KR101378214B1

KR101378214B1 - 검체 해석 방법 및 그것에 사용하는 분석 키트

Info

Publication number: KR101378214B1
Application number: KR1020117031345A
Authority: KR
Inventors: 나오꼬 나까무라; 고지 하시모또; 노부히로 겜마
Original assignee: 가부시끼가이샤 도시바
Priority date: 2009-06-29
Filing date: 2009-06-29
Publication date: 2014-03-27
Also published as: JP4528885B1; US8673595B2; WO2011001496A1; KR20120024873A; JPWO2011001496A1; CN102459630A; US20120171673A1; CN102459630B

Abstract

본 발명은 복수의 검체를 검체마다 다른 서열을 갖는 태그 서열을 포함하는 제1 프라이머와 그것과 쌍으로 사용되는 제2 프라이머를 사용하여 검체마다 독립된 반응계에 있어서 증폭시키고, 복수의 상기 반응계에 있어서 얻어진 태그 서열이 도입된 증폭 산물을 혼합하고, 혼합된 증폭 산물과 기체에 고정화된 핵산 프로브를 반응시켜, 발생한 하이브리다이제이션량을 검출함으로써 복수 검체를 해석하는 방법을 제공한다.

Description

검체 해석 방법 및 그것에 사용하는 분석 키트 {SAMPLE ANALYSIS METHOD AND ASSAY KIT FOR USE IN THE METHOD}

본 발명은 핵산의 해석 방법에 관한 것이다.

DNA칩은 수cm의 각 슬라이드 글래스나 실리콘 기판에 10 내지 10⁵종류의 DNA 핵산쇄가 프로브로서 고정화된 디바이스이다. DNA칩을 사용하여 검체가 해석되는 경우, 우선, 포함되는 핵산을 형광 색소나 방사성 동위 원소 등에 의해 표지하고, 이어서 칩 상의 프로브와 반응시킨다. 검체 중의 핵산이 칩 상의 프로브에 상보적인 핵산을 포함시키면 하이브리다이제이션이 발생한다. 칩 상에 고정된 프로브는 그 서열과 고정 위치가 명확하다. 따라서, 표지 유래의 신호가 얻어지는 칩 상의 위치를 특정함으로써 검체 중에 포함되는 핵산의 서열을 결정할 수 있다(비특허문헌 1). DNA칩은 1시료에 대하여 한번에 많은 유전자를 해석하기 때문에 매우 유용한 디바이스(검사 기구)이다. 통상은 1시료에 대하여 1칩이 사용된다. 2시료의 발현량의 차를 보이는 경우에는 2시료에 대하여 1칩으로 사용된다.

한편, 예를 들어 감염증의 분야 등에서는 조사하는 유전자의 수는 소수이지만, 검체수가 많은 경우가 있다. 그러나, 종래에는 검체수에 따라 다수의 칩을 사용할 필요가 있기 때문에 칩, 수고, 시간을 포함시킨 검사 비용이 높게 되어 있다.

Pease et al. Proc Natl Acac Sci U S A. 1994, 91, 5022-5026

상기의 정황을 감안하여, 본 발명은 1검체당의 검사 비용을 낮추고, 신속하면서 간편하게 복수의 검체를 해석하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

복수 검체의 해석 방법이며,

(a) 상기 검체마다 다른 서열을 갖는 태그 서열을 포함하는 제1 프라이머와, 상기 제1 프라이머와 쌍으로 사용되는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 검체마다 준비하는 공정(여기서, 상기 태그 서열은 상기 제1 프라이머가 상기 검체마다의 주형 핵산 중의 주형 서열에 하이브리다이즈하였을 때에 루프 아웃하도록 설계되어 있음)과;

(b) 상기 검체마다 독립된 반응계에서, 상기 검체마다 대응하는 상기 프라이머 세트를 사용하여 상기 검체마다의 주형 핵산을 증폭하고, 상기 태그 서열이 도입된 증폭 산물을 얻는 공정과;

(c) 상기 검체마다 얻어진 상기 증폭 산물을 하나로 혼합하는 공정과;

(d) 상기 당해 태그 서열을 포함하는 표적 서열을 검출하는 서열을 갖고, 기체 상에 고정화된 핵산 프로브와, 공정 (c)에서 혼합된 상기 증폭 산물을 반응시키는 공정과;

(e) 공정 (d)에 있어서 발생한 하이브리다이제이션량을 검출함으로써, 각 검체에 대하여 상기 표적 핵산의 유무 및/또는 양을 검출하는 공정을 구비하는 해석 방법이다.

본 발명의 방법에 의해 복수 검체를 1칩으로 검사할 수 있기 때문에, 1검체당의 검사 비용을 낮추고, 신속하면서 간편하게 복수의 검체를 해석하는 방법이 제공된다.

도 1은 태그 서열 도입 프라이머와 핵산 프로브를 도시하는 도면.
도 2는 증폭 공정을 도시하는 공정도.
도 3은 검출 공정을 도시하는 도면.
도 4는 증폭 공정을 도시하는 공정도.
도 5는 프라이머를 도시하는 도면.
도 6은 LAMP 증폭의 중간 산물을 도시하는 도면.
도 7은 증폭 공정을 도시하는 공정도.
도 8은 검출 공정을 도시하는 도면.
도 9는 프라이머를 도시하는 도면.
도 10은 증폭 공정을 도시하는 공정도.
도 11은 DNA칩의 평면도.
도 12는 DNA칩의 평면도.
도 13은 제한 효소 처리에 의해 증폭 산물을 절단한 결과를 나타내는 도면.
도 14a는 복수 검체를 검출한 결과를 나타내는 도면.
도 14b는 복수 검체를 검출한 결과를 나타내는 도면.
도 14c는 복수 검체를 검출한 결과를 나타내는 도면.

[정의]

본 명세서에서 사용되는 「핵산」이라고 하는 용어는 DNA, RNA, PNA, LNA, S-올리고, 메틸포스포네이트 올리고 등, 그 일부의 구조를 염기 서열에 의해 표현하는 것이 가능한 물질을 총괄적으로 나타내는 것이다.

「검체」란, 본 발명에 따르는 해석 방법을 행해야 할 대상이며, 핵산을 포함할 가능성이 있는 시료이면 된다. 검체는 증폭 반응 및/또는 하이브리다이제이션 반응을 방해하지 않는 상태인 것이 바람직하다. 예를 들어, 생체 등으로부터 얻어진 재료를 본 발명에 따르는 검체로서 사용하기 위해서는, 그 자체가 공지된 어느 수단에 의해 전처리를 행하면 된다. 예를 들어, 검체는 액체이어도 되며, 그 경우 「피검액」으로 칭하여도 된다. 따라서, 「피검액」이란, 핵산 또는 주형 핵산이 존재할 가능성이 있는 용액이라고 해석되어도 된다.

「다검체(multiple samples)」 및 「복수 검체(plural samples)」의 단어는 2 또는 2 이상의 검체를 나타내며, 교환 가능하게 사용하는 것이 가능하다.

검체에 포함되는 핵산을 「검체 핵산」이라고 칭한다. 검체 핵산 중, 본 발명에 따르는 프라이머에 의해 증폭하고자 하는 서열을 「주형 서열」이라고 칭한다. 주형 서열을 포함하는 핵산을 「주형 핵산」 또는 「주형」이라고 칭한다. 주형 핵산에 포함되는 일부분의 서열을 「부분 핵산 서열」이라고 칭한다. 부분 핵산 서열은 해석하고자 하는 서열 또는 염기이며, 본 발명에 따르는 프라이머는 부분 핵산 서열을 포함하는 영역을 증폭하도록 설계된다. 부분 핵산 서열은 주형 서열과 동등하여도 되고, 주형 서열에 포함되어도 된다.

