DE60317420T2

DE60317420T2 - Verfahren zu Identifizierung von Nukleotid-Polymorphismen unter Verwendung von Resonanzenergietransfer

Info

Publication number: DE60317420T2
Application number: DE60317420T
Authority: DE
Inventors: Yutaka Takarada; Yoshihisa Kawamura; Yoshihiro Soya
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2002-09-02
Filing date: 2003-09-02
Publication date: 2008-09-18
Anticipated expiration: 2023-09-03
Also published as: ATE378425T1; US7659060B2; EP1394271B1; EP1394271A1; US20040081991A1; DE60317420D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden einer Mutation oder eines Polymorphismus in einer Nucleinsäuresequenz. Die vorliegende Erfindung ist besonders geeignet für die Diagnose von genetischen Krankheiten, die Analyse von Nucleotidpolymorphismen und Ähnliches.
Ein Nucleotidpolymorphismus wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Unterschied in einer Nucleotidsequenz gegenüber dem Wildtyp. Es ist bekannt, dass Nucleotidpolymorphismen von Genen eine wichtige Rolle bei der Metabolisierung von Arzneistoffen spielen, und zwar als ursächliche Faktoren für die Streuung unter Personen bezüglich Nebenwirkungen oder nicht erfolgreicher Therapien. Sie sind auch bekannt als ursächliche Faktoren individueller Unterschiede, bekannt als Konstitutionen wie beispielsweise der Grundstoffwechsel. Zusätzlich dienen Nucleotidpolymorphismen als genetische Marker für eine Reihe von Krankheiten. Daher ist es klinisch bedeutend, solche Mutationen aufzuklären. Eine routinemäßige phänotypische Klassifizierung wird in klinischen Studien besonders für Psychiatriepatienten und Suizidpatienten empfohlen (Gram und Brsen, European Consensus Conference an Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, S. 87–96 (1990); Balant et al, Eur. J. Clin. Pharmacol., 36: 551–554 (1989)). Um nach der Identifizierung eines verantwortlichen Mutantentyp-Gens die Genotypen nachzuweisen, ist ein Verfahren für die Analyse einer Nucleinsäuresequenz erwünscht.
Ein Verfahren zur Bestimmung einer Nucleinsäuresequenz (ein Sequenzierverfahren) veranschaulicht beispielhaft eine übliche Nucleinsäuresequenzanalysetechnik. Ein Sequenzierverfahren kann verwendet werden, um einen Nucleotidpolymorphismus, der in einer Nucleinsäuresequenz enthalten ist, nachzuweisen und zu identifizieren. Allerdings erfordert dies eine Menge Arbeit und Zeit für die Herstellung einer Matrizen-Nucleinsäure, für eine DNA-Polymerasereaktion, für eine Polyacrylamidgelelektrophorese, für eine Analyse einer Nucleinsäuresequenz und Ähnliches. Die Arbeit kann erleichtert werden durch die Verwendung eines modernen, automatisierten Sequenzierers, obwohl die nötige Anlage teuer ist.
Auf der anderen Seite ist von verschiedenen genetischen Krankheiten bekannt, dass sie durch Punktmutationen in Genen verursacht werden. Für einige von ihnen sind die Stellen und Arten der Punktmutationen in den Genen, die die genetische Krankheit verursachen, bekannt.
Ein Verfahren für den Nachweis einer Punktmutation in einem Gen, das ein Genamplifikationsverfahren wie das Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (PCR) verwendet ( JP-B 4-67960 ; JP-B 4-67957 ), ist üblicherweise als Verfahren für den Nachweis solch einer erwarteten Punktmutation bekannt. Ein Oligonucleotid für einen Wildtyp, welches vollständig komplementär zu einem endständigen Anteil einer Region ist, die in einem Wildtypen amplifiziert werden soll, und ein Oligonucleotid für einen Mutantentyp, das vollständig komplementär zu einem endständigen Anteil einer Region ist, die in einem Mutantentyp-Gen amplifiziert werden soll, werden als eines von einem Paar an Oligonucleotiden für die Genamplifikation in diesem Verfahren verwendet. Das Oligonucleotid für einen Mutantentyp weist ein Nucleotid auf, das komplementär zu dem Nucleotid ist, welches für die erwartete Punktmutation an seinem 3'-Ende verantwortlich ist. Ein Gen in einer Probe wird unter Verwendung solcher Oligonucleotide für einen Wildtyp und einen Mutantentyp unabhängig voneinander einem Genamplifikationsverfahren unterzogen.
Wenn es sich bei einem Gen in einer Probe um einen Wildtyp handelt, erfolgt die Nucleinsäureamplifikation unter Verwendung eines Oligonucleotids für einen Wildtyp. Allerdings findet eine Verlängerungsreaktion und daher die Nucleinsäureamplifikation unter Verwendung eines Oligonucleotids für einen Mutantentyp nicht statt, da das 3'-Ende des Oligonucleotids nicht komplementär ist zu (ist fehlgepaart mit) dem entsprechenden Nucleotid in dem Gen der Probe. Auf der anderen Seite findet, wenn es sich bei einem in einer Probe befindlichem Gen um ein Mutantentyp handelt, die Amplifikation unter Verwendung eines Oligonucleotids für einen Wildtyp nicht statt, wohingegen die Amplifikation unter Verwendung eines Oligonucleotids für einen Mutantentyp stattfindet. Daher ist es möglich zu bestimmen, ob es sich bei einem Gen in einer Probe um einen Wildtyp oder einen Mutantentyp handelt, und zwar durch die Untersuchung ob eine Amplifikation unter Verwendung eines der Oligonucleotide stattfindet oder nicht, wobei eine Punktmutation in dem Gen der Probe identifiziert wird. In diesem Fall kann, um das Vorkommen der Amplifikation zu untersuchen, die Anwesenheit einer amplifizierten Nucleinsäure nachgewiesen werden. Dies erfolgt durch Elektrophorese eines Amplifikationsproduktes auf einem Agarosegel, Färben des Agarosegels mit einem fluoreszierenden Reagens, welches spezifisch an Nucleinsäuren bindet (z. B. Ethidiumbromid), und UV-Bestrahlung. Alternativ sind folgende Verfahren entwickelt worden: ein Southern-Blotting-Verfahren bei dem eine amplifizierte Nucleinsäure auf einer Nylonmembran immobilisiert wird und der Nachweis unter Verwendung einer markierten Sonde durchgeführt wird; ein Sandwich-Hybridisierungsverfahren bei dem eine amplifizierte Nucleinsäure durch eine Abfangsonde, die auf einem festen Substrat immobilisiert wird, eingefangen wird und einer Nachweisesonde dann erlaubt wird, für den Nachweis darauf einzuwirken und Ähnliches.
Gemäß einem kürzlich entwickelten Nachweisverfahren wird, anstelle des direkten Nachweises einer Fluoreszenzintensität, das Fluoreszenzresonanzenergietransferverfahren (FRET) für den Nachweis der Hybridisierung mit einer Sonde verwendet. Ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer wird zwischen einer fluoreszierenden Donor-Substanz und einem Quencherfarbstoff (der eine fluoreszierende Substanz sein kann oder auch nicht) erzeugt. Er wird erzeugt, wenn das Absorptionsspektrum des einen (ein Quencher) mit dem Emissionsspektrum des anderen (ein Donor) überlappt und die beiden Farbstoffe nahe beieinander liegen. Ein Farbstoffpaar, das solche Eigenschaften aufweist, wird ein Donor/Quencher-Farbstoffpaar oder ein Energietransfer-Farbstoffpaar genannt.
