CN102141533B - 环介岛等温基因扩增结果分析方法 - Google Patents

Abstract

一种环介岛等温基因扩增(LAMP)结果分析方法，是建立一种LAMP反应结果分析新方法，通过测定LAMP液电导率的变化获得目标基因的定性、定量信息，其工作方法是：(1)感应式电导仪工作传感器内插入薄壁管作为LAMP反应池；(2)分别在线测定每个反应池生化反应前后混合液的电导率值；(3)从各反应单元电导率的变化推知LAMP反应结果，进而给出目标DNA信息。本方法的特点是简便快速、高灵敏度、操作简便、仪器设备简单廉价、费用低；可低成本地进行生物基因检测。可广泛用于食品、药品质量控制，环境监测，临床诊断，转基因生物及其产品甄别等领域。

Description

环介岛等温基因扩增结果分析方法

技术领域：

本发明属于基因检测技术，具体地说，就是通过在线监测阵列环介岛等温基因扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)反应液电导率的变化来反映生化反应进程，进而获得目标基因的定性、定量信息。

背景技术：

得到广泛研究与应用的LAMP基因检测技术是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在等温条件进行扩增反应，不需要模板的热变性和长时间温度循环，具有很多优越性(见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T：Loop-mediated isothermalamplification of DNA，Nucleic Acids Res 2000，28(12)：E63.)。与传统的PCR扩增技术相比，LAMP具有简便、快速、不需要昂贵的仪器设备、适合现场使用、特异性好等特点，因此解决了基于核酸的分子生物学检测技术的诸多难题，使快速、廉价诊断成为可能。其反应过程如下：

(DNA/RNA)_n-1+dNTP＝(DNA)_n+P₂O₇ ^4-        (1)；

P₂O₇ ^4-+2Mg²⁺＝Mg₂P₂O₇(沉淀)             (2)。

目前，对LAMP结果的分析，目前主要有以下几种：

1、肉眼直接观察生成的焦磷酸镁沉淀(见文献Enosawa M，Kageyama S，Sawai K，Watanabe K，Notomi T，Onoe S，Mori Y，Yokomizo Y：Use ofLoop-Mediated Isothermal Amplification of the IS900Sequence for Rapid Detectionof Cultured Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis，J.Clin.Microbiol.2003，41，4359-4365)，或滴加显色剂后观察颜色变化(见文献Zhang Q，Shi C，Huang J，Jia K，Chen X，Liu H：Rapid diagnosis of turbot reddish body iridovirus in turbotusing the loop-mediated isothermal amplification method，J.Virol.Meth.2009，158，18-23)——该方法缺点是主观误差不可避免。

2、浊度仪测定焦磷酸镁沉淀法(见文献Mori Y，Kitao M，Tomita N，Notomi T：Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA，J.Biochem.Biophys.Methods.2004，59，145-157)，——该方法缺点是增加了贵重仪器的投入，且对各相关试剂溶液的透明度都有苛刻要求。

3、电泳法(见文献Ihira M，Yoshikawa T，Enomoto Y，Akimoto S，Ohashi M，Suga S，Nishimura N，Ozaki T，Nishiyama Y，Notomi T，Ohta Y，Asano Y：RapidDiagnosis of Human Herpesvirus 6Infection by a Novel DNA Amplification Method，Loop-Mediated Isothermal Amplification，J.Clin.Microbiol.2004，42(1)，140-145)——该方法缺点是耗时较长，效率低。

4、荧光定量PCR仪作荧光定量检测(见文献蔡哲钧，冯杰雄，朱圣禾，核酸环介导等温扩增技术，国际检验医学杂志，2006，27，1092-1096)——该方法缺点是极大增加了使用成本，也不利于仪器小型化设计。

5、杂交生物传感器法(见文献孙伟，高宏伟，钟江华，覃鹏，焦奎，环介导等温扩增-纳米硫化镉标记电化学检测单增李斯特菌的方法，专利公开号：101260424和文献Ahmed M，Hasan Q，Hossain M，Saito M，Tamiya E：Meat speciesidentification based on the loop mediated isothermal amplification andelectrochemical DNA sensor，Food Control，2010，21，599-605)——该方法其缺点是传感器制作繁琐，且只能用一次。

