用表或函数发生器等装置，可以控制电流和电压。可以根据本领域已知的方法进行电化学测量。例如，可以使用JP-A 1998-146183(KOKAI)所述的方法。
实施例
在下文中，将参考实施例详细描述本发明。
[实施例1]
将详细描述显示确定洗涤靶核酸的最佳温度的方法的实施例。在该实施例中，检测具有单核苷酸多态性(SNP)的核酸。靶核酸是含有NAT2基因的单核苷酸多态性G590A的核酸。通过LAMP扩增靶核酸。
(1)引物
在靶核酸的扩增中使用的合成的DNA寡聚物引物如表1所示。
表1
  SEQ ID NO：   引物名称   序列
  1   F3引物   CTGGGAAGGATCAGCCTC
2 FIP引物   GTTTGTAATATACTGCTCTCTCCTG-CCTTGCATTTTCTGCTTGAC
  3   B3引物   AAATGAAGATGTTGGAGACG
4 BIP引物   CACCAAAAAATATACTTATTTACGC-CTGCAGGTATGTATTCATAGACTC
  5   LP引物   GTACCAGATTCCTCTCTCTTCT
(2)LAMP反应溶液
在LAMP中使用的反应溶液的组合物如表2所示。
表2
  2×缓冲液   12.5μL
  Tris·HCl pH8.0 40mM
  KCl 20mM
  MgSO4 16mM
  (NH4)2SO4 20mM
  吐温200.2％
  甜菜碱1.6M
  dNTP 2.8mM
  F3引物(10μM)   0.5μL
  B3引物(10μM)   0.5μL
  FIP引物(20μM)   2μL
  BIP引物(20μM)   2μL
  LP引物(10μM)   1μL
  Bst DNA聚合酶   1μL
  人基因组(30ng/μL)   1μL
  灭菌的超纯水   4.5μL
  共计   25μL
(3)核酸扩增
使用3类人基因组即G-类型、A-类型和G/A-类型作为扩增模板。在63℃扩增1小时。此后，在80℃灭活酶2分钟。通过加入替代人基因组的灭菌水，制备阴性对照。对反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳。结果，出现LAMP产物特有的梯形图案，从而证实扩增。在阴性对照的反应溶液中，证实没有扩增。
(4)核酸探针
在该实施例中使用的3类核酸探针，如表3所示。
表3
  SEQ ID NO：   探针名称  序列
  6   阴性对照  GTGCTGCAGGTGCG
  7   590G-类型  TTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTT
  8   590A-类型  TTGAACCTCAAACAATTGAAGATTTTG
阴性对照的核酸探针具有与NAT2基因的序列无关的序列。在表3中，探针590G是用于检测野生型核酸的核酸探针。探针590A是用于检测突变型核酸的探针。这3种探针在其3’-末端用巯基修饰，以用于固定化到电极上。
(5)微阵列的制备
使用具有金电极的基质。通过使用巯基和金之间的强化学键合，将每个核酸探针固定化到金电极上。首先，将含有如上所述在其末端用巯基修饰的探针的溶液印迹在金电极上，在25℃放置1小时。此后，用0.2×SSC溶液洗涤基质。然后，用超纯水洗涤基质，再风干。将相同的探针固定化在4个电极上。将制备的微阵列放在一个特殊的盒中。该盒子具有一个流道，溶液经过该流道仅在核酸探针固定化的位置上流动。
(6)杂交
将2×SSC盐加入在上面(3)中得到的含有LAMP产物的反应溶液中。将该溶液注射进在上面(5)中制备的微阵列盒中。然后，将该盒置于核酸自动检查装置中(参见Rinsho Byori.55216-223，2007)。在自动检查装置中进行杂交、洗涤和检测步骤。在55℃杂交20分钟。如下进行洗涤：将置于检查装置中的0.2×SSC溶液发送到盒子，在44-52℃放置20分钟。在检测中，将也置于该装置中的含有50μMHoechst 33258的磷酸盐缓冲液发送到盒子，放置10分钟。此后，检测Hoechst 33258的氧化电流响应。通过在上述洗涤温度范围内的变化1℃的9个洗涤温度洗涤，进行实验。
(7)结果
结果如图3A至3E所示。在图3A至3E中，随着洗涤温度从46降低至45℃，G-类型靶核酸表现出来自非特异性A-类型探针的强信号，A-类型靶核酸表现出来自非特异性G-类型探针的增加信号。当洗涤温度是44℃时，非特异性信号进一步增加，使得G-和A-类型均质物难以与异质物区分开。当洗涤温度不低于51℃时，特异性信号降低。
计算出图3A至3E中4个电极的平均值，并绘制在如图4A至4C所示的图中。
在图4A至4C中，菱形标记显示出来自G-类型探针的信号，正方形标记显示出来自A-类型探针的信号。从图3和4可见，可以清楚地鉴别出A-类型、G-类型和异质物的最佳洗涤温度是47至50℃。
[实施例2]
将详细描述显示选择监测核酸探针的方法的实施例。使用不同链长度的5种核酸探针，检查洗涤温度和信号强度之间的关系。使用表4所示的合成的DNA寡聚物引物，用人基因组作为模板进行LAMP。LAMP反应溶液和扩增条件与实施例1相同。
表4
  SEQ ID NO：   引物名称   序列
  9   F3引物   GAGCTTGGCATATTGTATCTATACC
10 FIP引物   TCACTTTCCATAAAAGCAAGGTTTTTAAGTAA-CTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCAC
  11   B3引物   CTAGTCAATGAATCACAAATACGC
12 BIP引物   AGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATG-TAACATTTTACCTTCTCCATTTTGA