「표적 핵산」이란, 주형 핵산 또는 주형 서열을 본 발명에 따르는 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 사용하여 증폭하여 얻어진 증폭 산물을 말한다. 표적 핵산은 그 일부에 표적 서열을 포함한다.

「표적 서열」이란, 태그 서열과 주형 서열의 일부의 서열로 이루어진다. 당해 표적 서열은 핵산 프로브를 사용하여 표적 핵산을 검출하기 위하여 이용된다.

「핵산 프로브」란, 표적 서열과 상보적인 서열을 포함하는 핵산이다. 핵산 프로브는 기체 등의 고상 상에 고정화되어 사용되며, 주형 서열로부터 유래하는 영역을 포함하는 증폭 산물과 하이브리드를 형성한다.

「주형 서열 유래의 영역」이란, 프라이머에 의해 증폭되는 영역 중 프라이머가 결합하는 영역 이외의 영역에서 주형의 서열이 반영되는 영역을 의미한다. 유전자 다형 또는 유전자 변이를 검출하는 경우에는, 그들 부위가 이 영역 내에 들어가도록 설계된다.

「DNA칩」이란, 검출하고자 하는 핵산에 상보적인 서열을 갖는 핵산 프로브와, 검출 대상의 핵산의 사이의 하이브리다이제이션 반응을 이용하여 핵산을 해석하는 장치이다. DNA칩의 단어는 일반적으로 사용되는 「핵산 칩」, 「마이크로 어레이」 및 「DNA 어레이」등의 용어와 동일하며, 서로 교환 가능하게 사용된다.

「다검체를 해석하는」이란, 복수의 검체를 동시에 해석하는 것을 말한다. 「검체 중의 복수의 핵산 서열을 해석하는」이란, 1검체 중에 포함되는 복수의 부분 핵산 서열을 동시에 해석하는 것을 말한다. 동시에 해석되는 복수의 부분 핵산 서열은 1개의 주형 핵산에 포함되어 있어도 되고, 검체에 포함되는 다른 종류의 검체 핵산에 각각 포함되어도 된다.

또한, 해석되는 항목은, 예를 들어 바이러스 및/또는 세균 등으로부터 유래하는 유전자 등의 특정한 핵산의 검출, 유전자 발현량의 측정, 다형에 대한 유전자형의 동정 및/또는 변이의 유무 검출 등이어도 된다. 이것에 한정되는 것이 아니다.

[실시 양태]

이하, 본 발명의 실시 형태에 대하여 설명한다.

도 1은 태그 서열 도입 프라이머와 핵산 프로브를 도시하는 도면이다.

<프라이머>

도 1의 태그 도입 F 프라이머에 예시된 바와 같이, 프라이머에는 주형 핵산의 프라이머 결합 부위에 결합하는 서열과, 다검체를 해석하기 위한 태그 서열을 도입한다.

태그 서열은 검체마다 별개의 서열을 사용한다. 예를 들어, 5염기의 태그 서열을 준비하는 경우이면서 A, T, C, G의 4염기로 구성하는 경우에는 4⁵로 되어 1024 종류의 태그 서열이 후보로 된다. 그러나, 1염기 차이의 태그 서열을 사용한 경우에는 미스매치 하이브리다이제이션의 위험성이 높기 때문에, 바람직하게는 2염기 이상 서열이 다른 태그 서열을 준비한다. 준비하는 태그 서열의 수는 한번에 해석하고자 하는 검체군을 구성하고 있는 검체의 수만큼 준비하면 된다. 그에 의해 검체군을 구성하는 모든 검체를 식별하는 것이 가능하다.

태그 서열은 그것을 포함하는 프라이머가 주형 핵산에 결합하였을 때에, 태그 서열 부분은 주형 핵산에는 결합하지 않고 루프 아웃하도록 설계된다. 태그 서열의 길이는 루프 아웃하는 것이 가능하고, 또한 그것을 포함하는 프라이머가 주형 핵산을 증폭할 수 있는 범위 내이면 된다. 이것에 한정되는 것은 아니지만, 20염기 이하, 바람직하게는 10염기 이하이면 된다. 예를 들어, 1 내지 20염기, 2 내지 20염기, 1 내지 10염기, 2 내지 10염기이면 된다.

프라이머의 길이는 13 내지 40염기, 예를 들어 15 내지 30염기이어도 된다.

상기 태그 서열의 프라이머에의 삽입 장소에 대해서는 프라이머의 3' 말단으로부터 1염기 이상의 장소이면 되지만, 프라이머는 태그 서열 부분이 루프 아웃하여 주형에 결합할 필요가 있기 때문에, 프라이머의 3' 말단으로부터 3염기 이상의 장소인 것이 바람직하다. 또한, 도 1에 도시한 바와 같이 변이나 1염기 다형 등의 다형을 검출하는 경우, 핵산 프로브는 태그 서열과 주형 서열 유래의 서열의 양쪽을 포함할 필요가 있다. 이 경우, 삽입 부위를 5' 말단측에 위치시키면 프로브가 길어져 특이성이 저하하게 된다. 이것으로부터 삽입 부위는 프라이머가 루프 아웃하여 증폭할 수 있는 범위이면 3' 말단측에 가까운 쪽이 바람직하고, 3' 말단측으로부터 25염기 이내, 보다 바람직하게는 15염기 이내이다.

증폭법으로서 PCR을 이용하는 경우에는, 사용하는 태그 서열을 도입한 프라이머는 Forward 프라이머(F 프라이머) 또는 Reverse 프라이머(R 프라이머) 중 어느 것이어도 되며, 필요하면 양쪽 프라이머에 태그 서열을 도입하여도 된다.

증폭법으로서 LAMP법을 이용하는 경우에는 F2 영역 및/또는 B2 영역에 상기 태그 서열을 도입한 프라이머를 준비한다.

태그 서열을 구성하는 핵산의 종류는 DNA, RNA, PNA, LNA, S-올리고, 메틸포스포네이트 올리고 등, 그 일부의 구조를 염기 서열에 의해 표현하는 것이 가능한 물질이면 특별히 한정되지 않는다.

<핵산 프로브>

핵산 프로브는 표적 핵산 중에 포함되는 태그 서열을 검출하기 위하여, 태그 서열에 상보적인 서열을 포함하도록 설계된다. 또한, 필요에 따라 도 1에 도시한 바와 같이 주형 서열 유래의 영역과 상보적인 서열을 포함하도록 설계된다.

예를 들어, 검체 중의 핵산의 유전자 변이 및/또는 다형을 검출하는 경우에, 유전자 변이 및/또는 유전자 다형 부위를 프라이머 결합 부위 근방의 상기 주형 서열 유래의 영역에 위치시킨다. 그리고, 태그 서열 검출용의 서열과, 유전자 변이 및/또는 다형 검출용의 서열을 갖는 야생형 검출용의 핵산 프로브, 변이형 검출용의 핵산 프로브를 각각 사용하여 야생형 검출용의 핵산 프로브와 표적 핵산, 변이형 검출용의 핵산 프로브와 표적 핵산의 하이브리다이제이션량을 비교함으로써 검체의 유전자형을 판정할 수 있다.

또한, 세균의 동일한 속으로 분류되어 있는 복수의 종을 동정하는 경우에, 예를 들어 속 공통으로 증폭하는 상기 태그 도입 프라이머를 검체마다 준비하여 증폭을 행한다. 이때, 각각의 종에 특징적이고 다른 종과 특이성을 낼 수 있는 영역을 프라이머 결합 부위 근방의 상기 주형 서열 유래의 영역에 위치시킨다. 그리고, 태그 서열 검출용의 서열과, 각각의 종에 특징적인 서열을 갖는 종 동정용의 핵산 프로브와 표적 핵산, 종과 무관계의 서열을 나타내는 네가티브 컨트롤용 핵산 프로브와 표적 핵산의 하이브리다이제이션량을 비교함으로써 종의 동정을 행할 수 있다.

