CN112877460A - 转基因成分高通量筛查方法、检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转基因成分高通量筛查方法、检测试剂盒及其应用；所述方法为根据已商业化的转基因作物中外源插入基因的情况，针对外源基因选取10个能覆盖所有商业化转基因品系的片段作为筛选元件，通过生物信息学分析获得该10个筛选元件的保守序列，在微流体芯片的每个微孔预先包埋上针对检测靶标而设计的DNA引物对和对应的TaqMan探针，根据序列设计特异性引物和探针进行微流体芯片检测，根据扩增结果判断样品是否含有转基因成分，含有哪种作物的转基因成分，本申请所述方法的灵敏度试验达0.1％，且具备良好的特异性。本发明的试剂盒和检测方法为解决预包装及加工食品中转基因成分高通量筛查检测提供良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种转基因成分高通量筛查方法、检测试剂盒及其应用。
背景技术
近年来，随着转基因技术的飞速发展，转基因作物及其产品大量涌现。但是由于转基因作物及其产品对人体健康和生物多样性的影响未经过长期检验，所以一直以来其安全性都受到社会各界的关注。为了保护消费者对转基因产品的知情权、选择权和健康权，各国都建立了多种方法对转基因植物及其产品中的转基因特征分子进行检测，以期对转基因植物从源头到餐桌进行全程监控。欧盟规定食品中含有超过0.9％的转基因成分时，必须在标签上做出标识，澳大利亚和新西兰限量为1％，韩国为3％，日本和印度尼西亚为5％。我国于2002年发布《农业转基因生物标识管理办法》，规定用农业转基因生物或含有农业转基因生物成分的产品加工制成的产品，均应在产品标签上进行转基因成分的标注。
预包装食品和加工产品由于配料种类繁多、加工工艺复杂，对于转基因成分的筛查检测非常困难，即使检出含有转基因成分，也很难判断是哪种原材料含有转基因成分。由于各国对于转基因产品的标识有不同的要求，有些国家规定必须标明转基因成分的含量，并且各个国家对所标识转基因含量的要求不尽相同，为了解决贸易争端等问题，对预包装和加工食品中转基因成分进行定性、定量的高通量筛查检测成为关键。
目前，国内外均没有专门针对预包装和加工食品进行筛查检测的标准和方法。现行SN/T1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》是国内比较常用的，种类较为齐全的转基因产品实时荧光PCR检测方法。转基因食品及饲料欧盟参考实验室(COMMUNITY REFERENCE LABORATORY FOR GM FOOD AND FEED)则是针对不同的转基因作物品系有不同的实时荧光PCR检测方法。
转基因成分检测方法主要为实时荧光PCR方法和普通PCR方法。普通PCR方法由于操作繁琐，灵敏度低等不足已逐渐被实时荧光PCR检测方法所取代。但是单通道实时荧光PCR法检测成本较高，步骤繁琐，不适合于转基因产品的多品系筛查检测。预包装食品和加工产品由于配料种类繁多、加工工艺复杂，对于转基因成分的筛查检测非常困难，即使检出含有转基因成分，也很难判断是哪种原材料含有转基因成分。尤其对于业务量大的检测部门，需要研发一种简单快捷、灵敏准确同时又省时省力的高效方法。
PCR微流控芯片是利用MEMS(Micro-Electro-Mechanical System)技术和微流控技术制备的微流控芯片，是一种先进的体外核酸扩增技术。微流控芯片具有体积小、比表面积大、集成度高、反应速度快、传热快等特性。通过在硅、玻璃、塑料、高聚物等基片材料上加工出一系列的微通道、微反应室及各种微控制器，从而使PCR在芯片上能够快速扩增。与常规的PCR扩增技术相比，PCR微芯片具备高效、快速、消耗试剂少、易于携带、集成度高等优点，是近年来研究的热点之一，在分子生物学、疾病检测、生物技术、免疫学、基因组工程、临床医学及环境检测等各个领域都有很广泛的应用。
由于各国对于转基因产品的标识有不同的要求，有些国家规定必须标明转基因成分的含量，并且各个国家对所标识转基因含量的要求不尽相同，为了解决贸易争端等问题，攻克国际贸易壁垒，对预包装和加工食品中转基因成分进行定性、定量的高通量筛查检测必然成为关键的技术储备。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明提供了一种基于微流体芯片技术的食品中转基因成分高通量筛查检测研究。提供了一种可以覆盖所有商业化转基因品系的微流体芯片高通量筛查方法、检测试剂盒及其应用。
本发明第一方面提供了一种基于微流体芯片技术的食品中转基因成分高通量筛查方法，具体的，所述方法为根据已商业化转基因作物中外源插入基因的情况，针对外源基因选取6～15个，优选10个能覆盖所有商业化转基因品系的基因片段作为筛选元件，通过生物信息学分析获得该筛选元件的保守序列，根据序列设计特异性引物和探针进行微流体芯片检测，根据扩增结果判断样品是否含有转基因成分，含有哪种作物的转基因成分。
进一步地，所述微流体芯片的每个微孔预先包埋上针对检测靶标而设计的DNA引物对和对应的TaqMan探针；所述的DNA引物对和对应的TaqMan探针选自SEQ ID NO.1～60。进一步地，所述探针的荧光标记为所有探针5’端都为FAM荧光标记，3’端则采用MGB或者TAMRA荧光标记。
进一步地，所述微流体芯片的每个微孔预先包埋的方法是将60-100ng样品基因组DNA、2ⅹTaqMan Evironmental MasterMix 2.0 50μl和超纯水混合为100μl预混液后，将该溶液直接加入Taqman微流体芯片的加样孔中；将TaqMan微流体芯片在10000～12000rpm下离心，优选离心两次，每次离心1分钟；使PCR反应液均匀地分配到PCR反应腔中；封口后形成384个彼此独立的反应室。
进一步地，所述检测方法的反应条件为：48～50℃1.5～2min；93～95℃8～10min；93～95℃12～15sec，58～60℃0.8～1.2min，至少35个循环。进一步优选的所述检测方法的反应条件为：50℃2min；95℃10min；95℃15sec，60℃1min，40个循环。