  13   LP引物   CATCAACAACCCTCGGGAC
在该实施例中使用的不同链长度的5种核酸探针如表5所示。5种探针具有与LAMP产物中的序列完全互补的序列。使用的阴性对照是与实施例1相同的探针。
表5
SEQ ID NO：   探针长度 序列
  14   17聚体   GGGTTCCTGGGAAATAA
  15   21聚体   TATGGGTTCCTGGGAAATAAT
  16   23聚体   TTATGGGTTCCTGGGAAATAATC
  17   24聚体   TTATGGGTTCCTGGGAAATAATCA
  18   30聚体   TTGTTATGGGTTCCTGGGAAATAATCAATG
通过与实施例1相同的方法，使用这些探针生产微阵列。
对上面得到的含有LAMP产物的反应溶液进行在微阵列上的杂交，以与实施例1相同的方式在不同温度洗涤。
结果如图5所示。在实施例1中测定的洗涤的最佳温度范围是47至50℃。在该温度范围，17-聚体探针(SEQ ID NO：14)显示出低信号强度。温度对信号强度的变化也较低。在上述温度范围，30-聚体探针(SEQ ID NO：18)显示出信号的高增加，信号几乎不变。21-聚体探针(SEQ ID NO：15)、23-聚体探针(SEQ ID NO：16)和24-聚体探针(SEQID NO：17)在上述温度范围显示出信号强度的剧烈变化。因此，这3种探针可以用作监测核酸探针。
在实施例1的结果中，通过在44℃洗涤不能区分均质和异质物。另一方面，通过在52℃洗涤，几乎检测不到信号。从该结果，例如通过使用23-聚体探针(SEQ ID NO：16)，当来自探针的信号强度是在5-40nA范围时，可以确定是在最佳温度范围进行洗涤。另一方面，当来自探针的信号强度是40nA或更高时，可以判断是在低于上述温度范围的温度进行洗涤。也可以判断，当信号强度是5nA或更低时，是在高于上述温度范围的温度进行洗涤。
当同时使用21-聚体探针(SEQ ID NO：15)和24-聚体探针(SEQ IDNO：17)时，它们可以用作监测核酸探针。在该情况下，来自21-聚体探针的信号强度小于25nA，同时来自24-聚体探针的信号强度是15nA或更高，可以确定是在上述温度范围内的温度进行洗涤。另一方面，当来自21-聚体探针的信号强度是25nA或更高时，可以判断是在低于上述温度范围的温度进行洗涤。当来自24-聚体探针的信号强度小于15nA时，可以判断是在高于上述温度范围的温度进行洗涤。
[实施例3]
检查信号强度变化速率和检测实验中的变化之间的关系。使用4种核酸探针来测定在洗涤的最佳温度范围中的信号强度变化速率。使用表4和6所示的合成的DNA寡聚物引物，使用人基因组作为模板，进行LAMP。LAMP反应溶液和扩增条件与实施例1相同。
表6
Figure A20091011823600221
在该实施例中使用的核酸探针是表5所示的SEQ ID NO：16的探针和表7所示的3种探针。3种探针是分别与LAMP产物中的序列完全互补的探针。使用的阴性对照是与实施例1相同的探针。
表7
  SEQ ID NO：   序列
  34   CCACCGTTCCCTGGCAG
  35   AGGTGACCACTGACGGC
  36   CCTGGTGATGGATCCCTTACTAT
通过与实施例1相同的方法，使用这些探针生产微阵列。
以与实施例1相同的方式，对上面得到的含有LAMP产物的反应溶液进行在微阵列上的杂交。
结果如图6A至6D所示。从在信号强度比达到50时的洗涤温度±2℃内的4个点绘制近似直线，由此测定信号强度变化速率。
SEQ ID NOS：34，16，35和36的探针的信号强度变化速率分别是18.4，15.4，13.3和11.1。检测实验之间的变化是10％、20％和30％时的误差范围如图所示。
当检测实验之间的变化是10％时，相差1℃的具有11.1的信号强度变化速率的SEQ ID NO：36的探针的测量值差异是在误差范围内，从而难以辨别1℃的差异。但是，从图中可以看出，随着信号强度变化速率增加至13.3、15.4和18.4，可以清楚地辨别相差1℃的测量值差异。
类似地，当检测实验之间的变化是20％时，相差2℃的SEQ ID NO：36的探针的测量值差异是在误差范围内，从而难以辨别2℃的差异。但是，从图中可以看出，随着信号强度变化速率增加至13.3、15.4和18.4，可以清楚地辨别2℃的差异。
当检测实验之间的变化是30％时，对于信号强度变化速率是13.3或15.4的探针，难以辨别2℃的差异。但是，从图中可以看出，具有18.4的信号强度变化速率的SEQ ID NO：34的探针可以清楚地辨别2℃的差异。
前述内容揭示，可以如下检测洗涤步骤中的异常：当检测实验之间的变化小于20％时，使用具有13或更高的信号强度变化速率的探针，或当检测实验之间的变化是20％或更高时，使用具有18或更高的信号强度变化速率的探针。例如，通过在该实施例中使用这样的探针，可以辨别在实施例1中确定的温度范围的47℃下限温度处进行洗涤的情况和在低于45℃的温度处进行洗涤的情况。
在该实施例中，使用在45-50℃附近的洗涤温度处具有快速信号强度变化速率的探针。但是，本领域技术人员会明白，最佳洗涤温度随靶核酸或检测条件的差异而变化。本领域技术人员可以容易地选择和使用具有合适Tm值的监测核酸探针。
[实施例4]
在异常洗涤条件下，进行靶核酸的检测。洗涤条件中的假定困难是，当用自动检查装置进行实验时，洗涤温度没有达到最佳温度，且洗涤液没有正常发送。使用的靶核酸是实施例1中NAT2 G590A的G-类型LAMP产物。使用实施例2中的23-聚体探针(SEQ ID NO：16)作为监测核酸探针。
结果如图7A至7C所示。图7A显示了其中洗涤温度是48.5℃且洗涤液正常发送的检测的结果。图7B显示了其中洗涤温度是44℃且洗涤液正常发送的检测的结果。图7C显示了其中洗涤温度是48.5℃且洗涤液没有正常发送的检测的结果。