综上所述，目前的扩增结果分析手段是制约LAMP更快发展与推广的关键因素。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是建立一种LAMP反应结果分析新方法，就是通过在线监测环介岛等温基因扩增(LAMP)反应液电导率的变化来反映生化反应进程，进而获得目标基因的定性、定量信息，可简便、快速、低成本地进行生物基因检测。

本发明是按以下技术方案实现的：

1、构建反应池-检测池：将4-96个电导率测定传感器探头排成阵列，每个探头腔体内插入一个0.2ml一次性薄壁管作为LAMP反应池，整个阵列嵌入由电加热装置与温控器构成的恒温槽内。开启电导率仪，即可在线感应测定每个薄壁管内液体的电导率值。

2、建立目标基因LAMP方法：确定LAMP反应混合液配方，根据靶基因数据库信息设计并合成对应于不同目标基因的成套引物。

3、制定工作曲线：将LAMP反应所需试剂混合后分装，向系列薄壁管中分别加入5μl标准浓度DNA梯度样品，置于保持65℃的反应池内30分钟。测定并记录各反应池开始反应及反应终点时的电导率数据，计算每个反应池测得电导率差值(Y)，并求出Y与标准DNA浓度值(C_x)之间的函数关系即得工作曲线。

对于定性检测要求的样品，无需建立该曲线，根据LAMP反应前后电导率变化差值直接判断结果：差值为零-阴性；差值大于零-阳性。

4、样品检测：常规方法提出待分析生物样品DNA代替标准样品，按步骤3进行。将所得每个反应池电导率差值带入工作曲线方程得到目标基因的定性、定量信息。

本发明与已有技术对比具有以下特点：

1、本方法可以通过测得的电导率变化来判断反应进程/结果，这种进程/结果与所加入的目标基因引物相关，可进而推断出目标基因的定性、定量信息。而电导率分析方法从本质上具有内在的优越性，得到的是电信号，不需要转换装置即可以直接输出，便于自动化，是典型的“绿色分析技术”。

2、本方法具有明显的快捷优势，可以快速高效实时监控反应进程。

3、本方法中不需要复杂昂贵的仪器设备，硬件成本低；使用能耗低；不使用光学、电学、生物学探针或指示剂，材料成本低，无健康危害风险。

4、该方法在食品、药品质量控制，环境监测，临床诊断，转基因生物及其产品甄别等诸多领域中，都具有广泛的应用前景。

具体实施方式：

下面通过实施例的两例来详细叙述本发明的技术方法(本发明不限于实例，实用广泛)。

实施例1、36份玉米转基因定性甄别：

步骤一、将38个电导率测定传感器探头排成阵列，每个探头腔体内插入一个0.2ml一次性薄壁管作为LAMP反应池，整个阵列嵌入由电加热装置与温控器构成的恒温槽内。

步骤二、常规方法提取36份玉米待测样品的DNA、1份转基因玉米的DNA(阳性)和1份非转基因玉米的DNA(阴性)。

步骤三、查数据库，得到玉米转基因启动子(CaMV 35S promoter)基因序列，设计外引物1、外引物2、内引物1、内引物2及两个成环引物LoopF和LoopB。

外引物1：5’-tccactgacg taagggatga；

外引物2：5’-caacacgtgagcgaaaccct

内引物1：5’-gagcgtgtcctctccaaatg caatcc cactatcctt cgca；

内引物2：5’-agtctct ctctacaaatcta gattaagggaatagaccctt；

LoopF：5’-cttatatagaggaagggtct；

LoopB：5’-g gtattattac acactcatc。

步骤四、将0.2μM的外引物1和外引物2、0.8μM的LoopF和LoopB、1.6μM的内引物1和内引物2、2mM Mg²⁺、0.8M甜菜碱、10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液、38μL Bst DNA聚合酶(8U/μL)迅速混匀并分装于1-38号0.2ml薄壁管内。向1-36号薄壁管内依次加入5μL 1-36编号的待测样品DNA溶液，向37和38号薄壁管内分别加入5μL阳性和阴性对照样DNA溶液。灭菌水补至每管终体积25μL，迅速置入恒温65℃的反应池阵列中，开启感应式电导率仪分别测定每个薄壁管内混合液的电导率值(S₀)。

步骤五、孕育30分钟后，分别测定每个薄壁管内混合液的电导率值(S₃₀)。

步骤六、结果判定：将每个反应池内所得S₃₀与S₀比较，数值不变的为阴性样品，数值降低的为阳性样品。阳性和阴性对照样反应池电导率数值的变化用来指示LAMP反应正常与否：