해석을 위한 지표로서 검체 중의 핵산의 증폭 유무를 검출하는 경우에는 반드시 주형 서열 유래의 영역과 상보적인 서열을 포함할 필요는 없지만, 포함되어도 된다.

본 발명에 따르는 핵산 프로브의 쇄 길이는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 5 내지 50염기의 범위가 바람직하고, 10 내지 40염기의 범위가 보다 바람직하고, 15 내지 35염기의 범위가 더욱 바람직하다.

또한, 핵산 프로브는 기체에 고정화시키기 위하여 아미노기, 카르복실기, 히드로실기, 티올기, 술폰기 등의 반응성 관능기, 아비딘, 비오틴 등의 물질로 수식된 것이어도 된다. 관능기와 뉴클레오티드의 사이에 스페이서를 도입하는 것도 가능하다. 스페이서에는 예를 들어 알칸 골격, 에틸렌글리콜 골격 등을 사용하여도 된다.

핵산 프로브를 고정화하기 위한 고상은, 일반적으로 DNA칩을 위한 고상으로서 사용되는 어느 하나의 기체이면 된다. 그러한 기체는 유리, 실리콘, 니트로셀룰로오스막, 나일론막, 마이크로타이타 플레이트, 전극, 자석, 비즈, 플라스틱, 라텍스, 합성 수지, 천연 수지, 또는 광 파이버 등에 의해 구성되어도 되지만, 이것들에 한정되지 않는다. 이들 기체 상에 복수종의 핵산 프로브를 고정화하여 DNA칩을 구성하면 된다.

<방법>

다음에 태그 서열을 도입한 프라이머와 DNA칩을 사용한 다검체의 해석 방법에 대하여 설명한다.

도 2에 도시한 바와 같이, 우선, 검체(검체 1, 검체 2, 검체 3)마다 서열이 다른 태그 서열(태그 서열 1, 태그 서열 2, 태그 서열 3)을 도입한 프라이머(검체 1용 프라이머, 검체 2용 프라이머, 검체 3용 프라이머)를 준비하고, 검체마다 독립된 반응계에 있어서 증폭을 행한다. 검체마다 독립된 반응계란, 각 검체가 서로 섞이지 않는 반응계이면 된다. 예를 들어, 검체마다 다른 튜브에서 증폭을 행하면 된다. 「반응계」란, 거기에 있어서 반응이 행하여지는 공간을 말하며, 예를 들어 튜브 및 웰 등의 용기이면 된다.

증폭 후, 검체마다 일부 서열이 다른 증폭 산물이 얻어진다. 주형 핵산이 존재하지 않는 경우(검체 2)에는 증폭은 일어나지 않고, 증폭 산물은 얻어지지 않는다. 각 반응계에 있어서 얻어진 증폭 산물은 검체마다 다른 태그 서열과 주형 핵산 유래의 영역을 포함한다(검체 1, 검체 3). 따라서, 증폭 산물에 포함되는 태그 서열을 동정함으로써 검체를 특정하는 것이 가능하다.

이 증폭 산물을 혼합하여, 도 3에 도시한 바와 같이 기체 상에 고정화한 각 태그 서열에 상보적인 서열을 포함하는 핵산 프로브와 하이브리다이제이션시킨다. 그 후, 증폭 산물과 핵산 프로브의 하이브리다이제이션을 적당한 검출법에 의해 검출한다.

도 2 및 도 3에서는 3검체에서의 예를 나타내었지만, 검체수에 대해서는 이것에 한정되지 않는 것은 명확하다. 또한, 도 1에서 도시한 바와 같이, 증폭 산물의 주형 서열 유래의 영역에 변이나 다형 부위가 위치하도록 프라이머를 설계하면, 태그 서열과 이들 변이 및/또는 다형을 검출 또는 동정하는 서열을 갖는 주형 서열로부터 유래하는 서열을 포함하는 핵산 프로브를 사용함으로써 변이 및/또는 다형의 해석을 행할 수 있다.

또한, 도 4에 도시한 바와 같이, 1개의 반응계 내에서 서열이 다른 복수의 주형 서열을 멀티 증폭하는 것도 가능하다. 증폭 후, 검체의 증폭 산물에 대하여 DNA칩 검출을 행하면, 복수의 주형 서열의 검출이 가능하게 된다. 검출은 기체 상에 고정화한 각 태그 서열에 상보적인 서열을 포함하는 핵산 프로브와 하이브리다이제이션시킨다. 그 후, 증폭 산물과 핵산 프로브의 하이브리다이제이션을 적당한 검출법에 의해 검출한다. 도 4에서는 3개의 주형 서열의 예를 나타내었지만, 주형 핵산의 수는 이것에 한정되지 않는 것은 명확하다. 또한, 증폭 산물의 주형 서열 유래의 영역에 변이나 다형 및/또는 동정하고자 하는 생물종에 특징적이고 다른 생물종과 특이성을 낼 수 있는 부위가 위치하도록 프라이머를 설계하면, 태그 서열과, 이것들의 변이, 다형 및/또는 생물종에 특징적인 부위를 검출 또는 동정하는 서열을 갖는 주형 서열로부터 유래하는 서열을 포함하는 핵산 프로브를 사용함으로써 변이, 다형, 생물종 등의 해석을 행할 수 있다.

본 발명에서의 검출 대상은, 예를 들어 개체의 게놈 DNA, 게놈 RNA, mRNA 등이 포함된다. 개체는 이것들에 한정되는 것이 아니지만, 인간, 인간 이외의 동물, 식물 및 바이러스, 세균, 박테리아, 효모 및 마이코플라즈마 등의 미생물이 포함된다.

이들의 핵산은 개체로부터 채취한 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 백혈구, 뇨, 변, 정액, 타액, 조직, 생체 검사, 구강내 점막, 배양 세포, 객담 등으로부터 추출된다. 혹은 미생물로부터 직접 추출된다. 핵산의 추출은 이것들에 한정되지 않지만, 시판되고 있는 핵산 추출 키트인 QIAamp(QIAGEN사제), 스카이테스트(스미또모 긴조꾸사제) 등을 이용하여 실행할 수 있다. 개체 시료나 미생물로부터 추출된 핵산을 포함하는 용액을 피검액으로 한다.

검체는 본 발명의 방법에 관한 증폭법에 의해 증폭된다. 검출 대상이 RNA인 경우에는 증폭 전에 예를 들어 역전사 효소에 의해 상보쇄 DNA로 변환할 수 있다. 역전사 효소와 DNA 폴리메라제의 양쪽을 동일 튜브 내에 첨가하여 역전사와 DNA 증폭을 동시에 행하여도 된다.

증폭법에 대해서는, 예를 들어 Polymerase chain reaction법(PCR법), Loop mediated isothermal amplification법(LAMP법), Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids(ICAN법), Nucleic acid sequence-based amplification법(NASBA법), Strand displacement amplification(SDA법), Ligase chain reaction(LCR법), Rolling Circle Amplification법(RCA법) 등의 방법을 이용할 수 있다. 얻어진 증폭 산물은 필요에 따라 단편화되거나 1본쇄화된다. 1본쇄화하는 수단으로서는, 예를 들어 열 변성, 비즈나 효소 등을 사용하는 방법, T7 RNA 폴리메라제를 사용하여 전사 반응을 행하는 방법이 있다. LAMP법이나 ICAN법 등에 의해 증폭되어 산물 중에 1본쇄 영역이 존재하고, 이 1본쇄 영역을 표적 서열로 하는 경우에는 그대로 하이브리다이제이션 공정에 제공할 수 있다.

