DE60038109T2 - Verfahren zur Analyse von AFLP Reaktionsmischungen unter Verwendung von Primer Verlängerungstechniken - Google Patents

Verfahren zur Analyse von AFLP Reaktionsmischungen unter Verwendung von Primer Verlängerungstechniken Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Analy sieren von Nukleinsäuresequenzen und eine Anordnung zur Verwendung in einem solchen Verfahren.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung Anordnungen und Verfahren zum Bestimmen, ob eine spezifische Nukleinsäuresequenz in einer Nukleinsäuresequenz oder Mischung von Nukleinsäuresequenzen vorliegt oder nicht.
  • Spezifischer betrifft die Erfindung ein Verfahren und eine Anordnung zum Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit von Sequenzen in Genom-DNA oder einer Probe von Restriktionsfragmenten abgeleitet aus Genom-DNA, wobei die Sequenzen einmaligen Restriktionsfragmenten entsprechen, die als genetische Marker dienen können, wie AFLP-Marker.
  • Das Verfahren und die Anordnungen der Erfindung sind insbesondere geeignet für die Analyse amplifizierter Mischungen von Restriktionsfragmenten, wie Reaktionsmischungen, die aus AFLP resultieren.
  • Es ist eine Reihe von Verfahren zum Analysieren von Nukleinsäuresequenzen bekannt. Im Allgemeinen umfassen diese Verfahren die Immobilisierung der zu analysierenden Sequenzen zum Beispiel durch Blotting, Hybridisierung der Sequenzen mit einer gekennzeichneten DNA- oder RNA-Sonde, Stringenzwaschungen zum Entfernen nichthybridisierten Materials, gefolgt von der Erkennung derjenigen Sequenzen, welche mit der Sonde hybridisiert haben.
  • Solche Techniken werden gelegentlich nach vorheriger Amplifizierung – wie durch PCR – der Ausgangsnukleinsäuresequenzen, üblicherweise eine Mischung von Restriktionsfragmenten aus einer Genom-DNA, ausgeführt. Die entstehende Mischung amplifizierter Fragmente wird dann getrennt, zum Beispiel auf der Grundlage von Unterschieden in der Länge oder im Molekulargewicht, wie durch Gelelektrophorese, und dann visualisiert, d. h. durch Blotting gefolgt von Hybridisierung. Das entstehende Muster von Bändern wird als ein DNA-Fingerabdruck bezeichnet.
  • Üblicherweise werden bei DNA-Fingerabdrücken Fingerabdrücke von nahe verwandten Spezies, Unterspezies, Varietäten, Sorten, Rassen oder Individuen verglichen. Derartige verwandte Fingerabdrücke können identisch oder sehr ähnlich sein, d. h. sie enthalten eine große Anzahl entsprechender – und somit weniger informativer – Bänder.
  • Unterschiede zwischen zwei verwandten Fingerabdrücken werden als "DNA-Polymorphismen" bezeichnet. Diese sind DNA-Fragmente (d. h. Bänder), welche in einem oder für einen spezifischen Fingerabdruck einmalig sind. Die Gegenwart oder Abwesenheit solcher polymorphen Bänder, oder des Musters davon, kann als ein genetischer Marker verwendet werden, d. h. zum Identifizieren einer/s spezifischen Spezies, Unterspezies, Varietät, Sorte, Rasse oder Individuums, zum Ermitteln der Gegenwart oder Abwesenheit eines spezifischen erblichen Merkmals, eines Gens oder zum Bestimmen des Zustands einer Erkrankung.
  • Für eine weitere Diskussion und Definitionen von DNA-Fingerabdrücken, DNA-Typisierung, DNA-Polymorphismen, Genotypisierung, PCR und ähnlichen Techniken wird auf die Diskussion des Standes der Technik in EP-0 534 858 A1 verwiesen.
  • Die Technik beschreibt auch Oligonukleotidanordnungen zum Analysieren von Nukleinsäuresequenzen oder Mischungen davon, siehe zum Beispiel WO 97/27317 , WO 97/22720 , WO 97/43450 , EP 0 799 897 , EP 0 785 280 , WO 97/31256 , WO 97/27317 und WO 98/08083 . WO9325563 beschreibt ein allelspezifisches Primerextensionsverfahren. WO9631622 beschreibt ein Verfahren zum Erkennen von Mutationen, wobei Zielsequenzen mit einer Oligonukleotidsonde auf einem festen Träger inkubiert werden, um einen Doppelstrang zu bilden. WO9905321 offenbart die Verwendung fester Substrate für die Durchführung der Amplifizierung oder enzymatischer Reaktionen darauf.
  • WO 90/09455 , WO 91/02087 , WO 91/13075 , WO 92/15712 und EP 0 123 513 beschreiben alle Techniken zum Erkennen von Punktmutationen an einer vorbestimmten Stelle einer DNA-Sequenz (üblicherweise Genom-DNA oder cDNA kompletter Länge), welche im Allgemeinen als "Minisequenzierung" bezeichnet werden. Siehe auch Syvänen, 1999 (Human Mutation 13: 1–10).
  • Minisequenzierung basiert auf der Erweiterung eines Primers, der mit einem Teil der DNA-Sequenz hybridisiert, so dass sich das 3'-Ende des Primers unmittelbar neben der Punktmutation befindet. Der so erhaltene Hybrid wird – üblicherweise in einem einzelnen "Ein-Röhrchen"-Reaktionsschritt – mit einer Mischung, welche mindestens ein erkennbares Nukleotid enthält, in Kontakt gebracht, und zwar unter Bedingungen, unter denen die Erweiterung des Primers mit dem erkennbaren Nukleotid stattfindet, wenn das erkennbare Nukleotid komplementär zu dem Nukleotid ist, welches an der Stelle der Punktmutation vorliegt, jedoch keine Erweiterung stattfindet, wenn das erkennbare Nukleotid nicht dem Nukleotid entspricht, welches an der Punktmutation vorliegt, so dass, egal ob die Erweiterung des Primers stattfindet oder nicht, dies Informationen zu dem Nukleotid bereitstellt, welches an der Stelle der Punktmutation vorliegt. (Alternativ dazu können 2–4 unterschiedlich gekennzeichnete Nukleotide gleichzeitig verwendet werden, wobei die Erweiterung mit einem spezifischen gekennzeichneten Nukleotid die Gegenwart eines komplementären Nukleotids an der Stelle der Mutation anzeigt).
  • Neben der Ausstattung mit einer erkennbaren Funktionalität, wird/werden das/die erkennbare(n) Nukleotid(e) und Reaktionsmischungen/-bedingungen, die bei der Minisequenzierung verwendet werden, auch derart ausgewählt, dass, nachdem das gekennzeichnete Nukleotid zu dem Primer hinzugefügt wurde, keine weitere Erweiterung des Primers stattfindet ("Abschlussmischungen"). Zum Beispiel können kettenabschließende Dideoxyribonukleosidtriphosphate (ddNTPs) oder Thionukleotide verwendet werden.
  • Das beschriebene Verfahren unterscheidet sich von der Minisequenzierung mindestens in den folgenden, nicht-einschränkenden Aspekten:
    • a) Minisequenzierung wird zum Erkennen/Bestimmen von Punktmutationen an einer spezifischen, bekannten Stelle im Genom verwendet und wird nicht zum Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit polymorpher Fragmente in einer Mischung von (amplifizierten) Restriktionsfragmenten verwendet;
    • b) zum Teil als eine Folge von a), wird bei der Minisequenzierung (amplifizierte) komplette Genom- oder cDNA als Ausgangsmaterial verwendet, nicht eine Mischung von (amplifizierten) Restriktionsfragmenten;
    • c) bei der Minisequenzierung wird üblicherweise nur eine oder höchstens eine kleine Anzahl von Mutationen gleichzeitig untersucht; bei der Erfindung wird üblicherweise eine Mischung von (amplifizierten) Restriktionsfragmenten auf die Gegenwart von mindestens 100 bis mehreren 1000 Markern gleichzeitig geprüft;
    • d) bei der Minisequenzierung ist es allgemein schwierig, Matrizen-DNA in mehrfacher Form zu erzeugen;
    • e) zum Teil als eine Folge von c) und d), werden bei der Minisequenzierung keine Anordnungen verwendet, welche eine große Anzahl unterschiedlicher Primer enthalten.
  • Die selektive Restriktionsfragmentamplifizierung oder AFLP, eine DNA-Fingerabdrucktechnik, welche keine vorherige Kenntnis der zu analysierenden Sequenz erfordert, ist in der Europäischen Patentanmeldung 0 534 858 durch den Anmelder und durch Vos et al., 1995 (Nucleic Acid Research Vol. 23, Nr. 21: 4407–4414 beschrieben. Diese Technik umfasst im Allgemeinen die folgenden Schritte:
    • (a) das Digerieren einer Nukleinsäure, insbesondere einer DNA, mit einer oder mehreren spezifischen Restriktionsendonukleasen zum Fragmentieren der DNA in eine entsprechende Serie von Restriktionsfragmenten;
    • (b) das Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit mindestens einem synthetischen Doppelstrang-Oligonukleotidadapter, von dem ein Ende mit einem der oder mit beiden Enden der Restriktionsfragmente kompatibel ist, um so markierte Restriktionsfragmente der Ausgangs-DNA zu erzeugen;
    • (c) das in Kontakt bringen der markierten Restriktionsfragmente unter Hybridisierungsbedingungen mit mindestens einem Oligonukleotidprimer;
    • (d) das Amplifizieren des markierten Restriktionsfragmentes hybridisiert mit den Primern durch PCR oder eine ähnliche Technik, um eine weitere Verlängerung der hybridisierten Primer entlang der Restriktionsfragmente der Ausgangs-DNA, an welche die Primer hybridisiert haben zu verursachen; und
    • (e) das Identifizieren oder Wiederherstellen des so erhaltenen amplifizierten oder verlängerten DNA-Fragmentes.
  • Die so amplifizierten DNA-Fragmenten können dann analysiert und/oder visualisiert werden, zum Beispiel mittels Gelelektrophorese, um einen genetischen Fingerabdruck bereitzustellen, welcher Bänder zeigt, die denjenigen Restriktionsfragmenten entsprechen, die mit dem Adapter verbunden wurden, erkannt durch den Primer, und daher amplifiziert während des Amplifizierungsschrittes, wobei die entstehenden Bänder Informationen zu dem spezifischen Restriktionsstellenmuster der Ausgangs-DNA bereitstellen.
  • Durch das Vergleichen von AFLP-Fingerabdrücken von verwandten Individuen können Bänder identifiziert werden, welche für jeden Fingerabdruck einmalig sind. Diese Polymorphismen werden als "AFLP-Marker" bezeichnet, und sie können wieder verwendet werden, um ein/e spezifische/s Individuum, Sorte, Rasse, Varietät, Unterspezies oder Spezies zu identifizieren und/oder die Gegenwart oder Abwesenheit eines spezifischen geerbten Merkmals, Gens oder Erkrankungszustandes zu ermitteln.
  • Für eine weitere Beschreibung des AFLP, seiner Vorteile, seiner Ausführungsformen sowie der darin verwendeten Techniken, Enzyme, Adapter, Primer und weiteren Verbindungen und Werkzeuge, wird auf EP-A-0 534 858 und die gleichzeitig anhängigen Europäischen Anmeldungen EP 0 976 835 und EP 0 974 672 , alle durch den Anmelder, verwiesen. Außerdem werden, wenn nicht anders angegeben, in der nachfolgenden Beschreibung die Definitionen aus Absatz 5.1 von EP-0 534 858 verwendet.
  • Obwohl AFLP im Allgemeinen weniger zeitaufwändig ist als hybridisierungsbasierte Techniken, weist er noch immer den Nachteil auf, dass die amplifizierten Fragmente getrennt (z. B. durch Gelelektrophorese) und visualisiert (z. B. durch die Erzeugung eines Fingerabdruckes) werden müssen. Dies sind sehr komplizierte und zeitaufwändige Vorgänge, welche spezielle Vorrichtungen wie Elektrophorese- und Autoradiographieausrüstungen erfordern. Danach müssen die Fingerabdrücke analysiert werden – was heutzutage im Allgemeinen durch das „Einlesen" des Fingerabdruckes in einen Computer geschieht – um die polymorphen Bänder zu identifizieren.
  • Jedoch kann eine solche Erkennung durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese ein einschränkender Faktor der enorm vielschichtigen Fähigkeit der AFLP-Technologie für die Markererkennung mit hohem Durchsatz sein.
  • WO98/30721 offenbart ein Verfahren auf der Grundlage von AFLP, wodurch der Bedarf an PAGE durch das Prüfen der amplifizierten Probe auf ihre Fähigkeit, mit einer AFLP-erzeugten Polynukleotidsonde zu hybridisieren, überflüssig wird.
  • Daher ist ein erstes Ziel der Erfindung das Bereitstellen einer alternativen Technik zu WO98/30721 zum Analysieren von Nukleinsäuresequenzen – insbesondere zum Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit von AFLP-Markern – welche die Verwendung von Gelelektrophorese nicht mehr erfordert und vorzugsweise auch die Verwendung von Autoradiographie und/oder von radioaktiven Materialien vermeidet und dadurch den Durchsatz verbessert (und das Bereitstellen eines Verfahrens zur AFLP-Markererkennung mit hohem Durchsatz).
  • Dies wird durch das Verfahren der Erfindung erreicht, welches auf der spezifischen Erweiterung/Verlängerung einer Oligonukleotidsequenz (d. h. eines Primers) basiert, welche komplementär zu dem (einem Teil des) zu erkennenden Fragment(es) ist, so dass die Erweiterung des komplementären Oligonukleotides nur stattfindet, wenn das zu erkennende Fragment vorliegt, und nicht stattfindet, wenn das zu erkennende Fragment abwesend ist. Somit zeigt die Tatsache, ob das Oligonukleotid erweitert wird oder nicht, die Gegenwart bzw. Abwesenheit des zu erkennenden Fragmentes an.
  • Diese erweiterungsbasierte Erkennung kann anstelle der Gelelektrophorese/Autoradiographie beim Analysieren von AFLP-Reaktionsmischungen insbesondere zur routinemäßigen Genotypisierung mit hohem Durchsatz verwendet werden. Zu diesem Zweck stellt die Erfindung unter anderem auch eine Anordnung von Oligonukleotiden bereit, die zum Prüfen einer AFLP-Reaktionsmischung auf die Gegenwart mehrerer AFLP-Marker gleichzeitig verwendet werden kann, d. h. in einem einzigen Erkennungsschritt.