本发明第二方面提供了一种用于食品中转基因成分高通量筛查方法的检测试剂盒，该试剂盒包括用于包埋微流体芯片的针对检测靶标而设计的DNA引物对和对应的TaqMan探针；所述的DNA引物对和对应的TaqMan探针选自SEQ ID NO.1～60。
进一步地，所述试剂盒中还含有如下PCR反应液：每100μl体系，有60-100ng阳性对照品、50μl的2×TaqMan Evironmental MasterMix 2.0、余量为超纯水；
进一步地，所述阳性对照品为转基因标准品购买自美国标准物质AOCS或欧洲标准物质ERM，包括：转基因油菜Topas19/2(AOCS0711-D4)、转基因油菜RF2(AOCS0711-C3)、转基因油菜Ms1(AOCS0711-A3)、转基因大豆A5547-127(AOCS 0707-C3)、转基因大豆A2704-12(AOCS 0707-B11)、转基因大豆MON87701(AOCS 0809-A)、转基因大豆CV127(AOCS 0911-D)、转基因大豆MON87769(AOCS 0809-B)、转基因大豆FG72(AOCS0610-A4)、转基因玉米GA21(AOCS0407-B)、转基因玉米87403(AOCS0216-A)、转基因水稻LL62(AOCS0306-I8)、转基因甜菜H7-1(AOCS1206-B)、非转基因油菜(AOCS0304-A2)、非转基因大豆(AOCS 0906-A)、非转基因玉米(AOCS0411-CD)等转基因标准物质购买自American Oil Chemists’Society(AOCS,Urbana,USA)，转基因大豆DP356043(ERM-BF425d)、转基因大豆DP305423(ERM BF426d)转基因油菜籽73496
(ERM-BF434e)、转基因玉米DAS40278-9(ERM-BF433d)、转基因马铃薯EH92-527-1(ERM-BF421B)等标准品购买自European Reference Materials(ERM)。
本发明第二方面提供了一种上文所述的检测试剂盒在筛查食品中转基因成分的应用，尤其是对预包装、加工食品、种子、饲料等样品中转基因成分高通量筛查。
进一步地，所述的食品为农作物或农作物产品。实施例中使用的12种样品收集自日常检验中获得的阳性样品。实验验证的为农作物样品，但试剂盒不仅限于农产品，包括预包装食品、加工产品、种子、饲料等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：在本申请的实施例中，以大豆及其加工产品、玉米及其加工产品、油菜及其加工产品、水稻及其加工产品、马铃薯及其加工产品等5个目前最为常见的转基因作物及其加工产品为研究对象，通过生物信息学分析获得该10个筛选元件的保守序列，根据序列设计特异性引物和探针进行微流体芯片检测，根据扩增结果判断样品是否含有转基因成分，含有哪种作物的转基因成分。最终确定，采用一系列不同浓度的阳性转基因标准品和非转基因标准品进行灵敏度试验，确定在检测样品DNA浓度稀释至0.1％时，仍可被稳定检出。采用阳性转基因标准品和非转基因标准品进行品系间交叉反应试验，验证引物和探针的特异性，最终确定本申请的微流控芯片具备良好的特异性，能够准确检测样品是否含有转基因成分。本方法普适性强、通量高、速度快、操作方法简便；Taqman微流控芯片方法与多重实时荧光定量PCR方法相比，操作简单，单孔单重扩增，避免样品间相互干扰；一次可同时对8个样品进行检测，每个样品可检测20个靶点基因；而20个靶点基因检测操作仅需加一次含有DNA模板的预混液即可完成，操作步骤极大简化；8个样品仅需5min完成上样，操作时间极大缩短。Taqman微流控芯片检测每个样品消耗试剂体积为100μL，而多重实时荧光定量PCR一般反应体积为25μL，一次最多也只能是检测2–3个靶点基因，总体的试剂消耗是TAC检测的2–2.5倍。本发明的试剂盒和检测方法为解决预包装及加工食品中转基因成分高通量筛查检测提供良好的应用前景。
附图说明
图1是TaqMan微流体芯片示意图。TaqMan微流体芯片Taqman array cards，TAC(Applied Biosystems，Foster City，CA)是一种384孔板结构的实时荧光定量PCR反应板。注塑而成的384孔板上分16列，每两列共享一个加样通道，每通道包含48个体积为1uL的空腔。每个微孔预先包埋上针对检测靶标而设计的DNA引物对和对应的TaqMan探针。
图2是设计TAC微流体芯片上每个微孔预先包埋的不同种类的引物对和探针，其中，图2A为包埋顺序示意图，图2B为TAC微流体芯片整体。
图3是转基因油菜Topas19/2的检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明中，除非另有其他明确说明，否则百分比、百分含量均以质量计。如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。其中，实施例所使用的转基因标准品购买自美国标准物质AOCS或欧洲标准物质ERM，包括：购买自American Oil Chemists’Society(Urbana，USA)的转基因油菜Topas19/2(AOCS0711-D4)、转基因油菜RF2(AOCS0711-C3)、转基因大豆A5547-127(AOCS 0707-C3)、转基因大豆A2704-12(AOCS 0707-B11)、转基因大豆MON87701(AOCS 0809-A)、转基因大豆CV127(AOCS 0911-D)、转基因大豆MON87769(AOCS 0809-B)、转基因大豆FG72(AOCS 0610-A4)、转基因大米LL62(AOCS 0306-I)、非转基因油菜(AOCS 0304-A2)、非转基因大豆(AOCS 0906-A)、非转基因玉米(AOCS0411-CD)等转基因标准物质；购买自European Reference Materials(ERM)的转基因玉米59122(ERM-BF424d)、转基因大豆DP356043(ERM-BF425d)、转基因大豆DP305423(ERM BF426d)，转基因马铃薯AM04-1020(IRMM，BF430e)、转基因马铃薯EH92-527-1(IRMM，BF421b)等标准品。12种饲料样品收集自日常检验中获得的阳性样品。