S₃₀(阳)-S₀(阳)＝0Ω/m-扩增不成功；

S₃₀(阳)-S₀(阳)＜0Ω/m-扩增成功；

S₃₀(阴)-S₀(阴)＝0Ω/m-正常，无模板DNA污染；

S₃₀(阴)-S₀(阴)＜0Ω/m-DNA污染形成假阳性。

实施例2、20个淡水水样中大肠杆菌(E.Coli)一般菌株的定量测定

步骤一、将20个电导率测定传感器探头排成阵列，每个探头腔体内插入一个0.2ml一次性薄壁管作为LAMP反应池，整个阵列嵌入由电加热装置与温控器构成的恒温槽内。

步骤二、常规方法提取20个待测水样中所有微生物的DNA并作相应编号。

步骤二、查数据库，得到E.Coli一般菌株通用保守基因序列，设计外引物1、外引物2、内引物1、内引物2及两个成环引物LoopF和LoopB。

外引物1：5’-atttaccgcagccagacg；

外引物2：5’-gccatctcctgatgacgc；

内引物1：5’-ctggggcgaggtcgtggtattccgacaaacaccacgaat；

内引物2：5’-cattttgcagctgtacgctcgcagcccatcatgaatgttgct；

LoopF：5’-ctttgtaacaacctgtcatcgaca；

LoopB：5’-atcaatctcgatatccatgaaggtg。

步骤三、制订工作曲线。将0.2μM的外引物1和外引物2、0.8μM的LoopF和LoopB、1.6μM的内引物1和内引物2、2mM Mg²⁺、0.8M甜菜碱、10×BstDNA聚合酶反应缓冲液、12μL Bst DNA聚合酶(8U/μL)迅速混匀并分装于1-12号0.2ml薄壁管内，然后按顺序分别向其中加入1×10^-16g/L、5×10^-16g/L、1×10^-15g/L、5×10^-15g/L、1×10^-14g/L、5×10^-14g/L、1×10^-13g/L、5×10^-13g/L、1×10^-12g/L、5×10^-12g/L、1×10^-11g/L和5×10^-11g/L的标准浓度DNA(提自E.Coli一般菌株)5μL。灭菌水补至每管终体积25μL，迅速置入恒温65℃的反应池阵列中，开启感应式电导率仪分别测定每个薄壁管内混合液的电导率值(S₀)。LAMP反应30分钟后，分别再测定每个薄壁管内混合液的电导率值(S₃₀)。计算每个反应池测得电导率差值(Y＝S₀-S₃₀)，并求出Y与标准DNA浓度值(C_x)之间的函数关系即得工作曲线方程。

步骤四、用20个待测水样中微生物的DNA代替标准样品DNA模板，按照步骤三获得各自的电导率差值Y，然后带入工作曲线方程得到E.Coli一般菌株DNA的浓度，然后换算出菌株浓度。

Claims (1)

1.一种环介岛等温基因扩增结果分析方法，其特征在于它是通过测定环介岛等温基因扩增反应液电导率的变化数据来获得目标基因的定性、定量信息的分析方法；

所述分析方法包括以下步骤：

(1)构建反应池—检测池：将4-96个电导率测定传感器探头排成阵列，每个探头腔体内插入一个0.2ml一次性薄壁管作为环介岛等温基因扩增反应池，整个阵列嵌入由电加热装置与温控器构成的恒温槽内；开启感应式电导率仪，即可在线感应测定每个薄壁管内液体的电导率值；

(2)建立目标基因环介岛等温扩增方法：确定环介岛等温基因扩增反应混合液配方，根据靶基因数据库信息设计并合成对应于不同目标基因的成套引物；

(3)制定工作曲线：将环介岛等温基因扩增反应所需试剂混合后分装，向系列薄壁管中分别加入5μl标准浓度DNA梯度样品，置于保持65℃的反应池内30分钟；测定并记录各反应池开始反应及反应终点时的电导率数据，计算每个反应池测得电导率差值Y并求出Y与标准DNA浓度值Cx之间的函数关系即得工作曲线；

(4)样品检测：常规方法提出待分析生物样品DNA代替标准样品，按步骤(3)进行；将所得每个反应池电导率差值带入工作曲线方程得到目标基因的定性、定量信息。