  • In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung daher ein Verfahren zum Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit eines Zielrestriktionsfragmentes in einer Mischung von Restriktionsfragmenten unter Verwendung einer Oligonukleotidsequenz, die im Wesentlichen komplementär zu einem Teil des Zielrestriktionsfragmentes ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
    • a) das in Kontakt bringen der Mischung von Restriktionsfragmenten mit der Oligonukleotidsequenz unter Hybridisierungsbedingungen, so dass, wenn das Zielrestriktionsfragment vorliegt, ein Hybrid zwischen dem Zielrestriktionsfragment und der Oligonukleotidsequenz gebildet wird, so dass der entstehende Hybrid mindestens ein ungepaartes Nukleotid des Zielrestriktionsfragmentes direkt neben dem 3'-Ende der Oligonukleotidsequenz aufweist;
    • b) das Hinzufügen von mindestens einem gekennzeichneten Nukleotid oder Nukleotidanalogon zu der aus Schritt a) resultierenden Mischung, unter Bedingungen, die für die Erweiterung eines Oligonukleotides geeignet sind, so dass, wenn ein Hybrid des Zielrestriktionsfragmentes und des Oligonukleotides vorliegt, und das mindestens eine gekennzeichnete Nukleotid oder Nukleotidanalogon komplementär zu dem mindestens einen ungepaarten Nukleotid des Zielrestriktionsfragmentes direkt neben dem 3'-Ende der Oligonukleotidsequenz ist, die Nukleotidsequenz mit dem gekennzeichneten Nukleotid oder Nukleotidanalogon erweitert wird;
    • c) das Erkennen der Gegenwart oder Abwesenheit eines beliebigen Hybrides mit einem hinzugefügten gekennzeichneten Nukleotid oder Nukleotidanalogon und/oder einer beliebigen Oligonukleotidsequenz mit einem hinzugefügten gekennzeichneten Nukleotid oder Nukleotidanalogon.
  • Das Verfahren der Erfindung kann ferner einen oder mehrere Schritte enthalten, in welchen der zwischen dem Zielrestriktionsfragment und der Oligonukleotidsequenz gebildete Hybrid von sämtlichen Restriktionsfragmenten getrennt wird, welche nicht an eine Oligonukleotidsequenz hybridisiert sind, sowie von sämtlichen anderen unerwünschten Sequenzen oder Verbindungen. Ein solcher Schritt kann nach Schritt a), nach Schritt b) oder nach beiden ausgeführt werden.
  • Ferner wird dem Fachmann klar sein, dass die Reihenfolge, in welcher die verschiedenen Verbindungen/Sequenzen (d. h. die Restriktionsfragmente, das Oligonukleotid und das gekennzeichnete Nukleotid) in Schritt a) und b) hinzugefügt/miteinander gemischt werden, variiert werden kann, und dass solche Variationen innerhalb des Umfangs der Erfindung und der Ansprüche liegen. Jedoch stellt die oben beschriebene Reihenfolge die einfachste Möglichkeit der Ausführung der Erfindung dar.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit von einem oder mehreren Zielrestriktionsfragmenten in einer Mischung von Restriktionsfragmenten, welches folgende Schritte umfasst:
    • a) das in Kontakt bringen der Mischung von Restriktionsfragmenten mit mindestens einer Oligonukleotidsequenz unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die Oligonukleotidsequenz zu einem Teil eines Zielrestriktionsfragmentes, jedoch nicht zu einem anderen Restriktionsfragment in der Mischung komplementär ist, so dass der entstehende Hybrid mindestens ein ungepaartes Nukleotid des Zielrestriktionsfragmentes direkt neben dem 3'-Ende der Oligonukleotidsequenz aufweist;
    • b) das Erweitern der Oligonukleotidsequenz mit mindestens einem gekennzeichneten Nukleotid oder Nukleotidanalogon, wobei das mindestens eine gekennzeichnete Nukleotid oder Nukleotidanalogon komplementär zu dem mindestens einen ungepaarten Nukleotid des Zielrestriktionsfragmentes direkt neben dem 3'-Ende der Oligonukleotidsequenz ist;
    • c) das Erkennen der Oligonukleotidsequenz mit dem hinzugefügten gekennzeichneten Nukleotid oder Nukleotidanalogon.
  • Wieder kann dieses Verfahren einen oder zwei optionale Schritte zum Trennen der Zielrestriktionsfragmente, die mit der Oligonukleotidsequenz hybridisiert sind, von sämtlichen Restriktionsfragmenten, die nicht an eine Oligonukleotidsequenz hybridisiert sind, sowie von anderen unerwünschten Sequenzen und überschüssigen Reagenzien, enthalten.
  • In dem Verfahren der Erfindung wird während des Schrittes a) die Mischung von Restriktionsfragmenten üblicherweise gleichzeitig mit mindestens 3, vorzugsweise mindestens 10, bevorzugter mindestens 50, am bevorzugtesten mindestens 100 unterschiedlichen Oligonukleotidsequenzen in Kontakt gebracht, wobei jede Oligonukleotidsequenz am bevorzugtesten für nur ein Zielrestriktionsfragment spezifisch ist. Zu diesem Zweck ist/sind die in dem Verfahren der Erfindung verwendete(n) Oligonukleotidsequenz(en) vorzugsweise an einen festen Träger gebunden, bevorzugter derart, dass eine Anordnung gebildet wird, und derartige Anordnungen bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung.
  • Mit "ein Oligonukleotid spezifisch für ein Zielrestriktionsfragment" ist gemeint, dass die Oligonukleotidsequenz im Wesentlichen nur zu dem beabsichtigten Zielrestriktionsfragment komplementär ist, jedoch ist sie am bevorzugtesten im Wesentlichen nicht zu einem beliebigen anderen Restriktionsfragment in der Mischung komplementär. Eine Oligonukleotidsequenz gilt als „im Wesentlichen komplementär zu" einem Zielrestriktionsfragment, wenn sie ein hohes Maß an Sequenzhomologie mit dem entsprechenden Teil des Zielrestriktionsfragmentes (bestimmt auf der Grundlage der kompletten Länge der Oligonukleotidsequenz) aufweist, d. h. von mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, am bevorzugtesten mindestens 99%.
  • In der vorliegenden Beschreibung wird das Restriktionsfragment, welches den zu erkennenden Polymorphismus enthält, als die "Zielsequenz" bezeichnet.
  • Im Allgemeinen ist eine Zielsequenz dadurch gekennzeichnet, dass sie durch das Schneiden einer Ausgangs-DNA, üblicherweise einer Genom-DNA oder -cDNA, mit mindestens einem, üblicherweise jedoch mit zwei Restriktionsenzymen, von denen vorzugsweise mindestens eines ein „häufiges Schneide-"Restriktionsenzym und mindestens eines ein "seltenes Schneide-"Restriktionsenzym ist, erhalten werden kann/wird. (Im Falle von Genom-DNA dient das "häufige Schneideenzym" dem Zweck der Reduzierung der Größe der Restriktionsfragmente auf einen Bereich von Größen, welche effizient und in einer Art und Weise amplifiziert werden, die mit den verwendeten Erkennungstechnik kompatibel ist, und das „seltene Schneideenzym" dient dem Zweck der Steuerung der Gesamtanzahl der erzeugten Fragmente. Für beide wird auf EP-A-0 534 858 und EP-A-0 721 987 durch den Anmelder verwiesen.) Zu nicht-einschränkenden Beispielen geeigneter häufiger Schneideenzyme zählen MseI und TaqI. Zu nicht-einschränkenden Beispielen von im Handel erhältlichen seltenen Schneideenzymen zählen PstI, HpaII, MspI, ClaI, HhaI, EcoRI, EcoRII, BstBI, HinP1, HinDIII, MaeII, BbvI, PvuII, XmaI, SmaI, NciI, AvaI, HaeII, SalI, XhoI, BstYI, BamHI, BglII und PvuII, von denen PstI, HpaII, MspI, ClaI, EcoRI, EcoRII, BstBI, HinP1, HinDIII, BamHI, BglII und MaeII bevorzugt sind.
  • Vorzugsweise ist die Zielsequenz ein Restriktionsfragment, wie es in einer Mischung von Restriktionsfragmenten vorliegt, bevorzugter ein amplifiziertes Restriktionsfragment, wie es in einer Mischung von Restriktionsfragmenten und/oder amplifizierten Restriktionsfragmenten vorliegt.
  • Noch bevorzugter ist die Zielsequenz ein Restriktionsfragment, welches einem polymorphen Fragment oder Band von Interesse entspricht, wie einem AFLP-Marker. Als solche kann die Zielsequenz ein nicht-amplifiziertes Fragment sein, welches in einer Mischung von begrenzter DNA vorliegt, oder sie kann ein durch AFLP amplifiziertes Restriktionsfragment sein, wie es in der Reaktionsmischung vorliegt, die nach der AFLP-Amplifizierung erhalten wird.
  • Die zum Erkennen der Zielsequenz verwendete Oligonukleotidsequenz wird im Folgenden als das "Erkennungsoligonukleotid", die "Erkennungssequenz" oder der "Erkennungsprimer" bezeichnet, wobei die Begriffe als äquivalent zu betrachten sind.
  • Die Erkennungssequenzen können ferner einen "Schwanz" – wie eine Poly-T-Sequenz – enthalten, um die Zugänglichkeit für die Zielsequenz zu verbessern.
  • Jede Erkennungssequenz sollte mindestens teilweise komplementär zu einer spezifischen Zielsequenz sein, wie oben definiert. Die Erkennungssequenz kann jede beliebige Nukleinsäure (d. h. DNA oder RNA) sein, ist jedoch vorzugsweise DNA. Die Erkennungssequenz weist im Allgemeinen eine Größe von etwa 10 bis 100 Basenpaaren auf, vorzugsweise etwa 20 bis 50 Basenpaare. Die Erkennungssequenzen können alle die gleiche Größe aufweisen, oder sie können unterschiedliche Größen aufweisen. Die Erkennungssequenz kann auf jede geeignete Art und Weise erhalten werden. Zum Beispiel kann, wenn ein oder mehrere polymorphe Bänder in einem AFLP-Fingerabdruck eines spezifischen Satzes von (vorzugsweise verwandten) Individuen identifiziert wurden, die Sequenz jeden Bandes/Fragmentes auf eine an sich bekannte Art und Weise bestimmt werden, und es können Erkennungssequenzen synthetisiert werden, die komplementär zu einem beliebigen Teil der Sequenz von jedem der polymorphen Bänder sind, d. h. unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers oder auf jede andere an sich bekannte Art und Weise. Es können auch Festphasen-Nukleinsäure-Synthesetechniken verwendet werden, welche direkt in einer Anordnung mit den gewünschten Erkennungssequenzen resultieren können, wie unten beschrieben. Ferner kann die Erkennungssequenz unter Verwendung bekannter Techniken der Gentechnik erhalten werden, zum Beispiel durch Primerextension unter Verwendung der Zielsequenz als eine Matrize und/oder durch Verwendung von einem oder mehreren Restriktionsenzymen, gegebenenfalls unter Verwendung von Amplifizierung.
  • Außerdem kann die Erkennungssequenz ein oder mehrere "alternative Nukleoside" enthalten, wie in der gleichzeitig anhängigen Europäischen Anmeldung EP 0 974 672 des Anmelders beschrieben, so dass die Erkennungssequenz ein „alternativer Primer" wie darin beschrieben ist. Ähnlich kann die Erkennungssequenz in Schritt b) mit einem solchen alternativen Nukleosid/Nukleotid, welches mit einer Kennzeichnung versehen ist, erweitert werden. Zu Beispielen davon zählen die Basen Inosin (I) und Uracil (U) sowie dUTP und dITP, und diese sind innerhalb des Begriffes "gekennzeichnetes Nukleotidanalogon", wie oben erwähnt, eingeschlossen. Es soll verstanden werden, dass die Gegenwart derartiger alternativer Nukleoside die Erkennungssequenz und die Zielsequenz nicht daran hindert, im Wesentlichen komplementär miteinander zu sein, wie oben definiert.
  • Wenn die Mischung von Restriktionsfragmenten, die auf die Gegenwart von einer oder mehreren Zielsequenzen untersucht wer den soll, mittels AFLP amplifiziert wurde, kann die (ein Teil der) Erkennungssequenz zu dem (einem Teil des) ursprünglichen Restriktionsfragment(es), zu der (einem Teil der) Adaptersequenz oder zu beiden komplementär sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform entspricht die Erkennungssequenz einem AFLP-Primer mit einem oder mehreren (weiteren) selektiven Nukleotiden, die am 3'-Ende hinzugefügt sind. Bevorzugter entspricht die Erkennungssequenz dem/n (einem der) AFLP-Primer(n), der/die zum Amplifizieren der Restriktionsfragmente verwendet wurde/n, mit einem oder mehreren (weiteren) selektiven Nukleotiden hinzugefügt zum 3'-Ende.
  • Zum Beispiel können, wenn die Restriktionsfragmente unter Verwendung eines +(n)-AFLP-Primers amplifiziert wurden, ein oder mehrere +(n+q)-Primer als eine Erkennungssequenz verwendet werden, welche die (einen Teil der) konstante(n) Region des ursprünglichen +(n)-AFLP-Primers sowie die (n) selektiven Nukleotide des ursprünglichen Primers einschließen, mit (q) weiteren Nukleotid(en) hinzugefügt am 3'-Ende (wobei n üblicherweise 0–6 und q üblicherweise 1–10 ist).
  • Vorzugsweise enthält eine derartige auf einem AFLP-Primer basierende Erkennungssequenz insgesamt 5–15, vorzugsweise 7–12 selektive Nukleotide, d. h. am 3'-Ende der Sequenz, welches der konstanten Region des AFLP-Primers entspricht. Besonders geeignete Kombinationen von AFLP-Primer und Erkennungssequenz sind ein +4- bis +6-AFLP-Primer für die Amplifizierung, kombiniert mit einer entsprechenden +7- bis +12-Erkennungssequenz im Schritt b) der Erfindung. Es können bereits unter Verwendung eines +6-AFLP-Primers in Kombination mit einer entsprechenden +7-Erkennungssequenz gute Ergebnisse (d. h. Sensitivität und Selektivität) erhalten werden.
