JP2009509527A - 変異させた集団のハイスループットスクリーニング - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
「逆遺伝学」は、TILLING集団を使用する最も一般的な方法である。対象となる遺伝子は、例えば、転写プロファイリング又は候補遺伝子アプローチによって同定され、応答すべき問題は、この遺伝子が対象となる或る特定の表現型形質に影響するかどうかである。したがって課題は、この遺伝子の機能欠損変異を有する1つの(又はいくつかの)植物を同定することである。これは、典型的には、下記工程を含む多重工程のスクリーニング過程において一般に実行される:
1.TILLING集団の多数の(プールした)M2植物(例えば3072個)のゲノムDNAを単離する。
2.1つのプール当たり8〜32の植物からの等しい量のDNAのプールは、CEL Iスクリーニング系の感受性に依存するプールレベルで集められる(以下を参照)。これは3072の植物の場合には、合計96〜384のプールしたDNAサンプルをもたらす。
3.すべてのプールされたDNAからの遺伝子の部分を増幅するために、標識されたPCRプライマーを使用する。オーバーラップしたPCR断片を、遺伝子全体をカバーするために使用する(例えば、600bpである複数のPCR断片が1500bpである1個の遺伝子から3回増幅される)。
4.プールされたDNAサンプルから採取されたPCR産物のヘテロ二本鎖を調製し、単一のヌクレオチド配列のミスマッチを認識し切断するCEL I又は他の酵素(例えば、マングビーンヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ及びサーベイヤー(Surveyor)等)と共にインキュベートし、処理されたサンプルを変性(シークエンシング)ゲル上で又はキャピラリー電気泳動法によって分離する。
5.遺伝子中の変異を保有する植物を含むプールは、CEL I処理に起因する消化産物のバンドを観察することにより同定される。
変異させた集団の植物を成長させ、対象となる形質について表現型の分析を行なった。次に、対象となる表現型に連鎖していない変異を外部交配するために、対象となる表現型を有する植物を野生型の植物と交配する。最終的に、対象となる表現型に関連する原因変異遺伝子は、従来の遺伝学的マッピング集団(F2、RIL(組換え近交系統)等))におけるマッピングQTL(量的形質遺伝子座)と類似したポジショナルクローニング(遺伝的マーカーを使用して)によって同定される。理論上可能ではあるが、変異させた集団は、一般にはこのように使用されない。
以下の説明及び実施例において、多くの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含む、明細書及び特許請求の範囲についての明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。特別に本明細書において定義されないならば、使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献の開示は、参照によりそれら全体は本明細書において援用される。
(a)変異させた集団の各メンバーのゲノムDNAを単離して、集団の各メンバーのDNAサンプルについて提供する工程と、
(b)工程(a)で採取されたDNAをプールする工程と、
(c)1組の(任意的に標識された)プライマーによりDNAプールから標的配列を増幅する工程と、
(d)工程(c)の増幅産物をプールして、増幅産物のライブラリーを作成する工程と、
(e)ライブラリー中の増幅産物を任意的に断片化する工程と、
(f)ハイスループットシークエンシングを使用して、産物及び/又は断片のヌクレオチド配列を決定する工程と、
(g)断片の配列をクラスタリングすること(アライメントさせること)によって変異を同定する工程と、
(h)標的配列の修飾された機能について同定された変異をスクリーニングする工程と、
(i)同定された変異へハイブリダイズするように向けられたプライマーを設計する工程と、
(j)工程(i)のプライマー、及び工程(c)のプライマーのうちの1つにより工程(d)のライブラリーを増幅する工程と、
(k)変異を保有するメンバー(複数可)を同定する工程と、
(l)任意で、工程(c)のプライマーを使用して工程(k)のメンバー(複数可)からの標的配列を増幅することによって変異を確認する工程及び増幅された産物の配列を決定する工程と
を含む、変異させた集団のメンバーの標的配列中の変異の検出のための方法へ向けられる。
シングとの5工程から成る。方法はより詳細に以下で説明されるだろう。