이 1본쇄화 공정이 불필요하게 되므로, 증폭에 의해 얻어진 표적 핵산은 스템ㆍ루프 구조를 갖는 것이 바람직하다. 스템ㆍ루프 구조를 갖는 증폭 산물은 1본쇄인 루프 부분의 서열을 프로브와의 반응에 잘 이용할 수 있다.

표적 핵산의 증폭에는 LAMP법(예를 들어, 일본 특허 제3313358호를 참조하기 바람)이 적절하게 이용된다. LAMP법은 신속하면서 간편한 유전자 증폭법이며, 증폭 산물 중에 스템ㆍ루프 구조를 갖고 있다.

도 5는 LAMP법에서 사용되는 기본적인 프라이머의 설계예를 도시하는 도면이다. 도 5의 모식도를 사용하여 LAMP법의 원리를 간단하게 설명한다. LAMP법에서는 주형 핵산의 최대 8개의 영역을 인식하는 6종류의 프라이머와 쇄 치환형 DNA 합성 효소를 사용한다. 주형 핵산은 등온(60 내지 65℃) 조건 하에서 증폭된다. 상기 8개의 영역은 주형 핵산의 5' 말단측으로부터 순서대로 F3 영역, F2 영역, LF 영역, F1 영역, 3' 말단측으로부터 순서대로 B3c 영역, B2c 영역, LBc 영역 및 B1c 영역으로 정의된다. 또한, F1c, F2c, F3c, B1, B2 및 B3 영역은 각각 F1, F2, F3, B1c, B2c 및 B3c 영역의 상보쇄에서의 영역을 나타내고 있다. 도 5에 도시하는 8종의 프라이머는 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 갖는 FIP 이너 프라이머, 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 갖는 BIP 이너 프라이머, F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머, B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머, LF 영역과 상보적인 서열을 갖는 LFc 프라이머, LBc 영역과 동일한 서열을 갖는 LBc 프라이머이다. 증폭 반응에 필수적인 것은 FIP 이너 프라이머, BIP 이너 프라이머이며, F3 프라이머, B3 프라이머, LF 프라이머 및 LB 프라이머는 증폭 효율을 높이기 위하여 첨가된다.

LAMP법에 의한 증폭 산물 중에는 도 6에 도시한 바와 같은 루프 구조가 형성되고, F2 영역부터 F1 영역의 사이, F2c 영역부터 F1c 영역의 사이, B2 영역부터 B1 영역의 사이 및 B2c 영역부터 B1c 영역의 사이가 1본쇄의 영역으로 된다. 이로 인해, 이 영역에 표적 서열을 설계하면 간편하면서 고감도로 표적 핵산을 검출할 수 있다(예를 들어, 일본 특허 공개 제2005-143492호 공보를 참조하기 바람). LF 프라이머 및/또는 LB 프라이머와 표적 서열이 겹치는 경우에는, LF 프라이머 및/또는 LB 프라이머는 첨가하지 않는 쪽이 바람직하다.

도 7을 사용하여 LAMP법을 이용한 경우의 태그 서열 도입 프라이머와 DNA칩을 사용한 다검체의 해석 방법에 대하여 설명한다.

우선, F2 영역 및/또는 B2 영역에 상기 태그 서열을 도입한 프라이머를 검체마다 준비한다.

이어서, 상기 프라이머를 사용하여 검체마다 독립된 반응계에 있어서 증폭을 행한다. 예를 들어, 검체마다 다른 튜브에서 증폭을 행하면 된다. 증폭 후, 1본쇄 루프 부분에 검체마다 일부 서열이 다른 증폭 산물이 얻어진다. 주형 핵산이 존재하지 않는 경우에는 증폭은 일어나지 않고 증폭 산물은 얻어지지 않는다. 이 증폭 산물을 혼합하여, 도 8에 도시한 바와 같이 기체 상에 고정화한 각 태그 서열에 상보적인 서열을 포함하는 핵산 프로브와 하이브리다이제이션시킨다. 그 후, 증폭 산물과 핵산 프로브의 하이브리다이제이션을 적당한 검출법에 의해 검출한다.

도 7 및 도 8에서는 3검체에서의 예를 나타내었지만, 검체수에 대해서는 이것에 한정되지 않는 것은 명확하다.

또한, 도 9에 도시한 바와 같이 핵산 프로브에서 검출되는 주형 서열 유래의 영역, 즉 F2 영역부터 F1 영역의 사이, F2c 영역부터 F1c 영역의 사이, B2 영역부터 B1 영역의 사이 및 B2c 영역부터 B1c 영역의 사이에 변이나 다형 부위를 위치시키면, 이들 변이나 다형을 검출하는 핵산 프로브를 사용함으로써 검출을 행할 수 있다.

또한, 도 10에 도시한 바와 같이, 1개의 반응계 내에서 다른 서열로 이루어지는 복수 종류의 주형 서열을 멀티 증폭하는 것도 가능하다. 증폭 후, 검체의 증폭 산물에 대하여 DNA칩 검출을 행하면, 복수의 표적 서열에 대하여 복수 검체를 해석하는 것이 가능하게 된다. 검출은 기체 상에 고정화한 각 태그 서열에 상보적인 서열을 포함하는 핵산 프로브와 하이브리다이제이션시킨다. 그 후, 증폭 산물과 핵산 프로브의 하이브리다이제이션을 적당한 검출법에 의해 검출한다. 도 10에서는 3개의 주형 핵산의 예를 나타내었지만, 주형 핵산수는 이것에 한정되지 않는 것은 명확하다. 또한, 증폭 산물의 주형 서열 유래의 영역에 변이나 다형 부위, 및/또는 동정하고자 하는 생물종에 특징적이고 다른 생물종과 특이성을 낼 수 있는 부위가 위치하도록 프라이머를 설계하면, 태그 서열과 이것들의 변이, 다형 및/또는 생물종을 검출 또는 동정하는 서열을 갖는 주형 서열로부터 유래하는 서열을 포함하는 핵산 프로브를 사용함으로써 변이, 다형, 생물종 등의 해석을 행할 수 있다.

<DNA칩>

본 발명에 있어서 사용되는 DNA칩은 기체와 기체 상에 고정화된 핵산 프로브를 구비하면 된다. DNA칩의 기체는 전류 검출형을 대표로 하는 전기 화학적 검출형, 형광 검출형, 화학 발색형 및 방사능 검출형 등, 종래 공지된 어느 종류의 마이크로 어레이용의 기체이어도 된다.

어느 종류의 마이크로 어레이도 그 자체의 공지된 방법에 의해 제조하는 것이 가능하다. 예를 들어, 전류 검출형 마이크로 어레이의 경우, 네가티브 컨트롤 프로브 고정화 영역 및 검출용 프로브 고정화 영역은 각각 다른 전극 상에 배치되면 된다.

DNA칩의 예를 모식도로서 도 11에 도시하지만, 이것에 한정되는 것이 아니다. DNA칩은 기체(1)에 고정화 영역(2)을 구비한다. 핵산 프로브는 상기 고정화 영역(2)에 고정화된다. 이러한 DNA칩은 당해 분야에서 주지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 기체(1)에 배치되는 고정화 영역(2)의 수 및 그 배치는, 당업자가 필요에 따라 적절히 설계 변경하는 것이 가능하다. 이러한 DNA칩은 형광을 이용한 검출 방법을 위하여 적절하게 사용되어도 된다.