  • Wie oben erwähnt, sind die Erkennungssequenzen vorzugsweise an einen festen Träger gebunden, bevorzugter so, dass sie eine Anordnung bilden. Eine solche Anordnung umfasst im Allgemeinen mindestens 10, spezifischer mindestens 100, bevorzugter mindestens 1000 unterschiedliche Erkennungssequenzen. Bei einer "Anordnung hoher Dichte" oder "Mikroanordnung" kann die Gesamtzahl der Erkennungssequenzen im Bereich von 1000–100.000 pro cm2 Oberflächenbereich liegen.
  • Die Erkennungssequenzen sind im Allgemeinen auf eine solche Art und Weise an den Träger gebunden, dass jede Erkennungssequenz an einen spezifischen, einzelnen Teil des Trägers angehaftet ist und diesem entspricht, so dass ein unabhängig erkennbarer Bereich auf dem Träger gebildet wird, wie ein Punkt oder Band. Dies ermöglicht es, die Anordnung durch Scannen der Bereiche zu "lesen" (d. h. visuell oder anderweitig), an denen jede Erkennungssequenz (d. h. eine Sequenz, welche einem Marker von Interesse entspricht) angehaftet ist.
  • Vorzugsweise sind die Erkennungssequenzen an den Träger gemäß eines vorbestimmten, regelmäßig verteilten Musters gebunden, in welchem zum Beispiel verwandte Erkennungssequenzen (d. h. welche verwandten Markern entsprechen) zusammen gruppiert werden können, d. h. in einer oder mehreren Linien, Säulen, Reihen, Quadraten, Rechtecken usw., vorzugsweise in einer "adressierbaren" Form. Dies vereinfacht die Analyse der Anordnung weiter.
  • Die Dichte der unterschiedlichen Erkennungssequenzen liegt im Allgemeinen in dem Bereich von 1–100.000 unterschiedlichen Erkennungssequenzen/cm2, üblicherweise 5–50.000 Erkennungssequenzen/cm2, im Allgemeinen zwischen 10–10.000 Erkennungssequenzen/cm2.
  • Eine Anordnung der Erfindung kann (auch) Sätze von Erkennungssequenzen enthalten, welche Markern entsprechen, die unterschiedliche (d. h. genetisch nicht verwandte) Merkmale oder Eigenschaften anzeigen, und eine derartige Anordnung kann verwendet werden, um ein Individuum (Genom) gleichzeitig auf die Gegenwart oder Abwesenheit all dieser Eigenschaften zu analysieren. Jedoch entsprechen die Erkennungssequenzen üblicherweise Markern aus einer "Genotypisierungssammlung", d. h. aus Markern, wie sie bei Individuen vorliegen können, die zu der gleichen Familie, Gattung oder vorzugsweise Spezies gehören, d. h. um – zum Beispiel – eine "Mais-Anordnung", eine "Tomaten-Anordnung", eine "Weizen-Anordnung" usw. bereitzustellen.
  • In einer Ausführungsform entsprechen die Erkennungssequenzen, die auf der Anordnung vorliegen, den AFLP-Markern, die unterschiedliche Unterspezies, Varietäten, Sorten, Linien oder Rassen der gleichen Spezies kennzeichnen.
  • Eine Anordnung der Erfindung kann auch Erkennungssequenzen enthalten, welche Markern entsprechen, die einen bestimmten genetischen Zustand eines Individuums kennzeichnen, wie die Gegenwart oder Abwesenheit eines Erkrankungszustandes, d. h. von Onkogenen und von genetisch bestimmten Erkrankungen.
  • Obwohl vorzugsweise jede Erkennungssequenz auf der Anordnung einem polymorphen Band von Interesse (d. h. einem Marker) entspricht, ist die Gegenwart von einigen nicht- oder weniger informativen Erkennungssequenzen (welche zum Beispiel nicht-polymorphen Bändern oder Markern entsprechen, die in zu großer Zahl vorliegen, um nützliche Informationen bereitzustellen) auf der Anordnung nicht ausgeschlossen. Diese machen jedoch üblicherweise weniger als 50%, vorzugsweise weniger als 30%, bevorzugter weniger als 10% aller auf der Anordnung vorliegenden Erkennungssequenzen aus. Es ist auch eingeschlossen, dass einige oder die meisten der Erkennungssequenzen für ein/e spezifische/s Anwendung oder Genom informativ sein können, jedoch nicht für ein/e andere/s. Jedoch entsprechen vorzugsweise 95–100% aller Erkennungssequenzen einem AFLP-Marker oder kennzeichnen diesen.
  • Der feste Träger (d. h. die Trägersubstanz) für die Anordnung kann jedes beliebige feste Material sein, an welches Nukleinsäuresequenzen angehaftet werden können, einschließlich poröse, fasrige, verwobene und nicht-verwobene Materialien sowie Verbundmaterialien. Es können auch halbfeste Materialien wie Gele oder Matrizen (wie sie zum Beispiel in der Chromatographie verwendet werden) verwendet werden, obwohl dies nicht bevorzugt ist.
  • Zu geeigneten Trägern zählen, jedoch nicht darauf beschränkt, diejenigen hergestellt aus Kunststoffen, Harzen, Polysacchariden, Silika oder silikabasierten Materialien, funktionalisiertem Glas, modifiziertem Silicium, Kohlenstoff, Metallen, anorganischen Gläsern, Membranen, Nylon, natürlichen Fasern wie Seide, Wolle und Baumwolle, und Polymermaterialien wie Polystyrol, Polyethylenglykoltetraphthalat, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylonitril, Polymethylmethacrylat, Polytetrafluorethylen, Butylkautschuk, Styrenbutadienkautschuk, Naturkautschuk, Polyethylen, Polypropylen, (Poly)tetrafluorethylen, (Poly)vinylidenfluorid, Polycarbonat und Polymethylpenten. Weitere geeignete Trägermaterialien sind zum Beispiel in US-A-5,427,779 , WO 97/22720 , WO 97/43450 , WO 97/31256 , WO 97/27317 und EP 0 799 897 erwähnt.
  • Vorzugsweise weist der Träger eine im Wesentlichen flache, rechteckige Form auf, mit den Erkennungssequenzen auf einer Oberfläche davon gebunden. Es kann jedoch auch jede beliebige andere geeignete zwei- oder dreidimensionale Form verwendet werden, wie eine Scheibe, eine Kugel oder Perlen, oder Materialien oder Strukturen, welche es zulassen, dass ein flüssiges Medium, welches die zu analysierende Probe enthält, durch den Träger hindurch passiert oder fließt, wie Säulen, Röhrchen oder Kapillaren, sowie Strukturen des (makro)porösen, Bahn- oder Membran-Typs, einschließlich der Durchfluss-Genosensorgeräte, auf die in WO 97/22720 verwiesen wird.
  • Die Größe der Anordnung sowie der einzelnen Bereiche, welche jeder der unterschiedlichen Erkennungssequenzen entsprechen, kann in Abhängigkeit von der Gesamtmenge der Erkennungssequenzen sowie des beabsichtigten Verfahrens zum Analysieren der Anordnung variieren.
  • Bei einer Anordnung, die visuell untersucht werden soll, können die gesamte Anordnung und die einzelnen Bereiche darauf von einer solchen Größe sein, dass sie mit dem bloßen Auge oder durch ein Mikroskop gesehen und unterschieden werden können, d. h. im Bereich von 1 bis 12 cm2 für die gesamte Anordnung und 0,01–1 cm2 für die einzelnen Bereiche.
  • Anordnungen, die unter Verwendung anderer Arten von (üblicherweise automatisierten) Scanvorrichtungen analysiert werden, können eine geringere Größe aufweisen und haben vorzugsweise die Form von Anordnungen hoher Dichte oder Mikroanordnungen im Bereich von 0,01–12 cm2 für die gesamte Anordnung und 0,0001–1 cm2 für die einzelnen Bereiche. Dies erlaubt das Ausführen der Hybridisierung in einem kleinen Volumen an einer kleinen Probe oder sogar die Verwendung von Durchflusstechniken.
  • Die Erkennungssequenzen können auf jede beliebige an sich bekannte Art und Weise an den Träger gebunden sein und die spezifische verwendete Technik ist hauptsächlich abhängig vom verwendeten Träger. Die Bindung erfolgt am 5'-Ende oder an einer anderen Stelle der Erkennungssequenz, wie jeweils anwendbar, jedoch vorzugsweise nicht am 3'-Ende, da dies während der Primerextensionsreaktion erweitert werden soll.
  • Vorzugsweise werden die Erkennungssequenzen kovalent an die Anordnung gebunden, d. h. durch eine geeignete chemische Technik. Zu diesem Zweck können die Erkennungssequenzen und/oder der Träger modifiziert werden, um eine oder mehrere Gruppen oder Funktionalitäten zum Anhaften der Erkennungssequenz an die Anordnung zu tragen. Zum Beispiel kann die Oberfläche des Trägers aktiviert werden, um eine oder mehrere Gruppen wie Carboxy-, Amino-, Hydroxy- usw. zu tragen.
  • Geeignete Verfahren zum Anhaften der Erkennungssequenzen an den Träger werden dem Fachmann klar sein. Im Allgemeinen kann jedes beliebige Verfahren zum Anhaften einer Nukleinsäure an einen festen Träger verwendet werden, einschließlich der in US-A-5,427,779 ; US-A-4,973,493 ; US-A-4,979,959 ; US-A-5,002,582 ; US-A-5,217,492 ; US-A-5,525,041 ; US-A-5,263,992 ; WO 97/46313 und WO 97/22720 beschriebenen Verfahren, sowie der darin zitierten Verweise.
  • Als ein Beispiel kovalenter Anhaftung kann die Kopplung unter Verwendung photoreaktiver Gruppen wie N-Oxysuccinimid erfolgen, wobei entweder die an die Anordnung gebundene Nukleinsäuresequenz mit einer photoreaktiven Gruppe derivatisiert und an die Oberfläche angehaftet wird oder die Oberfläche wird zuerst mit einer photoreaktiven Gruppe behandelt, gefolgt von der Aufbringung der Erkennungssequenz, zum Beispiel in N-Terminus-Amino-modifizierter Form. Ein geeignetes Protokoll, welches dem in Amos et al., Surface Modification of Polymers by Photochemical Immobilization, The 17th Annual Meeting of the Society of Biomaterials, Mai 1991, Scottsdale AZ beschriebenen allgemeinen Verfahren folgt, ist in WO 97/46313 angegeben.
  • Zu weiteren kovalenten Bindungstechniken zählen die Verwendung von 3'-Aminopropanol-Gruppen oder Epoxysilanamin-Chemie, wie zum Beispiel beschrieben in WO 97/22720 .
  • Ein Beispiel einer starken, jedoch nicht-kovalenten Bindungstechnik beinhaltet die Anhaftung einer biotinylierten Erkennungssequenz auf einem mit Streptavidin beschichteten Träger.
  • Um kleine, einzelne, adressierbare Bereiche jeder der Erkennungssequenzen auf der Anordnung zu erzeugen, können Maskierungstechniken oder bekannte Mikrodispensiertechniken verwendet werden, zum Beispiel wie in WO 97/46313 und WO 97/22720 beschrieben.
  • Die Erkennungssequenzen können auch vor Ort auf der Anordnung synthetisiert werden, unter Verwendung von Festphasen-Nukleinsäure-Synthesetechniken, wieder wie in der obigen Referenz beschrieben.
  • Nach dem Anhaften der Erkennungssequenzen an den Träger ist die Anordnung im Allgemeinen bereit für die Verwendung.
  • In Schritt a) der Erfindung werden die eine oder die mehreren Erkennungssequenzen (oder die Anordnung der Erkennungssequenzen) mit der zu analysierenden Probe (d. h. der Mischung von Restriktionsfragmenten) unter an sich bekannten Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht. Geeignete Hybridisierungsbedingungen (d. h. verwendete Puffer, Salzstärke, Temperatur, Dauer) können durch den Fachmann auf der Grundlage von Erfahrung oder gegebenenfalls nach einigen Vorexperimenten ausgewählt werden. Diese Bedingungen können abhängig von Faktoren wie der Größe der Erkennungssequenzen, dem CG-Gehalt der Erkennungssequenzen, und ob die Erkennungssequenz oder Zielsequenz an eine Anordnung, wie unten beschrieben, gebunden ist, variieren.
  • Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind zum Beispiel in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual, (1989) 2. Ed. Cold Spring Harbour, N. Y.; Berger and Kimmel, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Methods in Enzymology, (1987), Volume 152, Academic Press Inc., San Diego, CA; Young and Davis (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80: 1194; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24, Hybridization with Nucleic Acid Probes, P. Thijssen, Ed., Elsevier, N. Y. (1993) sowie WO 97/43450 , EP-A-0 799 897 , WO 97/27317 , wo 92/10092 , WO 95/1195 , WO 97/22720 und US-A-5,424,186 beschrieben und können im Allgemeinen Temperaturen zwischen 25–70°C, vorzugsweise 35–65°C, eine Dauer zwischen 1 Minute und 30 Stunden, vorzugsweise etwa 15 Minuten bis 2 Stunden, und die Verwendung eines geeigneten Puffers wie eines Tris-Puffers umfassen.
  • Die Hybridisierungsbedingungen sind vorzugsweise derart ausgewählt, dass jede Erkennungssequenz nur einen Hybrid (Doppelstrang) mit einer Zielsequenz bildet, mit welcher die Erkennungssequenz im Wesentlichen komplementär ist, wie oben definiert, falls eine solche Zielsequenz vorliegt, und sie ansonsten keinen Hybrid bildet.
  • Besonders bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind diejenigen, die an sich für die Primerextension bekannt sind, wie die bei Minisequenzierungstechniken verwendeten Primerextensionsbedingungen, d. h. wie in WO 90/09455 , WO 91/02087 , WO 91/13075 , WO 92/15712 und EP 0 123 513 beschrieben. Dies hat den Vorteil, dass sowohl Schritt a) als auch Schritt b) oben unter den gleichen "Primerextensionsbedingungen" ausgeführt werden können, d. h. in einer einzigen Reaktion, unter Verwendung des gleichen Puffers usw., gegebenenfalls unter wiederholter Temperaturzirkulation.