(a)単一のアダプター化された断片が各々のビーズへアニールされている状態で、アダプター化された断片をビーズへアニールする工程と、
(b)各々の油中水滴型マイクロリアクターが単一のビーズを含む、油中水滴型マイクロリアクター中でビーズを乳化する工程と、
(c)各々のウェルが単一のビーズを含む、ウェル中にビーズを入れる工程と、
ピロリン酸シグナルを生成する工程とを含む。
(a)集団における各々のメンバーのDNAサンプルを提供するために、変異させた集団の各々のメンバーのゲノムDNAを単離する工程と、
(b)工程(a)で得られたDNAをプールする工程と、
(c)好ましくはプライマーのうちの少なくとも1つが、遺伝子特異的セクション、タグ及びシークエンスプライマー結合部位を含む、1組のタグを付けた(任意で標識した)プライマーにより、DNAプールから標的配列の一部又はセグメントを増幅する工程と、
(d)増幅産物のライブラリーを作成するために工程(c)の増幅産物をプールする工程と、
(e)ハイスループットシークエンシングを使用して、増幅産物のヌクレオチド配列を決定する工程と、
(f)断片の配列をクラスタリングすること(アライメントさせること)によって変異を同定する工程と、
(g)タグを使用して、変異があるメンバー(複数可)を同定する工程と、
(h)任意で、工程(c)のプライマーを使用して工程(g)のメンバー(複数可)からの標的配列の増幅により変異を確認する工程、及び増幅された産物の配列を決定する工程と
を含む、変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法に関する。
(i)次のシークエンシング工程で使用することができるシークエンスプライマー結合部位と、
(ii)プライマー(及び結果として生じる増幅産物)を集団のもとのメンバーに連結する役目をするタグと、
(iii)対象となる標的配列(すなわち遺伝子)にアニールすることができる遺伝子特異的配列とを含む。
5’−シークエンスプライマー結合部位−タグ−遺伝子特異的PCRプライマー配列−3’
シークエンスプライマー結合部位及び遺伝子特異的なPCRプライマー配列の長さは、一般のPCR使用において通常の長さであり、すなわち、独立して約10bp〜約30bp、好ましくは15bp〜25bpである。好ましくは、増幅される配列の部分又はセグメントは、下記に述べられるハイスループットシークエンシング技術を使用して、1回の実行でシークエンスすることができる長さに相当する。或る特定の実施形態において、部分又はセグメントは、約50bp〜約500bpの間、好ましくは約75bp〜約300bp、及びより好ましくは約90bp〜約250bpの長さを有する。上で述べられたように、この長さは、今なお開発されている技術を含む使用されたシークエンシング技術に応じて変化してもよい。
(1)(a)5’−コンスタントセクションに連結された(b)縮重タグセクション(NNNN)に連結された(c)遺伝子特異的セクション−3’を含む、ロングPCRプライマー、及び
(2)(a)5’−コンタクトセクションに連結された(b)非縮重タグセクション−3’(すなわち、NNNNの中の選別)から成り、次に増幅されるショートPCRプライマーを含むことを特徴とするタグのシステムを使用することができる。非縮重タグセクションは、各々のサンプルに特有であり、例えば、サンプル1ではACTG、サンプル2ではAATC等である。ショートプライマーは、ロングプライマーのサブセットにアニールする。プライマーのコンスタントセクションは、シークエンスプライマーとして使用することができる。図3を参照。
(1)1500bp遺伝子全体がEMS誘発変異の存在について調べられる場合のアプローチ及び
(1)1つ又は複数の100bpストレッチがEMS誘発変異の存在について調べられる場合のアプローチである。
実施例I
TILLING集団の3072の植物のゲノムDNAを単離する。1植物当たり等量のDNAの3Dプーリングスキームを構築し(例えば、15×15×14)、3072/14=219又は3072/15=205の異なるDNAサンプルを含む44プール(15+15+14=44)がもたらされる。(Vandenbussche et al.、上記)。
実施例II
(100bpは1回の454シークエンス実行の読み取りの長さである)
TILLING集団の3072の植物のゲノムDNAを単離する。1植物当たり等量のDNAの3Dプーリングスキームを構築し(例えば、15×15×14)、3072/14=219又は3072/15=205の異なるDNAサンプルを含む44プール(15+15+14=44)がもたらされる。(Vandenbussche et al.、上記)。
