DE60219199T2 - Analyse und detektion von mehreren zielsequenzen unter verwendung von zirkulären proben - Google Patents

Analyse und detektion von mehreren zielsequenzen unter verwendung von zirkulären proben Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biotechnologie. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hochdurchsatzauftrennung und zum Nachweis von Nukleotidsequenzen sowie die Verwendung des Verfahrens zur Unterscheidung und Identifizierung einer Zielsequenz wie bei Einzelnukleotidpolymorphismen zur Verfügung. Die Erfindung stellt zudem Sonden zur Verfügung, die in der Lage sind, an die Zielsequenz von Interesse zu hybridisieren, Primer für die Amplifikation der ligierten Sonden, die Verwendung dieser Sonden und Primer zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von Nukleotidsequenzen, die sich auf eine breite Auswahl genetischer Merkmale und Gene beziehen, sowie Kits von Primer und/oder Sonden, die zur Verwendung in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es gibt ein schnell wachsendes Interesse an dem Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen. Dieses Interesse ergab sich nicht nur aus dem kürzlich offenbarten Nukleotidsequenzentwurf des menschlichen Genoms und dem Vorhandensein einer großen Menge von Einzelnukleotidpolymorphismen (ENP) darin sowie in den Genomen von vielen anderen Organismen, sondern auch aus den Markertechnologien wie AFLP. Das Erkennen, dass das Vorhandensein von Einzelnukleotidsubstitutionen (und anderen Arten von genetischem Polymorphismen wie kleine Insertionen/Deletionen; Indels) in Genen eine Vielzahl von Informationen zur Verfügung stellt, hat auch zu diesem verstärkten Interesse beigetragen. Es ist nun im Allgemeinen anerkannt, dass diese Einzelnukleotidsubstitutionen einer der Hauptgründe für eine wesentliche Anzahl von monogenetischen und multigenetischen Erbkrankheiten zum Beispiel in Menschen sind, oder anderweitig in die Entwicklung komplexer Phenotypen wie Leistungsmerkmale in Pflanzen und Nutztierspezies involviert sind. Somit sind Einzelnukleotidsubstitutionen in vielen Fällen auch mit wichtigen Merkmalen in Menschen, Pflanzen und tierischen Spezies assoziiert oder wenigstens dafür indizierend.
  • Die Analyse dieser Einzelnukleotidsubstitutionen und Indels wird in einer Fülle wertvoller Informationen resultieren, die vielfältige Implikationen auf die Medizin und Landwirtschaft in dem größtmöglichen Umfang haben werden. Es wird zum Beispiel allgemein angenommen, dass diese Entwicklungen in patientenspezifischer Medikation resultieren werden. Um diese genetischen Polymorphismen zu analysieren, gibt es einen wachsenden Bedarf an geeigneten, zuverlässigen und schnellen Verfahren, die die Handhabung einer großen Anzahl von Proben und großen Anzahlen von (hauptsächlich) ENPs in einer Hochdurchsatzweise ohne ein wesentliches Kompromittieren der Qualität der erhaltenen Daten ermöglichen.
  • Obwohl derzeit sogar eine große Diversität an Hochdurchsatz-Nachweisplattformen für ENPs existiert (wie Fluorometer, DNA-Microarrays, Massenspektrometer und Instrumente zur Kapillarelektrophorese), ist die hauptsächliche Beschränkung zur Erzielung eines kostengünstigen Nachweises im Hochdurchsatzformat, dass derzeit eine robuste und effiziente Multiplexamplifikationstechnik zur nicht zufälligen Auswahl von ENPs fehlt, um diese Plattformen effizient zu nutzen, was in einer suboptimalen Verwendung dieser starken Nachweisplattformen und/oder hohen Kosten pro Datenpunkt resultiert. Der "Begriff „Durchsatz", wie er hierin verwendet wird, definiert einen relativen Parameter, der die Anzahl von Proben und Zielsequenzen anzeigt, die pro Zeiteinheit analysiert werden können.
  • Genauer gesagt, ist es unter Verwendung üblicher Amplifikationstechniken wie der PCR-Technik möglich, eine beschränkte Anzahl von Zielsequenzen durch das Kombinieren der korrespondierenden Primerpaare in einer einzelnen Amplifikationsreaktion zu amplifizieren, aber die Zahl der Zielsequenzen, die gleichzeitig amplifiziert werden können, ist klein und es kann eine intensive Optimierung notwendig sein, um ähnliche Amplifikationseffizienzen bei den einzelnen Zielsequenzen zu erreichen. Eine der Lösungen zur Multiplexamplifikation ist die Verwendung eines einzelnen Primerpaares für die Amplifikationen von allen Zielsequenzen, was voraussetzt, dass alle Ziele die korrespondierenden Primerbindungsstellen enthalten müssen. Dieses Prinzip wird von der AFLP-Technik aufgenommen ( EP A 0 534 585 ). Bei der Verwendung der AFLP-Technik resultieren die Primerbindungsstellen aus einem Verdau der Zielnukleinsäure (d. h. gesamtgenomischer DNA oder cDNA) mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen gefolgt durch Adapteligierung. Die AFLP-Technik zielt im Wesentlichen auf eine Zufallsauswahl von Sequenzen, die in der Zielnukleinsäure enthalten sind. Es wurde gezeigt, dass unter Verwendung der AFLP-Technik eine praktisch unbeschränkte Menge an Zielsequenzen in einer einzelnen Reaktion abhängig von der Anzahl der Zielsequenzen, die die Primerbindungsregion(en) enthalten, die perfekt komplementär zu den Amplifi kationsprimern ist, amplifiziert werden können. Die Nutzung der Verwendung eines einzelnen Primerpaares zur Amplifikation in Kombination mit einem nicht zufälligen Verfahren zur ENP-Zielselektion sowie die effiziente Nutzung einer Nachweisplattform im Hochdurchsatzformat kann daher die Effizienz der ENP-Genotypisierung wesentlich erhöhen, jedoch wurde eine solche Technologie auf dem Gebiet bisher nicht bereit gestellt.
  • Eines der prinzipiellen Verfahren, die zur Analyse von Nukleinsäuren einer bekannten Sequenz verwendet werden, basiert auf dem Binden zweier Sonden an eine Zielsequenz und wenn die Sonden benachbart zu der Zielsequenz hybridisiert sind, dem Ligieren der Sonden. Das OLA-Prinzip (Oligonukleotid Ligations Assay) wurde unter anderem in der U.S. 4,988,617 (Landegren et al.) und in der WO 01/06012 beschrieben. Diese Veröffentlichung offenbart ein Verfahren zur Bestimmung der Nukleinsäuresequenz in einer Region einer bekannten Nukleinsäuresequenz mit einer bekannten möglichen Mutation. Zum Nachweis der Mutation werden Oligonukleotide zur Bindung an Segmente direkt benachbart zu der zu bestimmenden Sequenz ausgewählt. Eine der ausgewählten Oligonukleotidsonden hat eine Endregion, in der eines der Nukleotide der Endregion komplementär zu entweder dem normalen oder zu dem mutierten Nukleotid an der korrespondierenden Position in der bekannten Nukleinsäuresequenz ist. Eine Ligase wird zur Verfügung gestellt, die kovalent die Sonden miteinander verbindet, wenn diese korrekt basengepaart und direkt benachbart zueinander positioniert sind. Das Vorhandensein oder das Fehlen der verbundenen Sonden ist ein Anzeichen des Vorhandenseins der bekannten Sequenz und/oder der Mutation.
  • Abbot et al. entwickelten in der WO 96/15271 ein Verfahren für ein Multiplexligationsamplifikationsprozedere, das die Hybridisierung und Ligation von benachbarten Sonden umfasst. Diese Sonden werden mit einem zusätzlichen Längensegment ausgestattet, wobei gemäß Abbot et al. die Sequenz davon nicht wichtig ist. Die vorsätzliche Einführung von Längenunterschieden soll die Unterscheidung auf der Basis der Fragmentlänge in auf Gel basierenden Techniken erleichtern.
  • Die WO 97/45559 (Barany et al.) beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Unterschieden in der Nukleinsäuresequenz durch die Verwendung von Kombinationen von Ligasenachweisreaktionen (LNR) und Polymerasekettenreaktionen (PCR). Offenbart werden Verfahren, die das Binden allelspezifischer Sondensätze an eine Zielsequenz und die anschließende Ligierung mit einer thermostabilen Ligase, optional gefolgt durch das Entfernen der nicht ligierten Primer mit einer Exonuklease, umfassen. Die Amplifikation der ligierten Produkte mit fluoreszierend markierten Primern resultiert in einem fluoreszierend markierten amplifizierten Produkt. Der Nachweis der Produkte basiert auf der Trennung nach Größe oder der elektrophoretischen Mobilität oder auf einem adressierbaren Array.
  • Der Nachweis der amplifizierten Sonden wird auf einem universal adressierbaren Array, der Einfangoligonukleotide enthält, durchgeführt. Diese Einfangoligonukleotide enthalten eine Region, die in der Lage ist, an eine vorbestimmte Region in der amplifizierten Sonde, eine sogenannte Zip-Region oder einen Zip-Code, zu binden. Jede amplifizierte Sonde enthält einen unterschiedlichen Zip-Code und jeder Zip-Code wird an sein korrespondierendes Einfangoligonukleotid auf dem Array hybridisieren. Der Nachweis des Markers in Kombination mit der Position auf dem Array stellt die Information bezüglich des Vorhandenseins der Zielsequenz in der Probe zur Verfügung. Dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis einer Anzahl von Nukleinsäuresequenzen in einer Probe. Jedoch involviert das Design, die Validierung und die routinemäßige Verwendung von Arrays zum Nachweis von amplifizierten Proben viele Schritte (Ligation, Amplifikation, optionale Rufreinigung des amplifizierten Materials, Arrayproduktion, Hybridisierung, Waschen, Scannen und Datenquantifizierung), von denen einige (insbesondere die Hybridisierung und das Waschen) schwer zu automatisieren sind. Der auf Arrays basierende Nachweis ist somit arbeitsintensiv und teuer zum Analysieren einer großen Anzahl von Proben auf eine große Anzahl von ENPs.
  • Die LDR-Oligonukleotidsonden in einem gegebenen Satz können ein Produkt mit einzigartiger Länge generieren und können somit von anderen Produkten basierend auf der Größe unterschieden werden. Zur Amplifikation wird ein Primerersatz zur Verfügung gestellt, bei dem einer der Primer einen Marker enthält. Unterschiedliche Primer können mit unterschiedlichen Markern ausgestattet werden, um die Unterscheidung der Produkte zu ermöglichen.
  • Das Verfahren und die verschiedenen Ausführungsformen, die durch Barany et al. beschrieben werden, haben bestimmte Nachteile. Einer der großen Nachteile ist, dass das Verfahren im Prinzip kein echtes Verfahren im Hochdurchsatzformat für die Bestimmung einer großen Anzahl von Zielsequenzen in kurzen Zeiträumen unter Verwendung zuverlässiger und robuster Verfahren ohne das Kompromittieren der Qualität der produzierten Daten und der Effizienz des Verfahrens zur Verfügung stellt.
  • Noch genauer gesagt, einer der Nachteile der Mittel und Verfahren, wie sie von Barany et al. offenbart werden, liegt in der beschränkten Multiplexkapazität, wenn die Diskriminierung inter alia auf der Länge der allelspezifischen Sondensätze basiert. Die Diskriminierung zwischen Sequenzen, die nur durch einen relativ kleinen Längenunterschied unterscheidbar sind, ist im Allgemeinen nicht leicht und kann vorsichtig optimierte Randbedingungen erfordern, um die gewünschte Auflösungsstärke zu erhalten. Die Diskriminierung zwischen Sequenzen, die einen größeren Längenunterschied aufweisen, ist im Allgemeinen leichter zu erreichen. Dies kann eine Erhöhung der Anzahl von Sequenzen zur Verfügung stellen, die in der Probe analysiert werden können. Jedoch ist die Bereitstellung der notwendigen längeren Nukleotidsonden eine weitere zu nehmende Hürde. Auf dem Gebiet werden synthetische Nukleotidsequenzen durch die konventionelle chemische Schritt für Schritt-Oligonukleotidsynthese mit einer Ausbeute von ungefähr 98,5 % pro hinzugefügtes Nukleotid hergestellt. Wenn längere Sonden synthetisiert werden (länger als ca. 60 Nukleotide), dann fällt die Ausbeute im Allgemeinen und die Zuverlässigkeit und Reinheit der synthetisch produzierten Sequenz kann ein Problem werden.
  • Diese und andere Nachteile der Verfahren, die in der WO 97/45559 sowie in anderen Publikationen, die auf Oligonukleotidligationsassays basieren, offenbart werden, führten die vorliegenden Erfinder zu dem Schluss, dass die darin beschriebenen Verfahren für eine Anpassung an ein Protokoll mit Hochdurchsatzformat weniger geeignet sind, das in der Lage ist, eine große Anzahl von Proben zu handhaben, die jeweils große Zahlen von Sequenzen umfassen.
  • Das spezifische Problem der Bereitstellung längerer Sonden wurde von Schouten et al. ( WO 01/61033 ) gelöst. Die WO 01/61033 offenbart die Herstellung von längeren Sonden zur Verwendung in einem Ligations-Amplifikations-Assay. Sie stellten Sonden zur Verfügung, die deutlich länger als solche sind, die durch konventionelle chemische Syntheseverfahren erhalten werden können, und zwar zur Vermeidung des Problems, dass mit der auf Länge basierenden Diskriminierung amplifizierter Produkte unter Verwendung von Plattengelen oder Kapillarelektrophorese assoziiert ist, nämlich, dass nur ein kleiner Teil des Nachweisfensters/der Auflösungskapazität von bis zu einer Kilobase an Länge verwendet wird, wenn OLA-Sonden durch chemische Mittel synthetisiert werden. Bei einem oberen Grenzwert in der Praxis von ungefähr 100 bis 150 Basen für chemisch synthetisierte Oligonukleotide gemäß dem derzeitigen Stand der Technologie resultiert dies in Amplifikationsprodukten, die höchstens weniger als 300 aber auch sehr viel weniger Rasenpaare lang sind (siehe Barany et al.). Die Schwierigkeit der Generierung solch langer Sonden (mehr als ungefähr 150 Nukleotide) mit ausreichender Reinheit und Ausbeute durch chemische Mittel wurde durch Schouten et al. unter Verwendung eines Verfahrens gelöst, bei dem die Sonden durch eine enzymatische, Template-gerichtete in vivo Polymerisierung erhalten wurden, zum Beispiel durch die Wirkung einer DNA-Polymerase in einer geeigneten Zelle wie einem M13-Phagen.
  • Jedoch setzt die Herstellung und Aufreinigung solcher biologischer Sonden eine Sammlung geeigneter Wirtsstämme voraus, die M13-Phagen enthalten, die die gewünschte Längenvariationen vermitteln, sowie die Verwendung von mehreren kurzen chemisch synthetisierten Oligonukleotiden in dem Verfahren, so dass deren Verwendung sehr arbeitsintensiv und zeitaufwändig ist, und somit kostenintensiv und nicht zur Entwicklung eines Assays im Hochdurchsatzformat geeignet ist. Zudem kann die Verwendung von relativ langen Sonden und relativ großen Längenunterschieden zwischen den amplifizierbaren Zielsequenzen in unterschiedlichen Am Amplifikationseffizienzen zum Vorteil der kürzeren Zielsequenzen resultieren. Dieses beeinträchtigt nachteilig die Qualität der Gesamtdaten, wodurch die Entwicklung eines echten Verfahrens im Hochdurchsatzformat behindert wird. Somit bleibt der Bedarf an einer zuverlässigen und kostengünstigen Lösung einer Multiplexamplifikation mit anschließendem Nachweis basierend auf der Länge für eine Anwendung im Hochdurchsatzformat bestehen.
  • Andere Lösungen, die auf dem Gebiet vorgeschlagen wurden, wie die Verwendung zirkulärer (Padlock/Schloss-)Sonden ( WO 95/22623 ) in Kombination mit einer isothermen Amplifikation, wie eine rollende Kreisamplifikation (RKA), werden wegen der verbesserten Hybridisierungseigenschaften der zirkulären Sonden und dem isothermen Charakter der RKA als profitabel angesehen.
  • Die rollende Kreisamplifikation ist ein Amplifikationsverfahren, bei dem ein erster Primer an eine ligierte oder gebundene zirkuläre Sonde hybridisiert wird. Die anschließende Primerverlängerung unter Verwendung einer Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität resultiert in der Bildung eines langen Polynukleotidstranges, der mehrere Formen der ligierten zirkulären Sonde enthält. Solch ein langer Strang von Concatameren der ligierten Sonde wird anschließend durch die Verwendung von Hybridisierungssonden nachgewiesen. Diese Sonden können markiert sein. Die exponentielle Amplifikation der ligierten Sonde kann durch die Hybridisierung eines zweiten Primers erreicht werden, der an den concatameren Strang hybridisiert und anschließend verlängert wird. Die (exponentielle) rollende Kreisamplifikation ((E)RKA) wird inter alia in U.S. 5 854 033 , U.S. 6 143 495 , WO 97/19193 , Lizardi et al., Nature genetics 19(3): 225–232 (1998) beschrieben.
  • Die U.S. 5,876,924 , WO 98/04745 und WO 98/04746 von Zhang et al. beschreiben eine Ligationsreaktion unter Verwendung von zwei benachbartenr Sonden, wobei eine der Sonden eine Einfangsonde mit einem bindenden Element wie Biotin ist. Nach der Ligation werden die nicht ligierten Sonden entfernt und die ligierte Einfangsonde wird unter Verwendung paramagnetischer Kügelchen mit einem Liganden-(Biotin)Bindungsbereich nachgewiesen. Zhang offenbart auch die Amplifikation von zirkulären Sonden unter Verwendung von PCR-Primern in einer rollenden Kreisamplifikation unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität, wodurch ein langes Concatamer der zirkulären Sonde beginnend von der Verlängerung des ersten Primers aus generiert wird. Ein zweiter PCR-Primer hybridisiert anschließend an das lange Concatamer und die Verlängerung davon stellt eine zweite Generation von Concatameren dar und erleichtert die exponentielle Amplifikation. Der Nachweis basiert im Allgemeinen auf der Hybridisierung der markierten Sonden.
  • Jedoch haben sich diese Verfahren bei Anwendungen im Hochdurchsatzformat als weniger wünschenswert herausgestellt. Einer der Gründe dafür ist, dass für ein auf der Diskriminierung nach Länge basierendes Verfahren im Hochdurchsatzformat die Verwendung von (E)RKA in der Bildung langer Concatamere resultiert. Diese Concatamere sind problematisch, da sie für den Nachweis im Hochdurchsatzformat nicht geeignet sind.
  • Die U.S. 6,221,603 offenbart eine zirkuläre Sonde, die eine Restriktionsschnittstelle enthält. Die Sonde wird unter Verwendung der (E)RKA amplifiziert und die resultierenden Concatamere sind an der Restriktionsschnittstelle beschränkt. Die Restriktionsfragmente werden dann nach Länge aufgetrennt und nachgewiesen. Die Trennung und der Nachweis werden auf einer kapillarelektrophoretischen Plattform wie dem MegaBACE-Zubehör durchgeführt, das von Molecular Dynamics Amersham-Pharmacia verfügbar ist. Zum Nachweis können markierte dNTP's in die Fragmente während der Amplifikation eingebracht werden, oder die Fragmente können durch das Färben oder markierte Nachweissonden nachgewiesen werden. Der Teilverdau durch das Restriktionsenzym kann jedoch die Zuverlässigkeit des Verfahrens beeinträchtigen. Zudem ermöglichen die Verfahren zur Markierung der Fragmente, wie sie in der U.S. 6,221,603 offenbart werden, keine vollständige Nutzung der Kapazität von MegaBACE zum gleichzeitigen Nachweis von mehreren Farben.
  • Die vorliegenden Erfinder haben sich zum Ziel gesetzt, die existierenden Probleme auf dem Gebiet zu eliminieren oder wenigstens zu verringern, während sie gleichzeitig versuchen, die vorteilhaften Aspekte davon beizubehalten und die Technologie weiter zu verbessern. Andere Probleme auf dem Gebiet und durch die vorliegende Erfindung dafür zur Verfügung gestellte Lösungen werden sich durch die Beschreibung, die Figuren und die verschiedenen Ausführungsformen und Beispiele besser ergeben.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Trennung und zum Nachweis von mehreren Sequenzen im Hochdurchsatzformat. Das vorliegende Verfahren löst viele der zuvor auf dem Gebiet vorhandenen Probleme. Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung einen Mehrfach-Ligations- und Amplifikationsassay zur Verfügung, der die schnelle und Hochdurchsatzanalyse einer Vielzahl von Proben ermöglicht, die vorzugsweise eine Vielzahl von Sequenzen enthalten. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Diskriminierung und zum Nachweis einer Vielzahl von Nukleotidsequenzen im Hochdurchsatzformat basierend auf einer Kombination von Längenunterschieden und Markern zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung kombiniert die Vorteile von bestimmten Verfahren, während sie gleichzeitig Nachteile vermeidet, die mit den verschiedenen Techniken assoziiert sind, wodurch ein verbessertes Verfahren für den Nachweis von Zielsequenzen in einer zuverlässigen und reproduzierbaren Weise zur Verfügung gestellt wird, das auch für ein Hochdurchsatznachweisverfahren geeignet ist.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Trennung und zum Nachweis einer Vielzahl von Zielsequenzen im Hochdurchsatzformat, optional in einer Vielzahl von Proben, das das Durchführen eines ligationsabhängigen Amplifikationsassays für jede Probe umfasst.
  • Das Verfahren ist vorzugsweise ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder des Fehlens wenigstens einer Zielsequenz (2) in einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • a) das Ausstatten einer Nukleinsäureprobe mit wenigstens einer zirkularisierbaren Sonde (26) für jede in der Probe nachzuweisende Zielsequenz, wobei die Sonde einen ersten zielspezifischen Abschnitt an ihrem 5'-Ende (4) aufweist, der zu einem ersten Teil einer Zielsequenz (5) komplementär ist, sowie einen zweiten zielspezifischen Abschnitt an ihrem 3'-Ende (6) aufweist, der zu einem zweiten Teil der Zielsequenz (7) komplementär ist, wobei der erste und der zweite Teil der Zielsequenz benachbart zueinander positioniert sind, und wobei die Sonde zusätzlich einen Tag-Abschnitt (8, 9) umfasst, der im Wesentlichen zu der Zielsequenz nicht komplementär ist, wobei der Tag-Abschnitt eine Füllsequenz (10, 11) umfassen kann und wobei der Tag-Abschnitt wenigstens eine primerbindende Sequenz (12, 13) umfasst;
    • b) das Ermöglichen, dass die ersten und zweiten zielspezifischen Abschnitte der zirkulären Sonde an die ersten und zweiten Teile der Zielsequenzen binden, wobei die ersten und zweiten zielspezifischen Abschnitte der Sonde benachbart zueinander auf der Zielsequenz binden;
    • c) das Bereitstellen von Mitteln zum Ligieren der ersten und zweiten zielspezifischen Abschnitte, die zueinander benachbart an die Zielsequenz gebunden sind, und das Ermöglichen, dass die ersten und zweiten zielspezifischen Abschnitte miteinander verbunden werden, um eine ligierte zirkuläre Sonde (28) zu produzieren, die mit einer Zielsequenz in der Probe korrespondiert;
    • d) das Bereitstellen wenigstens eines ersten Primers, der zu der primerbindenden Sequenz (12) komplementär ist, sowie eines Polymeraseenzyms;
    • e) das Amplifizieren der resultierenden Mischung zur Herstellung einer amplifizierten Probe (19), die Amplikons (20) umfasst, die lineare Verkörperungen der ligierten zirkulären Sonden sind;
    • f) das Bestimmen des Vorhandenseins oder des Fehlens einer Zielsequenz in einer Probe durch den Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens des korrespondierenden Amplikons; wobei die wenigstens eine zirkularisierbare Sonde einen blockierenden Abschnitt enthält, der eine blockierende Gruppe umfasst, die benachbart zu dem 3'-Ende der primerbindenden Stelle so positioniert ist, dass der blockierende Abschnitt die Verlängerung oder Amplifikation des Primers verhindert, der an die zirkularisierte Sonde hybridisiert ist, wodurch eine lineare Verkörperung der zirkulären Sonde generiert wird, und derart, dass die blockierende Gruppe von der Primerverlängerung oder Amplifikation ausgeschlossen ist.
  • Sonde
  • Die zirkuläre Oligonukleotidsonde, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist eine einzelne lineare Oligonukleotidsonde, die in Schritt (a) für jede Zielsequenz in einer Probe zur Verfügung gestellt wird. Diese einzelne lineare Oligonukleotidsonde verbindet den für zwei Ziele spezifischen Abschnitt in ein einzelnes Molekül, das in Schritt (c) zirkularisiert wird, wenn die verbundenen Komplementaritätsabschnitte verbunden werden. Somit sind in der einzelnen linearen Sonde die Abschnitte der Zielkomplementarität jeweils an den äußeren Enden der einzelnen linearen Sonde vorhanden. Die Komplementaritätsabschnitte an den äußeren Enden werden durch Abschnitte unterbrochen, die als Primerbindungssequenzen dienen können, und können zusätzlich durch Füllsquenzen verschiedener Längen unterbrochen sein. Ein Beispiel solch einer Anordnung von funktionellen Gruppen in der zirkulären Sonde ist: (Ziel-Komplementaritätsabschnitt 1 – Füllsequenz 1, Primerbindungssequenz 1 – Primerbindungssequenz 2 – Füllsequenz 2 – Ziel-Komplementaritätsabschnitt 2). Der Fachmann wird zu schätzen wissen, dass die zirkulären Sonden in einer linearen Form synthetisiert und angewendet werden, und dass sie nur zirkulär sein werden, wenn die zwei komplementären Abschnitte an den äußeren Enden der Sonde an die geeignete Zielsequenz gebunden miteinander verbunden (ligiert) werden. Somit bezieht sich der Begriff „zirkuläre Sonde", wie er hierin verwendet wird, tatsächlich auf ein lineares Molekül, das durch die von der Zielsequenz abhängige Verbindung (Ligation) zirkularisiert wird. Nur der Begriff „verbundene zirkuläre Sonde", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül in echter zirkulärer Form.
  • Die komplementären Abschnitte der Oligonukleotidsonden sind derart konstruiert, dass eine Sonde für jede Zielsequenz in einer Probe zur Verfügung gestellt wird, vorzugsweise eine spezifische Sonde, wobei die Sonden jeweils einen Abschnitt an beiden von deren äußeren Enden enthalten, der komplementär zu einem Teil der Zielsequenz ist, und die korrespondierenden komplementären Teile der Zielsequenz im Wesentlichen benachbart zueinander positioniert sind. In einer zirkulären Oligonukleotidsonde hat die Oligonukleotidsonde einen Abschnitt an ihrem 5'-Ende, der komplementär zu einem ersten Teil einer Zielsequenz ist, und einen Abschnitt an ihrem 3'-Ende, der komplementär zu einem zweiten Abschnitt der Zielsequenz ist. Somit ist, wenn die zirkuläre Sonde an komplementäre Teile einer Zielsequenz gebunden wird, dann das 5'-Ende der Oligonukleotidsonde im Wesentlichen benachbart zu dem 3'-Ende der Oligonukleotidsonde, so dass die jeweiligen Enden der Sonde ligiert werden können, um eine Phosphodiesterbindung zu bilden, und somit eine zirkuläre Sonde entsteht.
  • Zirkuläre Sonden sind für den Ligationsschritt (c) vorteilhaft, weil beide zielkomplementären Abschnitte in dem gleichen Molekül enthalten sind. Verglichen mit konventionellen linearen Sonden, wie sie inter alia durch die WO 97/45559 beschrieben werden, bedeutet dies, dass äquimolare Mengen der zwei zielspezifischen Abschnitte jeweils in der Nähe voneinander vorhanden sind. Bei solchen Sonden ist es wahrscheinlicher, dass sie an ihre jeweiligen Zielsequenzen hybridisieren, weil die Hybridisierung des ersten zielkomplementären Abschnitts an das Ziel die Hybridisierung des zweiten Abschnitts und umgekehrt erleichtert. Zusätzlich verringert die Verwendung zirkulärer Sonden die Wahrscheinlichkeit der Bildung inkorrekter Ligationsprodukte, die aus der Ligation zwischen Sonden mit unterschiedlichen Zielsequenzen resultieren, bedingt durch die niedrigere Anzahl von möglichen Kombinationen von Ligationsprodukten, die gebildet werden können, wenn die ersten und zweiten Sonden Teil des gleichen zirkulären Moleküls sind.
  • Für mehr Details bezüglich der Charakteristiken, dem Design und der Konstruktion, der Verwendung und der Vorteile von Padlock-/Schloss-Sonden wird inter alia auf die folgenden Dokumente Bezug genommen: M. Nilsson et al., „Padlock Probes: Circularizing Oligonucleotides for Localized DNA Detection,", Science 265: 2085–88 (1994); Pickering et al. in Nucleic Acids Research, 2002, Bd. 30, e60 – US 5,854,033 ; US 5,912,124 ; WO 02/06868 , WO 01/06012 , WO 00/77260 , WO 01/57256 , wobei die Inhalte von diesen hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden.
  • Für jede Zielsequenz, für die das Vorhandensein oder das Fehlen in einer Probe zu bestimmten ist, wird eine spezifische Oligonukleotidsonde mit Abschnitten konstruiert, die zu den benachbarten komplementären Teilen von jeder Zielsequenz komplementär sind. Somit kann in dem Verfahren der Erfindung für jede Zielsequenz, die in einer Probe vorhanden ist, ein korrespondierendes (spezifisches) Amplicon in der amplifizierten Probe erhalten werden. Vorzugsweise wird eine Vielzahl von Oligonukleotidsonden, die zu einer Vielzahl von Zielsequenzen in einer Probe komplementär sind, zur Verfügung gestellt. Eine Oligonukleotidsonde für eine gegebene Zielsequenz in einer Probe wird sich wenigstens in der Nukleotidsequenz von Sonden für andere Zielsequenzen unterscheiden und wird sich vorzugsweise auch in der Länge von Sonden für andere Ziele unterscheiden, mehr bevorzugt wird eine Sonde für ein gegebenes Ziel eine gebundene Sonde und/oder Amplicon produzieren, das sich in der Länge von gebundenen Sonden unterscheidet, die mit anderen Zielen in der Probe korrespondieren, wie es unten beschrieben wird. Alternativ dazu können Amplicons, die mit verschiedenen Zielen korrespondieren, eine identische Länge aufweisen, wenn sie ansonsten unterschieden werden können, z. B. durch unterschiedliche Marker, so wie es unten beschrieben wird.
  • Tag & Primerbindungsstellen
  • Die Oligonukleotidsonde enthält zusätzlich ein Tag, das im Wesentlichen nicht mit der Zielsequenz komplementär ist. Dieses Tag hybridisiert nicht oder nicht wesentlich, vorzugsweise wenigstens nicht unter den oben genannten Bindungsbedingungen, an irgendeine der Zielsequenzen in einer Probe, vorzugsweise nicht an irgendeine der Sequenzen in einer Probe. Das Tag umfasst vorzugsweise wenigstens eine, vorzugsweise zwei Primerbindungsstellen und kann optional eine oder mehrere Füllsequenzen von unterschiedlicher Länge und/oder einen blockierenden Abschnitt enthalten (siehe unten).
  • Füllsequenzen
  • Das Tag der Oligonukleotidsonden kann eine oder mehrere Füllsequenzen von variabler Länge umfassen. Die Länge des Füllers variiert von 0 bis 500, vorzugsweise von 0 bis 100, mehr bevorzugt von 1 bis 50. Die Länge des Tags variiert von 15 bis 540, vorzugsweise von 18 bis 140, mehr bevorzugt von 20 bis 75. Der Füller kann eine einzigartige Sequenz sein, wie sie als eine Zip-Code-Sequenz bekannt ist, wie sie von lannone et al. (2000), Cytometry 39: S. 131–140, beschrieben wird.
  • Blockierender Abschnitt
  • In einer alternativen Ausführungsform kann die zirkuläre Sonde einen blockierenden Abschnitt (27) enthalten. Der blockierende Abschnitt blockiert die Primerverlängerung. Der blockierende Abschnitt ist vorzugsweise zwischen den zwei Primerbindungsstellen positioniert. Vorzugsweise ist der blockierende Abschnitt im Wesentlichen benachbart zu dem 3'-Ende des Vorwärtsprimers und im Wesentlichen benachbart zu dem 5'-Ende der Bindungsstelle des Rückwärtsprimers positioniert, siehe auch 14. Ein Beispiel solch einer Anordnung von funktionellen Gruppen in der zirkulären Sonde ist: (Ziel-Komplementaritätsabschnitt 1 – Füllsequenz 1, Primerbindungssequenz 1 – blockierender Abschnitt – Primerbindungssequenz 2 – Füllsequenz 2 – Ziel-Komplementaritätsabschnitt 2). Dieser blockierende Abschnitt wird wirksam die Primerverlängerung während der Amplifikation beschränken, wodurch lineare Darstellungen der verbundenen zirkulären Sonden zur Verfügung gestellt werden. Vorzugsweise ist der blockierende Abschnitt selbst so zwischen den zwei Primerbindungsstellen positioniert, dass der Abschnitt von der Amplifikation ausgenommen ist. Der blockierende Abschnitt kann Nicht-Nukleotidpolymere wie HEG (Hexaethylenglycol) umfassen. Wenn ein blockierender Abschnitt wie eine HEG-Gruppe vorhanden ist, dann kann die verwendete DNA-Polymerase eine Strangverdrängungsaktivität haben, weil der blockierende Abschnitt die Bildung von langen Concatameren verhindern wird.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann die ligierte oder verbundene zirkuläre Sonde, die einen blockierenden Abschnitt enthält, auch unter Verwendung nur eines Primers, vorzugsweise des Vorwärtsprimers, amplifiziert werden. Diese Amplifikation wird in der linearen Anhäufung von Amplicons mit jeder Amplifikationsrunde resultieren. Die zirkuläre Sonde kann in diesem Fall eine oder mehrere Primerbindungsstellen enthalten, so lange nur ein Primer zur Verfügung gestellt wird.
  • Durch die Generierung linearer Verkörperungen der verbundenen zirkulären Sonden, den Amplicons, kann das Problem der langen Concatamere vermieden werden, was das Verfahren für richtige elektrophoretische Technologien im Hochdurchsatzformat geeignet macht. Durch die Amplifikation von nur kurzen Strängen der Oligonukleotide unter Verwendung des blockierenden Abschnitts, wie es hierin oben beschrieben wird, oder durch die Verwendung wenigstens eines Primers in Kombination mit einer Polymerase, die keine Strangverdrängungsaktivität besitzt, kann ein Satz von Amplicons, der eine Probe verkörpert, erhalten werden, wobei die Amplicons eine diskrete Länge innerhalb eines vorbestimmten Bereichs basierend auf der Konstruktion der Sonden aufweisen. Die anschließende Beladung auf eine elektrophoretische Vorrichtung wird in der schnellen Trennung der Amplicons resultieren.
  • Hybridisierung
  • In Schritt (a) wird eine Mehrzahl von unterschiedlichen Zielsequenzen, d. h. wenigstens zwei unterschiedliche Zielsequenzen, mit einer Mehrzahl spezifischer Oligonukleotidsonden unter hybridisierenden Bedingungen in Kontakt gebracht. Die Oligonukleotidsonden werden anschließend an die benachbarten komplementären Teile der mehreren Zielsequenzen in der Probe binden gelassen. Verfahren und Bedingungen zur spezifischen Bindung der Oligonukleotidsonden an komplementäre Zielsequenzen sind auf dem Gebiet wohlbekannt (siehe z. B. in Sambrook und Russel (2001) „Molecular Cloning: A Laborstory Manual (3. Ausgabe), Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory Press). Üblicherweise werden nach dem Vermischen der Oligonukleotidsonden und Zielsequenzen die Nukleinsäuren durch Inkubation (im Allgemeinen bei zwischen 94 °C und 96 °C) für einen kurzen Zeitraum (z. B. 30 Sekunden bis 5 Minuten) in einem Niedrigsalzpuffer (z. B. einem Puffer, der keine Salze oder weniger Salze enthält als äquivalent zu einer Ionenstärke von 10 mM NaCl ist) denaturiert. Die Probe, die die denaturierten Sonden und Zielsequenzen enthält, wird anschließend auf eine optimale Hybridisierungstemperatur für die spezifische Bindung der Sonden und Zielsequenzen abkühlen gelassen, die üblicherweise ungefähr 5 °C unter der Schmelztemperatur des Hybrids zwischen dem komplementären Abschnitt der Sonde und deren komplementärer Sequenz (in der Zielsequenz) liegt. Um eine unspezifische oder ineffiziente Hybridisierung von einer der zwei Sondenabschnitte zu vermeiden, oder in einer Probe mit mehreren Zielsequenzen, ist es bevorzugt, dass in einer Probe die Abschnitte der Sonden, die komplementär zu den Zielsequenzen sind, ähnliche, vorzugsweise identische, Schmelztemperaturen zwischen den unterschiedlichen Zielsequenzen, die in der Probe vorhanden sind, aufweisen. Somit unterscheiden sich die komplementären Abschnitte der Sonden vorzugsweise um weniger als 20, 15, 10, 5 oder 2 °C in der Schmelztemperatur. Dieses wird durch die Verwendung komplementärer Abschnitte der Sonden mit einer ähnlichen Länge und einem ähnlichen G/C-Gehalt erleichtert. Somit unterscheiden sich die komplementären Abschnitte vorzugsweise um weniger als 20, 15, 10, 5 oder 2 Nukleotide in der Länge und deren G/C-Gehalt unterscheidet sich um weniger als 30, 20, 15, 10 oder 5 %. Der Begriff komplementär, wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass eine erste Nukleotidsequenz in der Lage ist, spezifisch an eine zweite Nukleotidsequenz unter Bedingungen normaler Stringenz zu hybridisieren. Eine Nukleotidsequenz, von der angenommen wird, dass sie komplementär zu einer anderen Nukleotidsequenz ist, kann eine kleinere Menge, d. h., vorzugsweise weniger als 20, 15, 10, 5 oder 2 % Fehlpaarungen enthalten. Alternativ dazu kann es notwendig sein, Fehlpaarungen zu kompensieren, z. B. durch die Aufnahme sogenannter universeller Nukleotide, wie sie zum beispielsweise in der EP A 974 672 beschrieben werden, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird, oder durch die Verwendung von geeignet verschlossenen Nukleinsäuren (LNAs, locked nucleic acids) und Peptidnukleinsäuren (PNAs). Da die Bindung der Sonden an Zielsequenzen konzentrationsabhängig ist, wird das Binden vorzugsweise in einem kleinen Volumen durchgeführt, d. h. in weniger als 10 μl. Unter diesen Hybridisierungsbedingungen ist die Bindung der Sonden an Zielsequenzen üblicherweise schnell und dauert nicht viel länger als 5, 10 oder 15 Minuten, obwohl längere Bindungszeiten verwendet werden können, so lange die Hybridisierungstemperatur aufrecht erhalten wird, um unspezifisches Binden zu vermeiden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurden exzellente Ergebnisse durch verlängerte Hybridisierungszeiten wie eine Über-Nacht-Hybridisierung oder für mehr als eine Stunde erhalten. Längere Hybridisierungszeiten können in diesen Assays vorteilhaft sein, weil der Unterschied in dem Signal bedingt durch unterschiedliche Hybridisierungseffizienzen verringert wird und es als wünschenswert angesehen wird, eine vollständige Hybridisierung und Ligierung von allen Sonden zu erreichen, für die eine Zielsequenz vorhanden ist. Exzellente Ergebnisse wurden durch einen kombinierten Hybridisierungs-Ligationsschritt unter Verwendung einer thermostabilen Ligase, wie sie hierin beschrieben wird, erhalten. In dieser Ausführungsform wurde die Hybridisierung-Ligation durch das Ermöglichen, dass die Sonden während einer Stunde in der Gegenwart einer thermostabilen Ligase hybridisieren, gefolgt durch einen Denaturierungsschritt durchgeführt. Das Wiederholen dieser Schritte für wenigstens zwei Male stellte gute Ergebnisse zur Verfügung. Das Wiederholen dieser Schritte 10 Male stellte exzellente Ergebnisse zur Verfügung.
  • Zur Vermeidung einer Verdampfung während der Denaturierung und des Bindens können die Wände und Deckel der Reaktionskammem (d. h. Röhren oder Mikrotiterwells) auch auf die gleiche Temperatur wie die Reaktionsmischung erwärmt werden. In bevorzugten Oligonukleotidsonden beträgt die Länge des komplementären Abschnitts vorzugsweise wenigstens 15, 18 oder 20 Nukleotide und vorzugsweise nicht mehr als 30, 40 oder 50 Nukleotide und die Sonden haben vorzugsweise eine Schmelztemperatur von wenigstens 50 °C, 55 °C oder 60 °C.
  • Nicht hybridisierte Sonden
  • Die Sonden, die nicht zu einem Teil der Zielsequenz komplementär sind, oder die zu viele Fehlpaarungen enthalten, werden nicht oder nur in einem geringen Ausmaß an die Zielsequenz hybridisieren, wenn eine Probe Hybridisierungsbedingungen ausgesetzt wird. Dem entsprechend ist es weniger wahrscheinlich, dass eine Ligierung zustande kommt. Die Anzahl der unechten Ligationsprodukte aus diesen Sonden wird daher im Allgemeinen nicht ausreichend sein und viel weniger als die der bona fide-Ligationsprodukte sein, so dass sie während der anschließenden Multiplexamplifikation zahlenmäßig unterlegen sind. Dem entsprechend werden sie nicht oder nur in einem geringeren Ausmaß nachgewiesen.
  • Ligation
  • Die jeweiligen 5'- und 3'-Enden der Oligonukleotidsonde, die im Wesentlichen benachbart zu den komplementären Teilen einer Zielsequenz gebunden sind, werden in Schritt (c) verbunden, um eine kovalente Bindung durch jegliches geeignetes Mittel, das auf dem Gebiet bekannt ist, zu bilden. Die Enden der Sonden können enzymatisch in eine Phosphodiestherbindung durch eine Ligase, vorzugsweise eine DNA-Ligase, verbunden werden. DNA-Ligasen sind Enzyme, die in der Lage sind, die Bildung einer Phosphodiestherbindung zwischen (den Enden von) zwei Polynukleotidsträngen zu katalysieren, die an benachbarten Positionen auf einem komplementären Strang gebunden sind. DNA-Ligasen setzen üblicherweise ATP (EC 6.5.1.1) oder NAD (EC 6.5.1.2) als einen Cofaktor zum Verschließen von Nicks in doppelsträngiger DANN voraus. Geeignete DNA-Ligasen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind T4 DNA-Ligase, E. coli DNA-Ligase oder vorzugsweise eine thermostabile Ligase wie z. B. Thermus aquaticus (Taq) Ligase, Thermus thermophilus DNA-Ligase oder Pyrococcus DNA-Ligase. Alternativ dazu kann eine chemische Autoligierung der modifizierten Polynukleotidenden verwendet werden, um zwei Oligonukleotidsonden zu ligieren, die an benachbarten Positionen auf den komplementären Teilen einer Zielsequenz gebunden sind (Xu und Kool, 1999, Nucleic Acid Res. 27: 875–881).
  • Sowohl die chemische wie auch die enzymatische Ligation kommt bei perfekt passenden komplementären Sonden-Zielsequenz-Komplexen effizienter zustande im Vergleich zu Komplexen, bei denen ein oder beide der Enden der Sonde eine Fehlpaarung mit der Zielsequenz bei oder nahe der Ligationsstelle bilden (Wu und Wallace, 1989, Gene 76: 245–254; Xu und Kool, supra). Um die Ligationsspezifität, d. h. die relativen Ligationseffizienzen von perfekt zueinander passenden Oligonukleotiden im Vergleich zu fehlgepaarten Oligonukleotiden zu erhöhen, wird die Ligation vorzugsweise bei erhöhten Temperaturen durchgeführt. Somit wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine DNA-Ligase eingesetzt, die bei 50–65 °C für längere Zeiten aktiv bleibt, die aber leicht bei höheren Temperaturen inaktiviert wird, die in dem Denaturierungsschritt während einer PCR, üblicherweise 90–100 °C, verwendet werden. Eine solche DNA-Ligase ist eine NAD erfordernde DNA-Ligase aus einem Gram-positiven Bakterium (Stamm MRCH 065), wie sie aus der WO 01/61033 bekannt ist. Diese Ligase wird als „Ligase 65" bezeichnet und ist kommerziell von MRC Holland, Amsterdam, verfügbar.
  • Gap-Ligierung
  • In einer alternativen Ausführungsform, die zum Beispiel auf die Identifizierung von Indels gerichtet ist, können die jeweiligen Enden so verbunden werden, dass ein Gap (Spalt) zurückbleibt. Dieses Gap wird mit einem geeigneten Oligonukieotid gefüllt und ligiert. Solche Verfahren sind auf dem Gebiet als „Gap-Ligation" bekannt und werden inter alia in der WO 00/77260 offenbart. Eine andere Möglichkeit zum Auffüllen dieses Gaps ist durch die Verlängerung von einem Ende der Sonde unter Verwendung einer Polymerase und einer Ligase in Kombination mit einzelnen Nukleotiden, die optional aus A, T, C oder G oder di-, tri- oder anderen kleinen Oligonukleotiden ausgewählt sind.
  • Primer
  • Die verbundenen Sonden werden unter Verwendung eines Paares von Primern amplifiziert, das den Primerbindungsstellen entspricht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird wenigstens einer der Primer oder der gleiche Satz von Primer für die Amplifikation von zwei oder mehreren unterschiedlichen verbundenen Sonden in einer Probe, vorzugsweise für die Amplifikation von allen verbundenen Sonden in einer Probe, verwendet. Solch ein Primer wird manchmal als ein Universalprimer bezeichnet, weil diese Primer in der Lage sind, die Amplifikation von allen Sonden, die die entsprechende Bindungsstelle des universellen Primers enthalten, zu primen, und dem entsprechend von allen ligierten Sonden, die die Bindungsstelle des Universalstelle des Primers enthalten, zu primen. Die unterschiedlichen Primer, die in der Amplifikation von Schritt (d) verwendet werden, sind vorzugsweise im Wesentlichen in ihrer Bindungs- und Primereffizienz gleich. Somit unterscheiden sich die Primer in einer Probe vorzugsweise um weniger als 20, 15, 10, 5 oder 2 °C in der Schmelztemperatur. Dieses kann, wie es oben für den komplementären Abschnitt der Oligonukleotidsonden dargestellt wird, erreicht werden. Im Gegensatz zu der Sequenz der komplementären Abschnitte wird die Sequenz der Primer nicht durch die Zielsequenz diktiert. Primersequenzen können daher bequem durch den Zusammenbau der Sequenz aus Tetrameren von Nukleotiden konstruiert werden, wobei jedes Tetramer ein A, T, C und G enthält, oder durch andere Wege, die sicherstellen, dass der G/C-Gehalt und die Schmelztemperatur der Primer identisch oder sehr ähnlich sind. Die Länge der Primer (und der entsprechenden Primerbindungsstellen in den Tags der Sonden) beträgt vorzugsweise wenigstens 12, 15 oder 17 Nukleotide und vorzugsweise nicht mehr als 25, 30, 40 Nukleotide.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen wenigstens zwei der Oligonukleotidsonden, die komplementär zu wenigstens zwei unterschiedlichen Zielsequenzen in einer Probe sind, eine Tag-Sequenz, die eine Primerbindungsstelle umfasst, die komplementär zu einer einzelnen Primersequenz ist. Somit wird vorzugsweise wenigstens einer der ersten und zweiten Primer in einem Primerpaar für die Amplifikation der verbundenen Sonden verwendet, die mit wenigstens zwei unterschiedlichen Zielsequenzen in einer Probe korrespondieren, mehr bevorzugt für die Amplifikation von verbundenen Sonden, die mit allen Zielsequenzen in einer Probe korrespondieren, verwendet. Vorzugsweise wird nur ein einzelner erster Primer verwendet und in einigen Ausführungsformen werden nur ein einzelner erster und ein einzelner zweiter Primer für die Amplifikation von allen verbundenen Sonden verwendet. Die Verwendung üblicher Primer zur Amplifikation von mehreren unterschiedlichen Fragmenten ist üblicherweise für die Effizienz des Amplifikationsschrittes von Vorteil.
  • Die aus der Ligation der benachbart gebundenen Sondenabschnitte erhaltenen verbundenen Sonden werden in Schritt (d) unter Verwendung eines Primersatzes, der vorzugsweise aus einem Paar von Primern für jede der verbundenen Sonden in der Probe besteht, amplifiziert. Das Primerpaar umfasst Primer, die zu Primerbindungssequenzen komplementär sind, die in den verbundenen Sonden enthalten sind. Ein Primerpaar umfasst üblicherweise einen ersten und wenigstens einen zweiten Primer, kann aber nur aus einem einzelnen Primer bestehen, der in beide Richtung arbeitet. Exzellente Ergebnisse wurden unter Verwendung von Primer erhalten, die auf dem Gebiet bekannt sind, wie der AFLP-Primer, wie sie inter alia in EP 534 858 und in Vos et al., Nucleic Acid Research, 1995, Bd. 23, 4407–44014, beschrieben werden.
  • Selektive Primer
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist einer oder mehrere der Primer, die in dem Amplifikationsschritt der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ein selektiver Primer. Ein selektiver Primer wird hierin als ein Primer definiert, der zusätzlich zu seiner universellen Sequenz, die komplementär zu einer Primerbindungsstelle in der Sonde ist, eine Region enthält, die so genannte „selektive Nukleotide" umfasst. Die Region, die die selektiven Nukleotide enthält, ist an dem 3'-Ende des Universalprimers positioniert.
  • Das Prinzip der selektiven Nukleotide wird inter alia in EP 534 858 und in Vos et al., Nucleic Acid Research, 1995, Bd. 23, 4407–44014, offenbart. Die selektiven Nukleotide sind zu den Nukleotiden in den (ligierten) Sonden komplementär, die benachbart zu der Primersequenz lokalisiert sind. Die selektiven Nukleotide bilden im Allgemeinen keinen Teil der Region in den (ligierten) Sonden, die als Primersequenz gezeigt wird. Primer, die selektive Nukleotide enthalten, werden als +N-Primer bezeichnet, in denen N für die Anzahl der selektiven Nukleotide steht, die an dem 3'-Ende des Primers vorhanden sind.
  • N wird vorzugsweise aus A, C, T oder G ausgewählt.
  • N kann auch unter vielen unterschiedlichen Nukleotidalternativen ausgewählt werden, d. h. Verbindungen, die in der Lage sind, das Verhalten von ACTG-Nukleotiden nachzuahmen, aber zusätzlich dazu andere Eigenschaften aufweisen, wie die Fähigkeit einer verbesserten Hybridisierung im Vergleich zu ACTG-Nukleotiden, oder die Fähigkeit aufweisen, die Stabilität des Duplex zu modifizieren, der aus der Hybridisierung resultiert. Beispiele davon sind PNA's, LNA's, Inosin etc. Wenn die Amplifikation mit mehr als einem Primer durchgeführt wird, wie mit einer PCR unter Verwendung von zwei Primern, dann kann einer oder beide Primer mit selektiven Nukleotiden ausgestattet sein. Die Anzahl der selektiven Nukleotide kann abhängig von der Spezies oder anderen Besonderheiten variieren, die der Fachmann bestimmen kann. Im Allgemeinen beträgt die Anzahl der selektiven Nukleotide nicht mehr als 10, vorzugsweise wenigstens 5, vorzugsweise 4, mehr bevorzugt 3, am meisten bevorzugt 2 und besonders bevorzugt ist sie 1 selektives Nukleotid.
  • Ein +1-Primer enthält somit ein selektives Nukleotid, ein +2-Primer enthält 2 selektive Nukleotide, etc. Ein Primer ohne selektive Nukleotide (d. h. ein konventioneller Primer) kann als ein +0-Primer (keine hinzugefügten selektiven Nukleotide) dargestellt werden. Wenn ein spezifisches selektives Nukleotid hinzu gegeben wird, wird es als +A oder +C, etc. dargestellt.
  • Durch die Amplifikation eines Satzes von (ligierten) Sonden mit einem selektiven Primer wird ein Untersatz von (ligierten) Sonden unter der Voraussetzung erhalten, dass die komplementäre Base an der geeigneten Position in der gewünschten von den Sonden eingebaut wird, von denen angenommen wird, dass sie unter Verwendung des selektiven Primers selektiv amplifiziert werden. Unter Verwendung eines +1-Primers wird zum Beispiel der Multiplex-Faktor der amplifizierten Mischung um einen Faktor 4 im Vergleich zu der Mischung von ligierten Sonden vor der Amplifikation verringert. Stärkere Verringerungen können durch die Verwendung von Primer mit mehrfachen selektiven Nukleotiden erreicht werden, d. h. eine 16-fache Verringerung des ursprünglichen Multiplex-Verhältnisses wird mit zwei selektiven Nukleotiden erhalten, etc.
  • Wenn ein Assay entwickelt wird, der nach der Ligation selektiv zu amplifizieren ist, ist es bevorzugt, dass die Sonde das komplementäre Nukleotid benachbart zu der Primerbindungssequenz enthält. Dies ermöglicht eine Vorauswahl der selektiv zu amplifizierenden ligierten Sonde.
  • Die Verwendung von selektiven Primern in der vorliegenden Erfindung hat sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn man auf Ligation basierenden Assays mit hohen Multiplexverhältnissen entwickelt, von denen anschließend nur ein spezifischer Teil analysiert werden muss, was in einer weiteren Kostenreduktion der Ligationsreaktion pro Datenpunkt resultiert. Durch das Konstruieren von Primern zusammen mit den benachbarten selektiven Nukleotiden können die spezifischen Anteile der Probe, die getrennt zu amplifizieren sind, zuvor ausgewählt werden.
  • Eines der Beispiele, bei dem dies vorteilhaft und nützlich ist, ist der Fall der Analyse von Proben, die nur kleine Mengen an DNA enthalten, und/oder zur Identifizierung von unterschiedlichen (Stämmen von) Pathogenen. Zum Beispiel wird in einem Assay, der auf den Nachweis von verschiedenen Stämmen von Anthrax (Bacillus anthracis) gerichtet ist, für jeden der Stämme ein Satz von jeweiligen Sonden konstruiert. Der Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens dieses Satzes (oder eines charakteristischen Anteils davon) von ligierten Sonden nach den Hybridisierungs- und Ligationsschritten des Verfahrens der Erfindung kann als eine Identifizierung des betroffenen Stammes dienen. Die selektive Amplifikation mit spezifisch konstruierten Primern (jeder selektive Primer ist an einen spezifischen Stamm gebunden) kann selektiv die verschiedenen Stämme amplifizieren, was deren Identifizierung ermöglicht. Zum Beispiel amplifiziert die Amplifikation mit einem +A-Primer selektiv die ligierten Sonden, die auf den Stamm X gerichtet sind, wobei ein +G-Primer selektiv die ligierten Sonden amplifiziert, die auf den Stamm Y gerichtet sind. Falls es erwünscht ist, wird zum Beispiel im Fall von kleinen Mengen einer Proben-DNA eine optionale erste Amplifikation mit einem +0-Primer die Menge an ligierten Sonden erhöhen, wodurch die selektive Amplifikation erleichtert wird.
  • Zum Beispiel wird ein universeller Primer von 20 Nukleotiden ein selektiver Primer durch die Zugabe eines selektiven Nukleotids an sein 3'-Ende, wobei die Gesamtlänge des Primers nun 21 Nukieotide beträgt. Siehe auch 15. Alternativ dazu kann der Universalprimer an seinem 5'-Ende um die Anzahl der hinzu gegebenen selektiven Nukleotide gekürzt werden. Zum Beispiel kann die Zugabe von zwei selektiven Nukleotiden an dem 3'-Ende der Primersequenz mit dem Fehlen (oder dem Entfernen) von zwei Nukleotiden an dem 5'-Ende des Universalprimers im Vergleich zu dem ursprünglichen Universalprimer kombiniert werden. Somit wird ein Universalprimer von 20 Nukleotiden durch einen selektiven Primer von 20 Nukleotiden ersetzt. Diese Primer werden in dieser Anmeldung als "verschachtelte" Primer bezeichnet. Die Verwendung von selektiven Primern basierend auf Universalprimern hat den Vorteil, dass die Amplifikationsparameter wie Stringenz und Temperaturen im Wesentlichen die gleichen für die Amplifikation mit unterschiedlichen selektiven Primer bleiben können oder nur in einem geringen Ausmaß variieren. Vorzugsweise wird die selektive Amplifikation unter Bedingungen erhöhter Stringenz im Vergleich zur nicht selektiven Amplifikation durchgeführt. Unter erhöhter Stringenz ist gemeint, dass die Bedingungen zum Binden des Primers an die ligierte Sonde derart sind, dass nur perfekt gepaarte selektive Primer durch die in dem Amplifikationsschritt verwendete Polymerase verlängert werden. Die spezifische Amplifikation von nur perfekt gepaarten Primern kann in der Praxis durch die Verwendung eines sogenannten Touchdown-PCR-Profils erreicht werden, bei dem die Temperatur während des Primerbindungsschrittes schrittweise um zum Beispiel 0,5 °C erniedrigt wird, um perfekt gebundene Primer zu ermöglichen. Geeignete Stringenzbedingungen werden zum Beispiel für die AFLP-Amplifikation in der EP 534 858 und in Vos et al., Nucleic Acid Research, 1995, Bd. 23, 4407–44014, beschrieben. Der Fachmann wird basierend auf der Führung Wege finden, um die Stringenzbedingungen anzupassen, um seinen spezifischen Bedürfnissen zu entsprechen, ohne von dem Gedanken der Erfindung abzuweichen.
  • Einer der weiteren Vorteile der selektiven Amplifikation von ligierten Sonden ist, dass ein Assay mit einem hohen Multiplexverhältnis leicht zum Nachweis mit Verfahren oder mit Plattformen angepasst werden kann, die ein niedriges Multiplexverhältnis vorziehen. Eines der vielen Beispiele davon ist der Nachweis basierend auf Längenunterschieden wie die Elektrophorese und vorzugsweise die Kapillarelektrophorese, wie sie auf einem MegaBACE oder unter Verwendung von Nanotechnologie wie einem Lab-on-a-Chip durchgeführt wird.
  • Amplifikation
  • In Schritt (d) des Verfahrens der Erfindung werden die verbundenen Sonden durch jegliches geeignete Amplifikationsverfahren für Nukleinsäuren, das auf dem Gebiet bekannt ist, amplifiziert, um (nachweisbare) amplifizierte verbundene Sonden (Amplicons) zu produzieren, die lineare Verkörperungen der verbundenen zirkulären Sonden sind. Amplifikationsverfahren für Nukleinsäuren setzen üblicherweise zwei Primer, dNTP's und eine (DNA)-Polymerase ein. Ein bevorzugtes Verfahren für die Amplifikation ist die PCR. Die „PCR" oder „Polymerasekettenreaktion" ist ein schnelles Verfahren zur enzymatischen Amplifikation eines spezifischen DNA-Segments in vitro.
  • Die zu amplifizierende DNA wird durch das Erwärmen der Probe denaturiert. In der Gegenwart von DNA-Polymerase und einem Überschuss an Deoxynukleotidtriphosphaten, primen Oligonukleotide, die spezifisch an die Zielsequenz binden, die Synthese der neuen DNA. Es ist bevorzugt, dass die Polymerase eine DNA-Polymerase ist, die keine Strangverdrängungsaktivität aufzeigt oder dieses wenigstens nicht wesentlich tut. Beispiele davon sind Amplitaq und Amplitaq Gold (Hersteller Perkin Elmer) und Accuprime (Invitrogen). Eine Runde der Synthese resultiert in neuen Strängen von bestimmter Länge, die wie die parentalen Stränge an die Primer bei Denaturierung und Bindung hybridisieren können. Der zweite Zyklus der Denaturierung, der Bindung und der Synthese stellt zwei einzelsträngige Produkte her, die zusammen ein diskretes doppelsträngiges Produkt von genau der Länge zwischen den Primerenden darstellen. Dieses diskrete Produkt akkumuliert exponentiell mit jeder folgenden Runde der Amplifikation. Über die Dauer von ungefähr 20 bis 30 Zyklen kann eine millionenfache Amplifikation des diskreten Fragments erreicht werden. PCR-Protokolle sind auf dem Gebiet wohlbekannt und werden in üblichen Labortextbüchern beschrieben (z. B. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1995)). Geeignete Bedingungen für die Anwendung der PCR in dem Verfahren der Erfindung werden in der EP A 0 534 858 und in Vos et al., (1995) Nucleic Acid Res., 23: 4407–23: 4407-4407-4407-44014) beschrieben, wo mehrere DNA-Fragmente zwischen 70 und 700 Nukleotiden, die identische Primerbindungssequenzen enthalten, mit fast gleicher Effizienz unter Verwendung eines Primerpaares amplifiziert werden. Andere Multiplex- und/oder isotherme Amplifikationsverfahren, die eingesetzt werden können, umfassen z. B. die LCR, die "self-sustained sequence replication (3SR), die Q-β-Replikase-vermittelte RNA-Amplifikation oder die Strangverdrängungsamplifikation (SDA, strand displacement amplification). In einigen Fällen kann dies das Ersetzen der Primerbindungsstellen in den Tags der Sonden durch eine geeignete (RNA)-Polymerasebindungsstelle erfordern, so lange dieses zu linearen Amplifikationsprodukten führt, wie sie hierin zuvor definiert wurden, d. h. von diskreter Länge und entsprechend der Länge der zirkulären Sonden.
  • Wie es hierin beschrieben wird, können lineare Verkörperungen der verbundenen zirkulären Sonden durch die exponentielle Amplifikation der zirkulären Sonde mit zwei Primern, einem Vorwarts- und einem Rückwärtsprimer, unter Verwendung einer Polymerase erhalten werden, die keine oder im Wesentlichen keine Strangverdrängungsaktivität aufweist. Die erste Primerverlängerung in der Amplifikation mit dem Vorwärtsprimer generiert ein Oligonukleotidprodukt bis das 5'-Ende des Vorwärtsprimers erreicht wird. Dort wird die Primerverlängerung bedingt durch im Wesentlichen die Abwesenheit einer Strangverdrängungsaktivität der verwendeten Polymerase terminiert, was einen verlängerten Primer mit im Wesentlichen der gleichen Länge wie die gebundene zirkuläre Sonde hinterlässt. Der zweite Zyklus der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Primerverlängerung wird für den Vorwärtsprimer den identischen Strang wie während der ersten Primerverlängerung produzieren, wohingegen der Rückwärtsprimer an das Oligonukleotidprodukt von der Verlängerung der ersten Primerverlängerung hybridisieren wird und dadurch den komplementären Strang produziert, was in der exponentiellen Amplifikation der zirkulären Sonde resultiert, um dadurch Amplicons von diskreter Länge zu produzieren, die Verkörperungen der verbundenen zirkulären Oligonukleotidsonden sind.
  • Amplicons
  • Der Begriff „Amplicon", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf das Produkt des Amplifikationsschrittes der gebundenen oder ligierten Sonde. Der Begriff „Amplicon", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich somit auf eine amplifizierte verbundene Sonde. Nach dem Ligationsschritt, bei dem die zwei zielspezifischen Abschnitte mittels einer Ligase verbunden werden, wird die verbundene oder ligierte Sonde mit einem oder mehreren Primern und einer Polymerase kombiniert und amplifiziert. Die ligierte Sonde, die Primer, die Polymerase und/oder andere Parameter und Variablen sind solche, dass die Amplifikation in linearen Verkörperungen der zirkulären Sonde resultiert. In der vorliegenden Erfindung ist das Amplicon ein lineares Oligonukleotid mit einer Länge, die nicht wesentlich die Länge der zirkulären Sonde überschreitet. Die minimale Länge des Amplicons ist wenigstens die Summe der Länge der zwei zielkomplementären Abschnitte. Es ist bevorzugt, dass die Länge des Amplicons der Länge der zirkulären Sonde entspricht. Es ist mehr bevorzugt, dass die Länge des Amplicons die Ligation der korrespondierenden zirkulären Sonde anzeigt. Vorzugsweise enthält ein Amplicon keine Wiederholungen der Abschnitte der zirkulären Sonde, d. h. es ist kein Concatamer oder ein Multimer der zirkulären Sonde oder eine multimere Verkörperung davon. Vorzugsweise ist ein Amplicon eine lineare und monomere Verkörperung der gebundenen zirkulären Sonde.
  • Der durch die Umwandlung von zirkulären Sonden in lineare Amplicons erhaltene Vorteil ist derart, dass die vorteilhaften Eigenschaften der zirkulären Sonde verwendet werden (verbesserte Kinetiken, verbesserte Hybridisierung an den Zielstrang bedingt durch die Bildung der „Padlock-/Schloss"-Konformation), während die resultierenden Amplicons eine diskrete Länge aufweisen und anschließend ohne die Notwendigkeit zusätzlicher Schritte wie Restriktion und Markierung nachgewiesen werden können. 14 zeigt eine schematische Darstellung von zirkulären Sonden und Amplicons. Die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden diesbezüglich weitere Details zur Verfügung stellen.
  • Nachweis
  • Der Nachweis der markierten getrennten Proben wird mittels eines Detektors durchgeführt, um in Nachweisdaten zu resultieren. Der Detektor ist natürlich von dem allgemeinen System abhängig, mit dem die Trennung durchgeführt wird (Kapillarelektrophorese, Plattengelelektrophorese, fixierter Detektor-kontinuierliche Gelelektrophorese), hängt aber auch von dem Marker ab, der auf dem Primer vorhanden ist, wie ein fluoreszierender oder ein radioaktiver Marker.
  • Die Amplicons in einer Probe werden vorzugsweise auf einer elektrophoretischen Vorrichtung analysiert. Die elektrophoretische Vorrichtung trennt vorzugsweise die unterschiedlichen Amplicons in einer amplifizierten Probe auf der Basis der Länge, wonach die getrennten Amplicons, wie es unten beschrieben wird, nachgewiesen werden können. Eine geeignete elektrophoretische Vorrichtung kann eine Gelelektrophoresevorrichtung sein, z. B. für eine konventionelle (Polyacrylamid) Plattengelelektrophorese, oder eine Vorrichtung zur Kapillarelektrophorese, wie sie beispielhaft durch das MegaBACE-Zubehör verkörpert wird, das von Molecular Dynamics Amersham-Biosciences verfügbar ist. Eine Alternative sind kapillarelektrophoretische Vorrichtungen im Nanoformat, die als Lab-on-a-Chip bekannt sind. Die elektrophoretische Vorrichtung ist vorzugsweise eine Mehrkanalvorrichtung, in der viele Proben parallel in mehreren Kanälen elektrophoretisch behandelt werden können. Die elektrophoretische Vorrichtung hat eine Auftragungsposition (pro Kanal) zur Auftragung (Beladung) der amplifizierten elektrophoretisch zu behandelnden Probe, einen Trennbereich, über den die Fragmente in der Probe durch Elektrophorese wandern, und vorzugsweise auch eine Nachweisvorrichtung, die an einer Nachweisposition distal von der Position zur Auftragung positioniert ist. Die Nachweisvorrichtung wird üblicherweise einen Fotoverstärker zum Nachweis von Fluoreszenz, Phosphoreszenz oder Chemilumineszenz umfassen. Alternativ dazu können im Fall einer Gelelektrophorese die getrennten Fragmente in dem Gel durch z. B. Autoradiographie oder Fluorographie nachgewiesen werden.
  • Längenunterscheidung
  • Zur Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Zielsequenzen in der Probe wird vorzugsweise ein Unterschied in der Länge der jeweiligen korrespondierenden Amplicons verwendet. Durch die Auftrennung der Amplicons basierend auf der Länge kann das Vorhandensein der korrespondierenden Zielnukleotidsequenzen in der Probe bestimmt werden. Dem entsprechend basiert in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Unterscheidung zwischen Amplicons, die aus unterschiedlichen Zielsequenzen einer Probe abgeleitet sind, auf einem Längenunterschied zwischen den jeweiligen Amplicons, die den unterschiedlichen Zielsequenzen in einer Probe oder in einer amplifizierten Probe entsprechen.
  • Vorzugsweise wird der Längenunterschied durch die Länge der Füllsequenzen) in den Oligonukleotidsonden zur Verfügung gestellt. Durch das Mitumfassen einer Füllsequenz von festgelegter Länge in jeder Oligonukleotidsonde kann die Länge von jedem Amplicon in einer amplifizierten Probe derart gesteuert werden, dass eine geeignete Unterscheidung basierend auf den Längenunterschieden der Amplicons, die in Schritt (d) erhalten wurden, ermöglicht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform einer Sonde gemäß der Erfindung ist die Füllsequenz zwischen dem Abschnitt der Sonde komplementär zu der Zielsequenz und einer Primerbindungssequenz positioniert. Da es zwei zielspezifische Abschnitte an beiden Enden der Sonde und zwei Primerbindungsstellen gibt, können zwei Füllsequenzen dazwischen in die Sonde eingebracht werden. Als solche wird die Gesamtlänge der Füllsequenz durch die Kombination der Länge der ersten Füllsequenz und der zweiten Füllsequenz in der Sonde zur Verfügung gestellt. Dem entsprechend umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform die Oligonukleotidsonde zwei Füllesequenzen, und zwar vorzugsweise in den nicht zum Ziel komplmentären Tags. Eine grafische Darstellung davon ist in 14 zu finden.
  • Die Längenunterscheidung zwischen Amplicons, die aus Zielsequenzen in der Probe erhalten werden, ist vorzugsweise so ausgewählt, dass die Amplicons basierend auf deren Länge unterschieden werden können. Dieses wird durch die Verwendung von Füllsequenzen oder Kombinationen von Füllsequenzen erreicht, die (zusammen) in deutlichen Längenunterschieden resultieren, die auf elektrophoretischen Vorrichtungen unterschieden werden können. Somit sind vom Gesichtspunkt der Auflösungsstärke die Längenunterschiede zwischen den unterschiedlichen Amplicons, die durch deren Füllsequenzen bestimmt werden, so groß wie möglich. Jedoch sind unter bestimmten anderen wichtigen Überlegungen, wie sie zuvor gemacht wurden, die Längenunterschiede zwischen den unterschiedlichen Amplicons so klein wie möglich: (1) Die obere Grenze, die in der Praxis in Bezug auf die Länge von chemisch synthetisierten Sonden existiert, liegt bei maximal ungefähr 100–150 Basen; (2) die Amplifikation von größeren Fragmenten ist weniger effizient; (3) unterschiedliche Amplifikationseffizienzen von Fragmenten mit einer großen Variation in der Länge haben eine höhere Wahrscheinlichkeit; und (4) die Verwendung von Mehrfachinjektionen von Nachweisproben in die Nachweisvorrichtung funktioniert am besten mit Fragmenten in einem engen Längenbereich. Vorzugsweise sind die Längenunterschiede zwischen den zu bestimmenden Sequenzen, die durch die Füllsequenzen zur Verfügung gestellt werden, wenigstens ausreichend, um eine Unterscheidung zwischen im Wesentlichen allen Amplicons zu ermöglichen. Entsprechend der Definition basierend auf chemischen, enzymatischen und biologischen Nukleinsäuresyntheseverfahren beträgt der minimale verwendbare Größenunterschied zwischen den unterschiedlichen Amplicons in einer amplifizierten Probe eine Base und dieser Größenunterschied passt insbesondere in den unteren Größenbereichen zur Auflösungsstärke der meisten elektrophoretischen Vorrichtungen. Somit ist es basierend auf dem oben Gesagten bevorzugt, Multiplexassays mit Amplifikationsprodukten zu verwenden, die sich in der Länge durch eine einzelne Base (Basenpaar) unterscheiden. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Längenunterschied zwischen unterschiedlichen Amplicons in einer amplifizierten Probe wenigstens zwei Nukleotide. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung haben die Amplicons in einer Probe, die unterschiedlichen Zielsequenzen entsprechen, einen Längenunterschied von 2 Nukleotiden.
  • Marker
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst wenigstens einer der Primer, die komplementär zu den Primerbindungsstellen der ersten und zweiten Oligonukleotidsonden in der Probe sind, einen Marker, vorzugsweise umfasst der zweite Primer einen Marker. Der Marker kann aus einer großen Gruppe ausgewählt werden, die unter anderem fluoreszierende und/oder phosphoreszierende Gruppen wie Farbstoffe, Chromophoren oder Enzyme, Antigene, Schwermetalle, magnetische Sonden, phosphoreszierende Gruppen, radioaktive Marker, chemilumineszierende Gruppen oder elektrochemisch nachweisbare Gruppen enthält. Vorzugsweise ist der Marker ein fluoreszierender oder phosphoreszierender Farbstoff, der mehr bevorzugt aus der Gruppe FAM, HEX, TET, JOE, NED und (ET-)ROX ausgewählt ist. Farbstoffe wie FITC, Cy2, Texas Rot, TAMRA, Alexa fluor 488®, Bodipy® FL, Rhodamine 123, R6G, Bodipy 530, Alexafluor® 532 und IRDyes® von Licor, wie sie auf der NEN Glober IR2-Plattform verwendet werden, sind auch zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Vorzugsweise kann der Marker unter den fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Farbstoffen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus FAM, TET, JOE, NED, HEX, (ET-)ROX, FITC, Cy2, Texas Rot, TAMRA, Alexafluor 488®, Bodipy®FL, Rhodamine 123, R6G, Bodipy 530, Alexafluor® 532 und IRDyes® besteht.
  • Durch die Verwendung eines Primersatzes, der unterschiedlich markierte Primer enthält, kann die Anzahl der verbundenen Sonden, die in einer Probe unterschieden werden können, und somit die Zahl der Zielsequenzen in einer Probe, für jeden zusätzlichen Marker verdoppelt werden. Somit kann für jeden zusätzlichen Marker, der in einer Probe verwendet wird, die Zahl der Zielsequenzen, die in einer Probe analysiert werden kann, verdoppelt werden. Die maximale Anzahl von Markern, die in einer Probe in einem Verfahren mit Hochdurchsatzformat verwendet werden kann, bestimmt sich hauptsächlich durch die Beschränkungen in den Nachweiskapazitäten der verfügbaren Nachweisplattformen. Derzeit ermöglicht eine der am häufigsten verwendeten Plattformen (MegaBACE von Molecular Dynamics-Amersham-Biosciences Ltd.) den gleichzeitigen Nachweis von bis zu vier fluoreszierenden Farbstoffen, die FAM, JOE oder HEX, NED und (ET-)ROX sind. Jedoch können auch alternative kapillarelektrophoretische Instrumente geeignet sein, die A6I310, ABI3100, A6I3700 (Perkin-Elmer Corp.), CEQ2000 XL (Beckman Coulter) und andere umfassen. Nicht einschränkende Beispiele von Elektrophoresevorrichtungen, die auf Plattengelen basieren, umfassen A6I377 (Perkin Elmer Corp.) und das Global IR2 automatisierte DNA-Sequenziersystem, das von LI-COR, Lincoln, Nebraska, USA, verfügbar ist.
  • Länge und Marker
  • Der Durchsatz kann durch die Verwendung von mehreren markierten Primern erhöht werden. Eines der Probleme, das mit der Verwendung unterschiedlicher Marker in einer Probe assoziiert ist, ist die gegenseitige Beeinflussung oder restliche Beeinflussung. Die gegenseitige Beeinflussung oder restliche Beeinflussung (cross talk), wie sie hierin genannt wird, bezieht sich auf eine Überlappung der Emissionsspektren von unterschiedlichen (fluoreszierenden) Markern. Zum Beispiel hat, wenn fluoreszierende Farbstoffe verwendet werden, jeder Farbstoff ein unterschiedliches Emissions-(und Absorptions-)Spektrum. In dem Fall von zwei Farbstoffen in einer Probe können diese Spektren überlappen und können eine Störung des Signals bewirken, welche die Qualität der erhaltenen Daten beeinträchtigt. Insbesondere wenn zwei in einer Probe nachzuweisende Nukleotidfragmente mit einem unterschiedlichen Marker markiert sind und eines der Fragmente in einer großen Menge vorhanden ist, während das andere nur in kleinen Mengen vorhanden ist, kann die restliche Beeinflussung bewirken, dass das gemessene Signal des Fragments, das in nur kleinen Mengen vorhanden ist, sich hauptsächlich aus der Emission des anderen Markers mit einem überlappenden Emissionsspektrum ableitet, der vielfach in einem Fragment mit identischer Größe einer anderen Probe enthalten ist. Die umgekehrte Wirkung des anderen Farbstoffes kann auch zustande kommen, aber in diesem Fall ist die Wirkung wegen der Unterschiede in der Häufigkeit zwischen den Amplicons, die mit den jeweiligen Farbstoffen markiert sind, wahrscheinlich geringer.
  • Chehab et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 9178–9182 (1989) versuchten, zwischen Allelen durch die Bindung unterschiedlicher fluoreszierender Farbstoffe an kompetitierende Allelen in einem einzelnen Reaktionsröhrchen durch die Auswahl von Kombinationen von Markern zu unterscheiden, so dass das Emissionsmaximum eines Markers im Wesentlichen mit dem Emissionsminimum des anderen Farbstoffes überein stimmt. Jedoch gibt es bei einer bestimmten Wellenlänge, bei der ein Farbstoff ein Absorptionsmaximum zeigt, immer auch eine verbleibende Absorption von dem anderen Farbstoff, der in der Probe vorhanden ist, insbesondere wenn die Probe mehrere Farbstoffe enthält.
  • Dieser Weg zur Multiplexanalyse erwies sich wegen der relativ wenigen Farbstoffe, die spektral aufgelöst werden können, als in seiner Dimension beschränkt. Eines der Hauptprobleme bei der Verwendung von mehreren Farbstoffen ist, dass sich die Emissionspektren von unterschiedlichen fluoreszierenden Markern oft überlappen. Die resultierenden Signale der Rohdaten müssen um den Beitrag von ähnlich großen Fragmenten, die gleichzeitig nachgewiesen werden und mit einem anderen fluoreszierenden Farbstoff markiert sind, durch ein Verfahren korrigiert werden, das Überlappungskorrektur genannt wird. Die Überlappungskorrektur wird üblicherweise durch mathematische Mittel basierend auf den bekannten theoretischen Absorptionsspektren von beiden Farbstoffen nach dem Sammeln der "Roh-"daten aus der Nachweisvorrichtung durchgeführt. Die mathematische Korrektur basiert auf den theoretischen Spektren und ignoriert, dass die Spektren von Markern empfindlich sind und oft von der Zusammensetzung der Nachweisprobe beeinflusst werden. Diese Empfindlichkeiten können die Helligkeit und/oder die Wellenlänge der Emission beeinträchtigen. Das bedeutet, dass Parameter wie der pH-Wert, die Temperatur, die Anregungslichtintensität, nicht kovalente Wechselwirkungen, die Salzkonzentration und die Ionenstärke das resultierende Emissionspektrum stark beeinflussen. Insbesondere ist es bekannt, dass die Gegenwart von Restsalzen in einer Probe das Fluoreszenzsignal beeinträchtigt, das durch den Farbstoff abgegeben wird, und ein kritischer Faktor in dem Fall des Nachweises durch Kapillarelektrophorese unter Verwendung elektrokinetischer Injektion ist, weil es dann auch die Injektionseffizienz beeinträchtigt. Somit ist die spektrale Überlappung eine potentielle Fehlerquelle, die eine negative Auswirkung auf die Qualität der Daten im Falle eines Multiplexnachweises unter Verwendung unterschiedlicher fluoreszierender Farbstoffe hat.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung für dieses Problem zur Verfügung, so dass zwei (oder mehrere) Marker mit überlappenden Spektren in der gleichen Probe ohne wesentliche Beeinträchtigung der Datenqualität verwendet werden können. Durch eine festgelegte Kombination von Längenunterschieden und Marker wird eine Erhöhung in der Anzahl der Zielnukleotidsequenzen, die in einer Probe nachgewiesen werden können, erhalten, während die Qualität der Daten wenigstens konstant bleibt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die spektrale Überlappung zwischen zwei unterschiedlich markierten Sequenzen durch die Einführung eines Längenunterschiedes zwischen den zwei Sequenzen verringert. Dieser auf Marker bezogene Längenunterschied kann durch die Länge der Füllsequenz zur Verfügung gestellt werden, so wie es hierin beschrieben wird. Die Anzahl der unterschiedlichen Marker, die in der gleichen Probe in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden kann, beträgt wenigstens zwei, vorzugsweise wenigstens drei, mehr bevorzugt wenigstens vier. Die maximale Anzahl von Markern ist funktionell durch das Minimum der spektralen Überlappung begrenzt, das akzeptabel bleibt, und das für die meisten Anwendungen typischerweise bei weniger als 15 Prozent des wahren Signals liegt, vorzugsweise bei weniger als 10 Prozent, mehr bevorzugt bei weniger als 5 Prozent und am meisten bevorzugt bei weniger als 1 Prozent des wahren Signals liegt.
  • Um den potentiellen Einfluss von restlicher Überlappung auf die Datenqualität in dem Fall zu vermeiden, dass unterschiedliche Proben mit mehreren fluoreszierenden Farbstoffen mit überlappenden Emissionspektren markiert sind und Fragmente mit identischer Länge gleichzeitig in dem gleichen Probenlauf nachgewiesen werden, ist es in einer besonders bevorzugten Ausführungsform bevorzugt, die Füllsequenzen so zu wählen, dass sich die Amplicons um mindestens zwei Basenpaare innerhalb eines Multiplexsatzes unterscheiden und sich durch ein einzelnes Basenpaar zwischen Multiplexsätzen unterscheiden, die mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert sind, die überlappende Spektren aufweisen. Dadurch kann die Länge der Fragmente, die mit den jeweiligen Farbstoffen markiert sind, so gewählt werden, dass der potentielle Einfluss von restlicher Überlappung auf die Qualität der Daten umgangen wird, weil einzigartige Kombinationen von Fragmentengröße und markierendem Farbstoff festgelegt werden (3).
  • Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist auf ein Verfahren gerichtet, bei dem eine Probe, die Amplicons enthält, aus einer Vielzahl von Zielsequenzen abgeleitet wird. Diese Amplicons sind unterschiedlich markiert, wodurch Gruppen von Amplicons definiert werden, die den gleichen Marker tragen. Innerhalb jeder Gruppe stellt die Füllsequenz einen Längenunterschied von wenigstens zwei, vorzugsweise zwei Nukleotiden zur Verfügung. Zwischen zwei Gruppen mit Marker mit Spektralüberlappung stellt die Füllsequenz einen Längenunterschied von einem Nukleotid zur Verfügung, was wirksam in einer Gruppe mit einer geraden Anzahl von Nukleotiden und einer Gruppe mit einer ungeraden Anzahl von Nukleotiden resultiert, wie es oben beschrieben wird.
  • In einem Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur verbesserten Unterscheidung und zum Nachweis von Zielsequenzen in einer Probe, umfassend das Bereitstellen von wenigstens zwei oder mehr Gruppen von Oligonukleotidsonden, wobei die mit unterschiedlichen Gruppen von Oligonukleotidsonden erhaltenen Amplicons unterschiedliche Marker aufweisen, wobei im Wesentlichen jede amplifizierte verbundene Sondenzielsequenz in einer Gruppe den gleichen Marker aufweist, wobei in einer Gruppe identisch markierter Amplicons ein Längenunterschied zwischen jeder identisch markierten Sonde in dieser Gruppe zur Verfügung gestellt wird, wobei zwischen der ersten und der zweiten Gruppe ein zusätzlicher Längenunterschied derart zur Verfügung gestellt wird, dass jede amplifizierte verbundene Sonde in der amplifizierten Probe durch eine Kombination der Länge der Sequenz und des Markers gekennzeichnet ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden wenigstens zwei Gruppen von Oligonukleotidsonden für eine Probe zur Verfügung gestellt, wodurch jede Gruppe der Oligonukleotidsonden Tag-Sequenzen mit wenigstens einer gruppenspezifischen Primerbindungsstelle hat. Die verbundenen Sonden von jeder Gruppe werden mit einem Primerpaar amplifiziert, bei dem wenigstens einer der ersten und zweiten Primer komplementär zu der gruppenspezifischen Primerbindungsstelle ist, und bei dem wenigstens einer der ersten und zweiten Primer einer Gruppe einen gruppenspezifischen Marker umfasst. In jeder Gruppe unterscheidet sich ein Amplicon, das mit einer Zielsequenz in der gleichen Probe korrespondiert, in der Länge von einem Amplicon, das einer unterschiedlichen Zielsequenz in der Probe entspricht. Die gruppenspezifischen Marker sind vorzugsweise derart, dass die Nachweisvorrichtung zwischen den unterschiedlichen gruppenspezifischen Marker unterscheiden kann. Der Längenunterschied wird vorzugsweise durch die Länge der Füllsequenz zur Verfügung gestellt. Vorzugsweise hat in dieser Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ein erster Teil der Gruppen Amplicons mit einer geraden Anzahl von Nukleotiden und ein zweiter Teil der Gruppen hat Amplicons mit einer ungeraden Anzahl von Nukleotiden. Vorzugsweise sind die Gruppen der Amplicons mit einer geraden Anzahl von Nukleotiden und die Gruppen der Amplicons mit einer ungeraden Anzahl von Nukleotiden mit (fluoreszierenden) Marker markiert, die die geringste Überlappung in deren Emissions spektren aufweisen. Somit sind zwei Gruppen von Amplicons, bei denen jede Gruppe eine ungerade Anzahl von Nukleotiden aufweist, mit Markern markiert, die die geringste Überlappung in deren Emissionsspektren aufweisen. Das gleiche trifft für zwei Gruppen von Amplicons zu, wobei jede Gruppe eine ungerade Anzahl von Nukleotiden aufweist. Zwei Gruppen von Amplicons, bei denen eine Gruppe eine ungerade Anzahl von Nukleotiden aufweist und die andere Gruppe eine gerade Anzahl von Nukleotiden aufweist, sind mit Marker markiert, die eine größere Überlappung in deren Emissionsspektren aufweisen. Die relativen Vorgaben, wie sie hierin bezüglich „der geringsten Überlappung in deren Emissionsspektren" und „mit einer größeren Überlappung in deren Emissionsspektren" verwendet werden, beziehen sich auf eine Gruppe von Markern, aus denen eine Auswahl von Markern zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden kann. Diese Gruppe von Marker kann von der verwendeten Nachweisplattform bis hin zu anderen Faktoren abhängig sein, wie denen, die hierin zuvor offenbart wurden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens werden eine erste und zweite Gruppe von Amplicons mit einer geraden Anzahl von Nukleotiden hergestellt und es werden eine dritte und vierte Gruppe von ligierten amplifizierten Sonden mit einer ungeraden Anzahl von Nukleotiden hergestellt, und wobei die erste und zweite Gruppe jeweils mit FAM und NED markiert werden, und die dritte und vierte Gruppe jeweils mit (ET-)ROX und entweder JOE oder HEX markiert werden; oder umgekehrt, wobei die erste und zweite Gruppe jeweils mit (ET-)ROX und entweder mit JOE oder HEX markiert werden und die dritte und vierte Gruppe jeweils mit FAM und NED markiert werden. Somit werden in diesen Ausführungsformen die fluorezierenden Marker derart ausgewählt, dass die Gruppen von Amplicons, die ko-migrieren, weil sie beide Fragmente mit entweder geraden oder ungeraden Anzahlen von Nukleotiden enthalten, Marker haben, die die geringste Überlappung in deren Emissionsspektren aufweisen, wodurch eine Überlappung beim Nachweis der Amplicons in unterschiedlichen Gruppen soweit wie möglich vermieden wird (siehe auch unten).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist es daher wünschenswert, um eine Überlappung zu vermeiden, einen Längenunterschied mit einem unterschiedlichen Marker zu kombinieren, wenn ein Satz von Amplicons in einer solchen Weise analysiert wird, dass der Einfluss der spektralen Überlappung auf die Qualität der Daten durch Längenunterschiede zwischen den Amplicons vermieden wird, die mit den Farbstoffen markiert sind, die überlappende Emissionsspektren aufweisen.
  • Es ist bevorzugt, dass sich in jeder Probe die ligierten Sonden, die aus jeder Zielsequenz abgeleitet sind, von jeglicher anderen ligierten Sonde in der Probe in der Länge und/oder in dem Marker oder vorzugsweise in der Kombination der Länge und des Markers unterscheiden. Um eine geeignete Trennung der Amplicons von unterschiedlicher Länge zur Verfügung zu stellen, ist es bevorzugt, dass der Längenunterschied zwischen zwei unterschiedlichen ligierten Sonden wenigstens zwei Nukleotide, vorzugsweise zwei beträgt. Wenn man Polymorphismen nachweist, ist es bevorzugt, dass der Unterschied in der Länge zwischen zwei oder mehr (SNP)-Allelen des Polymorphismus nicht mehr als zwei beträgt, wodurch sichergestellt wird, dass die Effizienz der Amplifikation zwischen unterschiedlichen Allelen oder Formen des gleichen Polymorphismus ähnlich ist. Dies impliziert, dass vorzugsweise beide Allelen mit dem gleichen Primerpaar amplifiziert werden und somit mit dem gleichen Farbstoff amplifiziert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, die zum Beispiel auf den Nachweis von unterschiedlichen Allelen einer Vielzahl von Loci gerichtet ist, kann die Verteilung zwischen ungeraden/geraden Längen innerhalb einer Gruppe in der folgenden Weise konstruiert werden. Zwei Loci L1, L2 werden jeweils durch zwei Allelen A11, A12 für L1 und A21, A22 für L2 dargestellt. Die Längen der verschiedenen Allelen (oder der ligierten und amplifizierten Sonden, die diese Allelen verkörpern) sind derart, dass A11 > A12 > A21 > A22; A12 – A11 = 2; A22 – A21 = 2; A12 – A21 = 3. Zwischen den Gruppen G1 und G2, die Marker tragen, die eine Überlappung in deren Spektren aufweisen können, kann es einen Längenunterschied von 1 Nukleotid geben. Somit ist G1(A11) – G2(A11) = 1, daher beginnt die Gruppe mit entweder einer geraden oder ungeraden Länge.
  • Diese Verteilung hat einige wesentliche Vorteile im Vergleich zu der dichter gepackten hierin offenbarten Verteilung. Es ist bekannt, dass sich die unterschiedlichen Sequenzen von identischer Länge im Allgemeinen bedingt durch konformelle Unterschiede in ihrer elektrophoretischen Mobilität unterscheiden. Wenn es nur einen Unterschied in der Länge von einem Nukleotid gibt, kann dieses eine Überlappung zwischen den Spitzen bewirken, wenn die Sequenzen von sehr unterschiedlicher Mobilität sind. Zum Beispiel wird der Unterschied in der Mobilität zwischen zwei Allelen von einem Locus (A11, A12) geringer als der Unterschied in der Mobilität zwischen zwei Allelen von unterschiedlichen Loci (A12, A21) sein. Wenn es einen wesentlichen Unterschied in der Mobilität zwischen A12 und A21 gibt, dann kann dies zu einem nicht zuverlässigen Nachweis führen. Durch die Generierung von Längenverteilungen, wie sie hierin offenbart werden, kann dies vermieden werden. Der geringere Durchsatz ist dann gegen die Zuverlässigkeit des Nachweises abzuwägen.
  • Das Problem der Überlappung zwischen den Spektren der unterschiedlichen Marker wird dann angemessen vermieden. Dies wird schematisch in Tabelle A gezeigt. Tabelle A – Alternatives Verteilungsschema von Marker und Längen von Sonden
    Länge Gruppe 1 – Marker 1 Gruppe 2 – Marker 2 Gruppe 3 – Marker 3 Gruppe 4 – Marker 4
    N G1A11 G3A11
    N+1 G2A11 G4A11
    N+2 G1A12 G3A12
    N+3 G2A12 G4A12
    N+4
    N+5 G1A21 G3A21
    N+6 G2A21 G4A21
    N+7 G1A22 G3A22
    N+8 G2A22 G4A22
    N+9
    N+10 G1A31 G3A31
    N+11 G2A31 G4A31
    N+12 G1A32 G3A32
    N+13 G2A32 G4A32
    N+14
    N+15 G1A41 G3A41
    N+16 G2A41 G4A41
    N+17 G1A42 G3A42
    N+18 G2A42 G4A42
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird zwischen den Amplicons innerhalb einer Gruppe ein Längenunterschied von alternierenden zwei oder drei Nukleotiden zur Verfügung gestellt, d. h. 0, 2, 5, 7, 10, 12, etc. Die andere Gruppe hat dann einen Längenunterschied von 1, 3, 6, 8, 11, 13, etc.
  • Zielsequenzen
  • In ihrer breitesten Definition kann die Zielsequenz jegliche Nukleotidsequenz von Interesse sein. Die Zielsequenz ist vorzugsweise eine Nukleotidsequenz, die einen Polymorphismus enthält, diesen verkörpert oder damit assoziiert ist. Der Begriff Polymorphismus hierin bezieht sich auf das Vorkommen von zwei oder mehreren genetisch bestimmten alternativen Sequenzen oder Allelen in einer Population. Ein polymorpher Marker oder eine Position ist der Locus, an dem eine Divergenz zustande kommt.
  • Bevorzugte Marker haben wenigstens zwei Allelen, die jeweils mit einer Häufigkeit von mehr als 1 % oder mehr bevorzugt mehr als 10 % oder 20 % in einer gewählten Population vorkommen. Ein polymorpher Locus kann so klein wie ein Basenpaar sein.
  • Polymorphe Marker umfassen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen, eine variable Anzahl von Tandemrepeats (VATR's), hypervariable Regionen, Minisatelliten, Dinukleotidwiederholungen, Trinukleotidwiederholungen, Tetranukleotidwiederholungen, einfache Sequenzwiederholungen und Insertionselemente wie Alu. Die erste identifizierte allele Form wird willkürlich als die Referenzform bezeichnet und die anderen allelen Formen werden als alternative oder Variantenallelen bezeichnet. Die allele Form, die am häufigsten in einer ausgewählten Population vorkommt, wird manchmal als die Wildtypform bezeichnet. Diploide Organismen können für allele Formen homozygot oder heterozygot sein. Ein dialleler Polymorphismus hat zwei Formen. Ein trialleler Polymorphismus hat drei Formen. Ein Einzelnukleotidpolymorphismus kommt an einer polymorphen Stelle zustande, die durch ein einzelnes Nukleotid besetzt ist, welches der Ort der Variation zwischen allelen Sequenzen ist. Der Position gehen üblicherweise stark konservierte Sequenzen des Allels voraus oder folgen dieser (z. B. Sequenzen, die bei weniger als 1/100 oder 1/1000 Mitgliedern der Population variieren). Ein Einzelnukleotidpolymorphismus entsteht üblicherweise durch Substitution eines Nukleotids gegen ein anderes an der polymorphen Stelle. Einzelnukleotidpolymorphismen können auch durch eine Deletion eines Nukleotids oder eine Insertion eines Nukleotids relativ zu einem Referenzallel zustande kommen. Andere Polymorphismen umfassen kleine Deletionen oder Insertionen von mehreren Nukleotiden, die als Indels bezeichnet werden. Eine bevorzugte Zielsequenz ist eine Zielsequenz, die mit einem AFLP®-Marker assoziiert ist, d. h. ein Polymorphismus, der mit AFLP® nachweisbar ist.
  • DNA
  • In der Nukleinsäureprobe können die Nukleinsäuren, die das Ziel umfassen, jegliche Nukleinsäure von Interesse sein. Obwohl die Nukleinsäuren in der Probe üblicherweise in der Form von DNA vorliegen werden, kann die Nukleotidsequenzinformation, die in der Probe enthalten ist, von jeglicher Quelle von Nukleinsäuren stammen, einschließlich z. B. von RNA, PolyA+-RNA, cDNA, genomischer DNA, Organellen-DNA wie mitochondrialer oder Chloroplasten-DNA, synthetischen Nukleinsäuren, DNA-Bibliotheken, Klonbänken und jeglicher Auswahl oder Kombinationen davon. Die DNA in der Nukleinsäureprobe kann doppelsträngig, einzelsträngig oder doppelsträngige DNA sein, die in einzelsträngige DNA denaturiert ist. Die Denaturierung doppelsträngiger Sequenzen ergibt zwei einzelsträngige Fragmente, von denen eines oder beide durch Sonden analysiert werden können, die für die jeweiligen Stränge spezifisch sind. Bevorzugte Nukleinsäureproben umfassen Zielsequenzen auf cDNA, genomischer DNA, Restriktionsfragmenten, adapterligierten Restriktionsfragmenten, amplifizierten adapterligierten Restriktionsfrag menten, AFLP-Fragmenten oder Fragmenten, die in einer AFLP-Template-Voramplifikation erhalten wurden.
  • Proben
  • Es ist bevorzugt, dass eine Probe zwei oder mehrere unterschiedliche Zielsequenzen enthält, d. h. zwei oder mehrere bezieht sich auf die Identität anstatt auf die Menge der Zielsequenzen in der Probe. Insbesondere umfasst die Probe wenigstens zwei unterschiedliche Zielsequenzen, insbesondere wenigstens 10, vorzugsweise wenigstens 25, mehr bevorzugt wenigstens 50, besonders bevorzugt wenigstens 100, vorzugsweise wenigstens 250, mehr bevorzugt wenigstens 500 und am meisten bevorzugt wenigstens 1000 zusätzliche Zielsequenzen. In der Praxis ist die Anzahl der Zielsequenzen unter anderem durch die Zahl der ligierten zirkulären Sonden beschränkt. Zum Beispiel können zu viele unterschiedliche Oligonukleotidsonden in einer Probe die Zuverlässigkeit des Multiplexamplifikationsschrittes korrumpieren.
  • Eine weitere Beschränkung wird z. B. durch die Anzahl der Fragmente in einer Probe gebildet, die durch die elektrophoretische Vorrichtung mit einer Injektion aufgelöst werden können. Die Anzahl kann auch durch die Genomgröße des Organismus oder die Komplexität des Transkriptoms eines jeweiligen Zelltyps beschränkt sein, aus dem jeweils die DNA- oder cDNA-Probe abgeleitet ist.
  • Mehrfachinfektion
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden, um zu einem Verfahren im Hochdurchsatzformat mit einer Vielzahl von Proben zu gelangen, eine Anzahl von Proben ähnlich behandelt, um dadurch eine Vielzahl amplifizierter Nachweisproben zu generieren, die dann auf einer Mehrkanalvorrichtung analysiert werden können, die wenigstens in der Lage ist, die Marker und/oder Längenunterschiede nachzuweisen. Geeignete Vorrichtungen werden hierin beschrieben.
  • Um den Durchsatz auf den elektrophoretischen Plattformen zu erhöhen, wurden Verfahren entwickelt, die in dieser Anmeldung beschrieben werden und die üblicherweise als Mehrfachinjektion dargestellt werden. Durch das Injizieren mehrerer Proben, die Fragmente von diskreten, festgelegten Längen enthalten, in die gleiche elektrophoretische Matrix und/oder in kurz aufeinander folgende Läufe kann der Durchsatz erhöht werden. Alle nachweisbaren Fragmente haben vorzugsweise eine Länge innerhalb einer spezifischen Spannbreite und nur eine begrenzte Anzahl von Fragmenten kann in einer Probe nachgewiesen werden, wodurch der Vorteil einer selektiven Amplifikation zur Verringerung des Multiplexverhältnisses durch die Auswahl einer Untergruppe der ligierten Sonden in dem Amplifikationsschritt zustande kommt, was in einer Untergruppe von Amplicons resultiert.
  • Die Schritte (a) bis (e) des Verfahrens der Erfindung können mit zwei oder mehreren Nukleinsäureproben durchgeführt werden, die jeweils zwei oder mehrere unterschiedliche Zielnukleinsäuren enthalten, um zwei oder mehrere amplifizierte Proben herzustellen, in denen das Vorhandensein oder das Fehlen von Amplicons analysiert wird.
  • Die Multiplexanalyse der amplifizierten Proben nach dem Verfahren der Erfindung umfasst das Auftragen wenigstens eines Teils einer amplifizierten Probe auf eine elektrophoretische Vorrichtung zur anschließenden Trennung und zum Nachweis. Vorzugsweise enthält eine solche amplifizierte Probe amplifizierte ligierte Sonden, oder es wird zumindest angenommen, dass sie diese enthält, was ein Anzeichen ist, dass eine Zielsequenz mit den bereitgestellten Oligonukleotidsonden hybridisiert hat und dass diese Sonden benachbart an die komplementäre Zielsequenz gebunden haben, so dass sie verbunden wurden, d. h. ligiert wurden. Anschließend wird eine amplifizierte Probe einem Trennungsschritt für einen ausgewählten Zeitraum ausgesetzt, bevor eine weitere amplifizierte Probe eingesetzt wird.
  • In dem Verfahren der Erfindung werden (Teile von) zwei oder mehrere unterschiedliche amplifizierte Proben gleichzeitig auf den gleichen Kanal der elektrophoretischen Vorrichtung aufgetragen (8). Abhängig von den Bedingungen der Elektrophorese ist der Zeitraum (23) zwischen zwei (oder mehreren) hintereinander aufgetragenen amplifizierten Proben derart, dass die am langsamsten wandernde amplifizierte ligierte Sonde (19) in einer amplifizierten Probe am Nachweispunkt (24) nachgewiesen wird, bevor die am schnellsten wandernde amplifizierte ligierte Sonde einer anschließend aufgetragenen amplifizierten Probe an dem Nachweispunkt (24) nachgewiesen wird. Somit werden die Zeitintervalle zwischen aufeinander folgenden Mehrfachinjektionen in einen Kanal der Vorrichtung derart gewählt, dass hintereinander aufgetragene Proben nach der Trennung nicht am Punkt des Nachweises überlappen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren der Erfindung zusätzlich die folgenden Schritte:
    • (e1) die Wiederholung der Schritte (a) bis (e) zur Generierung von wenigstens zwei amplifizierten Proben;
    • (e2) Das nacheinander Auftragen wenigstens eines Teils der amplifizierten Proben, die in den Schritten (e) und (e1) erhalten wurden, auf eine Auftragsposition eines Kanals einer elektrophoretischen Vorrichtung, das elektrophoretische Trennen der Amplicons in den amplifizierten Proben und das Nachweisen der getrennten Amplicons an einer Nachweisposition, die distal von der Auftragsposition des Kanals positioniert ist; wobei der Zeitraum zwischen dem nacheinander aufgetragenen amplifizierten Proben derart ist, dass die am langsamsten wandernden amplifizierte gebundene Sonde in einer amplifizierten Probe an der Nachweisposition nachgewiesen wird, bevor die am schnellsten wandernde amplifizierte gebundene Sonde einer danach aufgetragenen amplifizierten Probe an der Nachweisposition nachgewiesen wird.
  • Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht die Analyse einer Vielzahl von Proben mit hohem Durchsatz, die jeweils eine Vielzahl unterschiedlicher Zielsequenzen enthalten, durch die aufeinander folgende Injektion der amplifizierten Proben, die Amplicons enthalten, die den Zielsequenzen in den Proben entsprechen, in einen Kanal einer mehrkanaligen elektrophoretischen Vorrichtung wie einer Kapillarelektrophoresevorrichtung. Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht die Analyse einer Vielzahl von Zielsequenzen in einer Vielzahl von Proben auf einer Vielzahl von Kanälen, wodurch der Durchsatz der Anzahl der Proben im Vergleich zu konventionellen Verfahren für die Analyse von Nukleotidsequenzen wesentlich erhöht wird, die in einem gegebenen Zeitfenster analysiert werden können. Dieses Verfahren profitiert von Proben, die nachzuweisende Amplicons enthalten, die einen bestimmten Größenbereich aufweisen, weil dadurch der Zeitraum (23) zwischen aufeinander folgenden Injektionen im Vergleich zu Verfahren wesentlich verringert werden kann, bei denen (die Reste von) Concatameren vorhanden sind.
  • Der gewählte Zeitraum verhindert, dass nacheinander aufgetragene Proben nach der Trennung eine Überlappung von Amplicons an dem Nachweispunkt aufweisen. Der gewählte Zeitraum wird beeinflusst durch i) die Länge der Amplicons; ii) die Längenvariation in den Amplicons; und iii) die Nachweisvorrichtung und deren Betriebsbedingungen. Das Auftragen der Proben und das Trennen von nacheinander aufgetragenen Proben in dem gleichen Kanal kann wiederholt in einem oder mehreren Kanälen vorzugsweise gleichzeitig durchgeführt werden, um eine aufeinander folgende elektrophoretische Trennung von mehreren Proben in einem Kanal und/oder die gleichzeitige Analyse von mehreren Proben über mehrere Kanäle nacheinander durchzuführen. Eine grafische Darstellung davon wird in 8 wieder gegeben.
  • Der Zeitraum zwischen zwei nacheinander beladenen amplifizierten Proben kann experimentell vor dem Durchführen des Verfahrens bestimmt werden. Dieser Zeitraum wird derart ausgewählt, dass bei den gegebenen Eigenschaften einer amplifizierten Probe, insbesondere dem Unterschied in der Länge zwischen den kürzesten und den längsten Amplicons in einer amplifizierten Probe sowie den anderen experimentellen Faktoren wie dem Gel (Matrix) und/oder den Pufferkonzentrationen, der Ionenstärke, etc., die Frag mente in amplifizierten Proben in einem solchen Ausmaß am Nachweispunkt getrennt werden, welcher am gegenüber liegenden Ende (distal) von der Auftragungsposition lokalisiert ist, wo die Probe aufgetragen wurde, dass die unterschiedlichen Amplicons in einer Probe einzeln nachgewiesen werden können. Nach dem Auftragen der letzten amplifizierten Probe kann die Trennung für einen zusätzlichen Zeitraum durchgeführt werden, um es den Amplicons der letzten Probe zu ermöglichen, getrennt und nachgewiesen zu werden. Die Kombination des gewählten Zeitraums zwischen dem Auftragen von zwei aufeinander folgenden Proben und dem optionalen zusätzlichen Zeitraum wird derart gewählt, dass an der Nachweisposition die unterschiedlichen Amplicons in nacheinander aufgetragenen Proben derart getrennt werden, dass sie einzeln nachgewiesen werden können und zwar trotz der eingeschränkten Längenvariation, die zwischen unterschiedlichen Amplicons innerhalb einer einzelnen Probe existiert. So werden überlappende Wanderungsmuster verhindert, wenn Proben, die Fragmente von verschiedenen Längen enthalten, nacheinander auf die elektrophoretische Vorrichtung aufgetragen (injiziert) werden.
  • Unter Verwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung ist es im Prinzip möglich und bevorzugt, Proben kontinuierlich aufzutragen, zu laden oder zu injizieren. Vorzugsweise ist die Vorrichtung in der Lage, solch einen Betrieb automatisch durchzuführen, z. B. durch einen programmierbaren Computer gesteuert. Vorzugsweise ist die Mehrkanalvorrichtung für solch einen Betrieb geeignet oder wenigstens für eine längere Durchführung ohne Wartung, wie das Ersetzen von Puffern, Teilen, etc., ausgestattet. Jedoch wird dies in der Praxis im Allgemeinen nicht der Fall sein. Wenn eine letzte Probe eingesetzt wird, ist es im Allgemeinen notwendig, die Trennung für einen zusätzlichen Zeitraum weiterzuführen, bis das letzte Fragment der letzten Probe nachgewiesen wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Füllsequenzen, die in den Tags der Oligonukleotidsonden vorhanden sind, verwendet, um die Längenunterschiede (d. h. 0 bis 500 Nukleotide, Basen oder Basenpaare) zwischen den amplifizierten ligierten Sonden zur Verfügung zu stellen. Die Gesamtlänge des Amplicons und die Variation in der Länge bestimmt sich hauptsächlich durch die Techniken, durch die diese Fragmente analysiert werden. In dem Mehrfachinjektionsverfahren mit hohem Durchsatz der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass der Bereich der Längen der Amplicons in einer amplifizierten Probe eine untere Grenze von 40, 60, 80 oder 100 und eine obere Grenze von 120, 140, 160 oder 180 Nukleotiden, Basen oder Basenpaaren für konventionelle (Kapillar-)Elektrophoreseplattformen hat. Es ist besonders bevorzugt, dass der Bereich der Längen der Amplicons von 100 bis 140 Nukleotide variiert. Jedoch sind diese Zahlen stark auf die derzeitigen Beschränkungen der zurzeit bekannten Techniken bezogen. Basierend auf dem Wissen, dass durch diese Erfindung zur Verfügung gestellt wird, ist der Fachmann in der Lage, diese Parameter anzupassen, wenn sich andere Umstände ergeben.
  • Die Zuverlässigkeit der Multiplexamplifikation wird weiter durch die Beschränkung der Variation in der Länge der amplifizierten ligierten Sonden verbessert. Beschränkungen in der Längenvariation der Amplicons sind bevorzugt, um die Mehrfachinjektion effizienter zu nutzen und dies resultiert zusätzlich in einer Reduktion der bevorzugten Amplifikation von kleineren Amplicons in einer kompetitiven Amplifikationsreaktion mit größeren ligierten Sonden. Dies verbessert die Zuverlässigkeit des Hochdurchsatzverfahrens der vorliegenden Erfindung. Zusammen mit dem Mehrfachinjektionsprotokoll, wie es hierin offenbart wird, sorgen diese Maßnahmen allein oder in Kombination für eine deutliche Erhöhung in dem Durchsatz im Vergleich zum Stand der Technik. Eine weitere Verbesserung der Hochdurchsatzkapazität wird durch die Beschränkung der Anzahl unterschiedlicher Amplicons in einer Probe erhalten. Es wird als effizienter und ökonomischer angesehen, die Multiplexkapazität des Ligations-/Amplifikationsschrittes in Kombination mit der Einführung eines Mehrfachinjektionsprotokolls zu beschränken. Einer der vorteilhaftesten Aspekte der vorliegenden Erfindung liegt in der Kombination der Multiplexligation, der Multiplexamplifikation, vorzugsweise mit einem einzelnen Primerpaar oder mit mehreren Primerpaaren, die jeweils mehrere ligierte Sonden amplifizieren, der wiederholten Injektion und des Multiplexnachweises von unterschiedlichen Markern. Einer der zusätzlichen vorteilhaften Aspekte der vorliegenden Erfindung liegt in einer kombinierten Anwendung von Längenunterschieden mit unterschiedlichen (überlappenden) Markern, so dass jede ligierte Sonde und somit jede Zielsequenz innerhalb einer Probe durch eine einzigartige Kombination von Länge und Marker charakterisiert werden kann. Dies ermöglicht eine wesentliche Verbesserung der Effizienz der Analyse der Zielsequenzen sowie eine wesentliche Verringerung der Kosten für jedes analysierte Ziel.
  • Das Mehrfachinjektionsprotokoll kann auf verschiedene Weisen durchgeführt werden. Eine von diesen ist die Mehrfachbeladung von zwei oder mehreren Proben in die gleiche Matrix. Dieses wird als vorteilhaft angesehen, weil die Matrix bei der Durchführung aufeinander folgender kurzer Läufe erneut verwendet wird, wodurch die Effizienz und der Durchsatz erhöht werden. Ein anderer Vorteil ist die Mehrfachbeladung von zwei oder mehreren Proben in die gleiche Probenmatrix in dem gleichen Lauf. Es ist bevorzugt, die Matrix bei der Durchführung kurz aufeinander folgender Läufe erneut zu verwenden. In dieser Ausführungsform wird eine erste Probe injiziert und getrennt. Sobald das letzte Fragment nachgewiesen ist, wird die nächste Probe geladen. Vorzugsweise wird die Matrix zwischen zwei aufeinander folgenden kurzen Läufen nicht ersetzt, so dass die Läufe auf der gleichen Matrix durchgeführt werden. Dieses stellt eine zusätzliche Effizienz und verbesserte Ökonomie zur Verfügung, weil weniger Änderungen an der Matrix zustande kommen müssen, was die Menge an Verbrauchsmaterialien für diesen Analysentyp verringert (d. h. Puffer, etc.), und die Kosten pro Datenpunkt verringert. Zusätzlich können zeitaufwändige Ersatzmaßnahmen der Matrix im größeren Umfang vermieden werden, was die Effizienz des Verfahrens weiter erhöht.
  • Als solche wurden bestimmte Aspekte der Mehrfachbeladung oder der Mehrfachinjektion inter alia in der U.S. 6,156,178 und der WO 01/04618 beschrieben. Die zuletzt genannte Veröffentlichung offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren für die verbesserte Durchsatzanalyse von kleinen Verbindungen unter Verwendung mehrerer zeitlich getrennter Injektionen. Die Veröffentlichung offenbart, dass Proben, die Primer umfassen, die um ein Nukleotid verlängert sind (Einzelnukleotidprimerverlängerung oder SnuPE, was auch als Minisequenzierung bekannt ist), unter Verwendung mehrfacher zeitlich getrennter Injektionen auf einer Kapillarelektrophoresevorrichtung nachgewiesen werden können. Die Minisequenzierung basiert auf der Bindung eines komplementären Primers an eine zuvor amplifizierte Zielsequenz. Die anschließende Verlängerung des Primers mit einem getrennt zur Verfügung gestellten markierten Nukleotid ermöglicht die Identifizierung des Nukleotids, das zu dem Primer benachbart liegt. Im Prinzip hat das Primerverlängerungsprodukt eine konstante Länge. Zur Erhöhung des Durchsatzes wird die Verwendung aufeinander folgender Injektionen von Verlängerungsprodukten der gleichen Länge pro Lauf vorgeschlagen. Um weiter den Durchsatz zu erhöhen, können Primer einer unterschiedlichen Länge verwendet werden, die sich typischerweise um 15 bis 25 Nukleotide unterscheiden. Im Gegensatz dazu schlägt die vorliegende Erfindung die Analyse von Multiplexamplifikationsprodukten selbst direkt mit einer Längenvariation, die typischerweise zwischen 50 und 150 Nukleotiden liegt, vor. Dies ist wesentlich ökonomischer als die Minisequenzierung oder SnuPE, wie es zuvor gezeigt wurde, weil mehrere Zielsequenzen in einer einzelnen Reaktion amplifiziert werden, wohingegen bei der Minisequenzierung oder SnuPE-Amplifikation dies einzeln für jede Zielsequenz durchgeführt wird. Zudem kompromittiert die Verwendung von Primer einer unterschiedlichen Länge und komplementär zu der Zielsequenz die Effizienz des nachfolgenden Amplifikationsschrittes, der in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erforderlich ist. Diese Anwendungen adressieren im Allgemeinen nicht die Probleme, die mit dem Nachweis von stark unterschiedlichen Proben im Hochdurchsatzformat assoziiert sind, noch stellen sie Lösungen dafür zur Verfügung.
  • Exonukleasen
  • Ein bevorzugtes Verfahren der Erfindung umfasst zusätzlich einen Schritt der Entfernung der Oligonukleotidsonden, die nicht an Zielsequenzen gebunden sind, und/oder die nicht gebunden/ligiert sind. Die Entfernung solcher Sonden wird vorzugsweise vor der Amplifikation durchgeführt und vorzugsweise durch den Verdau mit Exonukleasen. Durch das Entfernen/Eliminieren von diesen Oligonukleotidsonden, die nicht gebunden/ligiert sind, kann eine wesentliche Verringerung der ligationsunabhängigen (inkorrekten) Zielamplifikation erreicht werden, was in einem verbesserten Signal-/Rausch-Verhältnis resultiert. Eine Lösung zur Eliminierung einer oder mehrerer der nicht gebundenen/nicht ligierten Komponenten ohne das Entfernen des Informationsgehalts der gebundenen Sonden ist es, Exonukleasen zu verwenden, um nicht gebundene/nicht ligierte Oligonukleotidsonden zu verdauen. Blockierende Gruppen umfassen die Verwendung einer Thiophosphatgruppe und/oder die Verwendung von 2-O-Methylribosezuckergruppen in dem Gerüst. Exonukleasen umfassen Exo I (3'-5'-Aktivität), Exo III (3'-5'-Aktivität) und Exo IV (sowohl 5'-3'- wie auch 3'-5'-Aktivität). Die zirkulären Sonden der vorliegenden Erfindung sind, sobald sie ligiert sind, im Gegensatz zu den nicht ligierten zirkulären Sonden gegenüber der Exonuklease unempfindlich. Dies ist ein weiterer Vorteil der Verwendung von Padlock/Schlosssonden in der vorliegenden Erfindung.
  • Ein Vorteil der Verwendung von Exonukleasen, zum Beispiel einer Kombination von Exo I (einzelstrangspezifisch) und Exo III (doppelstrangspezifisch), ist die Fähigkeit zur Zerstörung sowohl der Zielsequenz wie auch der nicht ligierten Oligonukleotidsonden, während die Sequenzen der Ligationsprodukte im Wesentlichen unverdaut verbleiben. Durch die Verwendung einer Exonukleasebehandlung vor der Amplifikation werden die Oligonukleotidsonden in jedem Satz deutlich reduziert und somit wird die Hybridisierung der verbleibenden nicht ligierten Oligonukleotidsonden an die ursprüngliche Ziel-DNA (die auch deutlich durch Exonukleasebehandlung verringert wird) und die Bildung einer Sequenz des Ligationsproduktes, welches ein geeignetes Substrat zur PCR-Amplifikation durch den Oligonukleotidprimersatz geeignet ist, wesentlich verringert, wodurch das Signal-/Rausch-Verhältnis verbessert wird.
  • Größenleiter
  • Die Probe kann mit einem Nukleotidfragmentgrößenstandard ausgestattet werden, der ein oder mehrere Nukleotidfragmente von bekannter Länge enthält. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Nukleotidgrößenstandards sind auf dem Gebiet gut bekannt (siehe z. B. Sambrook and Russel, 2001, supra). Solch ein Größenstandard bildet die Basis für eine geeignete Größensortierung der Amplicons in der Probe und somit für die richtige Identifizierung des nachgewiesenen Fragments. Der Größenstandard wird vorzugsweise mit jeder Probe und/oder mit jeder Injektion zur Verfügung gestellt. Ein Größenstandard enthält vorzugsweise eine Reihe von Längen, die vorzugsweise den gesamten Bereich der zu analysierenden Längen umfassen. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird es als vorteilhaft angesehen, flankierende Größenstandards hinzu zu geben, aus denen die Größen der Amplicons durch Interpolation abgeleitet werden können. Ein flankierender Größenstandard ist ein Größenstandard, der wenigstens zwei markierte Oligonukleotidsequenzen enthält, von denen vorzugsweise eine eine Länge hat, die wenigstens eine Base kürzer als die kürzeste amplifizierte ligierte Sonde ist, und vorzugsweise eine, die wenigstens eine Base länger als die längste amplifizierte ligierte Sonde ist, um die Interpolation zu ermöglichen und die Einführung einer weiteren Längenvariation in die Probe zu minimieren. Ein bevorzugter flankierender Größenstandard enthält ein Polynukleotid, das ein Nukleotid kürzer als die kürzeste amplifizierte ligierte Sonde ist, und eines, das wenigstens eine Base länger als die längste amplifizierte ligierte Sonde ist, und mit wenigstens einem Farbstoff markiert ist, der identisch zu dem Marker ist, der zur Markierung der Amplicons, die in der Probe enthalten sind, identisch ist.
  • Ein einfacher Weg zur Zusammenstellung eines geeigneten Größenstandards ist durch die (maßgeschneiderte) chemische Synthese von Oligonukleotiden mit geeigneten Längen, die mit einem geeigneten Marker am Ende markiert sind. Der Größenstandard wird mit jeder nacheinander aufgetragenen Probe aufgetragen, um als lokale Größenbezugspunkte zu dienen, um die Größe der geladenen Probenfragmente zu zeigen. Der Größenstandard kann in den gleichen Kanal oder die gleiche Bahn der elektrophoretischen Vorrichtung wie die zu analysierende Probe aufgetragen werden, d. h. zusammen mit der Probe, oder er kann in einem parallelen Kanal oder einer parallelen Bahn einer Mehrkanal-/Mehrbahnvorrichtung aufgetragen werden. Der flankierende Größenstandard kann mit jeglichem der Marker markiert werden, die in dem Verfahren verwendet werden. Wenn der Größenstandard in den gleichen Kanal der Vorrichtung aufgetragen wird, werden die Fragmente des Standards vorzugsweise mit einem Marker markiert, der von den Marker unterschieden werden kann, die zum Nachweis der Amplicons in einer Probe verwendet werden.
  • Poolbildung
  • In einer Variante der Technologie wird das Ausgangs-(DNA)-material von mehreren Einzelproben vereinigt, so dass weniger Nachweisproben, die dieses Material enthalten, in die Nachweisvorrichtung geladen werden. Dies kann in dem Fall von Bindungsungleichgewicht (LD, Linkage Disequilibrium mapping) vorteilhaft sein, wenn es das Ziel ist, amplifizierte ligierte Sonden zu identifizieren (wie solche, die ENP-Allelen darstellen), die spezifisch für einen bestimmten Pool von Ausgangsproben sind, z. B. Pools von Ausgangsmaterial, das sich aus Individuen mit unterschiedlichen Phenotypen für ein bestimmtes Merkmal ableitet.
  • Anwendung
  • Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich auf die Verwendung des Verfahrens in einer Reihe von Anwendungen. Die Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung ist in Techniken wie dem Genotypisieren, der Transkriptprofilierung, Genkartierung, Genentckung, Marker-unterstützter Selektion, Saatqualitätskontrolle, Hybridauswahl, QTL-Kartierung, Massensegregationsanalyse, DNA-Fingerabdruckbildung und der Mikrosatellitenanalyse zu finden, nicht aber darauf beschränkt. Ein anderer Aspekt bezieht sich auf den gleichzeitigen Nachweis der quantitativen Häufigkeit von Zielnukleinsäuresequenzen im Hochdurchsatzformat. Dieser Ansatz ist üblicherweise als Massensegretionsanalyse (BSA Bulk Segregant Analysis) bekannt.
  • Nachweis von Einzelnukleotidpolymorphismen
  • Eine besonders bevorzugte Anwendung des Hochdurchsatzverfahrens gemäß der Erfindung liegt in dem Nachweis von Einzelnukleotidpolymorphismen (ENPs oder SNPs – single nucleotide polymorphisms). Ein erster zielkomplementärer Teil der zirkulären Oligonukleotidsonden ist vorzugsweise benachbart zu der polymorphen Position lokalisiert, d. h. zu dem einzelnen polymorphen Nukleotid. Ein zweiter zum Ziel komplementärer Teil ist so konstruiert, dass dessen endständige Base an der polymorphen Stelle positioniert ist, d. h. er ist zu dem einzelnen polymorphen Nukleotid komplementär. Wenn die endständige Base zu dem Nukleotid komplementär ist, das an der polymorphen Position in einer Zielsequenz vorhanden ist, dann wird sie an die Zielsequenz binden und in der Ligation der zwei zielkomplementären Teile resultieren. Wenn das endständige Nukleotid, d. h. das allelspezifische Nukleotid, nicht passt, dann wird keine Ligation oder nur eine geringe Ligation zustande kommen und der Polymorphismus wird unentdeckt bleiben.
  • Wenn eine der Zielsequenzen in einer Probe aus einem Einzelnukleotidpolymorphismus (ENP) abgeleitet ist oder diesen enthält, können zusätzlich zu den Sonden, die spezifisch für dieses Allel sind, weitere Sonden zur Verfügung gestellt werden, die nicht nur die Identifizierung des Allels ermöglichen, sondern auch die Identifizierung von jedem der möglichen Allelen des ENPs (codominierende Auswertung). Diesbezüglich kann eine Kombination von zielkomplementären Teilen zur Verfügung gestellt werden:
    Ein komplementärer Teil, der der gleiche für alle betroffenen Allelen ist, und einer oder mehrere der anderen komplementären Teile, die für jedes der möglichen Allelen spezifisch sind. Dieser eine oder die mehreren anderen Typen der komplementären Teile enthalten im Wesentlichen die gleiche komplementäre Sequenz, unterscheiden sich aber dadurch, dass sie jeder ein Nukleotid enthalten, vorzugsweise an dem Ende, das dem spezifischen Allel entspricht. Der allelspezifische Teil kann in einer Zahl zur Verfügung gestellt werden, die der Zahl der unterschiedlichen erwarteten Allelen entspricht. Das Ergebnis ist, dass ein ENP durch die Kombination eines komplementären Teils mit vier anderen (allelspezifischen) komplementären Teilen unter Identifizierung aller vier theoretisch möglichen Allelen (jeweils einer für A, T, C und G) durch die Aufnahme von Füllsequenzen von unterschiedlichen Längen (bevorzugt) oder unterschiedlichen Markern in die allelspezifischen Sonden charakterisiert werden kann.
  • In einer besonderen Ausführungsform, die vorzugsweise auf die Identifizierung von Einzelnukleotidpolymorphismen gerichtet ist, ist der erste komplementäre Teil der Oligonukleotidsonde auf einen Teil der Zielsequenz gerichtet, der die polymorphe Stelle nicht enthält, und der zweite komplementäre Teil der Oligonukleotidsonde enthält, vorzugsweise an dem distalen Ende vom ersten komplementären Teil, ein oder mehrere Nukleotide, die komplementär zu der polymorphen Stelle von Interesse sind. Nach der Ligierung der benachbarten Teile ist die so gebundene Probe spezifisch für eines der Allelen eines Einzelnukleotidpolymorphismus.
  • Zur Identifizierung des Allels der polymorphen Stelle in der Zielsequenz kann ein Satz von Oligonukleotidsonden zur Verfügung gestellt werden, in dem ein erster komplementärer Teil sowie ein oder mehrere zweite komplementäre Teile zur Verfügung gestellt werden. Jeder zweite komplementäre Teil enthält dann ein spezifisches Nukleotid an dem Ende der komplementären Sequenz, vorzugsweise an dem 3'-Ende, in Kombination mit einer bekannten Länge der Füllsequenz. Zum Beispiel kann in dem Fall eines A/C-Polymorphismus der zweite komplementäre Teil ein spezifisches Nukleotid T in Kombination mit einer Fülllänge von 2 Nukleotiden enthalten, und ein anderer zweiter komplementärer Teil für diesen Polymorphismus kombiniert G mit einer Fülllänge von 0. Weil die Primer und die komplementären Teile der Sonden vorzugsweise die gleiche Länge aufweisen, stellt dieses einen Längenunterschied der resultierenden Amplicons von 2 Nukleotiden zur Verfügung. In dem Fall des Vorhandenseins und/oder des Fehlens aller vier theoretisch möglichen Nukleotide der polymorphen Position, ist es erwünscht, dass die Füllsequenz-spezifische Nukleotidkombination entsprechend angepasst wird. In einer Probe, die mehrere Zielsequenzen enthält, die mit dem gleichen Paar von Amplifikationsprimern amplifiziert (und somit markiert) sind oder mit mehreren Paaren von Amplifikationsprimern mit Markern amplifiziert sind, die überlappende Emissionsspektren haben, werden die kombinierten Fülllängen so gewählt, dass alle ligierten Sonden eine einzigartige Länge aufweisen. In 4 wird eine Darstellung dieses Prinzips für zwei Loci und für jeden Locus mit zwei Allelen zur Verfügung gestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform kann dieses Prinzip auf wenigstens zehn Loci mit wenigstens zwei Allelen pro Locus erweitert werden.
  • Nachweis der spezifischen Zielsequenz
  • Die Zielsequenz enthält eine bekannte Nukleotidsequenz, die aus einem Genom abgeleitet ist. Solch eine Sequenz enthält nicht notwendigerweise einen Polymorphismus, ist aber zum Beispiel für ein Gen, einen Promoter, ein Introgressionssegment oder ein Transgen spezifisch oder enthält Information für ein Produktmerkmal, eine Krankheitsresistenz, Ausbeute, Hybridvitalität, ist ein Anzeichen für Tumore oder andere Erkrankungen und/oder eine Genfunktion in Menschen, Tieren oder Pflanzen. Diesbezüglich sind die ersten und zweiten komplementären Teile der zirkulären Sonde so konstruiert, um einer vorzugsweise einzigartigen Zielsequenz in dem Genom, die mit der gewünschten Information assoziiert ist, zu entsprechen. Die komplementären Teile in der Zielsequenz sind benachbart zueinander positioniert. In dem Fall, dass die gewünschte Zielsequenz in der Probe vorhanden ist, werden zwei Sonden benachbart gebunden und können nach der Ligation und Amplifikation nachgewiesen werden.
  • Nachweis von AFLP-Markern
  • AFLP, dessen Anwendung und Technologie wird in Vos et al., Nucleic Acids Research, Bd. 23, (1995), 4407–4414 sowie in der EP A 0 534 858 und in der U.S. 6,045,994 beschrieben, die hierin alle durch Bezugnahme aufgenommen werden. Für eine weitere Beschreibung von AFLP, dessen Vorteile, dessen Ausführungsformen, dessen Techniken, Enzyme, Adaptoren, Primer und weitere Verbindungen, Werkzeuge und verwendete Definitionen wird explizit auf die relevanten Passagen der hier zuvor genannten Publikationen Bezug genommen, die sich auf AFLP beziehen. AFLP und dessen verwandte Technologie ist eine mächtige DNA-Fingerabdrucktechnik zur Identifizierung von zum Beispiel spezifischen Genmarkern (so genannten AFLP-Marker), die das Vorhandensein bestimmter Gene oder genetischer Merkmale anzeigen können oder im Allgemeinen zum Vergleich von DNA-, cDNA- oder RNA-Proben von bekanntem Ursprung oder Restriktionsmuster verwendet werden. AFLP-Marker sind im Allgemeinen mit dem Vorhandensein von polymorphen Stellen in einer zu analysierenden Nukleotidsequenz assoziiert. Solch ein Polymorphismus kann an der Restriktions schnittstelle, in den selektiven Nukleotiden, zum Beispiel in der Form von Indels oder Substitutionen oder in dem Rest des Restriktionsfragments, zum Beispiel in der Form von Indels oder Substitutionen vorhanden sein. Sobald ein AFLP-Marker als solcher identifiziert ist, kann der Polymorphismus, der mit dem AFLP-Marker assoziiert ist, identifiziert werden, und es können Sonden zur Verwendung in dem Ligationsassay der vorliegenden Erfindung entwickelt werden.
  • In einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine zirkuläre Nukleinsäuresonde, die einen ersten und einen zweiten Teil umfasst, der in der Lage ist, an korrespondierende Teile einer Zielsequenz zu hybridisieren, und zusätzlich wenigstens eine, vorzugsweise zwei Primerbindungssequenzen und eine Füllsequenz umfasst. Weitere Ausführungsformen der Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung sind so, wie es hierin oben beschrieben wird. Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Satz von Sonden, der zwei oder mehrere Sonden enthält, wobei jede Sonde einen ersten Teil und einen zweiten Teil umfasst, der komplementär zu einem Teil einer Zielsequenz ist, und wobei die komplementären ersten und zweiten Teile im Wesentlichen benachbart zueinander positioniert sind, wenn sie an die Zielsequenz hybridisiert sind, und wobei jede Sonde zusätzlich eine Füllsequenz umfasst, wobei die Füllsequenz im Wesentlichen benachbart zu dem komplementären Teil positioniert ist, und wenigstens eine, vorzugsweise zwei Primerbindungssequenzen im Wesentlichen benachbart zu der Füllsequenz positioniert sind.
  • Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die Verwendung einer zirkulären Sonde oder eines Satzes von Sonden in der Analyse von wenigstens einer Nukleotidsequenz und vorzugsweise für den Nachweis eines Einzelnukleotidpolymorphismus, wobei dieser Satz zusätzlich wenigstens eine zusätzliche Sonde umfasst, die ein Nukleotid enthält, das komplementär zu dem bekannten ENP-Allel ist. Vorzugsweise umfasst der Satz eine Sonde für jedes Allel eines spezifischen Einzelnukleotidpolymorphismus. Die Verwendung eines Satzes von Sonden ist zudem in einem Verfahren für den Nachweis von Einzelnukleotidpolymorphismen im Hochdurchsatzformat bevorzugt, bei dem die Länge der Füllsequenz in der Sonde spezifisch für einen Locus und/oder ein Allel eines Einzelnukleotidpolymorphismus ist.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Primer und insbesondere einen Satz von Primern, der einen ersten Primer und einen oder mehrere zweite Primer umfasst, wobei jeder zweite Primer einen Marker enthält, und jeder zweite Primer eine Nukleotidsequenz enthält, die spezifisch für den Marker ist.
  • Die vorliegende Erfindung hat auch Ausführungsformen in der Form von Kits. Kits gemäß dieser Erfindung sind zum Beispiel Kits, die Sonden umfassen, die zur Verwendung in dem Verfahren geeignet sind, sowie Kits, die Primer umfassen, zudem ein Kombinationskit, der Primer und Sonden umfasst, wobei vorzugsweise alle mit Enzymen, Puffern, etc. ausgestattet sind.
  • Die Effizienz der vorliegenden Erfindung kann wie folgt dargestellt werden. Wenn eine kapillarelektrophoretische Vorrichtung mit 96 Kanälen, und die in der Lage ist, vier Marker gleichzeitig nachzuweisen, verwendet wird, was 12 aufeinander folgende Injektionen pro Lauf pro Kanal mit einem empirisch optimierten minimalen ausgewählten Zeitraum zwischen den Injektionen ermöglicht, dann ermöglicht eine Probe, die 20 Zielsequenzen von Interesse enthält, den Nachweis von 96 (Kanälen) × 12 (Injektionen) × 20 (Zielsequenzen) × 4 (Marker) = 92160 Zielsequenzen als Hochdurchsatzformat unter Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung. In dem Fall eines ko-dominanten ENP-Nachweises können Daten, die 46080 ENPs betreffen, in einem einzigen Lauf nachgewiesen werden.
  • Beschreibung der Figuren:
  • Diese Erfindung wird durch die beigefügten Figuren illustriert. In den Figuren werden viele der Merkmale der Erfindung unter Verwendung von zwei linearen Sonden gezeigt, die benachbart zueinander hybridisieren. Der Fachmann wird zu schätzen wissen, dass die meisten dieser Merkmale auch auf andere Ausführungsformen, die hierin offenbart werden, anwendbar sind, wie die zirkulären Sonden, und wie man diese Merkmale in die anderen Ausführungsformen, wie die zirkulären Sonden, basierend auf der in dieser Anmeldung zur Verfügung gestellten Information aufnimmt.
  • 1: Schematische Darstellung des Oligonukleotid-Ligations-Amplifikations-Assays, der in amplifizierten ligierten Sonden resultiert.
  • Eine Zielsequenz (2), umfassend einen ersten (5) und einen zweiten (7) Teil, an die erste und zweite Sonden mit den Abschnitten (4) und (6) hybridisiert werden können, die jeweils komplementär zueinander sind. Die Sonden enthalten eine Tag-Sequenz (8, 9), die zu der Zielsequenz nicht komplementär ist. Die Tag-Sequenz kann eine Füllsequenz (10, 11) und eine Primerbindungsstelle (12, 13) enthalten. Nach der Sondenhybridisierung und Ligierung kann die ligierte Sonde (15) unter Verwendung von Primern (16, 17) amplifiziert werden, die in der Lage sind, an die korrespondierenden Primerbindungsstellen zu hybridisieren. Wenigstens einer der Primer enthält einen Marker (L). Die Amplifikation resultiert in einer amplifizierten Probe, die Amplicons (20) enthält.
  • 2: Schematische Darstellung von zwei ligierten Sonden, wobei (a) nur eine Sonde eine Füllsequenz (10) sowie Primerbindungssequenzen (12, 13) enthält; und (b) beide Sonden eine Füllsequenz (10, 11) und Primerbindungssequenzen (12, 13) enthalten.
  • 3: Schematische Darstellung einer besonderen Kombination von unterschiedlichen Längen und Marker mit einem schematischen Elutionsprofil in einem Kanal einer Vorrichtung mit mehreren Kanälen.
  • 4: Schematische Darstellung des Oligonukleotidligations-ligationsassays der vorliegenden Erfindung. Das Prinzip wird für zwei Loci 1 und 2 und für jeden Locus für zwei Allelen nur aus Gründen der Einfachheit dargestellt, kann aber leicht auf wenigstens 10 Loci mit jeweils zwei Allelen erweitert werden. Der Primersatz besteht aus einem ersten Primer (durchgezogene, fett gedruckte Linie) und einem zweiten Primer (gestrichelte, fettgedruckte Linie). Die theoretisch möglichen ligierten Sonden werden schematisch zusammen mit den Primern dargestellt. Die ligierten Sonden unterscheiden sich in der Länge.
  • 5: Schematische Darstellung des Oligonukleotidligations-ligationsassays der vorliegenden Erfindung. Das Prinzip wird für zwei Loci 3 und 4 und für jeden Locus mit mit zwei Allelen dargestellt. Der Primersatz besteht aus einem ersten Primer und zwei zweiten Primern. Die theoretisch möglichen ligierten Sonden werden schematisch zusammen mit den Primern dargestellt. Die ligierten Sonden unterscheiden sich in der Länge und in dem Marker.
  • 6: Schematische Darstellung der Ergebnisse einer Probe, die 80 amplifizierte ligierte Sonden enthält, mit:
    • – einem Längenunterschied zwischen 135 Basenpaaren (Bp) bis 97 Bp für die amplifizierten ligierten Sonden mit einer ungeraden Länge und mit Marker 1 und Marker 3 markiert; und
    • – einem Längenunterschied zwischen 134 Bp und 96 Bp für die amplifizierten ligierten Sonden mit einer geraden Länge und mit Marker 2 und Marker 4 markiert; und
    • – einer flankierenden Größenleiter mit Oligonukleotiden von 94/95 und 136/137 (Bp), die die Marker 1, 2, 3 oder 4 tragen.
  • 7: Schematische Darstellung des Trennprofils in einem Kanal, wobei eine Probe eingesetzt wird, die mehrere amplifizierte ligierte Sonden enthält, die mit Marker 1, 2, 3 und 4 markiert sind. Die mehreren markierten, amplifizierten, ligierten Sonden werden nachweisbar am Nachweispunkt getrennt.
  • 8: Schematische Darstellung der mehrfachen Injektion von Proben in einen Kanal mit einer grafischen Darstellung des gewählten Zeitraums (23) zwischen der Injektion von aufeinander folgenden Proben und dem zusätzlichen Zeitraum (25) nach dem Auftragen der letzten Probe.
  • 9: Schematische Darstellung der Ligation von bis zu 40 Loci und der anschließenden Amplifizierungs- und Nachweisphase des Verfahrens. Abhängig von der Komplexizität und der Anzahl der zu analysierenden Loci werden die Punkte in dem Verfahren, bei denen ein Vereinigen vorgesehen ist, als ein optionales (getricheltes) Merkmal gezeigt. Die Amplifikation wird hier unter Verwendung eines Vorwärtsprimers (vorwärts) und eines (unterschiedlich markierten) Rückwärtsprimers für jeden Marker (rückwärts 1, 2, 3, 4) durchgeführt. Wenn die Ligations-(Sub-)Proben vereinigt werden, dann gibt es im Prinzip zwei Optionen zur Amplifikation. Wenn zum Beispiel vor oder nach der Ligation (Sub-)Proben, die aus den Loci 1–10 abgeleitet sind, mit (Sub-)Proben, die aus Loci 11–20 abgeleitet sind, vereinigt werden, dann können die vereinigten (Sub-)Proben mit dem Vorwärtsprimern und den Rückwärtsprimern 1 und 2 in einem Schritt oder in zwei Schritten, zuerst mit Vorwärts und Rückwärts 1, gefolgt durch Vorwärts und Rückwärts 2 oder umgekehrt amplifiziert werden. Der Nachweis kann auch in einer ähnlichen Weise unter Nachweis beider Marker gleichzeitig oder des Markers 1, gefolgt durch Marker 2, optional durch Doppelinjektion durchgeführt werden.
  • 10: Ein Gel eines Multiplexoligonukleotidligationsassays von 12 ENPs aus dem Ecotyp Colombia, dem Ecotyp Landsberg erecta und einer 50/50-Mischung der Ecotypen Colombia und Landsberg erecta.
  • 11A: Teilweises Elektropherogramm des FAM-markierten Nachweises der Colombia-Probe auf einer Vorrichtung zur Kapillarelektrophorese (MEGABace). Es wurde die gleiche Multiplexmischung injiziert. Die amplifizierten ligierten Sonden in einem Größenbereich von 97–134 Bp und die flankierenden Größenfragmente (als S bezeichnet) sind 94, 95 und 137 Bp. Die Sonden und Größenfragmente sind alle mit FAM markiert.
  • 11B. Teilweises Elektropherogramm des FAM-markierten Nachweises der Probe Landsberg erecta auf einer Vorrichtung zur Kapillarelektrophorese (MEGABace). Es wurde die gleiche Multiplexmischung injiziert. Die amplifizierten ligierten Sonden in einem Größenbereich von 97–134 Bp und die flankierenden Größenfragmente (als S bezeichnet) sind 94, 95 und 137 Bp. Die Sonden und Größenfragmente sind alle mit FAM markiert.
  • 12A: Grobspurendatei einer Probe, die ein mit ET-ROX-markiertes Fragment von 120 Bp und ein mit NED-markiertes Fragment von 124 Bp enthält. Es wird auf die FAM- und JOE-Marker der anderen markierten Fragmente mit der gleichen Länge in der Probe hingewiesen. FAM und JOE haben überlappende Fluoreszenzspektren (ET-ROX und FAM, JOE und NED), was in überlappenden Signalen (Überlappung) mit Sequenzen von gleicher Länge resultiert.
  • 12B: Mathematische Überlappungskorrektur, die zu einem verarbeiteten um die Überlappung korrigierten Datensatz führt. Die Überlappung wird verringert, es bleiben aber Reste der überlappenden Spektren (FAM, JOE), was in falschen positiven (oder negativen) Signalen resultiert.
  • 12C, D, E, F: Einzelmarkierungsdiagramme illustrieren im Vergleich zu den positiven Signalen (C, F) das Vorhandensein von Resten (D, E) der mathematischen Korrektur.
  • 13A: Darstellung der Wirkung der unvollständigen Entfernung von Überlappungen eines ET-ROX-Fragments mit 120 Bp und eines NED-Fragments mit 124 Bp, was in inkorrekt bewerteten Daten im Vergleich zu den theoretisch erwarteten Daten resultiert.
  • 13B: Darstellung der Wirkung der Verwendung einer Überlappungskorrektur durch Längen-Marker-Kombinationen. Bewertete Daten und erwartete Daten werden korrekt interpretiert und falsche positive oder falsche negative Daten werden eliminiert.
  • 14: Darstellung einer zirkulären Sonde mit Primerbindungsstellen, Primern und einem optionalen blockierenden Abschnitt und deren relative Positionierung in der zirkulären Sonde. Nach der Amplifikation werden Amplicons gebildet, die Verkörperungen der zirkulären Sonde sind.
  • 15: Darstellung der Konstruktion der ausgewählten oder verschachtelten Primer, die in der selektiven Amplifikation einer Probe von ligierten zirkulären Sonden verwendet werden. Die ligierte zirkuläre Sonde wird schematisch mit einer Primerbindungsstelle und benachbarten Nukleotiden, die als N bezeichnet werden, gezeichnet. Für einen 24-fachen Ligationsassay wird die selektive Amplifikation mit einem selektiven Nukleotid verwendet, um die Reduktion auf 6-fache Amplifikations- und Nachweisassays zu visualisieren.
  • 16: Amplifikation eines 10-fachen Ligationsprodukts von Satz 4 auf Probe 2 mit Primer Eook+T5'-JOE. Es wird das Signal des JOE-Kanals gezeigt.
    • A. Überlappung in dem NED-Kanal, die durch die Amplifikation der 10-fachen Ligation von Satz 4 auf Probe 2 mit Primer Eook+T5'-JOE (siehe A) ausgelöst wird. Das NED-Signal wurde weggelassen.
    • B. Signal in dem NED-Kanal, das durch die Amplifikation mit Primer Eook+T5'-JOE und einer NED-markierten E00k-Amplifikation einer 10-fachen Ligation von Satz 4 auf Probe 2 ausgelöst wird (siehe A). Weil sich das 5'+T E00k-JOE-Signal in NED sich um 1 Bp unterscheidet, können diese beiden Spitzen unterschieden werden. X bedeutet Überlappung des fluoreszierenden Farb-stoffes JOE in dem NED-Kanal (entspricht dem Kanal in B).
    • C. Es wurde eine Amplifikation einer 10-fachen Ligation von Satz 4 auf Probe 2 unter Verwendung eines NED-markierten E00k-Amplifikationsprimers und eines 5'+T E00k mit JOE-markierten Primers durchgeführt und die Reaktions-Produkte wurden zum Nachweis auf dem MegaBACE vereinigt. Es wird das nicht verarbeitete Signal in dem NED-Kanal gezeigt. Weil sich die mit JOE-markierten Produkte um ein Rasenpaar in der Länge unterscheiden, können die Spitzen von NED und JOE in dem NED-Kanal unterschieden werden.
    • D. Die gleichen Reaktionsprodukte, die in C gezeigt werden, aber nach der Verarbeitung der Rohdaten, d. h. nach dem Entfernen der Überlappung. Der Größenunterschied von 1 Bp der 5'T E00k JOE-Produkte verhindert eine Fehlbewertung, die durch die Überlappung des JOE-Signals in dem NED-Kanal ausgelöst wird, wie es in den 16A, B und C gezeigt wird.
  • Alle Signale von A, B, C und D werden nach der Verarbeitung durch die Software Genetic Profiler Version 1 von Molecular Dynamics erhalten. Das Signal, das in D gezeigt wird, ist auf Überlappung korrigiert und zeigt somit verarbeitete Signale. Die Signale in A, B und D sind Rohdaten und nicht auf Überlappung hin korrigiert.
  • 17:
    • A. Analyse der 5'+T JOE- und FAM-markierten E00k-Amplifikation der Ligationsprodukte des Satzes 4 für Probe 5 (Kapillare G05) und 6 (Kapillare G06). Die Laufzeit betrug 40 Minuten.
    • B. Zweite Analyse der 5'+T JOE- und FAM-markierten E00k-Amplifikation der Ligationsprodukte des Satzes 4 für Probe 5 (Kapillare G05) und 6 (Kapillare G06). Dieser Lauf wurde direkt nach dem in A gezeigten auf der gleichen Matrix durchgeführt. Die Laufzeit betrug 40 Minuten.
  • 18: Selektive Amplifikation von 3 Sätzen aus einer 40-fachen Ligation für die Sätze 1, 2, 4 und 5 von Probe 3.
    • A. Selektive Amplifikation von Satz 1 mit E01k-Ned und M01k.
    • B. Selektive Amplifikation von Satz 2 mit E03k-5' + T-JOE und M04k.
    • C. Selektive Amplifikation von Satz 5 mit E04k-FAM und M03k.
  • Es sind alle Kanäle erkennbar. Es ist klar, dass es möglich ist, einen spezifischen Satz aus einem mehrfachen Ligationsprodukt für mehrere Sätze zu amplifizieren.
  • Beispiele
  • I. Konstruktion von Füllsequenzen
  • Um die Kreuzhybridisierung zwischen den Amplifikationsprodukten zu vermeiden, ist es bevorzugt, dass sich die Sequenzen der Füllsequenzen unterscheiden und keine Haarnadelkurven ("hairpins") bilden. In den Tabellen 1–5 werden Füllsequenzen dargestellt, die für die Entwicklung von Sonden für jeden fluoreszierenden Farbstoff verwendet werden können und die auf das Fehlen von Haarnadelkurven („hairpins") unter Verwendung von Primer Designer Version 2.0 (Urheberrecht 1990, 1991, Scientific and Educational software) verifiziert wurden. Die Füllsequenzen werden aus zufällig gewählten Tetramerblöcken, die ein G, C, T und A enthalten, konstruiert und haben somit nach der Definition einen 50 %-igen GC-Gehalt. Die Füllsequenz in der Vorwärts-OLA-Sonde für die zwei ENP-Allelen sind identisch gehalten, um eine begünstigte ENP-Allelamplifikation zu vermeiden. Tabelle 1: Längen der Füllsequenzen
    ET-ROX- und JOE-Sonden. FAM- und NED-Sonden.
    Gesamtfülllänge Fülllänge der Sonde vom Typ1 Fülllänge der Sonde vom Typ2 Gesamtfülllänge Fülllänge der Sonde vom Typ1 Fülllänge der Sonde vom Typ2
    0 0 0 1 1 0
    2 0 2 3 1 2
    4 4 0 5 5 0
    6 4 2 7 5 2
    8 8 0 9 9 0
    10 8 2 11 9 2
    12 12 0 13 13 0
    14 12 2 15 13 2
    16 16 0 17 17 0
    18 16 2 19 17 2
    20 20 0 21 21 0
    22 20 2 23 21 2
    24 24 0 25 25 0
    26 24 2 27 25 2
    28 28 0 29 29 0
    30 28 2 31 29 2
    32 32 0 33 33 0
    34 32 2 35 33 2
    36 36 0 37 37 0
    38 36 2 39 37 2
    Tabelle 2: Füllsequenzen für ET-ROX-Sonden (5'-3').
    Fülllänge
    Sonde Typ 1 Sonde Typ 2
    0 0
    0 2 CA
    4 TGCA 0
    4 TGCA 2 CA
    8 ACGT TACG 0
    8 ACGT TACG 2 CA
    12 TAGC GTCA GCAT 0
    12 TAGC GTCA GCAT 2 CA
    16 CATG GCAT ACGT TACG 0
    16 CATG GCAT ACGT TACG 2 CA
    20 GATC GCTA ACGT TACG GCAT 0
    20 GATC GCTA ACGT TACG GCAT 2 CA
    24 TCGA GATC ACGT CATG CTGA GCAT 0
    24 TCGA GATC ACGT CATG CTGA GCAT 2 CA
    28 CAGT TCAG GCAT TCGA CTAG CGTA TACG 0
    28 CAGT TCAG GCAT TCGA CTAG CGTA TACG 2 CA
    32 GTCA ATCG GACT CTGA GACT CATG CGAT GACT 0
    32 GTCA ATCG GACT CTGA GACT CATG CGAT GACT 2 CA
    36 GATC CGAT CGAT ATCG ACGT AGCT GCAT CGTA ATCG 0
    36 GATC CGAT CGAT ATCG ACGT AGCT GCAT CGTA ATCG 2 CA
    Tabelle 3: Füllsequenzen für JOE-Sonden (5'-3').
    Fülllänge
    Sonde Typ 1 Sonde Typ 2
    0 0
    0 2 TG
    4 ACTG 0
    4 ACTG 2 T0
    8 GCAT CAGT 0
    8 GCAT CAGT 2 TG
    12 ATCG GCAT TACG 0
    12 ATCG GCAT TACG 2 TG
    16 TACG GCAT AGTC ACGT 0
    16 TACG GCAT AGTC ACGT 2 TG
    20 GATC GCTA ACGT TACG GCAT 0
    20 GATC GCTA ACGT TACG GCAT 2 TG
    24 CTAG ATGC TCAG GCTA TCGA CATG 0
    24 CTAG ATGC TCAG GCTA TCGA CATG 2 TG
    28 GTAC CGAT ACGT TAGC GACT TAGC CGTA 0
    28 GTAC CGAT ACGT TAGC GACT TAGC CGTA 2 TG
    32 CGTA ATCG GATC CGTA ACGT GCAT ATGC CAGT 0
    32 CGTA ATCG GATC CGTA ACGT GCAT ATGC CAGT 2 TG
    36 GACT TCGA GATC TGCA ACGT ACGT CGTA AGCT GCTA 0
    36 GACT TCGA GATC TGCA ACGT ACGT CGTA AGCT GCTA 2 TG
    Tabelle 4: Füllsequenzen für FAM-Sonden (5'-3').
    Fülllänge
    Sonde Typ 1 Sonde Typ 2
    1 C 0
    1 C 2 GA
    5 C GACT 0
    5 C GACT 2 GA
    9 C CGAT TAGC 0
    9 C CGAT TAGC 2 GA
    13 C ATCG GATC AGCT 0
    13 C ATCG GATC AGCT 2 GA
    17 C ATGC TAGC ACGT ACTG 0
    17 C ATGC TAGC ACGT ACTG 2 GA
    21 C GTAC CAGT CATG GATC CGAT 0
    21 C GTAC CAGT CATG GATC CGAT 2 GA
    25 C GATC ATCG ACTG GTAC TACG GACT 0
    25 C GATC ATCG ACTG GTAC TACG GACT 2 GA
    29 C GTAC GCAT GCTA ACGT TACG GACT ATCG 0
    29 C GTAC GCAT GCTA ACGT TACG GACT ATCG 2 GA
    33 C CGTA GCAT CGAT ATCG GTCA ACTG GATC AGCT 0
    33 C CGTA GCAT CGAT ATCG GTCA ACTG GATC AGCT 2 GA
    37 C GTAC CATG TCGA CGTA GATC CGTA TAGC ACTG AGTC 0
    37 C GTAC CATG TCGA CGTA GATC CGTA TAGC ACTG AGTC 2 GA
    Tabelle 5: Füllsequenzen für NED-Sonden (5'-3').
    Fülllänge
    Sonde Typ 1 Sonde Typ 2
    1 C 0
    1 C 2 TC
    5 C GTAC 0
    5 C GTAC 2 TC
    9 C GCAT TCGA 0
    9 C GCAT TCGA 2 TC
    13 C ATCG GCAT GACT 0
    13 C ATCG GCAT GACT 2 TC
    17 C GTCA ATGC ACGT TACG 0
    17 C GTCA ATGC ACGT TACG 2 TC
    21 C GCAT CGAT AGCT CTGA ACGT 0
    21 C GCAT CGAT AGCT CTGA ACGT 2 TC
    25 C GCAT ATCG GATC GATC GCAT ACGT 0
    25 C GCAT ATCG GATC GATC GCTA ACGT 2 TC
    29 C ATCG GATC CATG CGTA GCAT ATCG ACGT 0
    29 C ATCG GATC CATG CGTA GCAT ATCG ACGT 2 TC
    33 C TGCA AGTC CGAT TACG ATCG ACGT GCTA TGCA 0
    33 C TGCA AGTC CGAT TACG ATCG ACGT GCTA TGCA 2 TC
    37 C AGCT CAGT ATCG AGTC GACT ACGT TGCA TACG GATC 0
    37 C AGCT CAGT ATCG AGTC GACT ACGT TGCA TACG GATC 2 TC
  • II. BEISPIELE VON MULTIPLEXLIGATIONSASSAYS UND DES NACHWEISES
  • Beispiel 1. Beschreibung der biologischen Materialien und der DNA-Isolierung
  • Es wurden rekombinante Inzucht (RI)-Linien, die aus einer Kreuzung zwischen den Ecotypen von Arabidopsis Colombia und Landsberg erecta (Lister und Dean, Plant Journal, 4, S. 745–750, (1993) generiert wurden, verwendet. Die Samen aus den parenteralen und RI-Linien wurden vom Nottingham Arabidopsis Stock Centre erhalten.
  • Die DNA wurde aus Blattmaterial von einzelnen Keimlingen unter Verwendung von per se bekannten Verfahren isoliert, zum Beispiel wie es im Wesentlichen in der EP 0 534 858 beschrieben wird, und in 1X TE-Losung (10 mM Tris-HCl pH 8,0, enthaltend 1 mM EDTA) gelagert. Die Konzentrationen wurden durch UV-Messungen in einem Spektrophotometer (MERK) unter Verwendung von Standardprozeduren bestimmt und auf 100 ng/μl unter Verwendung von 1X TE angepasst.
  • Beispiel 2. Auswahl von Arabidopsis ENP's.
  • Die ENP's von Arabidopsis, die aus der The Arabidopsis Information Resource (TAIR) Webseite: http://www.arabidopsis.org/SNPs.html:, ausgewählt wurden, werden in Tabelle 6 zusammengefasst. Tabelle 6. Ausgewählte ENPs aus Arabidopsis thaliana.
    ENP ENP-Allelen* RI-Kartierungsposition
    1 SGCSNP1 G/A Chr. 2; 72,81
    2 SGCSNP20 A/C Chr. 4; 15,69
    3 SGCSNP27 T/G Chr. 3; 74,81
    4 SGCSNP37 C/G Chr. 2; 72,45
    5 SGCSNP39 T/C Chr. 5; 39,64
    6 SGCSNP44 A/T nicht kartiert
    7 SGCSNP55 C/A Chr. 5; 27,68
    8 SGCSNP69 G/A Chr. 1; 81,84
    9 SGCSNP119 A/T Chr. 4; 62,06
    10 SGCSNP164 T/C Chr. 5; 83,73
    11 SGCSNP209 C/G Chr. 1; 70,31
    12 SGCSNP312 G/T Chr. 4; 55,95
    • * Für alle ENPs ist das Allel, das dem Schrägstrich vorangeht, das Colombia-Allel.
  • Beispiel 3. Oligonukleotidsondenkonstruktion für die Oligonukleotidligationsreaktion
  • Die Oligonukleotidsonden (in 5'-3'-Orientierung) wurden so ausgewählt, um die ENP-Allelen für jeden der 12 ENP-Loci zu unterscheiden, die in Beispiel 2 beschrieben werden. Die PCR-Bindungsbereiche sind unterstrichen, Füllsequenzen sind doppelt unterstrichen. Die Rückwärtsprimer sind am 5'-Ende phosphoryliert. p bedeutet phosphoryliert. Die Sequenzen werden in Tabelle 7 zusammengefasst.
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Beispiel 4. Konstruktion der PCR-Amplifikationsprimer
  • Die Sequenzen des für die PCR-Amplifikation verwendeten Primers waren komplementär zu den PCR-Primerbindungsregionen, die in die Ligationssonden eingebracht wurden, die in Beispiel 3 beschrieben werden. Die Sequenzen stellen die so genannten M13-Vorwärts- und M13-Rückwärts-Primer dar. Üblicherweise ist der Vorwärts-Primer mit FAM oder 33P-dATP abhängig von der Nachweisplattform markiert. Die Sequenzen der Primer in 5'-3'-Richtung sind:
    M13 vorwärts: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC [SEQ ID NO. 37]
    M13 rückwärts: AGCGGATAACAATTTCACACAGGA [SEQ ID NO. 38]
  • Die Konzentration dieser Oligos wurde auf 50 ng/μl angepasst.
  • Beispiel 5. Puffer und Reagenzien
  • Die Zusammensetzung der Puffer war: Hybridisierungspuffer (1 X), 20 mM Tris-HCl pH 8,5, 5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 10 mM DTT, 1 mM NAD+-Ligationspuffer (1 X) 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 25 mM Kac, 10 mM MgAc2, 10 mM DTT, 1 mM NAD+, 0,1 % Triton-X100. PCR-Puffer (10 X): 10 × PCR-Puffer (enthält 15 mM MgCl2). Qiagen, Valencia, Vereinigte Staaten von Amerika). Es wurden keine Zusätze in der PCR verwendet.
  • Beispiel 6. Ligation und Amplifikation
  • Ligationsreaktionen:
  • Die Ligationsreaktionen wurden wie folgt durchgeführt: 100 ng genomische DNA (1 μl von 100 ng/μl) in 5 μl Gesamtvolumen wurden mit Wärme durch Inkubation für 5 Minuten bei 94 °C denaturiert und auf Eis gekühlt. Als nächstes wurden 4 fMol von jedem der OLA-Vorwärts- und Rückwärtssonden, die in Beispiel 3 beschrieben werden (36 Oligonukleotide insgesamt), hinzu gegeben und die Mischung wurde für 16 Stunden bei 60 °C inkubiert. Als nächstes wurde eine Einheit Taq-Ligase (NEB) hinzu gegeben und die Mischung wurde für 15 Minuten bei 60 °C inkubiert.
  • Als nächstes wurde die Ligase mit Hitze durch Inkubation für 5 Minuten bei 94 °C inaktiviert und es wurde bei –20 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
  • PCR-Amplifikation:
  • Die PCR-Reaktionsmischung enthielt 10 μl Ligationsmischung, 1 μl 50 ng/μl (FAM oder 33P-markierten M13 Vorwärts- und Rückwärtsprimer (wie er in Beispiel 4 beschrieben wird), 200 μM von jedem dNTP, 2,5 Einheiten HotStarTaq Polymerase Qiagen, 5 μl 10X PCR-Puffer in einem Gesamtvolumen von 50 μl.
  • Die Amplifikation wurde durch thermische zyklische Behandlung in einem Perkin Elmer 9700 thermo cycler (Perkin Elmer Cetus, Foster City, Vereinigte Staaten von Amerika) gemäß dem folgenden thermischen Zyklusprofil durchgeführt:
    • Profil 1: Anfängliche Denaturierung/Enzymaktivierung 15 Min. bei 94 °C gefolgt durch 35 Zyklen von: 30 Sek. bei 94 °C, 30 Sek. bei 55 °C, 1 Min. bei 72 °C und eine letzte Verlängerung von 2 Min. bei 72 °C, 4 °C, für immer.
    • Profil 2: Anfängliche Denaturierung/Enzymaktivierung 15 Min. bei 94 °C gefolgt durch 35 Zyklen von: 5 Sek.
  • In dem Fall, dass ein mit 33P endständig markierter M13 Vorwärts-PCR-Primer verwendet wurde, wurde die Markierung durch Kination durchgeführt, wie es in Vos et al., 1995 (Nucleic Acids Research, Bd. 23: Nr. 21, S. 4407–4414, 1995) und in dem Patent EP 0 534 858 beschrieben wird.
  • Beispiel 7. Radioaktiver Nachweis von 12-fach ENPWave-Produkten
  • 10 zeigt ein elektrophoretisches Gel aus einem Multiplexoligonukleotidligationsassay von 12 ENPs von Arabidopsis, die in Beispiel 2 aufgelistet werden, nach den hierin zuvor beschriebenen Prozeduren unter Verwendung von DNA des Ecotyps Colombia (C), des Ecotyps Landsberg erecta (L) oder einer Mischung einer gleichen Menge von beiden Ecotypen (C + L) als Ausgangsmaterial.
  • 10 zeigt, dass die entsprechenden Allelen der ENP's SNP SGCSNP164, SGCSNP119, SGCSNP69, SGCSNP29, SGCSNP27 und SGCSNP1 deutlich in der Colombia-Probe zu sehen sind, und dass die entsprechenden ENP-Allelen der ENP-Loci SGCSNP164, SGCSNP119, SGCSNP69, SGCSNP29, SGCSNP27 und SGCSNP1 deutlich in der Landsberg-Probe zu sehen sind, und dass all diese ENP-Allelen zusammen in der Mischung von beiden Proben zu sehen sind.
  • Dieses Beispiel illustriert, dass wenigstens sechs ENP's gleichzeitig unter Verwendung der Multiplexligations-/amplifikationsprozedur ligiert und amplifiziert werden können. Dieses Beispiel illustriert zudem, dass wenigstens 12 ENPs in einer Probe nachgewiesen werden können. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8
    ENP-Name Länge Allel Ergebnis
    Lan SGCSNP164 136 C Ja
    Col SGCSNP164 134 T Ja
    Lan SGCSNP119 132 C Ja
    Col SGCSNP119 130 T Ja
    Lan SGCSNP69 128 T Ja
    Col SGCSNP69 126 A Ja
    Lan SGCSNP55 124 A Nein
    Col SGCSNP55 122 G Ja
    Lan SGCSNP44 120 T Nein
    Col SGCSNP44 118 A Nein
    Lan SGCSNP39 116 C Nein
    Col SGCSNP39 114 T Ja
    Lan SGCSNP37 112 G Ja
    Col SGCSNP37 110 C Nein
    Lan SGCSNP27 108 G Ja
    Col SGCSNP27 106 T Ja
    Lan SGCSNP20 104 C Nicht bewertet*
    Col SGCSNP20 102 A Nicht bewertet
    Lan SGCSNP312 104 T Nicht bewertet
    Col SGCSNP312 102 G Nicht bewertet
    Lan SGCSNP209 100 G Ja
    Col SGCSNP209 98 C Ja
    Lan SGCSNP1 100 A Ja
    Col SGCSNP1 97 G Ja
    • *; nicht bewertet; Col: Colombia-Allel, Lan: Landsberg-Allel
  • Beispiel 8. Gelelektrophorese
  • Die Gelelektrophorese wurde durchgeführt, wie es Vos. et al., Nucleic AcidsR 23 (21), (1995), 4407–4414, beschrieben wird. Nach dem Durchführen von auf Phosphor abtastenden Untersuchungen mit dem getrockneten Gel (Fuji Photo Film Co., LTD, Typ BAS III) für 16 Stunden wurde ein Bild durch das Abtasten unter Verwendung des Fuji- Scanners (Fuji Photo Film Co., LTD, Fujix BAS 2000) erhalten und in digitaler Form gespeichert.
  • Beispiel 9. Oligonukleotidgrößenfragmente für die Kapillarelektrophorese
  • Größenfragment 94 Bp:
    • 5'-fam-ACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCG [SEQ ID NO. 39]
  • Größenfragment 95 Bp:
    • 5'-fam-ACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGG [SEQ ID NO. 40]
  • Größenfragment 137 Bp:
  • 5'-fam-ACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTC [SEQ ID NO. 41]
  • Beispiel 10. Aufreinigung und Verdünnung der amplifizierten ligierten Sonden
  • In dem Fall des Nachweises unter Verwendung des Kapillarsequenzierungsinstruments MegaBACE 1000 wurde ein Entsalzen und Aufreinigen der PCR-Reaktionsmischungen im 96-Well-Format unter Verwendung der folgenden Prozedur durchgeführt:
  • A. Herstellung von 96-Well Sephadex-Reinigungsplatten.
  • Trockenes Sephadex® G-50 superfein (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wurde in die Wells einer 96-Well-Platte (MultiScreen®-HV, Millipore Corporation, Redford, MA, USA) unter Verwendung einer 45-Mikroliter Säulenladevorrichtung (Millipore Corporation) wie folgt: geladen
    • 1. Sephadex G-50 superfein wurde zu dem Säulenlader hinzu gegeben.
    • 2. Überschuss an Sephadex wurde von oben von dem Säulenlader mit einem Kratzer entfernt.
    • 3. Die Multiscreen-HV-Platte wurde umgekehrt oben auf dem Säulenlader platziert.
    • 4. Die Multiscreen-HV-Platte und der Säulenlader wurden beide umgedreht.
    • 5. Das Sephadex G-50 wurde durch das Antippen der Oberseite oder der Seite des Säulenladers freigesetzt.
  • Als nächstes wurde Sephadex G-50 wie folgt schwellen gelassen und gespült:
    • 6. 200 μl Milli-Q-Wassr wurden pro Well unter Verwendung einer Mehrkanalpipette hinzu gegeben.
    • 7. Ein Gestell zur Zentrifugenanordnung wurde oben auf eine Standard 96-Well-Mikrotiterplatte positioniert, die Multiscreen-HV-Platte wurde oben darauf gestellt und die Minisäulen wurden durch Zentrifugation für 5 Min. bei 900 g gepackt.
    • 8. Die 96-Well-Platte wurde entleert und zurück gestellt.
    • 9. Die Schritte 5–7 wurden ein Mal wiederholt.
    • 10.200 μl Milli-Q-Wasser wurden zu jedem Well zum Aufquellen des Sephadex G-50 hinzu gegeben und für 2–3 Stunden inkubiert. Gelegentlich wurden in diesem Stadium die Multiscreen-HV-Platten mit gequollenen Minisäulen aus Sephadex G-50 superfine gut mit Parafilm versiegelt und in einem Kühlschrank bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
    • 11. Ein Gestell zur Zentrifugenanordnung wurde oben auf eine Standard 96-Well-Mikrotiterplatte positioniert, die Multiscreen-HV-Platte wurde oben auf die Anordnung positoniert und die Minisäulen wurden durch Zentrifugation für 5 Min. bei 900 g gepackt.
    • 12. Die 96-Well-Mikroplatte wurde entfernt.
    • 13. Die Mischungen, die die amplifizierten ligierten Sonden enthalten, wurden vorsichtig zu der Mitte von jedem Well hinzu gegeben.
    • 14. Unter Verwendung des Gestells zur Zentrifugenanordnung wurde die Multiscreen-HV-Platte oben auf eine neue Standard Mikrotiterplatte mit U-Boden platziert und die Zentrifugation wurde für 5 Min. bei 900 g durchgeführt.
    • 15. Das Eluat in der Standard 96-Well-Platte (ungefähr 25 μl pro Well) enthält das aufgereinigte Produkt.
  • B. Verdünnung der aufgereinigten Produkte
  • Die aufgereinigten Produkte wurden 25–75-fach in Milli-Q-Wasser vor der Injektion verdünnt.
  • Beispiel 11. Kapillarelektrophorese auf dem MegaBACE
  • Herstellung der Proben
  • Es wurde eine 800-fache Verdünnung des Größenstandards ET-900 Rox (Amersham Pharmacia Biotech) in Wasser durchgeführt. 8 μl verdünntes ET-900 Rox wurden zu 2 μl gereinigter Probe gegeben. Vor dem Lauf wurde die Probe, die die Größenstandards enthält, durch Inkubation für 1 Min. bei 94 °C durch Hitze denaturiert und anschließend auf Eis gestellt.
  • Nachweis auf dem MegaBACE:
  • MegaBACE-Kapillaren wurden mit 1X LPA-Matrix (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) gemäß den Instruktionen des Herstellers gefüllt. Die Parameter für die elektrokinetische Injektion der Proben waren wie folgt: 45 Sek. bei 3 kV. Die Laufparameter waren 110 Min. bei 10 kV. Der Nachlauf, die Überlappungskorrektur, das Glätten der Spitzen und die Überlappungskorrektur wurden unter Verwendung der Software Genetic Profiler, Version 1.0, Aufbau 20001017 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA) durchgeführt und Elektropherogramme generiert.
  • Beispiel 12. Wiederholte Injektion auf dem MegaBACE.
  • Der minimale Zeitintervall zur geeigneten Trennung zwischen zwei nacheinander injizierten Proben wurde durch das Injizieren der Größenprobe bestimmt, wie sie in Beispiel 8 beschrieben wird. Der resultierende Zeitintervall wurde mit einem kleinen zusätzlichen Sicherheitsabstand verwendet, wenn die aufgereinigten amplifizierten ligierten Sonden aus dem Oligonukleotidassay injiziert wurden. Die Ergebnisse werden in 11 dargestellt.
    • A. Teilelektropherogramm des FAM-markierten Nachweises der Colombia-Probe auf einer Vorrichtung zur Kapillarelektrophorese (MegaBACE). Es wurde die gleiche Multiplexmischung zwei Mal injiziert. Die amplifizierten ligierten Sonden (Größenbereich 97–134 Bp) und die flankierenden Größenfragmente (94, 95 und 137 bp) sind alle mit FAM markiert.
    • B. Teilelektropherogramm des FAM-markierten Nachweises der Probe von Landsberg erecta auf einer Vorrichtung zur Kapillarelektrophorese (MegaBACE). Es wurde die gleiche Multiplexmischung zwei Mal injiziert. Die amplifizierten ligierten Sonden (Größenbereich 97–134 bp) und die flankierenden Größenfragmente (94, 95 und 137 bp) sind alle mit FAM markiert.
  • Beispiel 13. Verringerung der Überlappung unter Verwendung von Füllsequenzen mit unterschiedlichen Längen
  • In diesem Experiment wird die Verwendung von unterschiedlichen Längen-Marker-Kombinationen zur Vermeidung des negativen Einflusses eines unvollständigen Entfernens der Überlappung auf die Qualität eines dominant bewerteten (Vorhandensein/Fehlen) Datensatzes von ENP-Markern gezeigt. Die Fülllängen wurden so gewählt, dass ET-ROX- und JOE-markierte Fragmente identische Größen aufweisen und die FAM- und NED-Fragmente identische Größen aufweisen, sich aber um ein Basenpaar von denen der ET-ROX- und JOE-markierten Fragmente unterscheiden. Das Ergebnis ist, dass sogar in dem Fall eines unvollständigen Entfernens der Überlappung zwischen Farbstoffen mit überlappenden Emissionsspektren das beobachtete Signal nicht in einer inkorrekten Bewertung resultieren wird, weil die erwarteten Größen der Amplifikationsprodukte für jeden Marker bekannt sind. Somit definieren die Längen-Marker-Kombinationen die Erwartungsmuster für wahre Signale, die aus einer unvollständigen Überlappungskorrektur stammen. Die Ergebnisse werden in den 12 und 13 dargestellt.
  • Das Beispiel zeigt in 13:
    • A). Die Wirkung eines unvollständigen Entfernens der Überlappung auf die Datenqualität in dem Fall einer Probe, die ein ET-ROX-markiertes Fragment mit 120 Basenpaaren und ein NED-markiertes Fragment mit 124 Basenpaaren in einer Situation enthält, bei der Fragmente einer bestimmten Größe in Kombination mit allen Markern zu sehen sind. In diesem Fall führt die unvollständige Entfernung der Überlappung des ET-ROX-Signals in dem FAM-Kanal bei 120 Bp zu einer nicht korrekten Auswertung eines FAM-Fragments von 120 Basenpaaren (tatsächlich ein ET-ROX-markiertes Fragment von 120 Basenpaaren). In ähnlicher Weise führt eine unvollständige Überlappungskorrektur eines NED-Signals in JOE bei 124 Bp zusätzlich zu den korrekten Fragmenten zu einer falschen Auswertung eines JOE-Fragments von 124 Basenpaaren (tatsächlich ein NED-markiertes Fragment von 124 Basenpaaren).
    • B) Die Wirkung der Nutzung von auf Überlappung optimierte Längen-Marker-Kombinationen, so dass ET-ROX- und FAM-markierte Fragmente die gleiche Länge haben, wird durch die Wahl unterschiedlicher Fülllängen nicht vermieden, weil deren Emissionsspektren sich überlappen. In ähnlicher Weise werden amplifizierte, mit JOE und NED markierte, ligierte Sondenfragmente mit der gleichen Größe vermieden. In dem Fall einer hypothetischen Probe, die ein ET-ROX-markiertes Fragment von 120 Bp und ein NED-markiertes Fragment von 124 Bp enthält (das identisch zu dem ist, das oben in A beschrieben wird), werden die nach unvollständiger (mathematischer) Korrektur der Überlappung verbleibenden kleinen aber nachweisbaren Signale (Spitzen) von FAM bei 120 Bp und von JOE bei 124 Bp nicht bewertet, weil von ihnen bekannt ist, dass sie jeweils aus der Überlappung der ET-ROX- und NED-Signale stammen. Somit haben sie keinen Einfluss auf die Qualität der Daten und beide Fragmente werden korrekt bewertet.
  • Beispiel 14. Identifizierung von ENP
  • Die ausgewählten ENPs (SNPs) werden identifiziert und in Tabelle 9 zusammengefasst.
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  • Beispiel 15. Konstruktion einer Oligonukleotidsonde für die Oligonukleotidligationsreaktion
  • Die zirkulären Oligonukleotidsonden (in 5'-3'-Orientierung) wurden ausgewählt, um die ENP-Allelen für jeden der ENP-Loci zu unterscheiden, die in Beispiel 14 beschrieben werden. PCR-Bindungsstellen sind unterstrichen, Füllsequenzen sind doppelt unterstrichen. Rückwärtsprimer sind an dem 5'-Ende phosphorylisiert. p zeigt eine Phosphorylierung an. Die Sequenzen werden in Tabelle 10 zusammengefasst.
  • Figure 00820001
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  • Beispiel 16. Konstruktion von PCR-Amplifikationsprimern
  • Die Sequenz von einem der Primer, die zur PCR-Amplifikation verwendet wurden, war zu den PCR-Primerbindungsregionen komplementär, die in die Ligationssonden eingebaut wurden, die in Beispiel 15 beschrieben werden. Die Sequenz des zweiten PCR-Primers entsprach der PCR-Primerbindungsregion der Sonde. Üblicherweise ist der Vorwärtsprimer markiert. Die Konzentration der Oligonukleotide wurde auf 50 ng/μl angepasst. Die Sequenz der Primer in 5'-3'-Richtung wird in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 11. PCR-Amplifikationsprimer
    SEQ ID # Primer Nr. 5'-3'
    215 MseI + 0: 93E40 GATGAGTCCTGAGTAA* M00k
    216 EcoRI + 0 93L01 GACTGCGTACCAATTC* E00k
    217 EcoRI + 1 93L02 GACTGCGTACCAATTCA E01K NED
    218 EcoRI + 1 93L04 GACTGCGTACCAATTCG E03K 5' + T JOE
    219 EcoRI + 1 93L05 GACTGCGTACCAATTCT E04K FAM
  • *Es sind mehrere Marker möglich
  • Beispiel 17. Ligation und Amplifikation
  • 9 Proben (Proben 1–9) von homozygoten Tomatenlinien (Beispiel 14) wurden einer Multiplexoligonukleotidligationsreaktion unter Verwendung einer Mischung aus 20 Schlossproben (Satz 4) ausgesetzt. Die verwendeten Bedingungen waren 1 × Taq DNA-Ligasepuffer (NEB), 0,2 U/μl Taq DNA-Ligase und 0,05 fMol/μl von jeder Sonde in einem Volumen vom 10 μl. Die Ligation wurde in einer Thermozyklusvorrichtung (Perkin Elmer) unter den folgenden zyklischen Bedingungen durchgeführt: 2 Minuten bei 94 °C + 10 × (15 Sekunden bei 94 °C + 60 Minuten bei 60 °C) + 4 °C kontinuierlich. Nach der Ligation wurden 10 μl Ligationsprodukt mit 30 μl 1 × Taq DNA-Ligasepuffer verdünnt. Die 40 μl von jeder Reaktion wurden verwendet, um 4 Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von 4 unterschiedlich markierten E00k-Primern durchzuführen, die jeweils mit M00k kombiniert waren. Der E00k-Primer, der mit ET-ROX und JOE markiert war, wurde mit einem extra 1 bp im Vergleich zu E00k konstruiert, das mit FAM und NED markiert war, um mögliche Überlappung zwischen fluoreszierenden Markern zu verhindern, wenn diese Produkte auf dem MegaBACE analysiert werden. Die verwendeten Bedingungen waren 30 ng markierter E00k-Primer und 30 ng M00k-Primer, 1 × Accuprime Puffer I, 0,4 μl Accuprime Polymerase (Invitrogen) auf 10 μl verdünntes Ligationsprodukt in einer 20 folgenden zyklischen Bedingungen durchgeführt: 2 Minuten bei 94 °C + 35 × (15 Sekunden bei 94 °C + 30 Sekunden bei 56 °C + 60 Sekunden bei 68 °C) + 4 °C – kontinuierlich. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung von Sephadex 50 aufgereinigt und 80-fach mit MQ verdünnt. Das verdünnte PCR-Produkt wurde auf dem MegaBACE analysiert. Die unterschiedlichen fluoreszierend markierten Produkte wurden getrennt und in verschiedenen Kombinationen (2, 3 und 4 fluoreszierende Farbstoffe) laufen gelassen. Die Ergebnisse werden in 16 dargestellt.
  • Beispiel 18: Verwendung von Längen-/Farbstoff-Kombinationen und das Prinzip der wiederholten Injektion in Kombination mit der erneuten Verwendung der LPA-Matrix.
  • Die Amplifikationsprodukte von Satz 4 wurden unter Verwendung aufeinander folgender Läufe ohne Ersatz der LPA-Matrix zwischen den Läufen analysiert. Die Proben der Amplifikationsprodukte wurden nach einer Laufzeit von 40 Minuten ohne Änderung der Matrix injiziert. Die Ergebnisse werden in 17 dargestellt. Aufeinander folgende Läufe können ohne Änderung der Matrix und ohne wesentlichen Verlust an der Qualität der Daten durchgeführt werden.
  • Beispiel 19: Selektive Amplifikation einer Multiplexligationsprobe
  • Dieses Experiment zeigt die Möglichkeit einer stärkeren Vervielfachung der Oligonukleotidligation in Kombination mit der selektiven Amplifikation einer Subgruppe der gebildeten Ligationsprodukte unter Verwendung von (ALFP) Amplifikationsprimern mit selektiven Nukleotiden.
  • Bei Verwendung der 4 konstruierten Sondensätze basieren die Primer auf den Sätzen 1, 2, 4 und 5, wobei allerdings zusätzliche selektive Nukleotide direkt 3' von den Primerbindungsstellen in den Sonden lokalisiert sind.
  • Jeder Satz wurde getrennt ligiert, und in Kombination mit anderen Sätzen bis zu einem Multiplex von 40 basierend auf den 4 Sätzen zusammen. AFLP +1/+1-Amplifikationen unter Verwendung unterschiedlich markierter E00k-Primer wurden unter Verwendung des unten gezeigten Schemas durchgeführt.
  • Ligationssatz Amplifikation
    Marker Selektive Basen Satz
    1 NED E01k/M01k +A/+A 1
    2 JOE E03k/M04k +G/+T 2
    5 FAM E03k/M04k +T/+G 5
    1 + 4 NED E01k/M01k +A/+A 1
    2 + 4 JOE E03k/M04k +G/+T 2
    4 + 5 FAM E04k/M03k +T/+G 5
    1 + 2 + 4 + 5 JOE E03k/M04k +G/+T 2
    1 + 2 + 4 + 5 NED E01k/M01k +A/+A 1
    1 + 2 + 4 + 5 FAM E04k/M03k +T/+G 5
  • Die verwendeten Bedingungen waren 1 × Taq DNA-Ligasepuffer (NEB), 0,2 U/μl Taq DNA-Ligase und 0,05 fMol/μl von jeder Sonde in einem Volumen vom 10 μl. Die Ligation wurde in einer thermischen Zyklusvorrichtung (Perkin Elmer) unter den folgenden zyklischen Bedingungen durchgeführt: 2 Minuten bei 94 °C + 10 × (15 Sekunden bei 94 °C; 60 Minuten bei 60 °C) + 4 °C – kontinuierlich. Nach der Ligation wurde das 10 μl Ligationsprodukt mit 30 μl 1 × Taq DNA-Ligasepuffer verdünnt. Die verwendeten Bedingungen waren 30 ng markierter E00k-Primer und 30 ng M00k-Primer, 1 × Accuprime Puffer (Invitrogen) I, 0,4 μl Accuprime Polymerase (Invitrogen) auf 10 μl verdünntes Ligationsprodukt in einer 20 μl PCR-Reaktion. Die PCR wurde in einer thermischen Zyklusvorrichtung mit den folgenden zyklischen Bedingungen durchgeführt: 2 Minuten bei 94 °C + 35 × (15 Sekunden bei 94 °C + 30 Sekunden bei 56 °C + 6 Minuten bei 68 °C) + 4 °C – kontinuierlich. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung von Sephadex 50 aufgereinigt und 80-fach mit MQ verdünnt. Das verdünnte PCR-Produkt wurde auf dem MegaBACE analysiert. Die unterschiedlichen fluoreszierend markierten Produkte wurden in getrennten Kapillaren laufen gelassen. Die Ergebnisse werden in 18 dargestellt.
  • Pufferzusammensetzungen:
  • 1 × Taq DNA-Ligasepuffer
    • 20 mM Tris-HCl
    • 25 mM Kaliumacetat
    • 10 mM Magnesiumacetat
    • 10 mM DTT
    • 1 mMNAD
    • 0,1 % Triton X-100
    • (pH 7,6 @ 25 °C)
  • 1 × AccuPrime Taq DNA-Polymerasepuffer
    • 20 mM Tris-HCl (pH 8,4)
    • 50 mM KCl
    • 1,5 mM MgCl2
    • 0,2 mM dGTP, dATP, dTTP und dCTP
    • Thermostabiles AccuPrime® Protein
    • 10 % Glycerin
  • SEQUENTAUFLISTUNG
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Claims (29)

  1. Ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder des Fehlens einer Zielsequenz in einer Nukleinsäureprobe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) das Ausstatten einer Nukleinsäureprobe mit wenigstens einer zirkularisierbaren Sonde für jede in der Probe nachzuweisende Zielsequenz, wobei die Sonde einen ersten zielspezifischen Abschnitt an ihrem 5'-Ende aufweist, der zu einem ersten Teil einer Zielsequenz komplementär ist, sowie einen zweiten zielspezifischen Abschnitt an ihrem 3'-Ende aufweist, der zu einem zweiten Teil der Zielsequenz komplementär ist, wobei der erste und der zweite Teil der Zielsequenz benachbart zueinander positioniert sind, und wobei die Sonde zusätzlich einen Tag-Abschnitt umfasst, der im Wesentlichen zu der Zielsequenz nicht komplementär ist, wobei der Tag-Abschnitt eine Füllsequenz umfassen kann und wobei der Tag-Abschnitt wenigstens eine primerbindende Sequenz umfasst; b) das Ermöglichen, dass die ersten und zweiten zielspezifischen Abschnitte der zirkulären Sonde an die ersten und zweiten Teile der Zielsequenzen binden, wobei die ersten und zweiten zielspezifischen Abschnitte der Sonde benachbart zueinander auf der Zielsequenz binden; c) das Bereitstellen von Mitteln zum Ligieren der ersten und zweiten zielspezifischen Abschnitte, die zueinander benachbart an die Zielsequenz gebunden sind, und das Ermöglichen, dass die ersten und zweiten zielspezifischen Abschnitte miteinander verbunden werden, um eine ligierte zirkuläre Sonde zu produzieren, die mit einer Zielsequenz in der Probe korrespondiert; d) das Bereitstellen wenigstens eines ersten Primers, der zu der primerbindenden Sequenz komplementär ist, sowie eines Polymeraseenzyms; e) das Amplifizieren der resultierenden Mischung zur Herstellung einer amplifizierten Probe, die Amplikons umfasst, die lineare Verkörperungen der ligierten zirkulären Sonden sind; f) das Bestimmen des Vorhandenseins oder des Fehlens einer Zielsequenz in einer Probe durch den Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens des korrespondierenden Amplikons; wobei die wenigstens eine zirkularisierbare Sonde einen blockierenden Abschnitt enthält, der eine blockierende Gruppe umfasst, die benachbart zu dem 3'-Ende der primerbindenden Stelle so positioniert ist, dass der blockierende Abschnitt die Verlängerung oder Amplifikation des Primers verhindert, der an die zirkularisierte Sonde hybridisiert ist, wodurch eine lineare Verkörperung der zirkulären Sonde generiert wird, und derart, dass die blockierende Gruppe von der Primerverlangerung oder Amplifikation ausgeschlossen ist.
  2. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei ein Amplikon in einer amplifizierten Probe, das mit einer Zielsequenz in einer Probe korrespondiert, sich in der Länge von einem Amplikon in der amplifizierten Probe, das mit einer unterschiedlichen Zielsequenz in der Probe korrespondiert, unterscheidet, wobei der Unterschied in der Länge durch Füllsequenzen von unterschiedlicher Länge bereit gestellt wird, die in die Sonde eingebaut sind.
  3. Ein Verfahren gemäß den Ansprüchen 1–3, wobei das Amplikon eine Länge aufweist, die mit der Länge der verbundenen zirkulären Sonde korrespondiert.
  4. Ein Verfahren gemäß den Ansprüchen 1–3, wobei der Längenunterschied durch die Länge der Füllsequenz bereit gestellt wird.
  5. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei zwei unterschiedliche zirkuläre Sonden die gleiche Primerbindungsstelle enthalten, die in der Lage ist, an eine einzelne Primersequenz zu hybridisieren.
  6. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5, wobei der Primer einen Marker umfasst.
  7. Ein Verfahren gemäß den Ansprüchen 1–6, wobei der Primer einen Universalprimer mit einem Abschnitt enthält, der zu der Primerbindungssequenz komplementär ist und zusätzlich wenigstens ein selektives Nukleotid an seinem 3'-Ende enthält.
  8. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem a) eine Probe mit wenigstens zwei Gruppen der zirkularisierbaren Oligonukleotidsonden ausgestattet wird, wobei jede Gruppe der zirkularisierbaren Oligonukleotidsonden Tag-Sequenzen mit wenigstens einer gruppenspezifischen Primerbindungsstelle aufweist; b) die ligierten zirkulären Sonden von jeder Gruppe mit einem ersten Primer amplifiziert werden, wobei wenigstens ein Primer komplementär zu der gruppenspezifischen Primerbindungsstelle ist und wobei wenigstens einer der Primer aus einer Gruppe einen gruppenspezifischen Marker umfasst; und c) in jeder Gruppe eine amplifizierte ligierte Sonde, die mit einer Zielsequenz in der Probe korrespondiert, sich in der Länge von einer amplifzierten ligierten Sonde, die mit einer unterschiedlichen Zielsequenz in der Probe korrespondiert, unterscheidet, wobei der Unterschied in der Länge durch die Verwendung von Füllsequenzen in verschiedener Länge bereit gestellt wird, die in die Sonde eingebaut sind.
  9. Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei in einem ersten Teil der Gruppen der amplifizierten ligierten Sonden diese mit einer geradzahligen Anzahl von Nukleotiden hergestellt werden und in einem zweiten Teil der Gruppen der amplifizierten ligierten Sonden diese mit einer ungeraden Anzahl von Nukleotiden hergestellt werden.
  10. Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Gruppen der ligierten amplifzierten Sonden mit einer geradzahligen Anzahl von Nukleotiden und die Gruppen der ligierten amplifizierten Sonden mit einer ungeraden Anzahl von Nukleotiden mit Fluoreszenzmarkem markiert sind, die die geringste Überlappung in deren Emissionsspektren aufzeigen.
  11. Ein Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei eine erste und zweite Gruppe von ligierten amplifizierten Sonden mit einer geradzahligen Anzahl von Nukleotiden hergestellt werden und eine dritte und vierte Gruppe von ligierten amplifizierten Sonden mit einer ungeraden Anzahl von Nukleotiden hergestellt werden und wobei die erste und zweite Gruppe jeweils mit FAM und NED markiert werden und die dritte und vierte Gruppe jeweils mit (ET-)ROX und entweder JOE oder HEX markiert werden; oder wobei die erste und zweite Gruppe mit (ET-)ROX und entweder JOE oder HEX markiert werden und die dritte und vierte Gruppe jeweils mit FAM und NED markiert werden.
  12. Ein Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die zirkularisierbare Sonde zusätzlich eine zweite Primerbindungsstelle umfasst.
  13. Ein Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der blockierende Abschnitt, der die Primerverlängerung stoppt, eine blockierende Gruppe umfasst und wobei die blockierende Gruppe zwischen den zwei Primerbindungsstellen benachbart zu dem 3'-Ende der Bindungsstelle des Vorwärtsprimers und benachbart zu dem 5'-Ende der Bindungsstelle des Rückwärtsprimers so positioniert ist, dass die blockierende Gruppe von der Primerverlängerung oder Amplifikation ausgeschlossen ist.
  14. Ein Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Polymerase keine wesentliche Strangverdrängungsaktivität exprimiert.
  15. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, das zusätzlich die folgenden Schritte umfasst: a) (e1) die Wiederholung der Schritte (a) bis (e) zur Generierung von wenigstens zwei amplifizierten Proben; b) (e2) das nacheinander Auftragen wenigstens eines Teils der amplifizierten Proben, die in den Schritten (e) und (e1) erhalten wurden, auf eine Auftragsposition eines Kanals einer elektrophoretischen Vorrichtung, das elektrophoretische Trennen der Amplikons in den amplifizierten Proben und das Nachweisen der getrennten Amplikons an einer Nachweisposition, die distal von der Auftragsposition des Kanals positioniert ist; wobei der Zeitraum zwischen den nacheinander aufgetragenen amplifizierten Proben derart ist, dass die am langsamsten wandernde amplifizierte gebundene Sonde in einer amplifizierten Probe an der Nachweisposition nachgewiesen wird, bevor die am schnellsten wandernde amplifizierte gebundene Sonde einer danach aufgetragenen amplifizierten Probe an der Nachweisposition nachgewiesen wird.
  16. Ein Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Zielnukleotidsequenz einen Polymorphismus enthält, vorzugsweise einen Einzelnukleotidpolymorphismus.
  17. Ein Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Zielnukleotidsequenz ein DNA-Molekül ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus: cDNA, genomischer DNA, Restriktionsfragmenten, Adapter-ligierten Restriktionsfragmenten, amplifizierten Adapter-ligierten Restriktionsfragmente und AFLP-Fragmenten besteht.
  18. Verwendung eines Verfahrens, wie es in einem der vorangegangenen Ansprüche definiert wird, für den Nachweis einer Vielzahl von Zielnukleotidsequenzen mit hohem Durchsatz.
  19. Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 18 zum Nachweis von Polymorphismen, vorzugsweise von Einzelnukleotidpolymorphismen.
  20. Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 19 zur Erstellung eines Transkriptprofils.
  21. Verwendung gemäß Anspruch 18 zum Nachweis der quantitativen Häufigkeit von Zielnukleinsäuresequenzen.
  22. Verwendung gemäß Anspruch 18 zur Genkartierung, Entdeckung von Genen, zur Marker-unterstützten Selektion, zur Qualitätskontrolle von Aussaat, Hybridselektion, QTL-Kartierung, Massensegregantenanalyse, für DNA-Fingerabdrücke und zur Offenbarung von Information, die in Bezug zu Merkmalen, Krankheitsresistenz, Ausbeute, Hybridlebensfähigkeit und/oder Genfunktion steht.
  23. Zirkularisierbare Nukleinsäuresonde, umfassend einen ersten zielspezifischen Abschnitt an ihrem 5'-Ende, der zu einem ersten Teil einer Zielsequenz komplementär ist, sowie einen zweiten zielspezifischen Abschnitt an ihrem 3'-Ende, der zu einem zweiten Teil der Zielsequenz komplementär ist, wobei die Sonde zusätzlich einen Tag-Abschnitt umfasst, der im Wesentlichen zu der Zielsequenz nicht komplementär ist, wobei der Tag-Abschnitt eine Füllsequenz umfassen kann und wobei der Tag-Abschnitt wenigstens eine primerbindende Sequenz umfasst, wobei der Tag-Abschnitt zusätzlich einen blockierenden Abschnitt enthält, der eine blockierende Gruppe umfasst, die benachbart zu dem 3'-Ende der Primerbindungsstelle lokalisiert ist, so dass der blockierende Abschnitt in der Lage ist, die Verlängerung oder Amplifikation von jeglichem Primer zu stoppen, der an die zirkularisierbare Nukleinsäuresonde hybridisiert ist.
  24. Eine zirkularisierbare Oligonukleotidsäuresonde gemäß Anspruch 23 zur Verwendung in einem Verfahren, wie es in den Ansprüchen 1–16 definiert wird.
  25. Eine Gruppe von zwei oder mehr zirkularisierbaren Oligonukleotidsonden gemäß Anspruch 23 zur Verwendung in einem Verfahren, wie es in den Ansprüchen 1–16 definiert wird.
  26. Verwendung einer Gruppe von zwei oder mehr Oligonukleotidsonden, wie sie in Anspruch 23 definiert werden, wobei die Gruppe eine Sonde für jedes Allel eines Einzelnukleotidpolymorphismus umfasst.
  27. Ein Gruppe von Primern zusammen mit einer Sonde oder einer Gruppe von Sonden, wie sie in den Ansprüchen 23–26 definiert werden, zur Verwendung in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–16, wobei die Gruppe von Primern einen ersten Primer und einen oder mehrere zweite Primer umfasst, wobei jeder zweite Primer einen Marker enthält.
  28. Ein Kit, der Oligonukleotidsonden umfasst, wie sie in den Ansprüchen 23, 24 oder 25 definiert werden, der zur Verwendung in einem Verfahren geeignet ist, wie es in den Ansprüchen 1–16 definiert wird.
  29. Ein Kit gemäß Anspruch 28, der zusätzlich Primer zur Verwendung in einem Verfahren umfasst, wie es in den Ansprüchen 1 – 16 definiert wird.
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