  • Wenn die Mischung von Restriktionsfragmenten mit einer Erkennungssequenz in Kontakt gebracht wird und eine Zielsequenz für die Erkennungssequenz vorliegt, wird ein Hybrid zwischen der Zielsequenz und der Erkennungssequenz gebildet. Der Hybrid sollte ein solcher sein – d. h. die Erkennungssequenz sollte so ausgelegt sein, dass sie zu der Zielsequenz derart komplementär ist – dass sich mindestens ein ungepaartes Nukleotid der Zielsequenz direkt neben dem 3'-Ende der Erkennungssequenz befindet.
  • Während Schritt b) des Verfahrens der Erfindung, wird die mindestens eine Position, welche dem/n ungepaarten Nukleotid(en) in der Zielsequenz entspricht, mit mindestens einem Nukleotid "ausgefüllt", und zwar mittels Verlängerung der Erkennungssequenz, wobei die Zielsequenz als eine Matrize für eine Erweiterungsreaktion dient. Daher wird, wenn die Zielsequenz, welche der spezifischen Erkennungssequenz entspricht, nicht vorliegt, kein Hybrid gebildet und die Erkennungssequenz wird nicht erweitert, was zeigt, dass die Zielsequenz in der Ausgangsmischung nicht vorlag.
  • In Schritt b) wird die Erkennungssequenz vorzugsweise mit höchstens fünf, bevorzugter höchstens drei und am bevorzugtesten nur einem Nukleotid erweitert.
  • Vorzugsweise ist das in Schritt b) zum Erweitern der Erkennungssequenz verwendete Nukleotid (oder mindestens eines der dafür verwendeten Nukleotide) ein Nukleotid oder Nukleotidanalogon, welches auf eine an sich bekannte Art und Weise erkannt werden kann, zum Beispiel mittels einer erkennbaren Kennzeichnung, und ein solches Nukleotid wird als ein "erkennbares Nukleotid" bezeichnet. Es soll verstanden werden, dass der Begriff "erkennbares Nukleotid" auch die Erweiterung der Erkennungssequenz mit mehreren Nukleotiden, von denen mindestens eines gekennzeichnet ist oder anderweitig auf eine an sich bekannte Art und Weise erkannt werden kann, einschließt.
  • Geeignete Kennzeichnungen für die Verwendung bei dem erkennbaren Nukleotid sind zum Beispiel in WO 97/27317 , WO 97/22720 , WO 97/43459 , EP 0 799 897 , WO 97/31256 , WO 97/27317 und WO 98/08083 beschrieben, und zu ihnen zählen fluoreszierende Kennzeichnungen, phosphoreszierende Kennzeichnungen, chemolumineszierende Kennzeichnungen, biolumineszierende Kennzeichnungen, chemische Kennzeichnungen, biochemische Kennzeichnungen wie Enzyme, biologische Kennzeichnungen wie Biotin/Streptavidin, Radioisotope, Spin- oder Resonanzkennzeichnungen, Metallkolloide wie Gold, magnetische Perlen, Chromogene, Farbstoffe und ähnliche Kennzeichnungen.
  • Insbesondere können an sich für die Verwendung bei der Minisequenzierung bekannte Kennzeichnungstechniken und/oder gekennzeichnete Nukleotide verwendet werden, wie die in WO 90/09455 , WO 91/02087 , WO 91/13075 , WO 92/15712 und/oder EP 0 123 513 erwähnten.
  • Ferner können sogenannte "indirekte" Kennzeichnungen verwendet werden, welche nach der Hybridisierung an die Zielsequenz/Erkennungssequenz angefügt werden, wieder wie zum Beispiel in WO 97/27317 beschrieben.
  • Neben der Ausstattung mit einer erkennbaren Kennzeichnung ist der erkennbare Nukleotid vorzugsweise ein solcher, dass – gegebenenfalls in Verbindung mit den weiteren Komponenten der Reaktionsmischung und/oder den Bedingungen, die für die Erweiterung der Erkennungssequenz verwendet werden – die Erweiterung der Erkennungssequenz endet, nachdem das erkennbare Nukleotid zu der Erkennungssequenz hinzugefügt wurde. Zu diesem Zweck können kettenabschließende Nukleotide und/oder kettenabschließende Bedingungen verwendet werden, wieder wie sie an sich für die Verwendung bei der Minisequenzierung bekannt sind, zum Beispiel aus WO 90/09455 , WO 91/02087 , WO 91/13075 , WO 92/15712 und/oder EP 0 123 513 . Es kann auch eine Kombination aus einem erkennbaren Nukleotid und einem abschließenden Nukleotid verwendet werden, vorausgesetzt das erkennbare Nukleotid wird in die Erkennungssequenz integriert, bevor die Erweiterung der Erkennungssequenz abgeschlossen wird.
  • Als nicht-einschränkende Beispiele abschließender Nukleotide können Deoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs), Dideoxyribonukleosidtriphosphate (ddNTPs) oder Thionukleotide verwendet werden, welche alle mit geeigneten Kennzeichnungen wie oben beschrieben ausgestattet sind. Zu diesen zählen dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dITP, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP.
  • Zu den Bedingungen für die Erweiterung der Erkennungssequenz mit dem erkennbaren Nukleotid können alle Bedingungen zählen, die an sich für die Erweiterung eines Oligonukleotides oder eines Primers, das/der an eine Nukleinsäurematrize hybridisiert ist, bekannt sind, zum Beispiel wie in der Technik für die Minisequenzierung beschrieben, wie in WO 90/09455 , WO 91/02087 , WO 91/13075 , WO 92/15712 und/oder EP 0 123 513 . Zu diesen zählen die Verwendung einer Polymerase wie E. coli DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, Bakteriophage T7 DNA-Polymerase, Bakteriophage T4 DNA-Polymerase, Taq DNA-Polymerase und AMV-Transkriptase in einem geeigneten Puffer wie einem wässrigen Puffer, welcher Mg-Salze enthält, bei einer Temperatur von 20–80°C, vorzugsweise 30–70°C.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung enthält die Mischung, die in Schritt b) für die Erweiterung der Erkennungssequenz verwendet wird, nur ein (eine Art von) erkennbares/m Nukleotid, d. h. ein oder mehrere erkennbare Nukleotide, die nur zu einem aus A, T, C oder G komplementär sind. Unter diesen Bedingungen führen nur diejenigen Zielsequenzen, die: 1) erfolgreich mit der Erkennungssequenz hybridisieren können und 2) in ihrer Sequenz, an einer Position direkt neben dem Teil der Sequenz, welcher mit der Erkennungssequenz hybridisiert, ein Nukleotid aufweisen, welches zu dem erkennbaren Nukleotid komplementär ist, zur Erweiterung der Erkennungssequenz mit dem erkennbaren Nukleotid und dadurch zu einem po sitiven Signal, welches die Gegenwart der Zielsequenz in der zu analysierenden Mischung anzeigt.
  • Auf diese Art und Weise stellt, wenn das ungepaarte Nukleotid der Zielsequenz direkt neben dem 3'-Ende der Erkennungssequenz in dem Hybrid bekannt ist, die Verwendung eines erkennbaren Nukleotids, welches dem ungepaarten Nukleotid entspricht, eine weitere Auswahl oder Bestätigung der Identität der Zielsequenz bereit. Zum Verbessern der Selektivität und/oder Sensitivität können zwei oder mehr bekannte Nukleotide neben dem 3'-Ende der Erkennungssequenz mit gekennzeichneten Nukleotiden (vorzugsweise in einer unterscheidbaren Art und Weise gekennzeichnet) "ausgefüllt" werden, d. h. in einem Zyklus der Schritte a) und b) oder mehreren Zyklen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Mischung, die in Schritt b) für die Erweiterung der Erkennungssequenz verwendet wird, jedoch auch zwei, drei oder vier unterschiedliche erkennbare Nukleotide enthalten. Mit "unterschiedliches erkennbares Nukleotid" ist gemeint, dass jedes erkennbare Nukleotid zu einem unterschiedlichen ungepaarten Nukleotid A, T, G oder C auf der Zielsequenz komplementär ist, und jedes erkennbare Nukleotid ist auf eine solche Art und Weise gekennzeichnet, dass es – d. h. unter Verwendung einer geeigneten Erkennungstechnik – von dem/den anderen erkennbaren Nukleotid/en, die in der Erweiterungsreaktion und/oder der erweiterten Erkennungssequenz vorliegen, unterschieden werden kann, so dass die Erweiterung der Erkennungssequenz mit einem spezifischen erkennbaren Nukleotid die Gegenwart eines spezifischen Nukleotids auf der entsprechenden Position der Zielsequenz anzeigen kann.
  • Gegebenenfalls können nach der Hybridisierung von Schritt a) und/oder nach der Erweiterungsreaktion von Schritt b) sämtliche Restriktionsfragmente, die nicht an eine Erkennungssequenz hybridisiert sind, sowie jegliche anderen unerwünschten Sequenzen, Verbindungen oder überschüssige Reagenzien entfernt werden, zum Beispiel durch Waschung der Anordnung.
  • Nachdem die Erkennungssequenz in den Zielsequenz-/Erkennungssequenz-Doppelsträngen mit dem erkennbaren Nukleotid ("DN" – detectable nucleotide) erweitert wurden, wird die daraus resultierende Mischung analysiert, um zu bestimmen, welche Erkennungssequenz mit einem DN erweitert wurde, und zwar unter Verwendung einer geeigneten Erkennungstechnik. Diese Analyse kann ausgeführt werden, während die Erkennungssequenz(en) noch an die entsprechende(n) Zielsequenz(en) hybridisiert wird/werden, oder die Zielsequenz(en) kann/können in einem separaten Schritt vor der Erkennung und Analyse aus/von der/n Erkennungssequenz(en) entfernt/getrennt werden.
  • Wenn die Erkennungssequenzen in Form einer Anordnung vorliegen, wird die Anordnung analysiert, um zu bestimmen, welche Bereiche auf der Anordnung (d. h. welche Erkennungssequenz(en)) das erkennbare Nukleotid zeigen. Diese Bereiche werden im Allgemeinen als ein positives Signal erkannt, welches die Gegenwart des entsprechenden Markers in der Probe anzeigt.
  • Die Analyse der Anordnung kann auf jede Art und Weise durchgeführt werden, die an sich bekannt ist, einschließlich optischer Techniken, Spektroskopie, chemischer Techniken, biochemischer Techniken, photochemischer Techniken, elektrischer Techniken, Lichtstreuungstechniken, kolorimetrischer Techniken, Radiographietechniken usw., abhängig von der Kennzeichnung in dem erkennbaren Nukleotide. Geeignete Techniken sind zum Beispiel in WO 97/27317 , WO 97/22720 , WO 97/43450 , EP 0 799 897 , WO 97/31256 , WO 97/27317 und WO 98/08083 beschrieben. Zum Beispiel kann die Anordnung visuell oder durch (konfokale) Mikroskopie; durch Spektroskopie; mittels photographischen Films, elektronischer Detektoren oder einer CCD-Kamera; durch kolorimetrische oder (bio)chemische Untersuchung; oder durch ein anderes geeignetes Verfahren untersucht werden, für welche wieder auf WO 97/27317 , WO 97/22720 , WO 97/43450 , EP 0 799 897 , WO 97/31256 , WO 97/27317 und WO 98/08083 verwiesen sei. Automatisierte Scanvorrichtungen auf Grundlage solcher Techniken können auch verwendet werden.
  • Gegebenenfalls können die relative Intensität oder der absolute Wert eines Signals, welches durch ein erkennbares Nukleotid an einer spezifischen Stelle auf der Anordnung erzeugt wird, als eine relative Indikation oder ein absolutes Maß der Menge des entsprechenden Zielsequenzfragmentes, welches in der ursprünglichen Probe vorliegt, verwendet werden, zum Beispiel wie in WO 98/08083 beschrieben.
  • Die Analyse der Anordnung kann als solche nützliche Ergebnisse bereitstellen, d. h. die Gegenwart oder Abwesenheit eines genetischen Markers oder eines genetischen Merkmals von Interesse zeigen, ein Individuum identifizieren oder anderweitig Informationen zu dem analysierten Individuum bereitstellen, wie zu welchem/r Stamm, Varietät, Sorte oder Rasse es gehört. Sie kann auch direkt die Gegenwart oder Abwesenheit eines Erkrankungszustandes anzeigen.
  • Gegebenenfalls können die aus dem "Lesen" der Anordnung erhaltenen Daten auch weiter verarbeitet werden, d. h. indem sie mit Referenzen, mit früheren Ergebnissen oder mit einer Datenbank verglichen werden, gegebenenfalls unter Verwendung von Computeralgorithmen.
  • Vorteilhafterweise können das Verfahren und die Anordnung der Erfindung verwendet werden, um die herkömmliche Fingerabdruck-/Autoradiographie-Analyse bei AFLP zu ersetzen. Dieser Aspekt der Erfindung umfasst die Schritte (a)–(e) des oben beschriebenen allgemeinen AFLP-Verfahrens, wobei Schritt (e) durch die Erweiterungs-/Verlängerungsreaktion der Schritte a) bis c) oben durchgeführt wird.
  • Verglichen mit dem/der herkömmlichen Fingerabdruck/Autoradiographie können das Verfahren und die Anordnung der Erfindung schneller sein, und mehrere Marker, die das Erzeugen mehrerer einzelner Fingerabdrücke erfordern würden, könnten auf einer einzelnen Anordnung erkannt werden. All dies macht das Verfahren und die Anordnungen der Erfindung besonders geeignet für das routinemäßige und/oder Hochdurchsatz-Screening, zum Beispiel bei der Pflanzenzüchtung.
  • Außerdem kann die Anordnung der Erfindung in geeigneter Weise als ein Kit von Teilen bereitgestellt sein, welches die Anordnung und weitere Komponenten für die Verwendung mit der Anordnung wie Hybridisierungspuffer, Erweiterungspuffer, Polymerase, gekennzeichnete Nukleotide, Behälter/Verpackung und Handbücher sowie Komponenten für an sich bekannte AFLP-Kits umfassen. Die Anordnung der Erfindung kann sogar die Form eines Handgerätes haben, wie ein Messstab.