DNA칩의 다른 예를 도 12에 도시한다. 도 12의 DNA칩은 기체(11)에 전극(12)을 구비한다. 핵산 프로브는 상기 전극(12)에 고정화된다. 전극(12)은 포트(13)에 접속된다. 전극(12)으로부터의 전기적 정보는 포트(13)를 통하여 취득된다. 이러한 DNA칩은 당해 분야에서 주지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 기체(11)에 배치되는 전극(12)의 수 및 그 배치는 당업자가 필요에 따라 적절히 설계 변경하는 것이 가능하다. 또한, 본 예의 DNA칩은 필요에 따라 참조 전극 및 대향 전극을 구비하여도 된다.

전극은 금, 금의 합금, 은, 플라티나, 수은, 니켈, 팔라듐, 실리콘, 게르마늄, 갈륨 또는 텅스텐과 같은 금속 단체 및 그들의 합금, 혹은 그래파이트, 글래시 카본과 같은 탄소 또는 그들의 산화물 또는 화합물을 사용할 수 있지만, 그것들에 한정되지 않는다.

본 예와 같은 DNA칩은 전기 화학적인 검출 방법을 위하여 적절하게 사용되어도 된다.

<하이브리다이제이션 조건>

하이브리다이제이션은 하이브리드가 충분히 형성되는 적절한 조건 하에서 행하면 된다. 적절한 조건은 표적 핵산의 종류 및 구조, 표적 서열에 포함되는 염기의 종류, 핵산 프로브의 종류에 따라 상이하다. 예를 들어, 이온 강도가 0.01 내지 5의 범위이고, pH 5 내지 9의 범위의 완충액 중에서 하이브리다이제이션을 행하면 된다. 반응 온도는 10℃ 내지 90℃의 범위이어도 된다. 교반이나 진탕 등에 의해 반응 효율을 높여도 된다. 반응 용액 중에는 황산 덱스트란, 연어 정자 DNA 및 소 흉선 DNA와 같은 하이브리다이제이션 촉진제, EDTA 또는 계면 활성제 등을 첨가하여도 된다.

<세정 조건>

하이브리다이제이션 후, DNA칩을 세정하기 위한 세정액은 이온 강도가 0.01 내지 5의 범위이고, pH 5 내지 9의 범위의 완충액이 적절하게 사용된다. 세정액은 염 및 계면 활성제 등을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 염화나트륨 또는 시트르산나트륨을 사용하여 제조한 SSC 용액, Tris-HCl 용액, Tween20 용액 또는 SDS 용액 등이 적절하게 사용된다. 세정 온도는 예를 들어 10℃ 내지 70℃의 범위에서 행한다. 세정액은 프로브 고정화 기체의 표면 또는 핵산 프로브를 고정화한 영역에 통과 또는 체류시킨다. 혹은, 세정액 중에 DNA칩을 침지시켜도 된다. 이 경우, 세정액은 온도 제어 가능한 용기 중에 수용되는 것이 바람직하다.

<검출 방법>

하이브리다이제이션 공정에 의해 발생한 하이브리드의 검출은 형광 검출 방식 및 전기 화학적 검출 방식을 이용할 수 있다.

(a) 형광 검출 방식

형광 표지 물질을 사용하여 검출한다. 핵산의 증폭 공정에서 사용하는 프라이머를 FITC, Cy3, Cy5 또는 로다민 등의 형광 색소와 같은 형광학적으로 활성의 물질로 표지하여도 된다. 혹은 그들 물질로 표지한 세컨드 프로브를 사용하여도 된다. 복수의 표지 물질을 동시에 사용하여도 된다. 검출 장치에 의해 표지된 서열 또는 2차 프로브 중의 표지를 검출한다. 사용하는 표지에 따라 적절한 검출 장치를 사용한다. 예를 들어, 형광 물질을 표지로서 사용한 경우, 형광 검출기를 사용하여 검출한다.

(b) 전기 화학적 검출 방식

당해 분야에서 주지된 2본쇄 인식 물질을 사용한다. 2본쇄 인식 물질은 헥스트 33258, 아크리딘 오렌지, 퀴나크린, 도노마이신, 메탈로인터컬레이터, 비스아크리딘 등의 비스인터컬레이터, 트리스인터컬레이터 및 폴리인터컬레이터로부터 선택하여도 된다. 또한, 이들 2본쇄 인식 물질을 전기 화학적으로 활성인 금속 착체, 예를 들어 페로센, 비올로겐 등으로 수식하여도 된다.

2본쇄 인식 물질은 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로는 1ng/mL 내지 1mg/mL의 범위의 농도에서 사용한다. 이때에는 이온 강도가 0.001 내지 5의 범위이고, pH 5 내지 10의 범위의 완충액을 사용할 수 있다.

측정은, 예를 들어 2본쇄 인식 물질이 전기 화학적으로 반응하는 전위 이상의 전위를 인가하여 2본쇄 인식 물질로부터 유래하는 반응 전류값을 측정한다. 이때, 전위는 정속으로 인가하거나, 혹은 펄스로 인가하거나, 혹은 정전위를 인가하여도 된다. 포텐시오 스탯, 디지털 멀티미터 및 펑션 제너레이터와 같은 장치를 사용하여 전류, 전압을 제어하여도 된다. 전기 화학적 검출은 당해 분야에서 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 일본 특허 공개 평10-146183호 공보에 기재된 방법을 이용할 수 있다.

[분석 키트]

또한, 본 발명은 상술한 핵산의 해석 방법에 있어서 사용하기 위한 분석 키트도 제공한다. 그러한 분석 키트는

검체마다 다른 서열을 갖는 태그 서열을 포함하고, 상기 태그 서열은 상기 검체마다의 주형 핵산 중의 주형 서열에 하이브리다이즈하였을 때에 루프 아웃하도록 설계된 제1 프라이머와, 상기 제1 프라이머와 쌍으로 사용되는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및

기체와, 상기 기체 상에 고정화된 상기 태그 서열을 포함하는 표적 서열에 상보적인 핵산 프로브를 구비하는 DNA칩을 구비하면 된다.

이때 핵산 프로브는 태그 서열과 검체 중의 주형 서열로부터 유래하는 서열 중 적어도 일부분을 포함하는 표적 서열에 상보적인 핵산 프로브이어도 된다.

또한, 분석 키트는,

핵산 부분 서열마다 다른 서열을 갖는 태그 서열을 포함하고, 상기 태그 서열은 상기 핵산 부분 서열마다의 주형 서열에 하이브리다이즈하였을 때에 루프 아웃하도록 설계된 제1 프라이머와, 상기 제1 프라이머와 쌍으로 사용되는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및

이때 핵산 프로브는 태그 서열과 핵산 부분 서열마다의 주형 서열로부터 유래하는 서열 중 적어도 일부분을 포함하는 표적 서열에 상보적인 핵산 프로브이어도 된다.

또한, 분석 키트에 포함되는 제1 프라이머는, 적어도 1회의 해석에서 사용하는 데 필요한 종류 및 양의 프라이머를 포함한다. n개의 검체를 동시에 해석하는 경우에는 n종류의 제1 프라이머가 사용된다. 다른 종류의 제1 프라이머를 서열에 대하여 비교하면, 태그 서열 이외는 동등한 서열이어도 된다.

분석 키트에 포함되는 제2 프라이머는 적어도 1회의 해석에서 사용하는 데 필요한 양의 프라이머를 포함한다. 또한, 제1 프라이머 외에 제2 프라이머가 태그 서열을 포함하여도 된다. 그 경우, 제2 프라이머는 적어도 1회의 해석에서 사용하는 데 필요한 종류 및 양의 프라이머를 포함하여도 된다. n개의 검체를 동시에 해석하는 경우에는 n종류의 제2 프라이머가 사용된다. 다른 종류의 제2 프라이머를 서열에 대하여 비교하면, 태그 서열 이외는 동등한 서열이어도 된다.