实施例1
模板DNA的提取
实验材料放入液氮中研磨。采用TaKaRa公司的DNA extraction kit ofgenetically modified organism(GMO)detection Ver2.0(No.D9093；TaKaRa，Dalian，China)试剂盒进行基因组DNA的提取。提取的基因组DNA溶于100μL Tris-EDTA(TE)溶液中。纯化后的DNA样品用紫外分光光度计(ND-1000；NanoDrop，Wilmington，DE)测定浓度。
TAC微流体芯片设计
每个微孔预先包埋上针对检测靶标而设计的DNA引物对和对应的TaqMan探针，如表1。实验中所用的所有探针为FAM或VIC荧光标记。卡片设计为同时检测7个样品和一个阴性对照样品，或者6个样品和一个阴性对照样品和一个阳性对照样品。Taqman微流控芯片(Taqman array cards，TAC)可以同时运行384个实时荧光定量PCR反应，孔板上分16列，每两列共享一个加样通道，每通道包含48个体积为1μL的反应孔，组成一个反应孔区。芯片由8个构造相同的反应孔区组成，可同时运行8个样本。每个微孔预先包埋上针对检测靶标设计的DNA引物对和Taqman探针，实验中所用的所有探针5’端都为FAM荧光标记，3’端则采用MGB或者TAMRA荧光标记。所有检测项目和引物探针序列见表1。
表1 DNA引物对和对应的TaqMan探针
对于表1所给出的引物对和探针，针对不同靶标序列的使用原则，也就是如何设计TAC微流体芯片上每个微孔预先包埋哪些引物对和探针，如图2，具体如下：
其中，图2A为TAC微流体芯片上第一列微孔中，每个微孔预先包埋的引物对或探针的示意图；其中未作标记的微孔为未做包埋。
图2B为TAC微流体芯片上第1-8列微孔，均按照图2A的顺序包埋后，形成TAC微流体芯片板。
T-E9基因终止子国标序列、NOS终止子国标序列、35s启动子国标序列、PAT基因国标序列、PINII基因国标序列、RbcS4基因国标序列、35s终止子国标序列、40278国标序列(转基因玉米)、305423国标序列(转基因大豆)、CV127国标序列(转基因大豆)、ZSSIIb行标序列(玉米)、Adh1国标序列(玉米)、LECTIN行(国)标序列(大豆)、CruA行标序列(油菜)、PEP国标序列(油菜)、SPS行标序列(水稻)、PLD国标序列(水稻)、通用18sRNA(通用)、甜菜行(国)标序列(甜菜)、马铃薯行(国)标序列(马铃薯)。
TAC微流体芯片的工作流程
将60-100ng样品基因组DNA、2ⅹTaqMan Evironmental MasterMix 2.0 50μl和超纯水混合为100μl预混液后，将该溶液直接加入Taqman微流体芯片的加样孔中。将TaqMan微流体芯片放入Applied Biosystems 7900HT real-time PCR专用的离心适配器中，在331g(12000rpm)的吊桶式转头下离心两次，每次1分钟。使PCR反应液均匀地分配到384个PCR反应腔中。把待封口的芯片按照指定朝向放入封口器，将芯片上各反应腔体的通路封闭，形成384个彼此独立的反应室。反应按照以下条件进行：50℃2min；95℃10min；95℃15sec，60℃1min，40个循环。
TAC微流体芯片检测的特异性
采用阳性转基因标准品和非转基因标准品进行品系间交叉反应试验，验证引物和探针的特异性。引物、探针序列采用欧盟CRL检测方法中的引物探针和本研究中设计改良的引物探针进行比较，选取最优化的引物和探针序列，具体优化是指在应用Taqman微流控芯片进行检测的时候，也不能简单地把实时荧光PCR反应的引物和探针直接结合到反应板上，而是需要对大部分引物和探针进行调整，通常需调整它们的长度以适应在卡板上的通用情况。本文所使用的引物和探针便是结合Taqman微流控芯片的实际扩增条件，基于转基因作物筛查鉴定引物和探针序列进行重新调整设计而成。如表1所示。
采用转基因油菜Topas19/2、转基因油菜RF2、转基因大豆A5547-127、转基因大豆A2704-12、转基因大豆MON87701、转基因大豆CV127、转基因大豆FG72、转基因玉米59122、非转基因油菜、非转基因大豆、非转基因玉米、转基因大豆DP356043、转基因大豆DP305423等13种转基因标准品进行品系间交叉反应试验，验证引物的特异性。就Ct值而言，当检测样品呈指数形式扩增且荧光信号在阈值之上则可判定为扩增阳性。除此之外，其他的结果可判断为扩增阴性。
以转基因油菜Topas19/2的检测为例，检测结果如图3所示，以上述检测流程及方法检测转基因油菜Topas19/2(AOCS0711-D4)阳性标准品和已知转基因油菜Topas19/2检测样品进行试验，验证引物的特异性。检测结果显示，转基因油菜Topas19/2(AOCS0711-D4)阳性标准品18S内源基因，CruA内源基因、PEP内源基因阳性，35S终止子，Pat基因结果阳性。18S内源基因，说明样品DNA符合检测标准，CruA内源基因、PEP内源基因阳性说明含有油菜成分，35S终止子和Pat基因阳性说明检出样品中含有特定的转基因元件。说明本申请的微流控芯片具备良好的特异性，能够准确检测样品是否含有转基因成分。
使用相同的方法分别验证本申请其他引物对，具体检测结果如下表2-1和表2-2所示。
表2-1微流体芯片检测的特异性检测结果
表2-2微流体芯片检测的特异性检测结果
通过上表的检测结果分析，使用实时荧光PCR方法分别验证本申请其他引物对，结果与上述实验结果相似，均是能够对相应转基因品种检测出阳性结果，而对其他类型转基因样品为阴性。说明本申请的微流控芯片具备良好的特异性，能够准确检测样品是否含有转基因成分。
TAC微流体芯片检测的灵敏度
采用一系列不同浓度的阳性转基因标准品和非转基因标准品进行灵敏度试验，确定TAC流体芯片最低检测浓度。