Die Anregungsenergie einer fluoreszierenden Donor-Substanz wird auf einen benachbarten Quencher auf Grund einer Dipol-Interaktion, die durch einen Resonanzdipol verursacht wird, übertragen und hat das Löschen der fluoreszierenden Donor-Substanz zu Folge. In einigen Fällen, wenn der Quencher auch eine fluoreszierende Substanz ist, kann die Fluoreszenzintensität verstärkt werden. Die Effizienz eines Energietransfers hängt in hohem Maße von dem Abstand zwischen dem Donor und dem Quencher ab. Eine Gleichung für die Abschätzung dieser Beziehung wurde von Forster entwickelt (Forster, T., Ann. Phys., 2: 55–75 (1948)). Ein Abstand zwischen einem Donor- und einem Quencher-Farbstoff, der eine Energietransfereffizienz von 50% zur Folge hat, wird als Förster-Radius (Ro) bezeichnet. Andere Arten der Fluoreszenzlöschung schließen zum Beispiel die Ladungsübertragungslöschung und Stoßlöschung ein.
Energietransfer und andere auf Löschung basierende Verfahren, die durch eine Interaktion zwischen zwei benachbarten Farbstoffen verursacht werden, können in gleichartiger Weise durchgeführt werden. Daher ist er ein attraktives Mittel für den Nachweis oder die Identifizierung einer Nucleotidsequenz. Ein gleichartiges Analysesystem ist einfacher als ein herkömmliches Verfahren für die Analyse einer Hybridisierung mit einer Sonde, die auf dem Nachweis der Fluoreszenz von einem einzelnen fluoreszierenden Marker beruht. Dies liegt daran, dass eine verschiedenartige Analyse im Allgemeinen einen weiteren Schritt erfordert, und zwar die Trennung von hybridisierten Markern von freien Markern, die nicht hybridisiert sind. Üblicherweise basieren der FREI und andere, verwandte Verfahren auf der Überwachung einer Änderung in einem Fluoreszenzprofil von einem (oder beiden) Farbstoffmarkern nach dem Bindern durch die Hybridisierung der zwei komplementären Oligonucleotide. Die Änderung in einem Fluoreszenzprofil wird als Änderung eines Energietransferwerts oder Änderung eines Fluoreszenzlöschwerts in diesem System gemessen. Üblicherweise wird er in einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität eines der Farbstoffe wiedergegeben.
Eine Nucleotidsequenz von Interesse kann gemäß diesem Verfahren nachgewiesen werden ohne die hybridisierten Oligonucleotide von den unhybridisierten Oligonucleotiden zu trennen. Die Hybridisierung kann unter Verwendung von zwei getrennten, komplementären Oligonucleotiden durchgeführt werden, wobei eines mit einer fluoreszierenden Donor-Substanz und das andere mit dem Quencher markiert wird.
Ein Nucleotidpolymorphismus kann identifiziert werden, indem als eines der Oligonucleotide ein Oligonucleotid verwendet wird, das eine Nucleotidpolymorphismus-spezifische Sequenz aufweist, um ein Polymorphismus-spezifisches FRET-Signal zu liefern. Mehrere Systeme für Verfahren zur Analyse der FRET-Hybridisierung werden von Kricka, L. J. (Hrsg.), „Nonisotopic DNA Probe Techniques", Academic Press Inc., S. 311–352 (1992) erläutert. In einer anderen Ausführungsform kann man einen Donor und einen Quencher an ein einzelnes Oligonucleotid binden, so dass die Anwesenheit oder Abwesenheit der Hybridisierung des Oligonucleotids an eine komplementäre Sequenz zu einer nachweisbaren Abweichung in einem (oder beiden) der Fluoreszenzprofile führt. Wenn ein Oligonucleotid hybridisiert wird, erhöht sich normalerweise die Donor-Fluoreszenz und der Energietransfer/die Löschung wird in diesem System vermindert. Zum Beispiel, wenn ein selbst-komplementäres Oligonucleotid, das an beiden Enden Markierungen aufweiset, eine Haarnadelstruktur ausbildet, werden die zwei fluoreszierenden Substanzen am 5'- und 3'-Ende sich stark annähern, was zum Energietransfer und der Löschung führt. Wenn das selbst-komplementäre Oligonucleotid an eine komplementäre Sequenz in einem zweiten Oligonucleotid hybridisiert, wird die Haarnadelstruktur zerstört und der Abstand zwischen den zwei Farbstoffen vergrößert sich. Dann wird das Löschen vermindert.
Die mit der Haarnadelstruktur verbundenen Nachteile sind folgende: Da die Stabilität hoch ist, ist die Umwandlung in eine nicht-löschende Hybridisierungsform häufig langsam. Der Durchsatz ist gewöhnlich gering, mit einer nur geringen Neigung zur nicht-löschenden Hybridisierungsform. Eine wie vorstehend beschrieben markierte Haarnadelstruktur, die eine Sequenz für den Nachweis in einer Schleife zwischen selbst-komplementären Armen enthält, und einen Stiel ausbildet, wird in Tyagi, S. und Kramer, F. R., Nature Biotechnol., 14: 303–308 (1996) beschrieben. Der Basen-gepaarte Stiel muss für die Hybridisierung der Sequenz für den Nachweis mit einem Ziel, das die Abnahme der Löschung verursacht, geschmolzen werden. Eine „Doppel-Haarnadel"-Sonde und ein Verfahren für deren Verwendung werden in B. Bagwell et al. beschrieben (Nucleic Acids Res., 22: 2424–2425 (1994); US-Patent-Nr. 5,607,834 ). Eine Ziel-bindende Sequenz ist in der Haarnadelstruktur enthalten. Eine konkurrierende Hybridisierung zwischen dem Ziel und einer selbst-komplementären Sequenz in einer Haarnadelstruktur ist beteiligt. Bagwell et al. lösen das Problem der ungünstigen Hybridisierungskinetiken, indem sie die Haarnadelstruktur unter Verwendung einer Fehlpaarung destabilisieren.
Durch Verwendung dieses Verfahrens kann es möglich sein, einen Nucleotidpolymorphismus aufzufinden, indem eine Nucleotidpolymorphismus-spezifische Sequenz als Ziel-bindende Sequenz ausgewählt wird. Im Allgemeinen ist es nötig, stringente Hybridisierungsbedingungen zu wählen, um einen Unterschied in einem einzelnen Nucleotid unter Verwendung eines Oligonucleotidhybridisierungsverfahrens zu erkennen.
Es ist von einem gleichartigen Verfahren, in dem Energietransfer oder ein anderes Fluoreszenzlöschungsverfahren für den Nachweis einer Nucleinsäureamplifikation verwendet wird, berichtet worden. Ein Echtzeit-Nachweisverfahren, in dem eine doppelt markierte Sonde während einer PCR in einer Zielamplifikation-spezifischen Art und Weise gespalten wird, wird in L. G. Lee et al. beschrieben (Nucleic Acids Res., 21: 3761–3766 (1993)). Wird eine Nachweissonde an einen Teil stromabwärts eines Amplifikationsprimers hybridisiert, so wird die Nachweissonde durch eine 5'-3'-Exonucleaseaktivität der Taq-Polymerase gespalten. Dann werden die zwei Fluoreszenzfarbstoffe, die ein Energietransferpaar bilden, voneinander getrennt.