  • Die Anordnung der Erfindung kann zum Analysieren jeder Art von Nukleinsäuresequenz oder Mischung von Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, aus Pflanzen abgeleitete Sequenzen, aus Tieren abgeleitete Sequenzen, aus dem Menschen abgeleitete Sequenzen, mikrobielle Sequenzen, Hefesequenzen, Sequenzen aus Pilzen und Algen und Virensequenzen, einschließlich Genom-DNA, cDNA, Strukturgene, regulatorische Sequenzen und/oder Teile davon. Vor der Verwendung in dem Verfahren der Erfindung werden diese Ausgangsnukleinsäuren begrenzt, am bevorzugtesten unter Verwendung der gleichen Restriktionsenzyme wie sie beim Erzeugen der Sequenzen verwendet werden, aus welchen die Erkennungssequenz(en) abgeleitet wurde(n), wodurch eine Mischung von Restriktionsfragmenten bereitgestellt wird, die in Schritt a) oben direkt verwendet werden kann.
  • Außerdem wird in einer hochbevorzugten Ausführungsform der Erfindung beim Analysieren einer Mischung von Restriktionsfragmenten, von der angenommen wird, dass sie mindestens eine Zielsequenz enthält, die begrenzte Mischung vor dem in Kontakt bringen mit der/n Erkennungssequenz(en) in Schritt a) oben amplifiziert. Vorzugsweise erfolgt die Amplifizierung durch "AFLP", womit in diesem Zusammenhang allgemeiner gemeint ist, dass die Ausgangs-DNA unter Verwendung von mindestens einem Restriktionsenzym begrenzt und dann unter Verwendung von Adaptern und Primern amplifiziert wird. Dies führt zu einer Verringerung der Probenkomplexität mit weniger Untergrundrauschen. Die (AFLP-)Amplifizierung kann die Verwendung selektiver AFLP-Primer beinhalten oder nicht. Die Hoch durchsatzanalyse von AFLP-Markern kann insbesondere erreicht werden, wenn Zielsequenzen unter Verwendung von weniger selektiven Nukleosiden als sie für die Erkennung der gleichen AFLP-Marker durch PAGE verwendet werden, erzeugt werden.
  • Im Prinzip können das Verfahren und die Anordnungen der Erfindung auf jeden Zweck angewandt und für jeden Zweck verwendet werden, für den ein polymorpher Marker verwendet und/oder identifiziert werden kann. Dies beinhaltet, jedoch nicht darauf beschränkt, alle in der Technik beschriebenen Verwendungen für polymorphe Marker bei bekannten DNA-Fingerabdruck-, Genotypisierungs-, Profilerstellungs- und DNA-Identifikationstechniken. Das Verfahren und die Anordnungen der Erfindung sind natürlich besonders geeignet für Anwendungen, für welche ein AFLP-Marker verwendet und/oder identifiziert werden kann, einschließlich der oben und in EP-A-0 534 858 und den gleichzeitig anhängigen Europäischen Anmeldungen EP 0 976 835 und EP 0 974 672 erwähnten.
  • Mögliche Anwendungsgebiete sind zum Beispiel das Züchten von Pflanzen und Tieren, Varietäten- oder Sortenidentifikation, diagnostische Medizin, Krankheitsdiagnose bei Pflanzen und Tieren, Identifikation genetisch vererbter Erkrankungen beim Menschen, Familienbeziehungsanalyse, forensische Wissenschaft, Organtransplantation, mikrobielle und virale Typisierung wie mehrfaches Testen auf Stämme von Infektionskrankheiten; sowie das Studium der genetischen Vererbung, Genexpression, Mutationen, Onkogene und/oder Arzneimittelresistenz; oder für die mRNA-Erkennung.
  • Wie bereits oben erwähnt, ist in diesen Anwendungen vorgesehen, dass Anordnungen der Erfindung entwickelt werden können, die Erkennungssequenzen tragen, welche die meisten oder sogar alle Marker von Interesse für eine spezifische Genotypisierungssammlung, wie für eine spezifische Spezies, repräsentieren. Weitere Anordnungen der Erfindung können Erkennungssequenzen enthalten, welche die meisten oder alle Marker repräsentieren, die notwendig sind, um ein Individuum innerhalb einer Genotypisierungssammlung zu klassifizieren, d. h. als zu einer/m bestimmten Spezies, Unterspezies, Varietät, Sorte, Rasse, Stamm oder Linie gehörend, oder um die Vererbung eines/r genetischen Merkmals oder Eigenschaft zu studieren. Außerdem kann eine Anordnung der Erfindung Erkennungssequenzen enthalten, die Marker repräsentieren, welche die Anwesenheit, die Abwesenheit oder den Zustand einer genetisch bestimmten oder genetisch beeinflussten Erkrankung oder Störung anzeigen, einschließlich Krebs, Onkogene und Onkogenmutationen. Eine solche Anordnung kann dann für diagnostische Zwecke verwendet werden.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Ergebnisse und/oder Daten, die durch das Analysieren einer Mischung von Restriktionsfragmenten mit dem Verfahren der Erfindung erhalten werden können. Diese Ergebnisse oder Daten können zum Beispiel in Form eines Bildes, eines Wertes, digitaler oder analoger Daten oder in einer anderen geeigneten Form vorliegen, und sie können gegebenenfalls auf einem geeigneten Datenträger gespeichert sein, einschließlich Papier, photographischer Film, Computerdateien, einer Datenbank usw. Diese Daten können wie direkt aus der Analyse oder Bewertung der Anordnung erhalten sein, oder sie können weiterverarbeitet worden sein.
  • Die Erfindung wird nun weiter mittels des folgenden nicht-einschränkenden experimentellen Teils sowie durch die beigefügten Figuren veranschaulicht, welche Folgendes zeigen:
  • 1: Erkennung von 2 polymorphen Fragmenten 243 und 335 in einer +3+3 (1A) und +6+6 (1B) -AFLP-Matrize (siehe Beispiel 3). +3+3 impliziert, dass eine AFLP-+3+3-Reaktion als Matrize für die Primerextensionsreaktion verwendet wurde. +6+6 impliziert, dass eine AFLP-+6+6-Reaktion als Matrize für die Primerextensionsreaktion verwendet wurde. A impliziert, dass dATP in der Primerextensionsreaktion angeboten wurde; C impliziert, dass dCTP in der Primerextensionsreaktion angeboten wurde. 1 bis 16 bezie hen sich auf die Anzahlen der Proben. + impliziert, dass Primerextension stattgefunden hat., – impliziert, dass keine Primerextension stattgefunden hat.
  • 2: Erkennung von 2 polymorphen Fragmenten 243 und 335 unter Verwendung fluoreszierend gekennzeichneter ddNTPs (FAN ddCTP und JOE ddATP) in Matrizen mit abnehmender Komplexität, für das Fragment 243 erzeugt mit +3+3, +4+3, +3+4, +4+4, +6+4, +6+5, +6+6 Primerkombinationen und für das Fragment 335 mit +3+3, +3+4, +6+4, +6+6 Primerkombinationen. Die Bilder wurden auf einem ABI Prism-377 DNA-Sequenzer erzeugt. Die Primerextensionsreaktionen erfolgten an drei Proben: zwei Proben mit dem Fragment und eine Probe ohne das Fragment in der Reihenfolge +, –, +.
  • 3: Erkennung der polymorphen AFLP-Fragmente 243 (3A) und 335 (3B) unter Verwendung von fluoreszierend gekennzeichnete ddNTPs (FAN ddCTP und JOE ddATP) und Erkennungsschrittprimern, in welchen einige Nukleoside durch Inosinreste (I) ersetzt wurden. Die Matrizen wiesen eine abnehmende Komplexität auf, entsprechend erzeugt mit +3+3, +3+4, +6+4, +6+6 Primerkombinationen. Die Primerextensionsreaktionen erfolgten an zwei Proben: eine Probe mit dem Fragment und eine Probe ohne das Fragment in der Reihenfolge +, –.
  • 4: Erkennung des polymorphen AFLP-Fragmentes 243 erzeugt mit den +3+3-AFLP-Primerkombinationen EcoAAC/MsaCAA in einer ds-AFLP-Matrize. Die Erkennungsschrittprimer wurden an Glasstreifen angehaftet. Der Primerextensionsschritt erfolgte durch Temperaturzirkulation in einem PCR-Röhrchen. + impliziert, dass Primerextension stattgefunden hat, – impliziert, dass keine Primerextension stattgefunden hat (siehe Beispiel 6).
  • 5A: AFLP-Fingerabdruck erzeugt mit Primerkombinationen mit einer ansteigenden Anzahl selektiver Nukleoside (entsprechend +2+3, +3+3, +4+3, +3+4, +4+4, +6+4, +6+6, +6+3) für Panels mit 4 Proben: eine Probe ohne das Fragment und drei Proben mit dem Fragment in der Reihenfolge (–, +, +, +). Es wurden Primerextensionen ausgewählt, um das polymorphe Band 149 wie mit einem Pfeil angegeben zu erzeugen.
  • 5B: Erkennung des polymorphen Fragmentes 149 aus 5A auf einer Matrize erzeugt mit +4+4 und +6+4 Primerkombinationen. Primerextensionsassays erfolgten an 6 Reis-Individuen mit drei Proben ohne das Fragment und drei Proben mit dem Fragment in der Reihenfolge (–, +, –, +, +, –) mit den 4 ddNTPs (A, C, G, T) wie angegeben. Eine positive Reaktion erfolgte nur, wenn der Primer mit ddGTP erweitert war.
  • 6: AFLP-Fingerabdruck erzeugt mit Primerkombinationen mit einer ansteigenden Anzahl selektiver Nukleoside, für Panels mit 4 Individuen und beginnend mit einer +2+3 amplifizierten Matrize. Es wurden Primerkombinationen ausgewählt, um die polymorphen Bänder (Marker 1 und 2 und 3) wie angegeben zu erzeugen. Die Pfeile oben zeigen die maximale Komplexität der AFLP-Reaktion an, aus welcher der angezeigte Marker noch durch Minisequenzierung erkannt werden konnte (Erkennungsgrenze).
  • 7: Minisequenzierungsassays an ds-DNA mit einer ansteigenden Anzahl von PCR-Zyklen an 3 negativen Individuen (welche das Zielfragment nicht aufweisen) und einem positiven Individuum (welches das Zielfragment aufweist). Die Reaktion bei Individuum 4 zeigt, dass sich das Signal erhöht, wenn sich die Anzahl der PCR-Zyklen erhöht.
  • 8: Minisequenzierung auf Objektgläsern: in jedem Well waren Primer in ansteigenden Konzentratio nen von 300, 30 bzw. 3 pmol getüpfelt. Minisequenzierung erfolgte mit ansteigenden Konzentrationen von 0,05, 0,5, 5 und 50 pmol der ss-Matrize in den Wells 1, 2, 3 bzw. 4.
  • 9: Schematische Übersicht über das Verfahren der Erfindung. 9A zeigt die Bindung eines Oligonukleotides an einen Chip für jeden zu erkennenden AFLP-Marker. Als nächstes ist die Hybridisierung einer AFLP-Reaktionsmischung in 9b gezeigt. 9C zeigt die Durchführung einer Minisequenzierungsreaktion und die Entfernung von überschüssiger Kennzeichnung durch Waschung, was in einem Chip resultiert, der bereit für das Scannen und die Erkennung von AFLP-Markern ist, wie in 9D gezeigt.
  • 10: Bild der Minisequenzierungsreaktion von Beispiel 8, gescannt für 180 Sek. auf dem FITC- und Cy-3-Kanal unter Verwendung eines Genetac 1000 Microarray-Slidescanners.
  • 11: Bild der Minisequenzierungsreaktion von Beispiel 9. Die Muster wurden unter Verwendung eines Fuji BAS-2000 Phosphoimage-Analysesystems visualisiert.
  • EXPERIMENTELLER TEIL
  • Beispiel 1: Allgemeine Protokolle
  • AFLP-Matrizen wurden in Übereinstimmung mit Standardverfahren (Vos et al. 1995 Nucleic Acids Research Vol. 23, Nr. 21: 4407–4414; Zabeau and Vos; Europäische Patentanmeldung EP 0534858 ) unter Verwendung von EcoRI und MseI als die Enzymkombination hergestellt. Den AFLP-Reaktionen gingen Voramplifizierungen mit einem selektiven Nukleosid auf jedem Primer voran. Die AFLP-Reaktionen erfolgten mit der Anzahl selektiver Nukleoside auf jedem Primer wie angegeben, z. B. impliziert +3+3 3 selektive Nukleoside auf jedem Primer, wobei sich die erste Zahl auf den EcoRI-Primer bezieht und sich die zweite Zahl auf den MseI-Primer bezieht.
  • Für die Sequenzanalyse wurden AFLP-Fragmente aus einem getrockneten Polyacrylamidgel ausgeschnitten, mit einem Primer reamplifiziert, welcher die umgekehrte M13-Primersequenz aufweist, mit der Sequenz des konstanten Teils des AFLP-EcoRI-Primers und einem MseI-AFLP-Primer ohne selektive Nukleoside erweitert, und die reamplifizierten Fragmente direkt aus dem umgekehrten M13-Primer sequenziert. Die Sequenzierungsreaktionen erfolgten unter Verwendung des Farbstoffabschluss-Sequenzierungskits erworben von Perkin-Elmer und wurden auf einem ABI 377 Sequenzer analysiert. Anschließend wurden Erkennungsschrittprimer hergestellt. Die Sequenzanalyse enthüllte auch die Natur des dNTP oder ddNTP, das für die Primerextension hinzuzufügen war.
  • Wenn AFLP-Reaktionen als Matrize für Primerextensionsreaktionen verwendet wurden, erfolgten die AFLP-Reaktionen ohne radioaktiv oder fluoreszierend gekennzeichnete Primer und mit 75 ng beider Primer in einem Volumen von 50 μl.