분석 키트가 PCR법을 이용하는 것인 경우, 제1 프라이머는, 예를 들어 적어도 주형 핵산을 포함할 수 있는 n개의 검체에 대응지어진 태그 서열과, 당해 주형 핵산의 일부의 서열의 상보 서열을 포함하는 n종류의 포워드 프라이머 또는 리버스 프라이머이면 된다(여기서, n은 2 이상의 정수임). 제2 프라이머는 적어도 1회의 해석에서 사용하는 데 필요한 양의 프라이머를 포함한다. 그러한 제2 프라이머는 제1 프라이머와 쌍으로 사용되는 적어도 1종류의 리버스 프라이머 또는 포워드 프라이머이면 된다. 제1 프라이머가 포워드 프라이머이면 제2 프라이머는 리버스 프라이머이고, 제1 프라이머가 리버스 프라이머이면 제2 프라이머는 포워드 프라이머이면 된다.

LAMP법을 이용하는 해석 방법을 위한 분석 키트도 제공된다. 주형 서열의 5' 말단측으로부터 F3 영역, F2 영역, LF 영역, F1 영역이 설계되고, 3' 말단측으로부터 B3c 영역, B2c 영역, LBc 영역, B1c 영역이 설계되는 경우, 이하의 1 내지 9로 이루어지는 군으로부터 적어도 하나 선택되는 프라이머 세트가 포함된다;

1. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머(제1 프라이머), 및 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 갖는 BIP 프라이머(제2 프라이머);

2. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 갖는 FIP 프라이머(제2 프라이머), 및 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머(제1 프라이머);

3. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머(제1 프라이머), 및 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머(제2 프라이머);

4. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머(제1 프라이머), 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 갖는 BIP 프라이머(제2 프라이머), F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머(제3 프라이머) 및 B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머(제4 프라이머);

5. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 갖는 FIP 프라이머(제2 프라이머), 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머(제1 프라이머), F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머(제3 프라이머) 및 B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머(제4 프라이머);

6. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머(제1 프라이머), 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머(제2 프라이머), F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머(제3 프라이머) 및 B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머(제4 프라이머);

7. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머(제1 프라이머), 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 갖는 BIP 프라이머(제2 프라이머), F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머(제3 프라이머), B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머(제4 프라이머), LF 영역과 상보적인 서열을 갖는 LFc 프라이머(제5 프라이머) 및 LBc 영역과 동일한 서열을 갖는 LBc 프라이머(제6 프라이머);

8. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 갖는 FIP 프라이머(제2 프라이머), 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머(제1 프라이머), F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머(제3 프라이머), B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머(제4 프라이머), LF 영역과 상보적인 서열을 갖는 LFc 프라이머(제5 프라이머) 및 LBc 영역과 동일한 서열을 갖는 LBc 프라이머(제6 프라이머);

9. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머(제1 프라이머), 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머(제2 프라이머), F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머(제3 프라이머), B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머(제4 프라이머), LF 영역과 상보적인 서열을 갖는 LFc 프라이머(제5 프라이머) 및 LBc 영역과 동일한 서열을 갖는 LBc 프라이머(제6 프라이머).

또한, 당해 분석 키트는 증폭 반응을 행하기 위한 효소 및/또는 용기, 세정액, 완충액, 완충액을 제조하기 위한 염류 등을 포함하여도 된다. 또한, DNA칩은 핵산 프로브와 기체가 일체화되어 있지 않은 상태에서 포함되어도 된다.

이러한 분석 키트에 의해 보다 간편하게 핵산의 해석을 행하는 것이 가능하게 된다.

[예]

본 발명의 방법에 의한 검출의 구체예를 나타낸다. 이하의 예는 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 프라이머와 DNA칩을 사용하여 복수 검체를 해석하는 방법의 예이다.

(1) 주형 핵산의 증폭

처음에 태그 서열을 삽입한 프라이머를 사용하여 유전자 증폭을 행하여 목적의 유전자 산물이 생성되어 있는지를 제한 효소에 의해 확인하였다. 서열 번호 21의 인간의 MTHFR 유전자를 주형 핵산으로서 사용하고, 이것을 LAMP법에 의해 증폭하였다.

[프라이머]

표적 핵산의 증폭에 사용한 합성 DNA 올리고 프라이머를 표 1에 나타내었다.

염기 삽입이 없는 FIP 프라이머(FIP-1; 서열 번호 1), FIP 프라이머의 3' 말단측으로부터 4염기째에 AC(FIP-2; 서열 번호 2), ACAC(FIP-3; 서열 번호 3), ACACAC(FIP-4; 서열 번호 4), TGTG(FIP-5; 서열 번호 5), TCTC(FIP-6; 서열 번호 6)를 삽입한 것, FIP 프라이머 3' 말단측으로부터 6염기째에 AC(FIP-7 서열 번호 7), ACAC(FIP-8; 서열 번호 8), ACACAC(FIP-9; 서열 번호 9), TGTG(FIP-10; 서열 번호 10), TCTC(FIP-11; 서열 번호 11)를 삽입한 것의 총 11종의 FIP 프라이머를 준비하였다. 또한, BIP 프라이머(서열 번호 12), F3 프라이머(서열 번호 13), B3 프라이머(서열 번호 14), LBc 프라이머(서열 번호 15)에 대해서는 공통으로 사용하였다.

[LAMP 반응액]

LAMP법에 사용한 반응 용액의 조성을 표 2에 나타내었다.

[핵산의 증폭]

LAMP법에 의해 63℃에서 1시간 핵산을 증폭시켰다. 네가티브 컨트롤에서는 주형 핵산 대신에 멸균수를 사용하였다. 증폭의 상승 시간은 Loopamp 리얼타임 탁도 측정 장치를 사용하여 증폭 반응에 따라 생성되는 피로인산과 용액 중의 마그네슘의 백탁을 검출함으로써 행하였다.

[제한 효소에 의한 목적 산물 확인]

FIP 프라이머의 3' 말단측으로부터 4염기째에 AC(FIP-2), ACAC(FIP-3), ACACAC(FIP-4)를 도입한 것을 AccI에서 절단하였다. 염기 삽입이 없는 FIP 프라이머(FIP-1)는 AccI에서 절단되지 않지만, AC(FIP-2), ACAC(FIP-3), ACACAC(FIP-4)를 삽입한 것은 프라이머의 삽입 부분이 루프 아웃하여 주형 핵산으로 어닐링된다. 따라서, 목적의 산물이 생성되어 있는 경우, 그 증폭 산물은 당해 AccI에서 절단된다.

마찬가지로, FIP 프라이머의 3' 말단측으로부터 6염기째에 AC(FIP-7), ACAC(FIP-8), ACACAC(FIP-9)를 삽입한 것을 CviQI에서 절단하였다. 염기 삽입이 없는 FIP 프라이머(FIP-1)은 CviQI에서 절단되지 않는다. AC(FIP-7), ACAC(FIP-8), ACACAC(FIP-9)를 삽입한 것은 프라이머의 삽입 부분이 루프 아웃하여 주형 핵산으로 어닐링된다. 그로 인해, 목적의 산물이 생성되어 있으면 증폭 산물은 CviQI에서 절단된다.