采用转基因油菜RF2(AOCS0711-C3)、转基因大豆CV127(AOCS 0911-D)、转基因大豆MON87701(AOCS 0809-A)、转基因大豆FG72(AOCS 0610-A4)等4种标准品精提DNA(100％，100ng/μl)分别用非转基因油菜(AOCS 0304-A2)DNA和非转基因大豆(AOCS 0906-A)DNA分别稀释到1％，0.5％，0.1％，0.05％、0.01％几个梯度，将转基因大豆DP305423(ERMBF426d，10％浓度)、转基因玉米59122(ERM-BF424d，10％浓度)用ddH2O分别稀释到1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％几个梯度，每个稀释度分别取12μl进行微流控芯片实验，按照设定程序进行反应，以确定检测的灵敏度。所有试验重复三次，结果中所有Ct值均为所有重复试验的平均值。由灵敏度试验数据可知，在检测样品DNA浓度稀释至0.1％时，仍可被稳定检出。确定该检测芯片的最低灵敏度为0.1％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
序列表
<110> 大连海关技术中心
<120> 转基因成分高通量筛查方法、检测试剂盒及其应用
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
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<212> DNA
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<213> 上游引物(无)
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cttgaaccgc tggaataatg c 21
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 32
agataacgat aagattcatg gaa 23
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 9
ggggtttctt atatgctcaa cacatg 26
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 33
tcaccagtct ctctctacaa atctatcac 29
<210> 47
<211> 35
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 47
aaaccctata agaaccctaa ttcccttatc tggga 35
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 10
cacgaaccat tgagttacaa tc 22
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 34
tggttcattg tattctggct ttg 23
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 48
cgtagctaac cttcattgta ttccg 25
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 11
gagatgtcat cacacaactc tgacttag 28
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 35
ttctcgttat cttttgccac ttttac 26
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 49
agcttggtac taacatacga aa 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 12
ttattgggcc tacccattcg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 36
tcccatgccc atcaaagaag 20
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 50
agctcggatc gtgtactg 18
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 13
ttgacatctg ctccgaagca 20
<210> 37
<211> 17
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 37
tgctgccccc actcgtt 17
<210> 51
<211> 15
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 51
ctgcaatgca aaacg 15
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 14
cgtttcccat ctcttcctcc tt 22
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 38
cctgtgagga gcgagaaaat g 21
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 52
agctaccact atataaatc 19
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 15
caactcaata aggttgacga aaacg 25
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 39
agggcgcgac caagaga 17
<210> 53
<211> 14
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 53
caccccaaaa ccct 14
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 16
ggccagggtt tccgtgat 18