5’−シークエンスプライマー結合部位−4bpタグ−遺伝子特異的プライマーシークエンス−3’。
実施例III.トマトの変異体ライブラリー中の特異的突然変異の同定
この実施例は、特異的な遺伝子座(標的遺伝子)中の点変異を同定するために、大量の並列のシークエンシングによるトマトの変異体ライブラリーのスクリーニングを記述する。使用される変異体ライブラリーは、EMS変異誘発処理に由来する、5075のM2ファミリーから成る近交系有限花序トマト栽培品種M82の同質遺伝子ライブラリーである。5075のM2ファミリーの各々の種子を10%の相対湿度及び7℃で保存した。ライブラリーの起源及び特性は、Menda et al.(Plant J. 38: 861-872, 2004)及びhttp://zamir.sgn.cornell.edu/mutants/index.html上のデータベース中に記述されている。
葉の材料は、ライブラリーから無作為に選択され、3072のM2ファミリーの5つの個別の温室で栽培された植物から採取された。ライブラリー中で生じる任意の変異はM2子孫においてメンデルの法則の様式で分離するので、5つの個別のM2植物の葉材料のプーリングは、分離結果として、0.1%未満の任意の変異を見落とす可能性を減少させた。ゲノムDNAを、Stuart and Via (Biotechniques, 14: 748-750, 1993)によって記述された改変CTAB手順を使用して、プールされた葉の材料から単離した。DNAサンプルを、TE(10mMトリスHCl pH 8.0、1mM EDTA)中に100ng/μlの濃度で希釈し、96ウェルマイクロタイタープレート中で−20℃で保存した。
単離されたDNAサンプルを、20ng/μlの濃度に正規化し、続いて4重にプールし、その結果8枚の96ウェルマイクロタイタープレート中に含まれる768のサンプルがもたらされた。続いてこれらの8枚のマイクロタイタープレートは、3Dプーリングストラテジーにかけられ、DNAの28プールがもたらされた。3Dプーリングストラテジーは3つの異なる様式ですべてのDNAを一緒にプールすることから成り、したがって、各々の単独の4重プールがX座標プールで一度のみ、Y座標プールで一度のみ、及びZ座標プールで一度のみ生じることを保証する。Xプールは、8枚のマイクロタイタープレートすべてから、8つのウェルの1つの段当たりのすべてのDNAサンプル(例えば、A1〜H1)を一緒にプールすることによって組み立てられ、12のXプールをもたらした。したがって各々のXプールは、8(段中のウェル)×8(プレート)=4重プールの64サンプル保有し、256のM2ファミリーを表わす。Yプールは、8枚のマイクロタイタープレートすべてから、12のウェルの1つの列当たりのすべてのDNAサンプル(例えば、A1〜A12)を一緒にプールすることによって組み立てられ、8つのYプールをもたらした。したがって各々のYプールは、12(列中のウェル)×8(プレート)=4重プールの96サンプルを保有し、384のM2ファミリーを表わす。Zプールは、マイクロタイタープレート全体から、すべてのDNAサンプルを一緒にプールすることによって組み立てられ、8つのZプールをもたらした。したがって各々のZプールは、12×8=4重のプールの96サンプルを保有し、384のM2ファミリーを表わす。
この実施例における標的遺伝子座は、真核生物開始因子4Eに対するトマト遺伝子の一部であった(eIF4E)。この遺伝子は、シロイヌナズナ(Duprat et al., Plant J. 32: 927-934, 2002)、レタス(Nicaise et al.Plant Physiol. 132: 1272-1282, 2003)及びナス科(Ruffel et al, Plant J. 32: 1067-1075, 2002; Mol Gen. Genomics 274: 346-353, 2005)中のポチウイルスの感染に対する感受性に関与することが示され、この遺伝子における特異的変異は劣性のポチウイルス抵抗性に関連する。この実施例で記述される変異スクリーニングは、トマトeIF4E遺伝子における付加的変異を、新しいポチウイルス抵抗性の可能性のあるソースとして同定することを目的とした。トマトeIF4Eについては、cDNA配列のみが既知である(NCBIアクセッション番号AY723733及びAY723734)。cDNA配列に基づいて設計されたプライマーを使用するPCRアプローチを使用して、トマト栽培品種マネーバーグ(Moneyberg)のeIF4E遺伝子座のゲノム配列の断片を増幅及びシークエンスした。この結果、トマトeIF4Eの大部分のゲノム遺伝子座の配列が得られた。この遺伝子座は、4つのエクソン及び3つのイントロンから成る。変異スクリーニングのために、上記遺伝子のエクソン1が標的配列として選ばれた(配列番号57)。