  • Die Primerextensionsreaktion an ss-DNA erfolgte gemäß Syvänen et al. (Syvänen et al. 1990 Genomics 8: 684–692; Syvänen et al. 1993 Am. J. Hum. Geriet. 52: 46–59) mit den folgenden Modifikationen. 10 bis 25 μl AFLP-Reaktionsmischung wurden für eine Primerextensionsreaktion verwendet. Die AFLP-Reaktionen erfolgten unter Verwendung eines biotinylierten Primers („Bio-Primer") und eines Standardprimers, und biotinylierte AFLP-Produkte wurden auf Streptavidin-beschichteten magnetischen Perlen (Dyna-Perlen, Dynal, Norwegen) oder in Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplattenwells (Labsystems, Helsinki, Finnland) gesammelt. Anschließend erfolgte die Primerextensionsreaktion auf entweder 1) dem biotinylierten Strang („Bio-Strang"), der nach der Denaturierung mit NaOH an die Perlen/Mikrotiterplattenwells gebunden bliebt oder 2) dem Nicht-Bio-Strang, der durch Kochen und Abpipettieren des Überstandes von dem Bio-Strang getrennt werden konnte. Dies erfolgte nach der Reinigung der AFLP-Fragmente durch Hinzufügen von Shrimp Alkaline Phosphatase und Exonuklease I, um sämtliche übrig gebliebenen Primer und dNTPs zu entfernen; zu 50 μl AFLP-Reaktion wurden 50 μl der folgenden Mischung zugegeben: 4 μ Shrimp Alkaline Phosphatase (Amersham Life Science, Cleveland, Ohio), 2 μ Exonuklease I (Amersham, Pharmacia, Biotech), 5 μl Shrimp Alkaline Phosphatase-Puffer und Wasser auf 50 μl. Dies wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert, und anschließend wurden die Enzyme bei 95°C inaktiviert (Chen et al. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, 10756–10761).
  • Die Primerextensionsreaktion auf dem Bio-Strang erfolgte in 10 mM Tris-HCl, pH 9,5, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,002% Tween-20, 2 μl 5 μM Erkennungsprimer, 0,3 μl gekennzeichnetes 33P-ddNTP (Amersham), 3,2 Einheiten Thermosequenase und Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 μl. Die Reaktion wurde für 10 Minuten bei 50°C inkubiert, die Wells/Perlen wurden gewaschen und Minisequenzierungsprodukte durch Denaturierung in 20 μl Formamidfarbstoff (80% Formamid mit 10 mg/ml blauem Dextran) bei 94°C aus den Perlen freigesetzt, auf Whatman-Papier getüpfelt und für 16 Stunden Fuji Phosphoimage-Screens ausgesetzt. Die Muster wurden unter Verwendung eines Fuji BAS-2000 Phosphoimage-Analysesystems (Fuji Photo Film Company Ltd. Japan) visualisiert.
  • Die Minisequenzierungsreaktion auf dem Nicht-Bio-Strang erfolgte auf die gleiche Art und Weise wie oben beschrieben, jedoch erfolgten die Primerextensionsreaktionen auf Objektgläsern mit daran angehafteten modifizierten Primern (siehe die nicht-einschränkende schematische Zeichnung von 9). Nicht-Bio-Stränge der AFLP-Fragmente wurden zu der Reaktionsmischung zugegeben. Das Beschichten der Objektgläser und Binden der Primer erfolgte wie durch Guo et al. (Guo et al. 1994 Nucleic Acids Research Vol. 22, Nr. 24: 5456–5465) beschrieben. 1 μl Primer wurde manuell getüpfelt. Erkennungsschrittprimer wurden 5'-Amino- und 5'-(T)15-modifiziert. Die Objektgläser wurden gewaschen und für 16 Stunden Fuji Phosphoimage-Screens ausgesetzt. Die Muster wurden unter Verwendung eines Fuji BAS-2000 Phosphoimage-Analysesystems (Fuji Photo Film Company Ltd. Japan) visualisiert.
  • Die Primerextensionsreaktion auf ds-DNA erfolgte gemäß Syvänen et al. (1990, 1993) mit den folgenden Anpassungen. Die AFLP-Reaktionen wurden durchgeführt und mit Shrimp Alkaline Phosphatase und Exonuklease I behandelt, um sämtliche übrig gebliebenen Primer und dNTPs zu entfernen (Chen et al. 1997). Anschließend erfolgte die Primerextensionsreaktion in 50 μl 10 mM Tris-HCl, pH 9,5, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,002% Tween-20, 2 μl 5 μM modifizierter Erkennungsprimer, 0,3 μl gekennzeichnetes 33P-ddNTP (Amersham), 2,5 μl 2 μM ddNTPs, 3,2 Einheiten Thermosequenase. Das PCR-Profil bestand aus 35 Zyklen mit 15 Sekunden bei 95°C und 30 Sekunden bei 58°C (Chen et al. 1997). Die Primerextensionsreaktionen erfolgten auf Glasstreifen mit darauf angehafteten Primern in PCR-Röhrchen. Das Beschichten der Glasstreifen und Binden der Primer erfolgte wie durch Guo et al. (1994) beschrieben. 1 μl Primer wurde manuell getüpfelt. Erkennungsschrittprimer wurden 5'-Amino- und 5'-(T)15-modifiziert.
  • Die Glasstreifen wurden gewaschen und für 16 Stunden Fuji Phosphoimage-Screens ausgesetzt. Die Muster wurden unter Verwendung eines Fuji BAS-2000 Phosphoimage-Analysesystems (Fuji Photo Film Company Ltd. Japan) visualisiert.
  • Beispiel 2: Oligosynthese
  • Oligonukleotide wurden in Übereinstimmung mit Standardverfahren synthetisiert, oder sie wurden von MWG-Biotech GmbH (Deutschland) erworben.
  • Beispiel 3: Erkennung von zwei polymorphen AFLP-Fragmenten in Tomate
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Erkennung von zwei polymorphen AFLP-Fragmenten in Tomate, 243 und 335, erzeugt mit den +3+3-AFLP-Primerkombinationen bio-EcoAAC/MseCCA bzw. bio-EcoACT/MseCAC, oder den +6+6-AFLP-Primerkombinationen bio-EcoAACCAC/MseCAACAG bzw. bioEcoACTTTT/MseCACGAA.
  • Die AFLP-Reaktionen erfolgten unter Verwendung eines biotinylierten Eco-Primers und eines Standard-Mse-Primers, und biotinylierte AFLP-Produkte wurden in Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplattenwells gesammelt. Anschließend erfolgte die Primerextensionsreaktion auf dem Bio-Strang wie oben beschrieben, jedoch unter Verwendung von 32P-gekennzeichnetem dNTP (0,1 μl/Reaktion; Amersham). Für das polymorphe Fragment 243 in der +3+3-AFLP-Matrize wurden 3 Proben mit dem Fragment (1, 3, 4; 1A) und 1 Probe ohne das Fragment (2) untersucht; für das polymorphe Fragment 335 wurden 2 Proben mit dem Fragment (5, 7) und 2 Proben ohne das Fragment (6, 8) untersucht. Für das polymorphe Fragment 243 in der +6+6-AFLP-Matrize wurden 4 Proben mit dem Fragment untersucht (9, 10, 11, 12; 1B); für das polymorphe Fragment 335 wurden 2 Proben mit dem Fragment (13, 15) und 2 Proben ohne das Fragment (14, 16) untersucht. Für das Fragment 243 wurde der Erkennungsschrittprimer 1 verwendet, welcher mit einem C erweitert werden muss; für das Fragment 335 wurde der Erkennungsschrittprimer 2 verwendet, welche mit einem A erweitert werden muss. Die Reaktionen erfolgten sowohl mit dATP als auch mit dCTP. Die Erweiterungsprodukte wurden auf Whatman-3MM-Papier getüpfelt. Die Ergebnisse zeigen, dass eine positive Reaktion nur stattfindet, wenn das Ziel-AFLP-Fragment vorliegt und wenn die Primer gemäß der Sequenzinformation mit dem entsprechenden Nukleosidtriphosphat erweitert sind.
  • Die Sequenz der konstanten Region für die Eco-Primer war (5'-3'): GACTGCGTACCAATTC
  • Die Sequenz der konstanten Region für die Mse-Primer war (5'-3'): GATGAGTCCTGAGTAA
    • AFLP-Primer zum Erzeugen von Fragment 243 (5'-3'):
    • Bio-Eco+3: EcoAAC
    • Mse+3: MseCAA
    • Bio-Eco+6: EcoAACCAC
    • Mse+6: MseCAACAG
    • Erkennungsschrittprimer 1 zum Erkennen von Fragment 243, wenn erweitert mit dCTP (5'-3'):
    • AGCAGTAGCAACCACTTCAGCC
    • AFLP-Primer zum Erzeugen von Fragment 335 (5'-3'):
    • Bio-Eco+3: EcoACT
    • Mse+3: MseCAC
    • Bio-Eco+6: EcoACTTTT
    • Mse+6: MseCACGAA
    • Erkennungsschrittprimer 2 zum Erkennen von Fragment 335, wenn erweitert mit dATP:
    • ATCCGGCCAGTTATACC
  • Beispiel 4: Erkennung der polymorphen AFLP-Fragmente 243 und 355 unter Verwendung fluoreszierend gekennzeichneter ddNTPs
  • Die AFLP-Reaktionen erfolgten mit Primerkombinationen mit ansteigenden Zahlen selektiver Nukleoside, für Panels von 3 Individuen (+, –, +). Die AFLP-Primerextensionen wurden ausgewählt, um das Fragment 243 bzw. 355 zu erzeugen. Die AFLP-Reaktionen erfolgten unter Verwendung eines biotinylierten EcoRI-Primers und eines Standard-MseI-Primers, und biotinylierte AFLP-Produkte wurden auf Streptavidin-beschichteten magnetischen Perlen gesammelt. Anschließend erfolgte die Primerextensionsreaktion auf dem Bio-Strang, wie oben beschrieben, jedoch unter Verwendung fluoreszierend gekennzeichneter ddNTPs (0,1 μl/Reaktion Joe ddATP, Joe ddCTP, NEN, Boston, USA). Die Erkennungsschrittprimer und Erweiterungen waren wie in Beispiel 3. Die Erweiterungsprodukte wurden auf einem ABI Sequenzierungsgel analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass eine positive Reaktion nur stattfindet, wenn das Ziel-AFLP-Fragment vorliegt (2).
    • AFLP-Primer zum Erzeugen von Fragment 243 (5'-3'):
    • Bio-Eco+3: EcoAAC
    • Bio-Eco+4: EcoAACC
    • Bio-Eco+6: EcoAACCAC
    • Mse+3: MseCAA
    • Mse+4: MseCAAC
    • Mse+5: MseCAACA
    • Mse+6: MseCAACAG
    • Erkennungsschrittprimer 1 zum Erkennen von Fragment 243, wenn erweitert mit ddCTP (5'-3'):
    • AGCAGTAGCAACCACTTCAGCC
    • AFLP-Primer zum Erzeugen von Fragment 335 (5'-3'):
    • Bio-Eco+3: EcoACT
    • Bio-Eco+6: EcoACTTTT
    • Mse+3: MseCAC
    • Mse+4: MseCACG
    • Mse+6: MseCACGAA
    • Erkennungsschrittprimer 2 zum Erkennen von Fragment 335, wenn erweitert mit ddATP (5'-3'):
    • ATCCGGCCAGTTATACC
  • Beispiel 5: Erkennung der polymorphen AFLP-Fragmente 243 und 355 unter Verwendung von fluoreszierend gekennzeichneten ddNTPs und Erkennungsschrittprimern, in welchen einige Nukleoside durch Inosinreste ersetzt wurden.
  • Die AFLP-Reaktionen erfolgten mit Primerkombinationen mit ansteigenden Zahlen selektiver Nukleoside, für Panels von 2 Individuen (+, –). Die Primerextensionen wurden ausgewählt, um das Fragment 243 bzw. 355 zu erzeugen. Die AFLP-Reaktionen erfolgten unter Verwendung eines biotinylierten EcoRI-Primers und eines Standard-MseI-Primers, und biotinylierte AFLP-Produkte wurden auf Streptavidin-beschichteten magnetischen Perlen (Dynal) gesammelt. Anschließend erfolgte die Primerextensionsreaktion auf dem Bio-Strang, wie in Beispiel 2 beschrieben, jedoch unter Verwendung von sowohl Standard-AFLP-Primern als auch degenerierten AFLP-Primern, in welchen einige selektive Nukleoside durch Inosin als Erkennungsschrittprimer ersetzt waren. Für das Fragment 243 mussten die Erkennungsschrittprimer mit einem C erweitert werden und für das Fragment 355 musste der Erkennungsschritt mit einem A erweitert werden. Fluoreszierend gekennzeichnete ddNTPs wurden verwendet (0,1 μl/Reaktion (Joe ddATP, Fam ddCTP, NEN, Boston, USA). Die Erweiterungsprodukte wurden auf einem ABI Sequenzierungsgel analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass eine positive Reaktion nur stattfindet, wenn das Ziel-AFLP-Fragment vorliegt, und dass Standard-AFLP-Primer durch Primer ersetzt sein können, in denen Nukleoside durch 1, 2 bzw. 3 Inosinreste ersetzt wurden (3A für Fragment 243; 3B für Fragment 335). Nicht-selektive Nukleoside sind in Primern nur an Stellen eingefügt, die in der AFLP-Reaktion fixiert wurden, die als Matrize für die Primerextensionsreaktion verwendet wird.
    • AFLP-Primer zum Erzeugen von Fragment 243 (5'-3'):
    • Bio-Eco+3: EcoAAC
    • Bio-Eco+6: EcoAACCAC
    • Mse+3: MseCAA
    • Mse+4: MseCAAC
    • Mse+6: MseCAACAG
    • Erkennungsschrittprimer zum Erkennen von Fragment 243, wenn erweitert mit Fam ddCTP (5'-3'):
    • Mse+6: MseCAACAG
    • Mse+6: MseIIICAG
    • Mse+6: MseIIACAG
    • Mse+6: MseIAACAG
    • AFLP-Primer zum Erzeugen von Fragment 335 (5'-3'):
    • Bio-Eco+3: EcoACT
    • Bio-Eco+6: EcoACTTTT
    • Mse+3: MseCAC
    • Mse+4: MseCACG
    • Mse+6: MseCACGAA
    • Erkennungsschrittprimer zum Erkennen von Fragment 335, wenn erweitert mit Joe ddATP (5'-3'):
    • Mse+6: MseCACGAA
    • Mse+6: MseIIIGAA
    • Mse+6: MseIICGAA
    • Mse+6: MseIACGAA
  • Beispiel 6: Erkennung des polymorphen AFLP-Fragmentes 243 erzeugt mit den +3+3-AFLP-Primerkombinationen EcoAAC/MseCAA in der ds-AFLP-Matrize.