当洗涤液正常发送时，在洗涤中使用具有0.2×SSC的盐浓度的溶液。另一方面，当洗涤液没有正常发送时，在洗涤中使用具有2×SSC的盐浓度的溶液，它是用于杂交的反应溶液的盐浓度。
在图7A中，来自监测核酸探针的信号强度是约24nA。该信号强度是在实施例2所测定的5-40nA的信号强度范围内。检测来自G-类型探针的强信号。几乎检测不到来自A-类型探针的信号。这些结果揭示，形成特异性杂种，而几乎不形成非特异性杂种。因此，可以认为这些结果是理想的检测结果。
另一方面，在图7B和7C中，来自监测核酸探针的信号强度是约55nA。该强度是在上面测定的5-40nA的信号强度范围外。图7B和7C的结果都表明，来自A-类型探针的信号较强，且存在非特异性杂种。图7B和7C中的检测结果难以与异质物的检测结果区分开，因而导致误判的高可能性。
前述内容揭示，当在洗涤步骤中存在异常时，来自监测核酸探针的信号强度是在洗涤的最佳信号强度范围外。因此，通过用合适的监测核酸探针测量信号强度，可以判断洗涤步骤是否正常进行。由此可以消除由洗涤步骤中的异常造成的误判，且可以提高检测的准确度。
如上所述，根据本发明使用监测核酸探针，由此可以检测洗涤步骤中的异常，并避免由洗涤步骤中的异常引起的误判。因此，可以提高将靶核酸从类似序列中检测出的准确度。
本领域技术人员会容易地明白其它优点和改进。因此，本发明在它的更宽方面不限于本文所示和所述的特定细节和代表性实施方案。因此，可以作出多种改进，而不脱离所附权利要求和它们的等价体所定义的一般发明概念的精神或范围。
序列表
<110>Kabushiki Kaisha Toshiba
<120>检测靶核酸的方法
<130>08S0813
<150>JP 2008-119297
<151>2008-04-30
<160>36
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>F3引物
<400>1
ctgggaagga tcagcctc                    18
<210>2
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FIP引物
<400>2
gtttgtaata tactgctctc tcctgccttg cattttctgc ttgac                  45
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B3引物
<400>3
aaat gaagat gttggagacg                 20
<210>4
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BIP引物
<400>4
caccaaaaaa tatacttatt tacgcctgca ggtatgtatt catagactc                 49
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LP引物
<400>5
gtaccagatt cctctctctt ct                    22
<210>6
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Negative control
<400>6
gtgctgcagg tgcg                             14
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>590 G型
<400>7
ttgaacctcg aacaattgaa  gatttt               26
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>590A型
<400>8
ttgaacctca aacaattgaa gattttg                   27
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>F3引物
<400>9
gagcttggca tattgtatct atacc                     25
<210>10
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FIP引物
<400>10
tcactttcca taaaagcaag gtttttaagt aactcttaga tatgcaataa ttttcccac                59
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B3引物
<400>11
ctagtcaatg aatcacaaat acgc                       24
<210>12
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BIP引物
<400>12
agaaagtaaa agaacaccaa gaatcgatgt aacattttac cttctccatt ttga                54
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LP引物
<400>13
catcaacaac cctcgggac                   19
<210>14
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>14