ATGGCAGCAGCTGAAATGGAGAGAACGATGTCGTTTGATGCAGCTGAGAAGTTGAAGGCCGCCG ATGGAGGAGGAGGAGAGGTAGACGATGAACTTGAAGAAGGTGAAATTGTTGAAGAATCAAATGA TACGGCATCGTATTTAGGGAAAGAAATCACAGTGAAGCATCCATTGGAGCATTCATGGACTTTT TGGTTTGATAACCCTACCACTAAATCTCGACAAACTGCTTGGGGAAGCTCACTTCGAAATGTCT ACACTTTCTCCACTGTTGAAAATTTTTGGGG
プライマーは、トマトeIF4Eのエクソン1のPCR増幅のために設計された。フォワードプライマーは、ATGの5’で4塩基のタグ配列をともない、エクソン1のオープンリーディングフレームのATG開始コドンに対応するように設計され、28のプールの各々のために特有の識別子を提供した。フォワードPCRプライマーの離れた5’末端で、5’−Cが追加された。すべてのプライマーは、続いて行なわれるアダプターのライゲーションを容易にするために、それらの5’末端でリン酸化された。28のフォワードプライマーの配列及び名称は、表1中にリストされる。タグ配列には、下線が引かれる。
標的遺伝子座のエクソン1を、上で記述されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して、3DプールされたDNAから増幅した。各々のPCR反応のために、フォワードプライマーとリバースプライマーとを同じタグと共に使用した。28の3Dプールの各々からのエクソン1の増幅のために、フォワードプライマー及びリバースプライマーの異なるセットを使用した。各々のサンプルのためのPCR増幅反応条件は、以下のとおりであった:25μl DNA(=50ng)、5μl RNase混合物、10μl 5×Herculase PCRバッファー、0.6μlの4種類のdNTPs(20mM)、1.25μlフォワードプライマー(50ng/μl)、1.25μlリバースプライマー(50ng/μl)、0.5μl Herculase DNAポリメラーゼ、28.9μlミリQ精製水。RNase混合物は、157.5μlミリQ精製水+17.5μl RNaseから成った。
3Dプールからの混合増幅産物は、Margulies et al.(Nature 437: 376-380, 2005、及びオンライン追補)によって記述されるような、454 Life Sciencesシークエンシング技術を使用するGS20シークエンサー上で、ハイスループットシークエンシングにかけられた。具体的には、Margulies et al.によって記述されるようなエマルジョンPCR増幅、及び続いて行なわれる断片シークエンシングを容易にするために、PCR産物をアダプターへライゲーションした。454アダプター配列、エマルジョンPCRプライマー、シークエンスプライマー及びシークエンスの実行条件は、すべてMargulies et al.によって記述される。454シークエンシング過程においてセファロースビーズ上で増幅されたエマルジョンPCR断片中の機能的要素の直線状順序は、以下のとおりだった:454 PCRアダプター−454シークエンスアダプター−Cヌクレオチド−4bpタグ−標的増幅プライマー配列1−標的断片内部配列−標的増幅プライマー配列2−4bpタグ−Gヌクレオチド−454シークエンスアダプター−454PCRアダプター−セファロースビーズ。
マイクロタイタープレートの各々の領域に対して、454のソフトウェアによるベースコーリング(塩基呼び出し)後に、FASTAによりフォーマットされたシークエンスを備えたファイルが生成された。これらは1つのファイルへ連結された。このファイル内で、検索は、5ヌクレオチド(Cプラス4bpタグシークエンス)が挿入されたフォワードプライマーの100%マッチに対する正規表現により行なわれた。同様なことが、5ヌクレオチド(Cプラスタグシークエンス)により延長されたリバースプライマーで行なわれた。次にすべての配列を、個別のファイルにおいてそれらのタグ配列(プール識別子)によってグループ化した。各々のファイルはssahaSNPツールにより分析され、既知のエクソン1ヌクレオチド配列を参照とした。ssahaSNPツールは、すべての単一ヌクレオチド配列差異、及び454シークエンス対参照ゲノムの「インデル」(変異誘発又は誤ったベースコーリングのいずれかの結果としての単一の塩基挿入又は単一の塩基欠失)について報告した。これらの単一のヌクレオチド配列差異及びインデル統計はデータベース中に保存され、エラー率分析及び点変異同定のために使用された。