  • +3+3-AFLP-Reaktionen erfolgten wie in Beispiel 3 beschrieben, jedoch mit Standard-AFLP-Primern (es wurde kein biotinylierter Primer verwendet).
  • Die Primerextensionsreaktionen erfolgten wie für ds-DNA beschrieben mit Temperaturzirkulation. 2 Proben mit dem Fragment und 2 Proben ohne das Fragment wurden untersucht; modifizierter Erkennungsschrittprimer 1 wurde verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass eine positive Reaktion nur stattfindet, wenn das Ziel-AFLP-Fragment vorliegt (4).
    • AFLP-Primer zum Erzeugen von Fragment 243 (5'-3'):
    • Eco+3: EcoAAC
    • Mse+3: MseCAA
    • Modifizierter Erkennungsschrittprimer 1 zum Erkennen von
    • Fragment 243, wenn erweitert mit ddCTP (5'-3'):
    • NH2-(T)15 AGCAGTAGCAACCACTTCAGCC
  • Beispiel 7: Erkennung des polymorphen AFLP-Fragmentes 149 in Reis unter Verwendung eines AFLP-+6-Primers als Erkennungsschrittprimer
  • AFLP-Fingerabdrücke wurden mit Primerkombinationen mit ansteigenden Zahlen selektiver Nukleoside erzeugt, für Panels von 4 Individuen (–, +, +, +; 5A). Primerextensionen wurden ausgewählt, um das Fragment 149 wie angegeben zu erzeugen. Die AFLP-Fingerabdrücke zeigen die Komplexität von AFLP-Reaktionen abhängig von der Anzahl selektiver Nukleoside.
  • Die als Matrize für Primerextensionsreaktionen verwendeten AFLP-Reaktionen erfolgten wie in Beispiel 3 beschrieben unter Verwendung eines biotinylierten EcoRI-Primers und eines Standard-MseI-Primers, und biotinylierte AFLP-Produkte wurden in Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplattenwells (Labsystems, Helsinki, Finnland) gesammelt. Anschließend erfolgte die Primerextensionsreaktion auf dem Bio-Strang unter Verwendung aller vier 33P-gekennzeichneten ddNTPs und unter Verwendung eines Standard-AFLP-+6-Primers, der mit einem G erwei tert werden musste. Der Primer MseCTAAAT wurde als Erkennungsschrittprimer bei +6+4- und +4+4-AFLP-Reaktionen an 6 Individuen mit drei Proben ohne das Fragment und drei Proben mit dem Fragment in der Reihenfolge (–, +, –, +, +, –; 5B) verwendet.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass eine positive Reaktion nur stattfindet, wenn das Ziel-AFLP-Fragment vorliegt, und wenn die Primer gemäß der Sequenzinformation mit dem entsprechenden Nukleosidtriphosphat erweitert sind.
    • AFLP-Primer zum Erzeugen von Fragment 149 (5'-3'):
    • Eco+2: EcoAA
    • Eco+3: EcoAAC
    • (bio)-Eco+4: (bio)-Eco-AACC
    • (bio)-Eco+6: (bio)-Eco-AACCTT
    • Mse+3: MseCTA
    • Mse+4: MseCTAA
    • Mse+6: MseCTAAAT
    • Erkennungsschrittprimer: Mse+6 (5'-3'): Mse-CTAAAT
  • H. Erkennung von AFLP-Markern durch Minisequenzierung
  • Minisequenzierung wurde als ein Verfahren zum Erkennen von AFLP-Fragmenten untersucht. Minisequenzierung unter Verwendung einer AFLP-Matrize kann angewandt werden als 1) ein Verfahren zum Adressieren der Sensitivität der Minisequenzierung, da die Anzahl von Matrizenfragmenten leicht variiert werden kann; 2) ein nicht-zufälliges Verfahren für die AFLP-Markererkennung durch Verwendung vorbestimmter Sequenzinformationen; 3) ein zufälliges Verfahren für die Markererkennung durch Verwendung erweiterter AFLP-Primer. Bisher wurde Minisequenzierung als ein Verfahren zum Erkennen von AFLP-Fragmenten unter Verwendung vorbestimmter Sequenzinformationen für die Herstellung von Erkennungsprimern untersucht, bei denen es sich entweder um erweiterte AFLP-Primer oder interne Erkennungsprimer handelte.
  • Häufig erkennen +6-Primer einmalige Fragmente nicht, wie durch die Bestimmung der +6-Sequenzen für den EcoRI-Primer sowie für den MseI-Primer für alle Fragmente in 2 Fingerabdrücken erzeugt mit einem EcoRI-+2- und einem MseI-+3-Primer gezeigt wurde. Die optimale Anzahl selektiver Nukleoside, die zu AFLP-Primern hinzugefügt sind, wenn sie als Erkennungsprimer verwendet werden, muss noch bestimmt werden.
  • I. Sensitivität der Minisequenzierungserkennung von AFLP-Fragmenten in einer AFLP-Matrize
  • Zum Bestimmen der Sensitivität der Minisequenzierung bei ss-DNA im Vergleich zur Sensitivität der Erkennung in einem Standard-AFLP-Gel, erfolgten AFLP-Reaktionen unter Verwendung ansteigender Zahlen selektiver Nukleoside für 3 AFLP-Marker (6 und 7). Die Minisequenzierung zum Erkennen der 3 AFLP-Marker wurde dem Protokoll, wie für die Minisequenzierung auf der ss-Matrize unter Verwendung des Bio-Strangs beschrieben, folgend angewandt. Die +6-AFLP-Primer wurden als Erkennungsprimer verwendet. Es wurde gezeigt, dass die maximale Komplexität der Matrize vom zu erkennenden Marker abhängig war: für Marker 1 war dies die +6+4-amplifizierte Matrize; für Marker 2 war dies die +6+4-amplifizierte Matrize und für Marker 3 war dies die +2+3-amplifizierte Matrize. Dies impliziert eine Erkennungsgrenze bei 1010 Molekülen, welche weniger sensitiv ist, als für die Erkennung auf Mikroanordnungen in Genexpressionsstudien beansprucht wird (106 Moleküle).
  • J. Minisequenzierung auf ds-DNA
  • Um in der Lage zu sein, die Komplexität der Matrize zu erhöhen und das Minisequenzierungsprotokoll zu vereinfachen, erfolgte die Minisequenzierung auf der ds-Matrize unter Verwendung eines Zwei-Schritt-PCR-Zyklusprofils: ein Denaturierungsschritt gefolgt von dem Primerverlängerungsschritt: auf diese Art und Weise konnte die Matrize in jedem Zyklus wiederverwendet werden und die Menge des durch den verlängerten Primer erzeugten Signals erhöhte sich (8). Diese Anpas sung des Protokolls ist ein Zeiteinsparungsschritt, da kein Bedarf besteht, vor der Minisequenzierungsreaktion eine Einzelstrangmatrize herzustellen. Die Erkennungsprimer wurden Biotin-gekennzeichnet, um die Produkte der Minisequenzierungsreaktion als eine Alternative zu Amino-gekennzeichneten Erkennungsprimern auf einem festen Träger leicht zu reinigen.
  • K. Festphasenerkennung von Minisequenzierungsprodukten auf Objektgläsern
  • Ein Protokoll für die kovalente Bindung von 5'-Aminoprimern auf Glas wurde untersucht (Guo et al. 1994), da bisher Minisequenzierungsreaktionen auf Glas aufgrund von viel Untergrundrauschen nicht erfolgreich waren. Die Primerbindung wurde durch die radioaktive Kennzeichnung von Primern mit einer internen Aminogruppe geprüft. Es wurde gezeigt, dass eine Bindung stattfindet. In einer Minisequenzierungsreaktion unter Verwendung eines ss-60-mer-Oligo als eine Matrize wurde gezeigt, dass unter Befolgung des Protokolls für die ss-Nicht-Biostrang-Minisequenzierung Reaktionsprodukte abhängig von der Menge der angebotenen Matrize und abhängig von der Menge des am Objektglas angehafteten Oligo erkannt wurden.
  • Die Minisequenzierung unter Verwendung einer +3+3-amplifizierten Matrize und unter Verwendung eines internen Erkennungsprimers unter Befolgung des Protokolls für die Minisequenzierung auf einer ds-Matrize erfolgte auf Glasstreifen in einem PCR-Röhrchen, und es wurde gezeigt, dass spezifische Produkte erhalten wurden.
  • L. Schlussfolgerungen
  • Das Minisequenzierungsprotokoll wurde durch die Verwendung von ds-DNA und die Durchführung der Minisequenzierung in einer Reihe von Zyklen zum Erhöhen der Sensitivität der Markererkennung verbessert. Die Minisequenzierung kann nun auf Objektgläsern durchgeführt werden, was ein wichtiger Schritt in Richtung der mehrfachen Erkennung von AFLP- und anderen Markern auf Chips ist. Die gegenwärtige Sensitivität ist ähnlich der Sensitivität der Markererkennung bei AFLP unter Verwendung von Polyacrylamidgelen. Es wird erwartet, dass durch die Verwendung neuer Mikroanordnungs- und Chiptechnologie die Sensitivität der Erkennung verbessert werden kann.
  • Beispiel 8: Entwicklung eines fluoreszierenden AFLP-Markererkennungssystems
  • 1. Beschreibung der biologischen Materialien
  • Die verwendeten biologischen Materialien sind die Reislinien IR20 und 6383.
  • 2. EcoRI/MseI-AFLP-Matrizenherstellung
  • AFLP-Matrizen wurden unter Verwendung der Restriktionsenzyme EcoRI und MseI hergestellt, und Voramplifizierungsreaktionen erfolgten in Übereinstimmung mit den durch Vos et al. (Nucleic Acids Research 23; Nr. 21, S. 4407–4414, 1995; und Patentanmeldung EP 0534858 ) beschriebenen Standardverfahren.
  • Die abschließenden selektiven Amplifizierungsreaktionen wurden aus einer 20-fach verdünnten +1/+1-Voramplifizierungsmischung unter Verwendung eines selektiven EcoRI-+2-Primers in Kombination mit einem MseI-+3-Primer durchgeführt.
    Name des AFLP-Markers Primerkombination Größe paare) (Basen-Elternlinie
    1. 1A1 E11/M48 571 IR20
    2. 1A8 E11/M48 264 IR20
    3. 1A11 E11/M48 187 IR20
    4. 1B1 E11/M48 154 IR20
    5. 1G6 E11/M49 342 6383
  • Die AFLP-Marker 1 bis 5 wurden herausgeschnitten, reamplifiziert und geklont. Die Kolonien wurden amplifiziert und AFLP-Matrizen hergestellt, alles in Übereinstimmung mit Standardverfahren.
  • Die Voramplifizierungsreaktionen wurden unter Verwendung eines EcoRI+0-Primers in Kombination mit einem biotinylierten Mse+0-Primer durchgeführt. Die DNA wurde mit Shrimp Alkaline Phosphatase und Exonuklease I, wie in Beispiel 1 benannt, gereinigt.
  • Die Sequenzen der Adapter, AFLP-Voramplifizierungsprimer und (selektiven AFLP-)Amplifizierungsprimer werden wie Folgt verwendet:
    • MseI-Adapter:
    • 92A18: 5'-GACGATGAGTCCTGAG-3
    • 92A19: 3'-TACTCAGGACTCAT-5'
    • MseI + 0 biotinylierter AFLP-Primer:
    • 93E40: *-5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'
    • MseI + 1 Voramplifizierungs-AFLP-Primer:
    • M01: 5'-GATGAGTCCTGAGTAAC-3'
    • MseI +3 selektive Amplifizierungs-AFLP-Primer:
    • M48: 5'-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3'
    • M49: 5'-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3'
    • EcoRI-Adapter:
    • 91M35: 5'-CTCGTAGACTGOGTACC-3'
    • 91M36: CATCTGACGCATGGTTAA-5'
    • EcoRI + 0 Voramplifizierungs-AFLP-Primer:
    • E00L: 5'-GTAGACTGCGTACCAATTC-3'
    • EcoRI + 1 Voramplifizierungs-AFLP-Primer:
    • E01: 5'-GACTGCGTACCAATTCA-3'
    • EcoRI +2 selektiver Amplifizierungs-AFLP-Primer:
    • E11: 5'-GACTGCGTACCAATTCAA-3'
  • 3. Oligosynthese
  • Oligonukleotid-Minisequenzierungserkennungsprimer wurden von MWG-Biotech GmbH erworben. Sie wurden 5'-Amino-modifiziert und sie weisen einen Poly-T-Schwanz von 15 Nukleotiden am 5'-Ende auf.
  • Die Sequenzen der Oligonukleotide sind Folgende:
    99f41: 5'-(T)15TGGCTGGCAACGAGCGACA-3
    99f42: 5'-(T)15TTCACCCGCCGGTTAGTITC-3
    99f43: 5'-(T)15ACTGTCCGCTCTCGCATTCA-3
    99f44: 5'-(T)15GATCACGACATCACGTTGCG-3
    99f45: 5'-(T)15ATTGCGAGCCACATCGTTCC-3
    99f46: 5'-(T)15GGCCTGAAACGCTGGGTTG-3
    99f47: 5'-(T)15TTTTCTCGGCTTTTCTTTCT-3
  • 4. Herstellung der Objektglaser
  • 3D-Link-aktivierte Objektgläser (SurModics) wurden gemäß der Herstelleranweisungen verwendet und verarbeitet. Die Oligonukleotid-Minisequenzierungserkennungsprimer wurden unter Verwendung eines QMS417-Microarrayers von Genetic Microsystems mit einer Konzentration von 0,8 μg/μl (±100 pmol) in 150 mM Natriumphosphat, pH 8,5, aufgedruckt.