[결과]

염기 삽입이 없는(FIP-1) 것은 상승 시간은 29분이었다. FIP 프라이머의 3' 말단측으로부터 4염기째에 AC(FIP-2), ACAC(FIP-3), ACACAC(FIP-4), TGTG(FIP-5), TCTC(FIP-6)을 삽입한 시료의 상승 시간은 32분, 37분, 38분, 38분, 37분이었다. 또한, FIP 프라이머 3' 말단측으로부터 6염기째에 AC(FIP-7), ACAC(FIP-8), ACACAC(FIP-9), TGTG(FIP-10), TCTC(FIP-11)을 삽입한 시료의 상승 시간은 30분, 38분, 47분, 32분, 35분이었다. 네가티브 컨트롤에서는 증폭이 상승되지 않았다. 이것으로부터 염기 삽입한 것에 의해 50분 이내에는 문제없이 증폭은 상승하고, 증폭 산물이 얻어지는 것이 밝혀졌다. 또한, 도 13에 도시한 바와 같이 제한 효소에 의해 목적 산물이 증폭되고 있는 것이 확인되었다.

(2) 표적 핵산의 DNA칩 검출

FIP 프라이머의 3' 말단측으로부터 4염기째에 ACAC(FIP-3), TGTG(FIP-5), TCTC(FIP-6)을 삽입한 프라이머를 사용하여 증폭을 행하였다. B3, F3, BIP, LBc 프라이머에 대해서는 공통으로 사용하였다(표 1 참조). 주형으로서 인간 게놈을 첨가한 것과, 당해 인간 게놈을 첨가하지 않고 대신에 멸균수를 첨가한 것의 2종류를 제조하였다. 그 후, 얻어진 증폭 산물에 대하여 칩 검출을 행하였다.

[핵산 프로브]

검출에 사용한 합성 DNA 올리고 핵산 프로브를 표 3에 나타내었다. 본 예에서는 핵산 프로브로서 FIP 프라이머의 3' 말단측으로부터 4염기째에 ACAC 삽입한 것(프로브 2; 서열 번호 17), TGTG 삽입한 것(프로브 3: 서열 번호 18), TCTC 삽입한 것(프로브 4; 서열 번호 19) 및 주형 서열로부터 유래하는 영역의 상보쇄로 되는 부분에 1염기의 변이를 넣은 것(프로브 5; 서열 번호 20)을 준비하였다. 네가티브 컨트롤로서 MTHFR 유전자 서열과는 무관한 서열을 갖는 네가티브 프로브(프로브 1; 서열 번호 16)를 사용하였다. 이상 5종의 프로브는 금 전극에 고정화하기 위하여 3' 말단측을 티올 수식하였다.

[전기 화학적 검출용 DNA칩]

상기의 핵산 프로브를 금 전극에 고정화하였다. 핵산 프로브의 고정화는 티올과 금의 강한 공유 결합성을 이용하여 행하였다. 핵산 프로브 용액을 금 전극 상에 스폿하고 25℃에서 1시간 정치하였다. 그 후, 1mM 머캅토헥산올 용액에 침지하여 0.2×SSC 용액으로 세정하였다. 동일 프로브는 각 4전극에 스폿하였다. 각 핵산 프로브의 전극의 위치를 이하에 나타낸다. 세정 후, 초순수로 세정, 풍건하여 전기 화학적 검출용 DNA칩을 얻었다.

[전극 배치]

전극과 그것에 고정화하는 핵산 프로브의 대응은 다음과 같다.

1-4 전극 네가티브 프로브(핵산 프로브 1)

5-8 전극 ACAC 검출용 프로브(핵산 프로브 2)

9-12 전극 TGTG 검출용 프로브(핵산 프로브 3)

13-16 전극 TCTC 검출용 프로브(핵산 프로브 4)

17-20 전극 ACAC 1염기 변이 도입 프로브(핵산 프로브 5)

[하이브리다이제이션]

상기와 같이 제작한 전기 화학적 검출용 DNA칩을 2×SSC의 염을 첨가한 LAMP 산물에 침지하고, 55℃에서 10분간 정치시켜 하이브리다이제이션을 행하였다. 그 후, 전기 화학적 검출용 DNA칩을 0.2×SSC 용액에 48℃에서 10분간 침지하여 세정하였다. 계속해서, 전기 화학적 검출용 DNA칩을 삽입제인 헥스트 33258 용액을 50μM 포함하는 인산 완충액 중에 1분간 침지하였다. 그 후, 헥스트 33258 용액의 산화 전류 응답을 측정하였다.

[결과]

도 14a는 인간 게놈을 첨가하여 증폭한 ACAC(FIP-3) 삽입 프라이머 세트의 증폭 산물과 멸균수를 첨가하여 증폭한 TGTG(FIP-5) 및 TCTC(FIP-6) 삽입 프라이머 세트의 증폭 산물을 혼합한 것이다. 도 14b는 인간 게놈을 첨가하여 증폭한 TGTG(FIP-5) 삽입 프라이머 세트의 증폭 산물과 멸균수를 첨가하여 증폭한 ACAC(FIP-3) 및 TCTC(FIP-6) 삽입 프라이머 세트의 증폭 산물을 혼합한 것이다. 마찬가지로 도 14c는 인간 게놈을 첨가하여 증폭한 TCTC(FIP-6) 삽입 프라이머 세트의 증폭 산물과 멸균수를 첨가하여 증폭한 ACAC(FIP-3) 및 TGTG(FIP-5) 삽입 프라이머 세트의 증폭 산물을 혼합한 것이다. 칩 검출의 결과, 도 14a에서는 ACAC를 검출하는 핵산 프로브 2로부터 높은 시그널이 얻어졌다. 도 14b에서는 TGTG를 검출하는 핵산 프로브 3으로부터 높은 시그널이 얻어졌다. 마찬가지로 도 14c에서는 TCTC를 검출하는 핵산 프로브 4로부터 높은 시그널이 얻어졌다. 이것으로부터 본 발명의 태그 서열을 삽입한 프라이머에서 복수 검체를 동시에 DNA칩 검출할 수 있는 것이 나타내어졌다. 또한, 도 14a에 대하여 세정 조건을 엄격하게 함으로써, ACAC 검출용 프로브와 1염기 차이의 핵산 프로브 5에 대하여 핵산 프로브 2와 비교하여 시그널이 낮게 되어 있고, 주형 서열 유래의 영역에 변이를 위치시킴으로써 변이가 검출 가능한 것이 시사되었다.

본 예는 3검체의 동시 검출을 나타내었지만, 검체수는 이것에 한정되지 않는 것은 명확하다. 필요에 따라 적절히 변경할 수 있다. 태그 서열의 삽입 장소 및 염기수에 대해서도 이것에 한정되지 않는 것은 명확하다. 필요에 따라 적절히 변경할 수 있다.

예에 있어서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 해석 방법에 의해 복수 검체가 단시간에 용이하면서 간편하게 해석되었다.

<산업상 이용가능성>

본 발명은 의료, 의약, 식품, 농업, 어업, 축산업 및 원예 등의 분야에 있어서 유전자 등의 핵산을 해석하기 위하여 유용하다.