組み合わせた28のプールすべてに対するデータ処理から得られた正確な配列の総数は、247052であった。配列は、フォワードプライマー及びエクソン1のPCR産物(128594=52%)のコード鎖(5’末端)でアライメントさせた群、並びにリバースプライマー及びPCR産物(118458=48%)の相補鎖でアライメントさせた群の、2つの群に分割された。異なるプール及びアライメント群の各々から得られた配列の数は、69〜7269にわたった。平均では、3072のM2ファミリーの各々は、配列の全回収において80回及び各々の対立遺伝子で40回で表わされたものとする。
このスクリーニングの目的が(EMS)誘導点変異(優先的にC→T変異及びG→A変異)の同定であるので、参照配列に対する比較においてインデルを表わす配列はすべて、この実施例における分析のために廃棄された。大部分の単一の塩基置換は、任意の与えられた3Dプールにおいて一度のみ生じ、いくつかは2回若しくは3回、又は稀により頻繁に生じる。これらの単一の塩基置換は、アライメントさせた配列のすべての位置で一様に、且つ、均一の頻度で塩基当たり0.005%で生じるので、それらは、シークエンシングエラーを表わし、変異体ライブラリー中に存在する特異的変異ではないと憶測された。しかしながら、スキャンされた配列中の少数の特異的塩基位置では、特異的な単一の塩基配列差異がはるかに高い発生で生じる。以下の基準が満たされる場合、そのような単一の塩基配列差異はライブラリー中の変異を示す:
1.単一の塩基配列差異はC→T又はG→Aの変異を表わす。
2.出現率は、3Dプール当たり10000配列読み取り当たり、20以上である。
3.単一の塩基配列差異が、正確に1つ及び多くて1つの、Xプール、Yプール及びZプールに生じる。
この実施例において、そのような変異の1つは、リバースプライマーに対応するアライメント群中にeIF4Eエクソン1配列の塩基位置221で発見された。G→A変異(相補的な鎖におけるC→Tに対応する)であるこの変異が、10000の配列当たり70の頻度でプールX12中に、10000配列当たり33の頻度でプールY3中に及び10000配列当たり62の頻度でプールZ6中に生じた。同様な位置でのこの同様な変異は、バックグラウンドエラーレイトにおいても生じず、他のプールのうちのいずれかにも生じなかった。
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Claims (17)
- 変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法であって、
(a)前記変異させた集団の各々のメンバーのゲノムDNAを単離して、各々の集団メンバーのDNAサンプルを提供する工程と、
(b)工程(a)で得られた前記DNAをプールする工程と、
(c)前記DNAプールからの1組の(任意に標識された)プライマーにより前記標的配列を増幅する工程と、
(d)工程(c)の前記増幅産物をプールして増幅産物のライブラリーを作成する工程と、
(e)前記ライブラリー中の前記増幅産物を任意に断片化する工程と、
(f)ハイスループットシークエンシングを使用して、前記増幅産物又は断片の前記ヌクレオチド配列を決定する工程と、
(g)前記断片の前記配列をクラスタリング/アライメントすることによって変異を同定する工程と、
(h)前記標的配列の修飾された機能について前記同定された変異をスクリーニングする工程と、
(i)前記同定された変異に対してハイブリダイズするようなプライマーを設計する工程と、
(j)工程(i)の前記プライマー、及び工程(c)の前記プライマーのうちの1つにより工程(d)の前記ライブラリーを増幅する工程と、
(k)前記変異を保有する前記集団メンバーを同定する工程と、
(l)工程(c)の前記プライマーを使用して工程(k)のメンバーからの前記標的配列を任意に増幅することによって、前記変異を確認する工程、及び前記増幅された産物の前記配列を決定する工程と
を含む変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法。 - 変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法であって、
(a)前記変異させた集団の各々のメンバーのゲノムDNAを単離して、各々の集団メンバーのDNAサンプルを提供する工程と、