  • 5. Minisequenzierung
  • Die Minisequenzierung bei ss-AFLP-Reaktionen erfolgte gemäß Syvänen et al. (1990, 1993) mit den folgenden Modifikationen. Die biotinylierten AFLP-Produkte wurden auf Streptavidin-beschichteten magnetischen Perlen (Dynal) gesammelt. Anschließend erfolgte Minisequenzierung auf dem nicht-biotinylierten Strang, der durch Kochen und Abpipettieren des Überstandes von dem biotinylierten Strang getrennt werden konnte. Die Minisequenzierungsreaktion wurde mit 20 μl ss-Reaktion von AFLP-Marker 1A1 in 10 mM Tris-HCl, pH 9,5, 50 mM KCl, 20 mM MgCl2, 0,02% Tween-20, 2 μl 0,01 mM FAM ddATP, 4,5 Einheiten Thermosequenase und Wasser auf ein Gesamtvolumen von 40 μl durchgeführt. Die Reaktion wurde für 20 Minuten bei 55°C inkubiert. Die Objektgläser wurden dann in 40 mM Tris, pH 8,8, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,1% Tween-20 gewa schen. Die Objektgläser wurden unter Verwendung eines Genetac 1000 Microarray-Slidescanners (Genomic Solutions) auf dem FITC- und Cy-3-Kanal für 180 Sekunden gescannt. Das Bild ist in 10 gezeigt.
  • 6. Ergebnisse
  • 10 zeigt einen Abschnitt des Objektglases mit Oligonukleotiden auf die folgende Art und Weise aufgedruckt:
    DUPLO
    1 35 5 7 9 1 3 5 7 9
    Bcntrl* 99f41 99f42 99f43 99f44 cntrl* 99f41 99f42 99f43 99f44
    D 99f45 99f46 99f47 cntrl* 99f45 99f46 99f47 cntrl* cntrl*
    • (cntrl* = Kontrolle: um zu bestimmen, welches die Positionen der Oligonukleotide waren, wurden ein Kontrolloligo mit einer 5'-Cy-3-Gruppe und eine interne Aminogruppe auf der Anordnung eingefügt.)
  • Das Oligonukleotid 99f41 kann durch ddATP erweitert werden, wenn der ss-AFLP-Marker 1A1 verwendet wird. Ein starkes Signal ist an Position B3 zu sehen, wo das Oligo 99f41 nach der Erweiterung durch Minisequenzierung mit FAN ddATP getüpfelt ist. Im Duplo ist das starke Signal auch zu sehen. Die Punkte in B1 und D9 sind die positiven Kontrollstellen.
  • 7. Schlussfolgerung
  • Dieses Beispiel demonstriert die spezifische Erkennung eines AFLP-Markers durch Minisequenzierung auf einer Anordnung, welche Erkennungsprimer für 7 unterschiedliche AFLP-Marker enthält, unter Verwendung eines einzelnen ss-AFLP-Markerfragmentes.
  • Beispiel 9: Entwicklung eines radioaktiven AFLP-Markererkennungssystems auf einem Mikrochip
  • 1. Minisequenzierung
  • Das biologische Material, die Matrizenherstellung, die Oligosynthese und die Herstellung der Objektgläser ist wie in Beispiel 9 beschrieben. Die Minisequenzierung bei ss-AFLP-Fragmenten erfolgte gemäß Syvänen et al. (1990, 1993) mit den folgenden Modifikationen. Die biotinylierten AFLP-Produkte wurden auf Streptavidin-beschichteten magnetischen Perlen (Dynal) gesammelt. Anschließend erfolgte Minisequenzierung auf dem nicht-biotinylierten Strang, der durch Kochen und Abpipettieren des Überstandes von dem biotinylierten Strang getrennt werden konnte.
  • Die Minisequenzierungsreaktion wurde mit 1,25 μl ss-Reaktion von AFLP-Marker 1A8, mit 1,25 μl Reaktion von Marker 1A11, 1,25 μl Reaktion von Marker 1B1 und 1,25 μl Reaktion von Marker 1G6 in 10 mM Tris-HCl, pH 9,5, 50 mM KCl, 20 mM MgCl2, 0,02% Tween-20, 0,42 μl gekennzeichnetem 33P-ddATP (Amersham), 4,5 Einheiten Thermosequenase und Wasser auf ein Gesamtvolumen von 40 μl durchgeführt. Die Reaktion wurde für 20 Minuten bei 55°C inkubiert. Die Objektgläser wurden dann in 40 mM Tris, pH 8,8, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,1% Tween-20 gewaschen. Die Objektgläser wurden für 16 Stunden Fuji Phosphoimage-Screens ausgesetzt. Die Muster wurden unter Verwendung eines Fuji BAS-2000 Phosphoimage-Analysesystems visualisiert. Das Bild der Minisequenzierungsreaktion ist in 11 gezeigt.
  • 2. Ergebnisse
  • 11 zeigt einen Abschnitt des Objektglases, welches die gleichen Oligonukleotide enthält, wie in Beispiel 9 beschrieben. Die Oligonukleotide 99f42, 99f44 und 99f45 können mit ddATP erweitert werden, wenn entsprechend ss-AFLP-Reaktion 1A8, 1A11 und 1B1 verwendet wird. Starke Signale sind an Position B5 zu sehen, wo Oligo 99f42 getüpfelt ist, an Position B9, wo Oligo 99f44 getüpfelt ist und an Position D3, wo Oligo 99f45 getüpfelt ist. Im Duplo sind die starken Signale auch zu sehen.
  • Die ss-AFLP-Matrize 1G6 hatte ein starkes Signal auf einem anderen Abschnitt des Objektglases (nicht gezeigt).
  • 3. Schlussfolgerung
  • Dieses Beispiel demonstriert die spezifische Erkennung von 3 AFLP-Markern durch Minisequenzierung auf einer Anordnung, welche Minisequenzierungserkennungsprimer für 7 unterschiedliche AFLP-Marker enthält, unter Verwendung einer Mischung von 4 unterschiedlichen ss-AFLP-Markerfragmenten.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001

Claims (12)

  1. Verfahren zum Analysieren einer AFLP-Reaktionsmischung auf die Gegenwart oder Abwesenheit von Zielrestriktionsfragmenten in einer Mischung aus Restriktionsfragmenten unter Verwendung von Oligonukleotidsequenzen, welche jeweils nur für ein Zielrestriktionsfragment spezifisch sind, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst, a) das in Kontakt bringen einer AFLP-Reaktionsmischung mit mindestens drei Oligonukleotidsequenzen unter Hybridisierungsbedingungen, so dass, wenn die Zielrestriktionsfragmente vorliegen, Hybride zwischen den Zielrestriktionsfragmenten und den Oligonukleotidsequenzen gebildet werden, so dass die entstehenden Hybride mindestens ein ungepaartes Nukleotid des Zielrestriktionsfragmentes direkt neben dem 3'-Ende der Oligonukleotidsequenz aufweisen; b) das Hinzufügen von mindestens einem gekennzeichneten Nukleotid oder einem Nukleotidanalogon zu der Mischung resultierend aus Schritt a), unter Bedingungen, die für die Erweiterung der Oligonukleotide geeignet sind, so dass, wenn die Hybride vorliegen, die Oligonukleotide mit dem gekennzeichneten Oligonukleotid oder dem Nukleotidanalogon erweitert werden; und c) das Erkennen der Gegenwart oder Abwesenheit von einem beliebigen Hybrid mit einem hinzugefügten gekennzeichneten Nukleotid oder Nukleotidanalogon und/oder einer Oligonukleotidsequenz mit einem hinzugefügten gekennzeichneten Nukleotid oder Nukleotidanalogon.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei jedes der Oligonukleotide mindestens 90% Nichtsequenziell mit dem Teil des Zielrestriktionsfragmentes aufweist, für welchen das Oligonukleotid spezifisch ist.
  3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei während des Schrittes b) die Oligonukleotidsequenzen durch ein einzelnes gekennzeichnetes Nukleotid oder Nukleotidanalogon erweitert werden.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei während des Schrittes a) die AFLP-Reaktionsmischung gleichzeitig mit mindestens 10, bevorzugter mindestens 50, am bevorzugtesten mindestens 100 unterschiedlichen Oligonukleotidsequenzen in Kontakt gebracht wird, wobei jede Oligonukleotidsequenz nur für ein Zielrestriktionsfragment spezifisch ist.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Oligonukleotidsequenzen eine Größe von etwa 10 bis 100 Basenpaaren, bevorzugt etwa 20 bis 50 Basenpaaren aufweisen und optional einen „Schwanz" wie eine Poly-T-Sequenz enthalten.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Oligonukleotidsequenzen auf einem festen Träger, bevorzugt in Form einer Matrix, immobilisiert sind.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die AFLP-Reaktionsmischung durch das Begrenzen der DNA mit mindestens einem und bevorzugt mit zwei Restriktionsenzymen und bevorzugter mit mindestens einem seltenen Schneide-Restriktionsenzym und mindestens einem häufigen Schneide-Restriktionsenzym, optional gefolgt von einer Adapterligation und -amplifikation der Restriktionsfragmente erhalten wird/zu erhalten ist.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei nach der Restriktion, jedoch vor Schritt a), die AFLP-Reaktionsmischung unter Verwendung von AFLP-Primern amplifiziert wurde.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die AFLP-Reaktionsmischung unter Verwendung von AFLP-Primern amplifiziert wurde, welche ein oder mehrere selektive Nukleotide am 3'-Ende umfassen.
  10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zielrestriktionsfragment einem AFLP-Marker entspricht.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die gleiche/n Reaktionspuffer, Salzstärke, Temperatur und Reaktionsdauer für die Hybridisierung von Schritt a) und für die Oligonukleotiderweiterung von Schritt b) verwendet werden.
  12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt b) durch das in Kontakt bringen der Hybride mit einer Reaktionsmischung, welche ein gekennzeichnetes Nukleotid oder Nukleotidanalogon umfasst, welches nur zu einem aus A, T, C oder G komplementär ist, durchgeführt wird.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000061800A2 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Keygene N.V. Method for the analysis of aflp® reaction mixtures using primer extension techniques
AU2001245650A1 (en) 2000-03-10 2001-09-24 Ana-Gen Technologies, Inc. Mutation detection using denaturing gradients
FR2806419A1 (fr) * 2000-03-14 2001-09-21 Limagrain Sa Sequence d'acide nucleique constituant des marqueurs de l'androgenese vegetale
EP1386002A4 (de) * 2001-04-16 2006-11-08 Applera Corp Verfahren und zusammensetzungen zur nukleotidanalyse
DE10245145B4 (de) * 2002-09-27 2004-12-02 IPK-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Verfahren zum Nachweis von SNPs auf polydimensionalen Microarrays
US20050053980A1 (en) 2003-06-20 2005-03-10 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
WO2006137734A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Keygene N.V. Improved strategies for sequencing complex genomes using high throughput sequencing technologies
CN102925561B (zh) 2005-06-23 2015-09-09 科因股份有限公司 用于多态性的高通量鉴定和检测的策略
ATE453728T1 (de) 2005-09-29 2010-01-15 Keygene Nv Screening mutagenisierter populationen mit hohem durchsatz
US10316364B2 (en) 2005-09-29 2019-06-11 Keygene N.V. Method for identifying the source of an amplicon
WO2007073165A1 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Keygene N.V. Method for high-throughput aflp-based polymorphism detection
ES2301342B1 (es) * 2006-03-14 2009-05-01 Oryzon Genomics, S.A. "metodo de analisis de acidos nucleicos".
ES2645661T3 (es) 2006-04-04 2017-12-07 Keygene N.V. Detección de alto rendimiento de marcadores moleculares basada en fragmentos de restricción
DE102007010311A1 (de) * 2007-02-23 2008-08-28 Thines, Marco, Dr. Organismusspezifisches hybridisierbares Nucleinsäuremolekül
JP5526556B2 (ja) * 2008-02-28 2014-06-18 株式会社リコー トナー、並びに現像剤、プロセスカートリッジ、画像形成装置、及び画像形成方法
US20090253121A1 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 Micah Halpern Method for amt-rflp dna fingerprinting
CN110678557A (zh) 2017-03-31 2020-01-10 玛赛拉·基亚里 通过管内杂交与通用标签-微阵列的组合的突变的基因分型

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3694689A (en) * 1988-04-28 1989-11-24 Mark H. Skolnick Amplified sequence polymorphisms (asps)
IE66572B1 (en) * 1989-02-13 1996-01-24 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
US5547839A (en) * 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
CZ291877B6 (cs) * 1991-09-24 2003-06-18 Keygene N.V. Způsob amplifikace přinejmenším jednoho restrikčního fragmentu z výchozí DNA a způsob přípravy sestavy amplifikovaných restrikčních fragmentů
WO1993025563A1 (en) * 1992-06-17 1993-12-23 City Of Hope A method of detecting and discriminating between nucleic acid sequences
CA2182517C (en) * 1994-02-07 2001-08-21 Theo Nikiforov Ligase/polymerase-mediated primer extension of single nucleotide polymorphisms and its use in genetic analysis
EP0804618B1 (de) * 1994-11-28 1999-01-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Mikrosatelliteverbindung für detektion genetisches polymorphismen
EP0721987A1 (de) * 1995-01-16 1996-07-17 Keygene N.V. Amplifikation von einfachen Sequenz-Wiederholungen
GB9507238D0 (en) * 1995-04-07 1995-05-31 Isis Innovation Detecting dna sequence variations
AU2253397A (en) * 1996-01-23 1997-08-20 Affymetrix, Inc. Nucleic acid analysis techniques
WO1997029211A1 (en) * 1996-02-09 1997-08-14 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services RESTRICTION DISPLAY (RD-PCR) OF DIFFERENTIALLY EXPRESSED mRNAs
AUPO427996A0 (en) * 1996-12-20 1997-01-23 Co-Operative Research Centre For Diagnostic Technologies Method for detecting a nucleotide at a specific location within a polynucleotide sequence and apparatus therefor
CA2286864A1 (en) * 1997-01-10 1998-07-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Hybridization-based genetic amplification and analysis
AU6846798A (en) 1997-04-01 1998-10-22 Glaxo Group Limited Method of nucleic acid sequencing
WO1998059066A1 (en) * 1997-06-25 1998-12-30 Orchid Biocomputer, Inc. Methods for the detection of multiple single nucleotide polymorphisms in a single reaction
CA2297661A1 (en) * 1997-07-22 1999-02-04 Darwin Molecular Corp. Amplification and other enzymatic reactions performed on nucleic acid arrays
WO1999008321A1 (en) 1997-08-07 1999-02-18 Matsushita Electric Works, Ltd. Epoxy resin sealing material for molding semiconductor chip and method for manufacturing the same
AU1696800A (en) * 1998-12-04 2000-06-26 Keygene N.V. Array and method for analysing nucleic acid sequences
WO2000061800A2 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Keygene N.V. Method for the analysis of aflp® reaction mixtures using primer extension techniques

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