gggttcctgg gaaataa                     17
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>15
tatgggttcc tgggaaataa t                21
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>16
ttatgggttc ctgggaaata atc                   23
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>17
ttatgggttc ctgggaaata atca                  24
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>18
ttgttatggg ttcctgggaa ataatcaatg            30
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>F3引物
<400>19
gtctcctgcc ctgacagc                         18
<210>20
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FIP引物
<400>20
cagtggtttc ttcatcccgc aggcacatct tgttccctc                     39
<210>21
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B3引物
<400>21
actccttggt gtgctcctc                         19
<210>22
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BIP引物
<400>22
ggaaggctca gtataaatag cagtgctgta gctgagctgc gg                  42
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LP引物
<400>23
gtcatttatc ccagttgtgc aacc                    24
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>F3引物
<400>24
gaggctattt ttgatcacat tgta                   24
<210>25
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FIP引物
<400>25
gaaaaccgat tgtggtcaga gggtgtctcc aggtcaatca a                   41
<210>26
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B3引物
<400>26
ggct gccaca tctgggag                       18
<210>27
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BIP引物
<400>27
catggttcac cttctcctga gcttccagac ccagcat                       37
<210>28
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LP引物
<400>28
cccagtacag aagttg                    16
<210>29
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>F3引物
<400>29
gtgggcttca tcctcac                   17
<210>30
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FIP引物
<400>30
agcacttctt caacctcttc ctctaaagac aatacagatc tggtcg                  46
<210>31
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B3引物
<400>31
tgataattag tgagttgggt gat                    23
<210>32
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BIP引物
<400>32
ggggagaaat ctcgtgccca agggtttatt ttgttcctta ttc                   43
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LP引物
<400>33
agtgagagtt ttaaactcga cc                    22
<210>34
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>34
ccaccgttcc ctggcag                          17
<210>35
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>35