1: 기체
2: 고정화 영역
11: 기체
12: 전극
13: 포트

서열목록 전자파일 첨부

Claims

복수 검체의 해석 방법이며,
(a) 상기 검체마다 다른 서열을 갖는 태그 서열을 포함하는 제1 프라이머와, 상기 제1 프라이머와 쌍으로 사용되는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 검체마다 준비하는 공정(여기서, 상기 태그 서열은 상기 제1 프라이머가 상기 검체마다의 주형 핵산 중의 주형 서열에 하이브리다이즈하였을 때에 루프 아웃하도록 설계되어 있음)과;
(b) 상기 검체마다 독립된 반응계에서, 상기 검체마다 대응하는 상기 프라이머 세트를 사용하여 상기 검체마다의 주형 핵산을 증폭하고, 상기 태그 서열이 도입된 증폭 산물을 얻는 공정과;
(c) 상기 검체마다 얻어진 상기 증폭 산물을 하나로 혼합하는 공정과;
(d) 상기 태그 서열을 포함하는 표적 서열을 검출하는 서열을 갖고, 기체(基體) 상에 고정화된 핵산 프로브와, 공정 (c)에서 혼합된 상기 증폭 산물을 반응시키는 공정과;
(e) 공정 (d)에 있어서 발생한 하이브리다이제이션량을 검출함으로써, 각 검체에 대하여 상기 표적 서열을 포함하는 표적 핵산의 유무 및/또는 양을 검출하는 공정을 구비하는 복수 검체의 해석 방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 상기 태그 서열과 상기 검체마다의 주형 서열로부터 유래하는 서열을 포함하는, 표적 서열을 검출하는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 해석 방법.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트가, 상기 주형 서열의 5' 말단측으로부터 F3 영역, F2 영역, LF 영역, F1 영역, 3' 말단측으로부터 B3c 영역, B2c 영역, LBc 영역, B1c 영역을 설정하였을 때, 이하의 1 내지 9로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하고,
1. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머, 및 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 갖는 BIP 프라이머;
2. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 갖는 FIP 프라이머, 및 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머;
3. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머, 및 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머;
4. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머, 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 갖는 BIP 프라이머, F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머 및 B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머;
5. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 갖는 FIP 프라이머, 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머, F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머 및 B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머;
6. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머, 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머, F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머 및 B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머;
7. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머, 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 갖는 BIP 프라이머, F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머, B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머, LF 영역과 상보적인 서열을 갖는 LFc 프라이머 및 LBc 영역과 동일한 서열을 갖는 LBc 프라이머;
8. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 갖는 FIP 프라이머, 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머, F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머, B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머, LF 영역과 상보적인 서열을 갖는 LFc 프라이머 및 LBc 영역과 동일한 서열을 갖는 LBc 프라이머;
9. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머, 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머, F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머, B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머, LF 영역과 상보적인 서열을 갖는 LFc 프라이머 및 LBc 영역과 동일한 서열을 갖는 LBc 프라이머;
(b)의 증폭이 LAMP법인 해석 방법.
검체 핵산 중의 복수의 부분 핵산 서열의 해석 방법이며,
(a) 상기 부분 핵산 서열마다 다른 서열을 갖는 태그 서열을 포함하는 제1 프라이머와, 상기 제1 프라이머와 쌍으로 사용되는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 상기 핵산 부분 서열마다 준비하는 공정(여기서, 상기 태그 서열은 상기 제1 프라이머가 상기 핵산 부분 서열마다의 주형 서열에 하이브리다이즈하였을 때에 루프 아웃하도록 설계되어 있음)과;
(b) 상기 프라이머 세트를 사용하여 상기 핵산 부분 서열마다의 주형 서열을 멀티 증폭하고, 상기 태그 서열이 도입된 증폭 산물을 얻는 공정과;
(c) 상기 태그 서열을 포함하는 표적 서열을 검출하기 위한 기체(基體) 상에 고정화된 핵산 프로브와, 공정 (b)에서 얻어진 상기 증폭 산물을 반응시키는 공정과;
(d) 공정 (c)에 있어서 발생한 하이브리다이제이션량을 검출함으로써, 각 핵산 서열에 대하여 상기 표적 서열을 포함하는 표적 핵산의 유무 및/또는 양을 검출하는 공정을 구비하는, 검체 핵산 중의 복수의 부분 핵산 서열의 해석 방법.
제4항에 있어서, 상기 핵산 프로브는, 상기 태그 서열과 상기 핵산 부분 서열마다의 주형 서열로부터 유래하는 서열을 포함하는 표적 서열을 검출하는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 해석 방법.
제4항에 있어서, 상기 프라이머 세트가, 주형 서열의 5' 말단측으로부터 F3 영역, F2 영역, LF 영역, F1 영역, 3' 말단측으로부터 B3c 영역, B2c 영역, LBc 영역, B1c 영역을 설정하였을 때, 이하의 1 내지 9로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하고,
1. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머, 및 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 갖는 BIP 프라이머;
2. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 갖는 FIP 프라이머, 및 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머;
3. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머, 및 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머;
4. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머, 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 갖는 BIP 프라이머, F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머 및 B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머;
5. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 갖는 FIP 프라이머, 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머, F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머 및 B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머;
6. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머, 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머, F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머 및 B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머;
7. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머, 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 갖는 BIP 프라이머, F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머, B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머, LF 영역과 상보적인 서열을 갖는 LFc 프라이머 및 LBc 영역과 동일한 서열을 갖는 LBc 프라이머;
8. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 갖는 FIP 프라이머, 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머, F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머, B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머, LF 영역과 상보적인 서열을 갖는 LFc 프라이머 및 LBc 영역과 동일한 서열을 갖는 LBc 프라이머;
9. 5' 말단측에 F1과 상보적인 서열을 갖고 3' 말단측에 F2와 동일한 서열을 가지면서 F2 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 FIP 프라이머, 5' 말단측에 B1c와 동일한 서열을 갖고 3' 말단측에 B2c와 상보적인 서열을 가지면서 B2c와 상보적인 서열 내에 검체마다 다른 태그 서열을 삽입한 BIP 프라이머, F3 영역과 동일한 서열을 갖는 F3 프라이머, B3c 영역과 상보적인 서열을 갖는 B3 프라이머, LF 영역과 상보적인 서열을 갖는 LFc 프라이머 및 LBc 영역과 동일한 서열을 갖는 LBc 프라이머
(b)의 증폭이 LAMP법인 해석 방법.
제1항에 기재된 복수 검체를 해석하는 방법에 사용하기 위한 분석 키트이며,
검체마다 다른 서열을 갖는 태그 서열을 포함하고, 상기 태그 서열은 상기 검체마다의 주형 핵산 중의 주형 서열에 하이브리다이즈하였을 때에 루프 아웃하도록 설계된 제1 프라이머와, 상기 제1 프라이머와 쌍으로 사용되는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트와,
기체와, 상기 기체 상에 고정화된 상기 태그 서열을 포함하는 표적 서열에 상보적인 핵산 프로브를 구비하는 DNA칩을 구비하는 분석 키트.
제7항에 있어서, 상기 핵산 프로브는, 상기 태그 서열 및 상기 검체 중의 주형 서열로부터 유래하는 서열을 포함하는 표적 서열에 상보적인 핵산 프로브인 것을 특징으로 하는 분석 키트.
제4항에 기재된 복수의 핵산 부분 서열의 해석 방법에 사용하기 위한 분석 키트이며,
상기 핵산 부분 서열마다 다른 서열을 갖는 태그 서열을 포함하고, 상기 태그 서열은, 상기 핵산 부분 서열마다의 주형 서열에 하이브리다이즈하였을 때에 루프 아웃하도록 설계된 제1 프라이머와, 상기 제1 프라이머와 쌍으로 사용되는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트와,
기체와, 상기 기체 상에 고정화된 상기 태그 서열 및 상기 핵산 부분 서열마다의 주형 서열로부터 유래하는 서열을 포함하는 표적 서열에 상보적인 핵산 프로브를 구비하는 DNA칩을 구비하는 분석 키트.
제9항에 있어서, 상기 핵산 프로브는, 상기 태그 서열 및 상기 핵산 부분 서열마다의 주형 서열로부터 유래하는 서열을 포함하는 표적 서열에 상보적인 핵산 프로브인 것을 특징으로 하는 분석 키트.