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 40
atggtgtccc cagtccttat gt 22
<210> 54
<211> 14
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 54
tgcaccagaa agtg 14
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 17
gaagctcgac atccgtcaag a 21
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 41
gcgtgatcgc gtctaaaaca 20
<210> 55
<211> 16
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 55
tccgaccgtc acaccg 16
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 18
cacctttctc gcaccaattg aca 23
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 42
tcaaactcaa cagcgacgac 20
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 56
tccgagccgt ccgtgcgtc 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 19
tggtgagcgt tttgcagtct 20
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 43
ctgatccact agcaggaggt cc 22
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 57
tgttgtgctg ccaatgtggc ctg 23
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 20
gtgacggaga attagggttc ga 22
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 44
cttggatgtg gtagccgttt c 21
<210> 58
<211> 15
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 58
cggagaggga gcctg 15
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 21
ggaagccaaa agggatcaat t 21
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 45
cagtcttgag agcggcacat ac 22
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 59
agtgctctac gaagttta 18
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 上游引物(无)
<400> 22
ggacatgtga agagacggag c 21
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 下游引物(无)
<400> 46
cctacctcta cccctccgc 19
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> 探针(无)
<400> 60
ctaccaccat tacctcgcac ctcctca 27
Claims (9)
1.一种转基因成分高通量筛查方法，其特征在于，针对外源基因选取6～15个能覆盖所有商业化转基因品系的基因片段作为筛选元件，通过生物信息学分析获得该筛选元件的保守序列，根据序列设计特异性引物和探针进行微流体芯片检测，根据扩增结果判断样品是否含有转基因成分，含有哪种作物的转基因成分，所述微流体芯片的每个微孔预先包埋上针对检测靶标而设计的DNA引物对和对应的TaqMan探针；所述的DNA引物对和对应的TaqMan探针选自SEQ ID NO.1～60。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针的荧光标记为所有探针5’端都为FAM荧光标记，3’端则采用MGB或者TAMRA荧光标记。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流体芯片的每个微孔预先包埋的方法是将60-100ng样品基因组DNA、2×TaqMan Evironmental MasterMix 2.0 50μl和超纯水混合为100μl预混液后，将该溶液直接加入Taqman微流体芯片的加样孔中；将TaqMan微流体芯片在10000～12000rpm下离心；使PCR反应液均匀地分配到PCR反应腔中；封口后形成彼此独立的反应室。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测方法的反应条件为：48～50℃1.5～2min；93～95℃8～10min；93～95℃12～15sec，58～60℃0.8～1.2min，至少35个循环。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述检测方法的反应条件为：50℃2min；95℃10min；95℃15sec，60℃1min，40个循环。
6.一种转基因成分高通量筛查检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于权利要求1所述方法，其包括用于包埋微流体芯片的针对检测靶标而设计的DNA引物对和对应的TaqMan探针；所述的DNA引物对和对应的TaqMan探针选自SEQ ID NO.1～60。