aggtgaccac tgacggc                          17
<210>36
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>36
cctggtgatg gatcccttac  tat                      23

Claims (18)

1.一种检测靶核酸的方法，其特征在于，包含：
制备靶核酸和用于监测洗涤水平的监测核酸，所述靶核酸包含靶序列，且所述监测核酸包含不与靶序列或靶序列的互补序列杂交的序列，
将所述靶核酸和监测核酸提供给包含靶序列的互补序列的核酸探针和监测核酸探针，以监测洗涤水平，所述监测核酸探针包含监测核酸所含的序列的互补序列，从而使靶核酸与核酸探针杂交，且使监测核酸与监测核酸探针杂交；
洗涤在上述步骤中产生的杂种，以去除非特异性杂种，
分别测量来自与靶核酸杂交的核酸探针的信号强度和来自与监测核酸杂交的监测核酸探针的信号强度，和
检查洗涤步骤是否正常进行；
其中所述监测核酸探针显示出与监测核酸杂交且随后在洗涤的最佳温度范围和该范围附近的改变的洗涤温度洗涤后信号强度的变化，
预先基于从已经与监测核酸杂交且随后在洗涤的最佳温度范围洗涤的监测核酸探针得到的信号强度，确定具有上下限的洗涤的最佳信号强度范围，且
所述检查步骤包含作出下述判断：当从与监测核酸杂交的监测核酸探针得到的信号强度是在洗涤的最佳信号强度范围内时，洗涤已经正常进行，和当所述信号强度是在洗涤的最佳信号强度范围外时，洗涤步骤中存在异常。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，当从与监测核酸杂交的监测核酸探针得到的信号强度高于洗涤的最佳信号强度范围的上限时，判断洗涤步骤中存在异常。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，当与监测核酸杂交后没有洗涤从监测核酸探针得到的信号强度假定为100时，在恒定盐浓度和恒定pH条件下，在不同的洗涤温度洗涤，监测核酸探针显示出每1℃13或更高的信号强度变化速率。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述信号强度变化速率是在恒定盐浓度和恒定pH条件下洗涤时，信号强度比相对于洗涤温度的函数的近似直线的倾斜度。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于，信号强度比相对于洗涤温度的函数的近似直线是在信号强度比达到50时的洗涤温度±2℃的范围内的4个点的信号强度形成的直线。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于，当与监测核酸杂交后没有洗涤从监测核酸探针得到的信号强度假定为100时，在恒定盐浓度和恒定pH条件下，在不同的洗涤温度洗涤，监测核酸探针显示出每1℃15或更高的信号强度变化速率。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于，所述信号强度变化速率是在恒定盐浓度和恒定pH条件下洗涤时，信号强度比相对于洗涤温度的函数的近似直线的倾斜度。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于，信号强度比相对于洗涤温度的函数的近似直线是在信号强度比达到50时的洗涤温度±2℃的范围内的4个点的信号强度形成的线。
9.根据权利要求1的方法，其特征在于，当与监测核酸杂交后没有洗涤从监测核酸探针得到的信号强度假定为100时，在恒定盐浓度和恒定pH条件下，在不同的洗涤温度洗涤，监测核酸探针显示出每1℃18或更高的信号强度变化速率。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述信号强度变化速率是在恒定盐浓度和恒定pH条件下洗涤时，信号强度比相对于洗涤温度的函数的近似直线的倾斜度。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于，信号强度比相对于洗涤温度的函数的近似直线是在信号强度比达到50时的洗涤温度±2℃的范围内的4个点形成的直线。
12.根据权利要求1的方法，其特征在于，基于使洗涤后来自非特异性杂种的信号强度与来自特异性杂种的信号强度彼此不同的温度，决定洗涤的最佳温度范围。
13.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述监测核酸是与靶核酸相同的核酸，用作监测核酸的序列不同于靶序列。
14.根据权利要求1的方法，其特征在于，监测核酸是不同于靶核酸的核酸。
15.根据权利要求1的方法，其特征在于，在洗涤的最佳温度范围的上限和下限之间的温度范围洗涤后，监测核酸探针显示出信号强度的变化。
16.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述监测核酸探针是至少2个探针的集合，一个探针通过在洗涤的最佳温度范围的上限和附近的温度洗涤，显示出信号强度的变化，另一个探针通过在洗涤的最佳温度范围的下限和附近的温度洗涤，显示出信号强度的显著变化。
17.根据权利要求1的方法，其特征在于，基于与监测核酸杂交且随后在恒定盐浓度和恒定pH条件下在洗涤的最佳温度范围内的改变的洗涤温度洗涤后来自监测核酸探针的信号强度，测定洗涤的最佳信号强度范围。
18.根据权利要求17的方法，其特征在于，在洗涤的最佳温度范围的上限洗涤后得到的信号强度是洗涤的最佳信号强度范围的下限，且在洗涤的最佳温度范围的下限洗涤后得到的信号强度是洗涤的最佳信号强度范围的上限。
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