Es kann auch möglich sein einen Nucleotidpolymorphismus aufzufinden, indem eine Nucleotidpolymorphismus-spezifischen Sonde als doppelt-markierte Nachweissonde gemäß diesem Verfahren verwendet wird.
Es ist auch ein Verfahren bekannt, bei dem der Nachweis unter Verwendung von zwei Sonden durchgeführt wird, d. h. einer markierten, polymorphen, ortsspezifischen Sonde und einer Sonde, die eine Donor-Markierung aufweist, die benachbart zu der markierten, polymorphen, ortsspezifischen Sonde ist (Reischl, U. et al. (Hrsg.), „Rapid Cycle Real-Time PCR-Methods and Applications, Springer Verlag, S. 91–96 (2001)). In diesem Fall ist es möglich, einen Polymorphismus durch den Nachweis von zwei Arten von FRET-Signalen zu identifizieren und zwar unter Verwendung der Markierung der polymorphen, ortsspezifischen Sonde zusammen mit der Donor-Markierung. Gemäß diesem Verfahren ist es auch notwendig, stringente Hybridisierungsbedingungen zu wählen, um einen Unterschied in einem einzelnen Nucleotid unter Verwendung eines Oligonucleotidhybridisierungsverfahrens wie vorstehend beschrieben zu erkennen. Außerdem sind vier markierte Sonden für dieses Verfahren erforderlich. Ein alternatives Verfahren ist bekannt, bei dem eine einzeln-markierte, polymorphe, ortsspezifische Sonde mit einer Donor-markierten Sonde hybridisiert wird, dann die Temperatur angehoben wird und ein Polymorphismus auf Grund der Temperatur bei der die polymorphe, ortsspezifische Sonde in einen Einzelstrang aufgespalten wird, identifiziert wird (Bernard, P. S. et al., Anal. Biochem., 255: 101–107 (1998)). Allerdings erfordert dieses Verfahren die Verwendung von zwei Sonden, d. h. eine markierte, polymorphe, ortsspezifische Sonde und eine Donor-markierte Sonde, genauso wie die Kontrolle der Dissoziation der Donor-Sonde in einen Einzelstrang.
Ein Verfahren für den Nachweis einer Zielnucleinsäure, basierend auf FREI zwischen einem Interkalator als eine Nucleinsäure-spezifische Markierung und einer fluoreszierende Markierung einer Sonde, die mit der Zielnucleinsäure hybridisiert wird, ist beschrieben worden (Heller, „Rapid Detection and Identification of Infectious Agents", Academic Press Inc., S. 245–256 (1985); Cardullo, R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8790–8794 (1988); Morrison et al., in Kricka, L. J. (Hrsg.), "Nonisotopic DNA Probe Techniques", Academic Press Inc., Kapitel 13 (1992)). Allerdings berichten Morrison et al., dass das nicht-spezifische Binden eines Interkalators an andere Teile als die Teile, die an der Hybridisierung mit einer Sonde beteiligten sind, ein erhöhtes Rauschen ergibt.
Ein Verfahren für den Nachweis einer Zielnucleinsäure, basierend auf FREI unter Verwendung eines SYBR Green-Interkalators und einer Sonde, die mit einer CY5-Fluoureszenzmarkierung markiert wurde, ist beschrieben worden ( WO 99/28500 ). Allerdings ist berichtet worden, dass die Verwendung von SYBR Green und einer CY5-markierten Sonde in FREI zu hohem Rauschen führt und daher nicht für den praktischen Gebrauch geeignet ist (Cane, P. A. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 43: 1600–1608 (1999)).
Man kann überlegen, dass ein Polymorphismus leicht, gemäß einem vorstehend beschriebenen Verfahren, durch den Nachweis einer amplifizierten Nucleinsäure aufgefunden werden kann. Allerdings weisen die herkömmlichen Verfahren die folgenden Probleme in der praktischen Anwendung auf: Da die Arbeitsschritte der Verfahren kompliziert sind, sind Analysen, die zum Erhalt stabiler Signale für einen Wildtyp und einen Polymorphismus führen, schwer vorzunehmen, und eine Menge Arbeit ist erforderlich, um einen Polymorphismus genau zu identifizieren.
Zum Beispiel ist es im Falle einer Elektrophorese nötig, einen Wildtyp und einen Polymorphismus getrennt nachzuweisen, und es ist schwierig, eine Menge einer Nucleinsäure auf Grund eines elektrophoretischen Bildes numerisch exakt auszudrücken. Im Falle eines Southern-Blotting-Verfahrens oder eines Sandwich-Hybridisierungsverfahrens, ist es notwendig, die Bedingungen für eine Hybridisierungsreaktion mit einer Sonde, die bei dem Verfahren erforderlich ist, genau anzugleichen. Außerdem erfordert das Verfahren einen Schritt zur Entfernung der Überschusssonde. Daher ist diese Vorgehensweise sehr kompliziert.
Ein Verfahren, das FREI verwendet, ermöglicht eine gleichartige Analyse. Der Nachweis kann leicht durchgeführt werden, da er nicht die Entfernung von Überschusssonden oder Ähnliches erfordert. Jedoch ist es als zweifelhaft betrachtet worden, ob solch ein Verfahren wegen der nachstehend aufgeführten Gründe zum Nachweis eines genetischen Polymorphismus in der Praxis verwendet werden kann: Das Verfahren erfordert zwei Oligonucleotidsonden, die unterschiedliche Markierungen aufweisen, oder eine doppelt-markierte Sonde, spezifisch für jeden Polymorphismus. Des weiteren ist berichtet worden, dass das beschriebene Verfahren, das SYBR Green und eine CY5-markierte Sonde verwendet, wegen des hohen Rauschens wie vorstehend beschrieben, nicht geeignet ist für die praktische Anwendung.
Das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegt, ist daher Mittel bereitzustellen, die die vorstehend angedeuteten Probleme bewältigen, indem ein Verfahren, das einen eindeutigen und reproduzierbaren Nachweis eines Polymorphismus in einer Nucleinsäuresequenz ermöglicht, genauso wie ein Reagens dafür zur Verfügung gestellt wird. Die Lösung des technischen Problems wird durch Bereitstellen der in den Patentansprüchen dargelegten Ausführungsformen erreicht.
Um die vorstehend beschriebenen Probleme zu lösen, ist versucht worden, ein Verfahren zu finden, das den vorstehend bezeichneten, herkömmlichen Verfahren überlegen ist und eine einfache und eindeutige Identifizierung eines Polymorphismuses ermöglicht, ohne dass ein komplizierter Arbeitsablauf für den Nachweis oder viele teure, markierte Sonden nötig sind. Gemäß dem Verfahren wird ein markiertes Oligonucleotid für einen Wildtyp oder einen Mutantentyp mit einer Nucleinsäure hybridisiert, die eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält; einer Nucleinsäure-spezifischen Markierung wird gestattet, darauf einzuwirken; eine Interaktion zwischen der Markierung des Oligonucleotids und der Nucleinsäure-spezifischen Markierung wird nachgewiesen und ein Nucleotidpolymorphismus wird identifiziert. Ein Unterschied auf Grund des Nucleotidpolymorphismus unter den Bedingungen, bei denen das hybridisierte Oligonucleotid in einen Einzelstrang getrennt wird, wird in dem Verfahren bestimmt. Dadurch ist die vorliegende Erfindung vollendet worden.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend genauer zusammengefasst:

(1) Ein Verfahren zum Auffinden eines Nucleotidpolymorphismuses, wobei das Verfahren umfasst:
• die Hybridisierung eines markierten Oligonucleotids für einen Wildtyp oder einen Mutantentyp mit einer Nucleinsäure in einer Probe, die eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält;
• das Zulassen, dass eine Nucleinsäure-spezifischen Markierung auf das Gemisch von Oligonucleotid und der Nucleinsäure einwirkt;
• das Nachweisen einer Interaktion zwischen der Markierung des Oligonucleotids und der Nucleinsäure-spezifischen Markierung und
• das Auffinden eines Nucleotidpolymorphismus, wobei das Auffinden einen Unterschied auf Grund des Nucleotidpolymorphismus bei Bedingungen benutzt, unter denen das hybridisierte Oligonucleotid in einen Einzelstrang getrennt wird;
(2) das Verfahren gemäß (1), wobei die Nucleinsäure-spezifische Markierung eine Nucleinsäuredoppelstrang-spezifische Markierung ist;
(3) das Verfahren gemäß (1) oder (2), wobei die Nucleinsäure-spezifische Markierung ein Fluoreszenzfarbstoff ist;
(4) das Verfahren gemäß (3), wobei der Fluoreszenzfarbstoff als Nucleinsäure-spezifische Markierung eine Wellenlänge innerhalb eines Bereichs von 500 bis 600 nm aufweist;
(5) das Verfahren gemäß einem von (1) bis (4), wobei die Markierung des Oligonucleotids ein Fluoreszenzfarbstoff ist;
(6) das Verfahren gemäß (5), wobei der Fluoreszenzfarbstoff als Markierung des Oligonucleotids eine Anregungswellenlänge innerhalb eines Bereichs von 520 bis 580 nm aufweist;
(7) das Verfahren gemäß (5) oder (6), wobei der Fluoreszenzfarbstoff als Markierung des Oligonucleotids eine maximale Fluoreszenzwellenlänge von 580 nm oder mehr aufweist;
(8) das Verfahren gemäß einem von (1) bis (7), wobei die Interaktion Fluoreszenzresonanzenergietransfer ist;
(9) das Verfahren gemäß einem von (1) bis (8), wobei die Bedingungen, unter denen das hybridisierte Oligonucleotid in einen Einzelstrang getrennt wird, die Temperaturbedingungen sind;
(10) das Verfahren gemäß einem von (1) bis (9), wobei die Nucleinsäure in der Probe, die eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält, zuvor amplifiziert worden ist;
(11) das Verfahren gemäß einem von (1) bis (9), wobei einem Reaktionsgemisch, das mindestens ein Oligonucleotid für die Amplifikation, das markierte Oligonucleotid für einen Wildtyp oder einen Mutantentyp und die Nucleinsäure-spezifischen Markierung enthält, gestattet wird, auf die Nucleinsäure, die in der Probe eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält, einzuwirken, um eine Amplifikationsreaktion durchzuführen, wobei der Nucleotidpolymorphismus unter Verwendung des markierten Oligonucleotids und der Nucleinsäure-spezifischen Markierung, die in dem Reaktionsgemisch enthalten ist, identifiziert wird;
(12) das Verfahren gemäß (11), wobei das Reaktionsgemisch eine DNA-Polymerase enthält;
(13) das Verfahren gemäß (12), wobei die DNA-Polymerase in dem Reaktionsgemisch im Wesentlichen keine 5'-3'-Exonucleaseaktivität aufweist;
(14) ein Verfahren zum Auffinden eines Nucleotidpolymorphismus, wobei das Verfahren umfasst:
• das Hybridisieren eines markierten Oligonucleotids für einen Wildtyp oder einen Mutantentyp mit einer Nucleinsäure, die in einer Probe eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält;
• das Zulassen, dass die Nucleinsäure-spezifische Markierung auf das Gemisch des Oligonucleotids und der Nucleinsäure einwirkt;
• das Nachweisen einer Interaktion zwischen der Markierung des Oligonucleotids und der Nucleinsäure-spezifischen Markierung und
• das Auffinden eines Nucleotidpolymorphismus, wobei das Auffinden einen Unterschied auf Grund des Nucleotidpolymorphismus bei einer Temperatur benutzt, bei der das hybridisierte Oligonucleotid, nach langsamer Anhebung der Temperatur des Reaktionsgemischs, in einen Einzelstrang getrennt wird;
(15) das Verfahren gemäß (14), wobei die Nucleinsäure-spezifische Markierung eine Nucleinsäuredoppelstrang-spezifische Markierung ist;
(16) das Verfahren gemäß (14) oder (15), wobei die Nucleinsäure-spezifische Markierung ein Fluoreszenzfarbstoff ist;
(17) das Verfahren gemäß (16), wobei der Fluoreszenzfarbstoff als Nucleinsäure-spezifische Markierung eine Fluoreszenzwellenlänge innerhalb eines Bereichs von 500 bis 600 nm aufweist;
(18) das Verfahren gemäß einem von (14) bis (17), wobei die Markierung des Oligonucleotids ein Fluoreszenzfarbstoff ist;
(19) das Verfahren gemäß (18), wobei der Fluoreszenzfarbstoff als Markierung des Oligonucleotids eine Anregungswellenlänge innerhalb eines Bereichs von 520 bis 580 nm aufweist;
(20) das Verfahren gemäß (18) oder (19), wobei der Fluoreszenzfarbstoff als Markierung des Oligonucleotids eine maximale Fluoreszenzwellenlänge von 580 nm oder mehr aufweist;
(21) das Verfahren gemäß einem von (14) bis (20), wobei die Interaktion Fluoreszenzresonanzenergietransfer ist;
(22) das Verfahren gemäß einem von (14) bis (21), wobei die Nucleinsäure, die in einer Probe eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält, zuvor amplifiziert worden ist;
(23) das Verfahren gemäß einem von (14) bis (21), wobei einem Reaktionsgemisch, das mindestens ein Oligonucleotid für die Amplifikation, das markierte Oligonucleotid für einen Wildtyp oder einen Mutantentyp und die Nucleinsäure-spezifischen Markierung enthält, gestattet wird, auf die Nucleinsäure in der Probe, die eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält, einzuwirken, um eine Amplifikationsreaktion durchzuführen, wobei der Nucleotidpolymorphismus unter Verwendung des markierten Oligonucleotids und der Nucleinsäure- spezifischen Markierung, die in dem Reaktionsgemisch enthalten ist, identifiziert wird;
(24) das Verfahren gemäß (23), wobei das Reaktionsgemisch eine DNA-Polymerase enthält;
(25) das Verfahren gemäß (24), wobei die DNA-Polymerase in dem Reaktionsgemisch im Wesentlichen keine 5'-3'-Exonucleaseaktivität aufweist;
(26) ein Verfahren zum Auffinden eines Nucleotidpolymorphismus, wobei das Verfahren umfasst:
• das Hybridisieren eines fluoreszenzmarkierten Oligonucleotids für einen Wildtyp oder einen Mutantentyp mit einer einzelsträngigen Zielnucleinsäure;
• das Zulassen, dass ein Fluoreszenzfarbstoff als Nucleinsäuredoppelstrang-spezifische Markierung auf das Gemisch des Oligonucleotids und der Nucleinsäure einwirkt;
• das Messen des Fluoreszenzsignals, das sich aus einer Interaktion zwischen dem Fluoreszenzfarbstoff und der Fluoreszenzmarkierung des Oligonucleotids ergibt und
• das Bestimmen einer Temperatur, bei der nach langsamem Anheben der Temperatur des Reaktionsgemischs das Oligonucleotid in einen Einzelstrang getrennt wird, basierend auf einer Änderung des gemessenen Fluoreszenzsignals;
(27) das Verfahren gemäß (26), wobei der Fluoreszenzfarbstoff als Doppelstrangnucleinsäure-spezifische Markierung eine Fluoreszenzwellenlänge innerhalb eines Bereichs von 500 bis 600 nm aufweist;
(28) das Verfahren gemäß (26) oder (27), wobei die Fluoreszenzmarkierung des Oligonucleotids eine Anregungswellenlänge innerhalb eines Bereichs von 520 bis 580 nm aufweist;
(29) das Verfahren gemäß einem von (26) oder (28), wobei die Fluoreszenzmarkierung des Oligonucleotids eine maximale Fluoreszenzwellenlänge von 580 nm oder mehr aufweist;
(30) das Verfahren gemäß einem von (26) bis (29), wobei die Interaktion Fluoreszenzresonanzenergietransfer ist;
(31) das Verfahren gemäß einem von (26) bis (30), wobei die Nucleinsäure in der Probe, die eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält, zuvor amplifiziert worden ist;
(32) das Verfahren gemäß einem von (26) bis (30), wobei einem Reaktionsgemisch, das mindestens ein Oligonucleotid für die Amplifikation, das markierte Oligonucleotid für einen Wildtyp oder einen Mutantentyp und die Nucleinsäure-spezifischen Markierung enthält, gestattet wird, auf die Nucleinsäure in der Probe, die eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält, einzuwirken, um eine Amplifikationsreaktion durchzuführen, wobei der Nucleotidpolymorphismus unter Verwendung des markierten Oligonucleotids und der Nucleinsäure-spezifischen Markierung, die in dem Reaktionsgemisch enthalten ist, identifiziert wird;
(33) das Verfahren gemäß (32), wobei das Reaktionsgemisch eine DNA-Polymerase enthält;
(34) das Verfahren gemäß (33), wobei die DNA-Polymerase in dem Reaktionsgemisch im Wesentlichen keine 5'-3'-Exonucleaseaktivität aufweist.

Die Figuren zeigen:
1 stellt Schmelzkurven dar, die aus Analysen eines Polymorphismus des endothelialen Stickoxidsynthasegens aus Beispielproben erhalten wurden.
Bei 2 handelt es sich um eine Figur, die Signale von Amplifikationsprodukten veranschaulicht, die aus Analysen eines Polymorphismus des endothelialen Stickoxidsynthasegens aus Beispielproben erhalten wurden und eine Echtzeit-Amplifikation beschreibt.
3 stellt Schmelzkurven dar, die aus Analysen eines Polymorphismus des endothelialen Stickoxidsynthasegens aus Beispielproben erhalten wurden und eine Echtzeit-Amplifikation beschreibt.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend genauer erklärt. Es besteht keine besondere Beschränkung hinsichtlich einer Nucleinsäure (z. B. ein Chromosom oder ein Fragment davon), die eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält in einer Probe, solange es sich um eine Zielnucleinsäure handelt, die die Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält, die für die Information des Gens von Interesse verantwortlich ist. Beispiele der Zielnucleinsäuren schließen Alu-Sequenzen genauso wie Exons, Introns und Promotoren von Protein-codierenden Genen ein. Besonders Gene, die mit verschiedenen Erkrankungen (einschließlich genetischen Krankheiten), Arzneistoffmetabolismus und Lebensstil-bedingten Krankheiten (Bluthochdruck, Diabetes usw.) in Verbindung stehen, veranschaulichen beispielhaft Zielnucleinsäuren. Das Gen des Angiotensin I-Converting Enzym (ACE) dient beispielhaft als Gen, das mit Bluthochdruck in Verbindung steht.
Eine Nucleinsäuresequenz kann hierin einfach als Nucleinsäure bezeichnet werden. Eine Mutantentyp-Nucleinsäure bedeutet eine Nucleinsäure, in der mindestens eines der Nucleotide, vorzugsweise ein einzelnes Nucleotid, in einer Wildtyp-Nucleinsäure als Folge einer Punktmutation durch ein anderes Nucleotid ersetzt wurde, oder in der ein Teil einer Wildtyp-Nucleinsäure eine eingefügte oder entfernet Sequenz oder Ähnliches enthält und von der die Stelle des mutierten Nucleotids aufgeklärt worden ist. Unterschiede in den Konstitutionen oder Ähnlichem auf Grund solcher Nucleotidpolymorphismen sind aufgeklärt worden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Verfahren zur Untersuchung, ob eine Nucleinsäure in einer Probe solch eine erwartete Mutation aufweist oder nicht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine Reaktion zur Hybridisierung eines Oligonucleotids für einen Wildtyp oder einen Mutantentyp im Allgemeinen das Zulassen, dass das Oligonucleotid auf eine Zielnucleinsäure einwirkt, die, um einen Doppelstrang auszubilden, in einen Einzelstrang denaturiert worden ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Oligonucleotid für einen Wildtyp ein Oligonucleotid, das eine Sequenz aufweist, die komplementär zu einem Chromosom oder einem Fragment davon ist und eine Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält, die einen normalen Phänotyp zeigt. Auf der anderen Seite ist ein Oligonucleotid für einen Mutantentyp ein Oligonucleotid, das eine Sequenz aufweist, die komplementär zu einem Chromosom oder einem Fragment davon ist und eine Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält, die eine zum Wildtyp unterschiedliche Sequenz besitzt. Die Länge des Oligonucleotids reicht von 13 bis 35 Basen, vorzugsweise von 16 bis 30 Basen.
Einem der Oligonucleotide für einen Wildtyp und dem Oligonucleotid für einen Mutantentyp wird gestattet, erfindungsgemäß auf eine Probe einzuwirken, unter Bedingungen, bei denen jedes Oligonucleotid sowohl mit einer Wildtyp- als auch einer Mutantentyp-Sequenz hybridisiert. Wenn zum Beispiel einem Oligonucleotid, dessen 50%-Schmelzpunkt bei 70°C liegt, erlaubt wird, bei 50°C zu agieren, hybridisiert das Oligonucleotid ohne Unterschied sowohl mit einer Wildtyp- als auch einer Mutantentyp-Sequenz, um Doppelstränge auszubilden. Das hybridisierte Oligonucleotid wird dann Bedingungen unterworfen, bei denen das Oligonucleotid von einer Nucleinsäuresequenz in einen Einzelstrang getrennt wird. Die Bedingungen, unter denen das Oligonucleotid aus einem Hybrid, das mit einer Wildtyp-Sequenz gebildet wurde, in einen Einzelstrang getrennt wird, unterscheiden sich von denen für ein Hybrid, das mit der Mutantentyp-Sequenz gebildet wurde. Ein Nucleotidpolymorphismus kann durch Bestimmen der Differenz identifiziert werden.
Bedingungen, unter denen ein Oligonucleotid erfindungsgemäß in einen Einzelstrang getrennt wird, umfassen Temperatur, pH-Wert und elektrische Bedingungen, aber sind nicht darauf beschränkt, solange die Bedingungen dazu verwendet werden können, einen Nucleinsäure-Doppelstrang in Einzelstränge zu trennen. Zum Beispiel wird im Fall der Temperaturbedingungen ein Oligonucleotid in einen Einzelstrang getrennt durch das langsame Anheben der Temperatur, nachdem dem Oligonucleotid erlaubt wird, auf eine Nucleinsäuresequenz einzuwirken. In diesem Fall wird ein Oligonucleotid für einen Wildtyp, das mit einer Wildtyp-Sequenz hybridisiert ist, in einen Einzelstrang getrennt bei einer Temperatur, die höher liegt als die Temperatur, bei der das Oligonucleotid für einen Wildtyp, das mit einer Mutantentyp-Sequenz hybridisiert ist, in einen Einzelstrang getrennt wird. Ein Nucleotidpolymorphismus kann auf Grund der Temperaturdifferenz identifiziert werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Chromosom oder ein Fragment davon, das eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält, grundsätzlich unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens amplifiziert werden. Gewöhnlich wird eine Region zwischen einem Vorwärts-Primer und einem Rückwärts-Primer unter Verwendung einer Zielnucleinsäure als Matrize amplifiziert, indem ein Chromosom oder ein Fragment davon, das eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält und in einen Einzelstrang denaturiert worden ist, und in Anwesenheit von vier Arten von Desoxynucleosidtriphosphaten (dNTPs), einer DNA-Polymerase, dem Vorwärts-Primer und dem Rückwärts-Primer, zur Reaktion gebracht wird.
Zu den Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren gehören PCR, NASBA (Nucleic acid Sequence-base amplification method; Compton J., Nature, 350: 91 (1991)), LCR ( WO 89/12696 , JP-A 2-2934 ), SDA (engl.: Strand Displacement Amplification; Walker, G. T. et al., Nucleic Acids Res., 20: 1691 (1992)), RCR ( WO 90/1969 ) und TMA (Transcription mediated amplification method; Abe, C. et al., J. Clin. Microbiol., 31: 3270 (1993)).
Unter diesen ist das PCR-Verfahren ein Verfahren, bei dem eine Region einer Nucleinsäure in einer Probe zwischen einem Paar von Oligonucleotiden exponentiell amplifiziert wird, indem ein Zyklus, der aus drei Schritten besteht (d. h. Denaturierungs-, Anlagerungs- und Verlängerungsschritt), in Anwesenheit der Nucleinsäure in der Probe, vier Arten von Desoxynucleosidtriphosphaten (dNTPs), dem Oligonucleotidpaar und einer thermostabile DNA-Polymerase, wiederholt wird. Genauer wird die Nucleinsäure in der Probe während des Denaturierungsschrittes denaturiert, während des Anlagerungsschrittes werden die Oligonucleotide mit den dazu komplementären Regionen der Einzelstrangnucleinsäure in der Probe hybridisiert und während des Verlängerungsschrittes werden DNA-Stränge, die komplementär sind zu den entsprechenden Einzelstrangnucleinsäuren, die in der Probe als Matrizen dienen, von den Oligonucleotiden aus durch die Wirkung der DNA-Polymerase verlängert, um Doppelstrang-DNAs herzustellen. In einem Zyklus wird eine doppelsträngige DNA zu zwei doppelsträngigen DNAs amplifiziert. Theoretisch wird die Region der DNA in der Probe zwischen dem Oligonucleotidpaar durch n-maliges Wiederholen des Zykluses 2ⁿ-fach amplifiziert. Da die amplifizierte DNA-Region in großer Menge vorliegt, kann sie leicht unter Verwendung von Elektrophorese oder Ähnlichem nachgewiesen werden. Da ein Genamplifikationsverfahren dazu verwendet werden kann, Spuren einer Nucleinsäure in einer Probe nachzuweisen, die gemäß herkömmlichen Verfahren nicht nachgewiesen werden können (der Nachweis von einem Molekül ist möglich), ist es ein in letzter Zeit weit verbreitetes Verfahren.
Ein Nucleotidpolymorphismus wird erfindungsgemäß durch Amplifizieren eines Chromosoms oder eines Fragments davon, das eine spezifische Nucleotid- Polymorphismus-Stelle enthält, unter Verwendung des vorstehend aufgeführten Verfahrens identifiziert: Hybridisieren eines markierten Oligonucleotids für einen Wildtyp oder einen entsprechenden Mutantentyp dazu, einer Nucleinsäure-spezifischen Markierung gestatten, darauf einzuwirken und Bestimmen der Bedingungen, unter denen das hybridisierte Oligonucleotid in einen Einzelstrang getrennt wird. Alle für die Reaktionen notwendigen Reagenzien können in dem Reaktionsgemisch enthalten sein. Insbesondere eine Reaktion zur Amplifikation einer Nucleinsäure, gefolgt von einer Reaktion zum Nachweis eines Polymorphismus, können durchgeführt werden, ohne einen Deckel eines Reaktionsgefäßes zu öffnen, nachdem eine Zielnucleinsäure zu einem Reaktionsgemisch, das einen Primer für die Amplifikation, eine Polymerase, eine markierte Nachweissonde, ein Nucleinsäure-spezifisches Markierungsreagens und Ähnliches enthält, zugegeben wurde. Gemäß diesem Verfahren ist kein komplizierter Arbeitsablauf für den Nachweis erforderlich und das Risiko einer Kontamination mit einem Amplifikationsprodukt, das mit einem Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren verbunden ist, kann größten Teils reduziert werden.
Um erfindungsgemäß reproduzierbare Ergebnisse mit geringem Rauschen zu erhalten, ist es vorzuziehen, dass eine Markierung eines Oligonucleotids eine relative Absorptionsintensität von 0,25 oder mehr aufweist, vorzugsweise 0,3 oder mehr, stärker bevorzugt 0,35 oder mehr, am meisten bevorzugt 0,4 oder mehr (wobei die Intensität bei der maximalen Anregungswellenlänge als 1 definiert wird) bei einer Wellenlänge, bei der eine Nucleotid-spezifische Markierung eine relative Fluoreszenzintensität von 0,3 oder mehr aufweist (wobei die Fluoreszenzintensität bei der maximalen Fluoreszenzwellenlänge für die Nucleinsäure-spezifische Markierung als 1 definiert wird).
Es ist besonders vorzuziehen, dass die Anregungswellenlänge einer Oligonucleotidmarkierung innerhalb eines Bereichs von 520 bis 580 nm liegt. Vorzugsweise besitzt die Markierung des Oligonucleotids bei jeder Wellenlänge im Bereich von 520 bis 580 nm eine relative Absorptionsintensität von 0,05 oder mehr und weist eine relative Absorptionsintensität von 0,25 oder mehr auf, vorzugsweise 0,3 oder mehr, stärker bevorzugt 0,35 oder mehr, am meisten bevorzugt 0,4 oder mehr bei einer zwischen 520 und 580 nm gewählten Wellenlänge, wobei die Intensität bei der maximalen Anregungswellenlänge als 1 definiert wird.
Des weiteren ist es vorzuziehen, dass eine Nucleinsäure-spezifische Markierung eine Fluoreszenzwellenlänge innerhalb eines Bereichs von 500 bis 600 nm aufweist. Vorzugsweise besitzt die Nucleinsäure-spezifische Markierung bei einer zwischen 500 und 600 nm gewählten Wellenlänge eine relative Fluoreszenzintensität von 0,5 oder mehr, vorzugsweise 0,6 oder mehr, stärker bevorzugt 0,8 oder mehr, wobei die Fluoreszenzintensität bei der maximalen Fluoreszenzwellenlänge als 1 definiert wird. Stärker bevorzugt weist die Nucleinsäure-spezifische Markierung eine maximale Fluoreszenzwellenlänge innerhalb eines Bereichs von 500 bis 600 nm auf.
Es ist vorzuziehen, dass die Fluoreszenzwellenlänge für die Nucleinsäure-spezifische Markierung wenig mit der Fluoreszenzwellenlänge der Markierung des Oligonucleotids überlappt. Vorzugsweise beträgt die relative Fluoreszenzintensität der Nucleinsäure-spezifischen Markierung bei der zur Messung für die Markierung des Oligonucleotids verwendeten Fluoreszenzwellenlänge 0,25 oder weniger, vorzugsweise 0,2 oder weniger, stärker bevorzugt 0,15 oder weniger, wobei die Fluoreszenzintensität bei der maximalen Fluoreszenzwellenlänge für die Nucleinsäure-spezifische Markierung als 1 definiert wird.
Vorzugsweise wird die Messung der Fluoreszenz der Markierung des Oligonucleotids durchgeführt bei einer Wellenlänge, die eine relative Fluoreszenzintensität von 0,5 oder mehr ergibt, vorzugsweise 0,6 oder mehr, stärker bevorzugt 0,7 oder mehr, wobei die Fluoreszenzintensität bei der maximalen Fluoreszenzwellenlänge für die Markierung des Oligonucleotids als 1 definiert wird.
Des weiteren liegt die maximale Absorptionswellenlänge für die Markierung des Oligonucleotids vorzugsweise bei 580 nm oder mehr.
Die Eigenschaften, die die Anregungswellenlänge und die Fluoreszenzellenlänge betreffen, entsprechen denen in Lösungen, die nach der Amplifikation den praktischen Messungen unterzogen werden.
Jede Markierung kann als eine Markierung eines Oligonucleotids verwendet werden, so lange sie die vorstehend erwähnten Erfordernisse erfüllt und mit einer Nucleinsäure-spezifischen Markierung in Wechselwirkung tritt. Beispiele dazu umfassen ROX, Texas Red, LightCycler RED 640, LightCycler RED 705, TAMRA und Alexa Fluor 633. Die Markierung kann an jeder Stelle an ein Oligonucleotid gebunden sein, solange die Bindung nicht die Hybridisierung des Oligonucleotids beeinflusst. Die Markierung wird vorzugsweise an das 5'- oder 3'-Ende angebracht.
Es kann auch jede Nucleinsäure-spezifische Markierung verwendet werden, solange sie die vorstehend-erwähnten Erfordernisse erfüllt, insbesondere an eine Nucleinsäure bindet, die mit einem markierten Oligonucleotid in Reaktion gebracht worden ist, und mit der Markierung des Oligonucleotids in Wechselwirkdung tritt. Vorzugsweise handelt es sich um eine Nucleinsäure-Doppelstrang-spezifische Markierung. Zu den Nucleinsäure-Doppelstrang-spezifischen Markierungen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Stoffe, die in Doppelstränge interkalieren wie beispielweise SYBR Green I, Ethidiumbromid, Acridinorange, Thiazolorange, Oxazolgelb, Rhodamin und Pico Green, wobei SYBR Green I und Pico Green bevorzugt werden.
Eine Kombination aus Nucleinsäure-spezifischer Markierung und Markierung des Oligonucleotids kann gemäß den vorstehend erwähnten Kriterien ausgewählt werden. Eine beispielhaft Kombination besteht insbesondere aus: SYBR Green I und ROX; SYBR Green I und Texas Red; SYBR Green I und LightCycler RED 640; SYBR Green I und LightCycler RED 705; SYBR Geen I und TAMRA; SYBR Green I und Alexa Fluor 633; Pico Green und ROX; Pico Green und Texas Red; Pico Green und LightCycler RED 640; Pico Green und LightCycler RED 705; Pico Green und TAMRA oder Pico Green und Alexa Fluor 633. Die Kombination besteht vorzugsweise aus SYBR Green I und Texas Red; SYBR Green I und LightCycler RED 640 oder SYBR Green I und LightCycler RED 705, wobei die Kombination aus SYBR Green I und Texas Red stärker bevorzugt wird.
Kit
Die erfindungsgemäßen Kits schließen ein Kit mit den Reagenzien für den Nachweis eines Nucleotidpolymorphismus ein, das ein markiertes Oligonucleotid für einen Wildtyp oder einen Mutantentyp und eine Nucleinsäure-spezifische Markierung enthält.
Wird der Nachweis in Kombination mit der Amplifikation durchgeführt, enthält der Kit des weiteren einen Vorwärts-Primer, einen Rückwärts-Primer, eine DNA-Polymerase und vier Arten von Desoxyribonucleosidtriphosphaten (dNTPs).
Jede DNA-Polymerase kann verwendet werden, solange sie für die Verlängerung eines Primers und für die Amplifikationsreaktionen verwendet werden kann. Vorzugsweise besitzt die DNA-Polymerase keine wesentliche 5'-3'-Exonucleaseaktivität.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung genauer, sind aber nicht dahingehend ausgelegt, deren Schutzbereich einzuschränken.
Beispiel 1: Nachweis eines Nucleotidpolymorphismus auf dem endothelialen Stickoxidsynthasegen
(1) Synthese der Oligonucleotide für den Nachweis eines Polymorphismus an der 298ten Position im endothelialen Stickoxidsynthasegen
Oligonucleotide, die Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 1 bis 3 (hierin als Oligos 1 bis 3 bezeichnet) besitzen, wurden von DNA-Synthesefirmen (Nippon Bio Service (JBioS), Sawady Technology, Genset KK, Amersham Pharmacia Biotech, usw.) nach unseren Vorgaben synthetisiert.
Oligo 1 hat eine Sequenz, die an der polymorphen Stelle, an der zehnten Position vom 5'-Ende, ein „G" enthält, und ist mit Texas Red am 5'-Ende markiert. Es ist am 3'-Ende mit Didesoxy modifiziert.
(2) Analyse eines Polymorphismus des endothelialen Stickoxidsynthasegens unter Verwendung von Schmelzkurven
(i) Amplifikationsreaktionen gemäß dem PCR-Verfahren
Nucleinsäurefragmente, die eine Nucleotid-Polymorphismus-Stelle (Glu298Asp; GAG (Glu) → GAT (Asp)) des menschlichen endothelialen Stickoxidsynthasegens enthalten, werden amplifiziert. Die Amplifikationsreaktionen wurden unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt, wobei als Proben DNA-Lösungen verwendet wurden, die aus menschlichen Leukocyten, gemäß einem Phenol/Chloroform-Verfahren extrahiert wurden, und nachstehende Reagenzien zugegeben wurden.
Reagenzien:
Eine Lösung von 25 μl, die die folgenden Reagenzien enthält, wurde hergestellt: Taq-DNA-Polymerasereaktionsgemisch:

Oligo 2 4 pmol

Oligo 3 20 pmol

× 10 Puffer 2,5 μl

2 mM dNTPs 2,5 μl

25 mM MgCl₂ 1,5 μl

Taq-DNA-Polymerase (Toyobo) 1 U

Extrahierte DNA-Lösung 20 ng
Amplifikationsbedingungen:

95°C für die Dauer von 5 Minuten;
95°C für die Dauer von 30 Sekunden; 60°C für die Dauer von 30 Sekunden,
72°C für die Dauer von 30 Sekunden (35 Zyklen);
72°C für die Dauer von 2 Minuten.

(ii) Nachweis mittels Schmelzkurven
Die Nachstehenden Reagenzien (5 μl) wurden zu 25 μl eines jeden Amplifikationsreaktionsgemisches aus (i) gegeben. Die Gemische wurden in Kapillarreaktionsgefäße für den LightCycler (Roche) überführt. Die Kapillarreaktionsgemische wurden in dem LightCycler platziert und die Schmelzkurven wurden unter den nachstehenden Bedingungen erstellt.
Reagenzien
Eine Lösung von 5 μl, die die folgenden Reagenzien enthält, wurde hergestellt:

1000-fach verdünntes SYBR Green I (Molecular Probes) 1,2 μl

200 mM EDTA (pH 8,0) 1 μl

Oligo 1 10 pmol
Reaktionsbedingungen

95°C für die Dauer von 1 Sekunde;
50°C für die Dauer von 1 Minute;