7.根据权利要求6所述的转基因成分高通量筛查检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有如下PCR反应液：每100μl体系，有60-100ng阳性对照品、50μl的2×TaqManEvironmental MasterMix 2.0、余量为超纯水。
8.根据权利要求6所述的转基因成分高通量筛查检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为转基因标准品购买自美国标准物质AOCS或欧洲标准物质ERM。
9.如权利要求6所述的转基因成分高通量筛查检测试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒对预包装、加工食品、种子、饲料等样品中转基因成分高通量筛查。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202110201371.6A CN112877460A (zh) | 2021-02-23 | 2021-02-23 | 转基因成分高通量筛查方法、检测试剂盒及其应用 |
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| CN202110201371.6A CN112877460A (zh) | 2021-02-23 | 2021-02-23 | 转基因成分高通量筛查方法、检测试剂盒及其应用 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114657276A (zh) * | 2022-03-04 | 2022-06-24 | 江汉大学 | 检测水稻转基因品系的引物对组合、试剂盒及检测方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101812512A (zh) * | 2009-12-23 | 2010-08-25 | 中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 | 一种检测转基因食品的复合基因芯片 |
| CN104561366A (zh) * | 2015-02-06 | 2015-04-29 | 曹际娟 | 利用微流体芯片高通量检测转基因玉米的方法 |
| CN108103220A (zh) * | 2016-12-30 | 2018-06-01 | 华智水稻生物技术有限公司 | 一种高通量的转基因元件筛选检测的方法 |
| CN110373488A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-10-25 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种检测转基因成分的dna标准样品及其应用 |
| CN110408716A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-11-05 | 中国检验检疫科学研究院 | 含有多种内标准基因特异片段的dna标准样品及其应用 |
-
2021
- 2021-02-23 CN CN202110201371.6A patent/CN112877460A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101812512A (zh) * | 2009-12-23 | 2010-08-25 | 中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 | 一种检测转基因食品的复合基因芯片 |
| CN104561366A (zh) * | 2015-02-06 | 2015-04-29 | 曹际娟 | 利用微流体芯片高通量检测转基因玉米的方法 |
| CN108103220A (zh) * | 2016-12-30 | 2018-06-01 | 华智水稻生物技术有限公司 | 一种高通量的转基因元件筛选检测的方法 |
| CN110373488A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-10-25 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种检测转基因成分的dna标准样品及其应用 |
| CN110408716A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-11-05 | 中国检验检疫科学研究院 | 含有多种内标准基因特异片段的dna标准样品及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局: "植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR 定性检验方法", 《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1204—2016》, 28 June 2016 (2016-06-28), pages 3 * |
| 国家市场管理总局国家标准化管理委员会发布: "转基因产品通用检测方法", 《中华人民共和国国家标准GB/T 38505-2020》, 6 March 2020 (2020-03-06), pages 1 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114657276A (zh) * | 2022-03-04 | 2022-06-24 | 江汉大学 | 检测水稻转基因品系的引物对组合、试剂盒及检测方法 |
| CN114657276B (zh) * | 2022-03-04 | 2023-07-07 | 江汉大学 | 检测水稻转基因品系的引物对组合、试剂盒及检测方法 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |