JP2014023434A - デンタルプラークの細菌叢の解析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は被験者からデンタルプラークを採取し、採取したデンタルプラーク中のDNAを抽出し、抽出されたDNA中の16S rRNA遺伝子を増幅し、増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする微生物の解析方法を提供する。
【選択図】図2
Description
デンタルプラークはバイオフィルムの成熟に伴い、細菌の種類ならびに各細菌の割合が変化することでその病原性が変化すると考えられる。これまでのところデンタルプラークを構成する細菌叢の経時的変化については1967年にRitz HLが報告した結果(非特許文献1)に報告がある。しかし、この報告のみでは、複雑な細菌叢を背景とする齲蝕原性バイオフィルムの詳細な構成を解明するには多くの課題を残している。
また、本発明は被験者からデンタルプラークを採取し、採取したデンタルプラーク中のDNAを抽出し、抽出されたDNA中の16S rRNA遺伝子を増幅し、増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする、齲蝕になりやすさを診断する方法を提供する。
さらに、本発明は被験者からデンタルプラークを採取し、採取したデンタルプラーク中のDNAを抽出し、抽出されたDNA中の16S rRNA遺伝子を増幅し、増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする、齲蝕になりやすさの診断を補助するためのデータ収集方法を提供する。
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16S rRNAとはリボソームのサブユニットを構成するRNAである。リボソームは配列の保存性が高く、生物種の比較の際の目安となりやすい。中でも16S rRNAは適度な長さを持っており、生物種の決定に好都合に用いられる。
細菌叢とは、特定の環境中に存在する細菌の集合をいう。本明細書において、細菌とは、微生物のことを指し、真正細菌のみでなく、古細菌、真核生物、菌類、粘菌、ウィルスなどを含む。
本実施例では、齲蝕多発群と齲蝕経験のない群とで細菌の構成に差が見られる場合を示す。被験者から採取して解析した細菌の構成が、齲蝕多発群の細菌構成に一致する、あるいは、類似すれば、齲蝕になりやすさが高いと診断でき、齲蝕経験のない群の細菌構成に一致する、あるいは類似すれば、齲蝕になりやすさが低いと判断することができる。
マイクロリアクターとは、微小なサイズの反応容器のことであり、より具体的にはエマルジョンを挙げることができる。近年、大量遺伝子解析の際、あらかじめアダプターを付加された遺伝子を、アダプターを介してビーズに結合して、エマルジョン内で増幅することで、ビーズ上で、クローナルに遺伝子を増幅する技術が用いられている。
キットは、それぞれの方法を実施するために用いられる、各種試薬、バッファー、酵素、オリゴDNAのほか、デンタルプラークを採取するための綿棒などの道具、あるいは、口腔内プラーク形成装置を含むことができる。
九州大学歯学部の学生を対象にボランティアを155名程募り、ボランティア全員に対して齲蝕の診査を行った。齲蝕の診査は、歯冠部齲蝕については社団法人日本学校歯科医会の「う歯(C)及び要観察歯(CO)の検出基準」に準じて齲歯(C)を検出し、根面齲蝕についてはWHOの基準に準じてCを検出した。その結果に基づき、齲蝕を多発する10名を被験者として選んだ。また、被験者に過去の齲蝕経験を質問し、その結果をもとに齲蝕を有さない被験者からなるグループを10名設定した。すなわち、合計20名を本実施例における被験者とした。
被験者の年齢、性別および齲蝕に関する健康パラメータを表1に示す。各10名ずつ、齲蝕を多発する被験者からなるグループ(被験者A〜J)ならびに齲蝕を有さない被験者からなるグループ(被験者K〜S)を選出した。なお、実験開始後、装置装着に対する違和感のため協力できない者が齲蝕を有さない被験者からなるグループに1名発生したため、最終的には齲蝕を有さない被験者からなるグループは9名となった。
被験者の年齢は21歳から28歳であり、齲蝕を多発する被験者からなるグループの平均年齢は24.1歳、齲蝕を有さない被験者からなるグループの平均年齢は23.2歳であったが、t検定により両群間に有意な差は認められなかった。
in vivoでのデンタルプラークの形成のため、図1に示す着脱可能なデンタルプラーク形成装置を作成した。経日的なプラーク形成過程の観察には10日間程度成熟させたプラークが必要であるが、実際の歯面のプラークの清掃を被験者に長期間停止させることは侵襲性や不快感を考えると倫理的に不可能である。そのため、図1に示す着脱可能な口腔内装置を開発した。
被験者の下顎歯列の印象を採得し、採取した印象をもとにマウスピース様の装置を歯科用の即時重合レジンを用いて作製し、装置による咬頭干渉がないように架橋部を残して咬合面を削除した。両側の臼歯部頬側面には、スティッキーワックスによって、歯面の代替となる焼結体合成ハイドロキシアパタイトのプラーク形成プレート(直径5mm、厚さ2mmの円筒状のプレート)を6枚ずつ接着し、プラークの形成面とした。装置の装着にあたっては、被験者に試適し、歯肉や粘膜への侵襲がないことおよび発音障害などが生じないことを確認した。
装着に際しては、以下の点を被験者に確認した。
(1)食事および歯磨き時は装置を外し、生理食塩水を満たしたケースに入れて保管すること。
(2)その際、決してハイドロキシアパタイトのプレートの面には触れないこと。
(3)食事および歯磨き時以外は常に装置を装着しておくこと。
装置装着から5日目までは1日ごとに1枚、さらに7日目に1枚、装置からプラーク形成プレートを取り外し,溶菌液の入ったチューブの中に浸漬した。超音波処理でプラーク形成プレートからプラークを剥ぎ取り、遠心分離機でプラークを一旦沈殿させ、溶菌液からプラーク形成プレートを除去した。取り除いたプラーク形成プレートについては、その表面にプラークの付着が無いことを顕微鏡で確認した。
サンプル中に含まれるDNAの抽出は、非特許文献2の方法を一部改良して行った。菌を採取したチューブの中に0.3gのzirconia−silica beads(直径0.1mM:Biospec Products,USA)と1個のtungsten−carbide bead(直径3mM:Qiagen,Germany)を加えて90℃で10分間加温した後、Disruptor Genie(Scientific Industries,Inc.,USA)を用いて菌体を震盪、破砕し、200μlの1% SDS溶液を加えて、70℃で10分間加温した。さらに、蛋白質成分を除去するため、フェノール(v/v)による抽出を1回、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール(25:24:1、v/v)混合溶液による抽出を1回行った後、エタノール沈殿処理を行い、生じた沈殿物を50μlのTE溶液(1mM EDTA を含む10mMトリス塩酸緩衝液 ; pH8.0)に溶解し、DNA試料として分析時まで−30℃で凍結保存した。
抽出DNA試料から16S rRNA遺伝子を増幅した。この際、アダプター配列と、検体ごとに人為的に取り決めた遺伝子配列(タグ)、が含まれるように増幅した。
すなわち、5’側にアダプター配列 Life Sciences adaptor Aと6塩基のタグ配列(CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG NNN NNN)を付与した8F(AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG)をフォワードプライマーとして、アダプター配列 Life Sciences adaptor B(CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG)を付与した338R(GGA CTA CCR GGG TAT CTA A)をリバースプライマーとしてPCR法により行った。用いたプライマーの配列を表2に示す。なお、検体数に対し、プライマーの種類が少ないが、これは反応と解析を3回に分けて行ったためである。
すなわち、上記で得られたアダプターが付加されたDNAは、一本鎖にした後、アダプターを介してビーズに結合した。ビーズを油水エマルジョンの中に包み込み、ビーズ1つとDNAフラグメント1つを持つマイクロリアクターを形成し、リアクター内にてDNA断片を増幅した。増幅反応後DNAフラグメントがビーズに結合している状態で油水エマルジョンを破壊した。
得られた塩基配列データは、まずPHPで記述したスクリプトにより断片長が240塩基以下のもの、平均Quality scoreが25を下回るものを取り除き、次にRで記述したスクリプトにより8Fプライマーを含まないもの、6塩基を超えるホモポリマーを含むもの、Nを含むものを解析から除外した。残りの配列については挿入した6塩基のタグ配列の情報をもとに各被験者に振り分けた。それぞれの配列はHuman Oral Microbiome Database(HOMD)に登録されている1647の口腔細菌16S rRNA遺伝子配列(HOMD rRNA RefSeq Extended Version 1.1)に対して相同性検索を行い、98.5%以上の相同性が認められた場合該当の菌種に振り分けた。振り分けられなかった配列についてはRDP pyrosequencing pipeline に公開されているcomplete−linkage clustering toolを用い、97%以上の相同性を持つものをOperational taxonomicUnit(OTU)としてまとめた。さらにDereplicate request functionを用い各OTUから代表配列を選出した。代表配列はRDP classifierを用いて属レベルまでその由来を決定した。
なお、各菌の存在比率の比較にはWilcoxon rank−sum test を用いた。
19名の被験者から得られた1から5日目のプラーク検体、計95サンプルについて16S rRNA遺伝子のパイロシーケンスを行い、プライマーに組み込まれたタグ配列を元にデータの解析を行った。得られた372,296 リードの塩基配列のうち、解析可能なものは244,017リードであった。検体ごとの解析リード数を表3に示す。平均2568 ± 916リード、最高4717リード(R,Day4)、最低827 リード(N,Day3)であった。
齲蝕多発群と齲蝕経験のない群について、検出OTU(細菌種)数、Chao1、Shannon indexの比較を行った。3日目、4日目については解析リード数に差が認められるため一概に比較することは出来ないが、1日目と2日目は、齲蝕経験のない群において、齲蝕多発群に比べて有意に多くのOTUが検出されており、プラーク形成初期においては齲蝕多発群の細菌群集構成がよりシンプルであることが示唆された。最大検出OTU数であるChao1、細菌群集の複雑さを示すShannon index においても有意とはいえないものの、同様の傾向が認められた(表4)。
19名の被験者のプラーク中からは40菌属と属レベルまでは分類することの出来ない24の細菌群が検出された。そのうちStreptococcus、Neisseria、Terrahaemophilus、Gemella、Rothia、Granulicatella、Prevotella、Actinomyces の8菌属は19名全員から検出され、これら8菌属で全体の7割以上を占めていた。各菌属の構成比率を図2に示す。Streptococcusが経過日数に関わらず最も優勢である一方で、その比率は日数経過に伴って減少が認められた。反対に上記8菌属以外の細菌の比率が日数の経過とともに増加していた。
菌属レベルでの細菌構成の比率を図3から図5に示す。図3以降の図においては、縦軸はパーセントを示し、横軸は19人の被験者に対応している。検出された64の菌属ないし細菌群のうち、9つは齲蝕多発群と齲蝕経験のない群の間にその存在比率に有意な違いが認められた。そのうちAbiotrophia、Class beta−proteobacteria、Gemella、Granulicatella、Neisseria、Porphyromonas、TM7は、5日間のうちどこかで齲蝕経験のない群で多く存在した。特にGemella、Neisseria の2菌属はプラーク形成初期、すなわち1日目から3日目にかけて齲蝕経験のない群で有意に高比率検出されており、細菌の初期付着過程における齲蝕病原性の違いに何らかの影響を及ぼしている可能性が考えられる。一方でStreptococcus は2日目に、Veillonella は2、4、5日目に齲蝕多発群において有意に高比率検出された。特にVeillonellaが齲蝕多発群においてプラーク成熟期にその比率が増加しているのは興味深い。これらの結果は齲蝕のなりやすさの診断の際の基準となりうる。
菌属レベルでの細菌構成の比率を図6から図8に示す。今回検出された500OTUのうち、12OTUは齲蝕多発群と齲蝕経験のない群の間でその存在比率に有意な違いが認められた。そのうち8OTUは齲蝕経験のない群で優勢になっており、4OTUは齲蝕多発群で優勢であった。Neisseria flava とGemella haemolysans は付着初期に齲蝕経験のない群で特に高比率で検出された。Gemella属についてはその他のGemella属の菌種(G. sanguinis、G. morbillorum)については有意差こそ認められないものの齲蝕多発群でより高頻度に検出されており、前年度のT−RFLP解析における結果とも良く一致していたと言える。反対に齲蝕多発群において高比率で検出されたのは、Veillonella sp. OT53とStreptococcus oralis であった。Streptococcus oralis は1日目こそ有意差が認められないものの5日間にわたり齲蝕多発群において非常に高比率で検出され、かつコントロール群でほとんど検出されなかった。これらの結果は齲蝕のなりやすさの診断の際の基準となりうる。パイロシーケンスのリード長は400塩基弱と短く菌種同定精度には若干不安があるため本結果からS. oralis であると言い切るには至らないが、齲蝕に関連のある特定のStreptococcus 属の菌種の存在が示唆されたといえる。ちなみに本OTUの塩基配列はS. mutans、S. sobrinus とは大きく異なっており、これらの菌種とは考え難い。
本研究から、歯の表面に形成されるデンタルプラークの形成過程には個人差があるが、縁上プラークはほぼ4日間程度で一定の細菌叢に落ち着くことが示唆された。また、齲蝕多発群と齲蝕経験のない群のプラーク細菌叢はプラーク形成後4日目の菌叢全体像のパターン分析によって明確に識別できた。両群間では年齢に有意な差はなく、齲蝕の誘発に関連する唾液流出量や緩衝能にも有意な差が認められなかったことから、両群間の齲蝕経験の差の大部分はプラークを構成する細菌種の差によって説明できると考えられる。また、本実施例で示された、齲蝕多発群と齲蝕経験のない群との細菌の構成の差は、被験者から採取して解析した細菌の構成から、齲蝕になりやすさの判断の基準となりうる。
Claims (10)
- 被験者からデンタルプラークを採取し、
採取したデンタルプラーク中のDNAを抽出し、
抽出されたDNA中の16S rRNA遺伝子を増幅し、
増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする
デンタルプラークの細菌叢の解析方法。 - 被験者からデンタルプラークを採取し、
採取したデンタルプラーク中のDNAを抽出し、
抽出されたDNA中の16S rRNA遺伝子を増幅し、
増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする、
齲蝕になりやすさの診断を補助するためのデータ収集方法。 - 16S rRNA遺伝子を増幅する際にマイクロリアクター内で増幅されることを特徴とする請求項1または2のいずれかに記載の解析方法。
- 遺伝子の配列の解析は、パイロシーケンス法によることを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の解析方法。
- 16S rRNA遺伝子を増幅する際に検体に特有のタグ配列を付加したプライマーを使用することを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の解析方法。
- プラーク形成から1から5日目のいずれかにおいてデンタルプラークを採取することを特徴とする請求項1から5のいずれかに記載の解析方法。
- プラーク形成から4日目のデンタルプラークを採取することを特徴とする請求項5に記載の解析方法。
- 口腔内プラーク形成装置を用いて形成されたデンタルプラークを採取することを特徴とする請求項1から7のいずれかに記載の解析方法。
- 請求項1および請求項1に係る請求項3から8の解析方法に用いられるデンタルプラークの細菌叢の解析キット。
- 請求項2および請求項2に係る請求項3から8のデータ収集方法に用いられる齲蝕になりやすさの診断キット。
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