(b)工程(a)で得られた前記DNAをプールする工程と、
(c)前記DNAプールからの1組のタグ付けされた(任意に標識された)プライマーにより標的配列部分を増幅すると共に、該プライマーのうち少なくとも1つが、好ましくは遺伝子特異的な部位、タグ及びシークエンスプライマー結合部位が含まれるようにする工程と、
(d)工程(c)の前記増幅産物をプールして、増幅産物のライブラリーを作成する工程と、
(e)ハイスループットシークエンシングを使用して、前記増幅産物の前記ヌクレオチド配列を決定する工程と、
(f)前記断片の前記配列をクラスタリング/アライメントさせることによって変異を同定する工程と、
(g)前記タグを使用して前記変異を保有する前記メンバーを同定する工程と、
(h)工程(c)の前記プライマーを使用して工程(g)の前記メンバー(複数可)からの前記標的配列を増幅することによって、前記変異を任意的に確認する工程、及び前記増幅された産物の前記配列を決定する工程と
を含む変異させた集団のメンバーにおける標的配列中の変異の検出のための方法。 - 前記変異させた集団が、変異を誘導する化学物質、電離放射線、標的化ヌクレオチド交換又は領域標的化変異誘発から成る群から選択された1つ又は複数による前記ゲノムの処理によって得られる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記集団が、変異していないが、天然に存在する変異を含む亜集団を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記プールする工程が、3Dプーリングストラテジーによるものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ハイスループットシークエンシングが、合成、好ましくはピロシークエンシングによって実行される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- シークエンシングは、ビーズのような固体支持体上で実施される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シークエンシングが、ハイスループットシークエンシング、好ましくは合成によるシークエンシング(Sequencing-by-Synthesis)に基づく、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シークエンシングが、合成によるシークエンシング、好ましくはピロシークエンシングによって実行される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- シークエンシングが、
(i)シークエンシングアダプターを、前記断片にライゲーションさせる工程と、
(ii)前記アダプターライゲーションされた断片をビーズへアニーリングさせる工程(各ビーズは、単一の断片とアニーリングする)と、
(iii)各マイクロリアクターは、単一のビーズを含むように油中水型マイクロリアクター中で前記ビーズを乳化させる工程と、
(iv)エマルジョンPCRを実行して、前記ビーズの表面上でアダプターライゲーションされた断片を増幅させる工程と、
(v)前記増幅されたアダプターライゲーションされた断片が付着しているビーズを選別/濃縮する工程と、
(vi)各ウェルが単一のビーズを含むようにウェル中に前記ビーズを配置する工程と、
(vii)ピロリン酸シグナルを生成する工程と
を含む、請求項6に記載の方法。 - 工程(c)及び/又は工程(i)中の前記プライマーが、改良された結合親和性を有するヌクレオチドを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)において増幅される前記標的配列の部分が、約80bp〜約400bpである、請求項2〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)において増幅される前記標的配列の部分が、約90bp〜約300bpである、請求項12に記載の方法。
- 工程(c)において増幅される前記標的配列の部分が、100bp〜約200bpである、請求項12に記載の方法。
- 特定の遺伝子又は形質のための1つ又は複数の(標識された)プライマーを含むキット。
- 変異特異的なプライマー又は対立遺伝子特異的プライマーをさらに含む、請求項15に記載のキット。
- ビーズ及び/又はシークエンシングプライマーをさらに含む、請求項15又は16に記載のキット。
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