Die Temperatur wurde mit einer Rate von 0,5°C/Sekunde von 50°C auf 95°C angehoben und die Fluoreszenz wurde mit STEP gemessen.
Die so erhaltenen Schmelzkurven sind in 1 gezeigt. In der Figur stellen die offenen Kreise die Ergebnisse eines homozygoten Wildtyps (G/G) dar, die Quadrate stellen die Ergebnisse eines Heterozygoten (G/T) dar, die offenen Dreiecke stellen die Ergebnisse eines polymorphen Homozygoten (T/T) dar und „x" stellt die Ergebnisse der Leerprobe dar. Wie aus der Figur zu ersehen, wurde im Fall einer Sequenz, die vollständig komplementär zu Oligo 1 ist, eine Schmelzkurve erhalten, die bei etwa 70°C einen Peak aufweist; im Fall einer homozygoten, polymorphen Sequenz wurde eine Schmelzkurve erhalten, die einen Peak bei etwa 65°C aufweist und im Fall einer heterozygoten Sequenz wurden zwei Peaks bei etwa 65 und 70°C erhalten.
Die erforderliche Gesamtzeit betrug mehrere Minuten.
Wie vorstehend beschrieben kann ein genetischer Polymorphismus in einer Zielnucleinsäure leicht und schnell, ohne einen komplizierten Arbeitsablauf, eindeutig bestimmt werden durch die Amplifikation eines Nucleinsäurefragments, das eine Sequenz der polymorphen Stelle enthält; das Hybridisieren eines markierten Oligonucleotids, das die polymorphe Stelle enthält; dem Zulassen, dass eine Nucleinsäure-spezifische Markierung darauf einwirkt, und dem Messen der Temperatur bei der das markierte Oligonucleotid in einen Einzelstrang dissoziiert.
(iii) Analysen eines Polymorphismus im endothelialen Stickoxidsynthasegen unter Verwendung einer Echtzeit-Amplifikation zuzüglich Schmelzkurven
DNA-Lösungen, die gemäß einem Phenol/Chlorform-Verfahren aus menschlichen Leukocyten extrahiert wurden, wurden als Proben verwendet. Die nachstehenden Reagenzien wurden zugegeben. Die Gemische wurden in Kapillarreaktionsgefäße für den LightCycler (Roche) überführt. Die Kapillarreaktionsgemische wurden in den LightCycler platziert. Nucleinsäurefragmente, die eine Nucleotid-Polymorphismus-Stelle (Glu298Asp) des endothelialen Stickoxidsynthasegens enthalten, wurden unter den nachstehenden Bedingungen amplifiziert. Dann wurden, ohne die Deckel der Reaktionsgefäße zu öffnen, Schmelzkurven erstellt, wobei eine markierte Oligonucleotidsonde, die in den Reaktionsgemischen enthalten war, verwendet wurde.
Reagenzien

Eine Lösung von 25 μl, die die folgenden Reagenzien enthält, wurde hergestellt:

Oligo 1	10 pmol
Oligo 2	4 pmol
Oligo 3	20 pmol
× 10 Puffer	2,5 μl
2 mM dNTPs	2,5 μl
25 mM MgCl₂	1,25 μl
KOD plus-DNA-Polymerase (Toyobo)	1 U
3000-fach verdünntes SYBR Green I (Molecular Probes)	2,5 μl
2,5 mg/ml BSA	2,5 μl
Extrahierte DNA-Lösung	20 ng

Amplifikations-/Nachweisbedingungen:
Amplifikationszyklus:

95°C für die Dauer von 1 Minute;
95°C für die Dauer von 1 Sekunde; 60°C für die Dauer von 10 Sekunden,
72°C für die Dauer von 3 Sekunden (40 Zyklen);

Schmelzkurvenzyklus:

95°C für die Dauer von 1 Sekunde;
50°C für die Dauer von 1 Minute;

Die Temperatur wurde mit einer Rate von 0,5°C/Sekunde von 50°C auf 95°C angehoben und die Fluoreszenz wurde mit STEP gemessen.
Die so erhaltenen Signale von SYBR Green I für die Amplifikationsprodukte sind in 2 und die Schmelzkurven in 3 gezeigt. In den Figuren stellen die offenen Kreise die Ergebnisse eines homozygoten Wildtyps (G/G) dar, die offenen Quadrate stellen die Ergebnisse eines Heterozygoten (G/T) dar, die offenen Dreiecke stellen die Ergebnisse eines polymorphen Homozygoten (T/T) dar und „x" stellt die Ergebnisse der Leerprobe dar. Wie aus 2 zu ersehen, konnte die Amplifikation, basierend auf den Signalen von SYBR Green I, eindeutig in einer Echtzeit-Art und Weise beobachtet werden. Wie bei den Schmelzkurven, die nach den Messungen der Signale erstellt wurden, wurde im Fall einer Sequenz, die vollständig komplementär zu Oligo 1 ist, eine Schmelzkurve erhalten, die bei etwa 70°C einen Peak aufweist; im Fall einer homozygoten, polymorphen Sequenz wurde eine Schmelzkurve erhalten, die einen Peak bei etwa 65°C aufweist, und im Fall einer heterozygoten Sequenz wurden zwei Peaks bei etwa 65 und 70°C erhalten.
Die erforderliche Gesamtzeit betrug etwa 30 Minuten.
Die relativen Absorptionsintensitäten bei 520 nm, 550 nm und 580 nm für Texas Red waren 0,07, 0,31 beziehungsweise 0,63, wobei die Absorptionsintensität bei der maximalen Absorptionswellenlänge als 1 definiert wird. Die relativen Fluoreszenzintensitäten bei 520 nm, 550 nm und 580 nm für SYBR Green I waren 1,00, 0,62 beziehungsweise 0,29, wobei die Absorptionsintensität bei der maximalen Fluoreszenzwellenlänge als 1 definiert wird.
SYBR Green I wurde mit 495 nm angeregt und die Messung der Fluoreszenz von Texas Red wurde mit einem 620 nm-Filter durchgeführt. In diesem Fall war die relative Fluoreszenzintensität für Texas Red 1 und die relative Fluoreszenzintensität für SYBR Green war 0,13, wobei jeweils die Absorptionsintensität bei der maximalen Fluoreszenzwellenlänge als 1 definiert wird.
Die maximale Absorptionswellenlänge für Texas Red liegt bei etwa 590 nm.
Die Messungen konnten unter Verwendung von ROX, LightCycler RED 640 oder LightCycler RED 705 als Markierung eines Oligonucleotids an Stelle von Texas Red in ähnlicher Weise durchgeführt werden (für die Messung unter Verwendung von LightCycler RED 705 wurde ein 700 nm-Filter verwendet).
Wie vorstehend beschrieben, konnte ein genetischer Polymorphismus in einer Zielnucleinsäure leicht und schnell, ohne komplizierten Arbeitsablauf und ohne das Zufügen eines Reaktionsgemisches oder dem Öffnen/Schließen eines Reaktionsgefäßes, eindeutig bestimmt werden. Die Bestimmung wurde durchgeführt, indem ein Nucleinsäurefragment, das eine Sequenz einer polymorphen Stelle enthält, amplifiziert wurde; ein markiertes Oligonucleotid, das die polymorphe Stelle enthält, hybridisiert wurde; einer Nucleinsäure-spezifische Markierung gestattet wurde, darauf einzuwirken und die Temperatur, bei der das markierte Oligonucleotid in einen Einzelstrang dissoziiert, gemessen wurde.

SEQ ID NO: 1: Eine synthetische DNA mit einer Sequenz, die eine Nucleotid-Polymorphismus-Stelle (Glu298Asp) des menschlichen endothelialen Stickoxidsynthasegens aufweist.
SEQ ID NO: 2: Eine synthetische DNA, die eine Sequenz des menschlichen endothelialen Stickoxidsynthasegens aufweist.
SEQ ID NO: 3: Eine synthetische DNA mit einer Sequenz, die komplementär zum menschlichen endothelialen Stickoxidsynthasegen ist.

SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zum Auffinden eines Nucleotidpolymorphismus, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Hybridisieren eines markierten Oligonucleotids mit einer Nucleinsäure, die eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält, in einer Probe, wobei das Oligonucleotid eine Sequenz hat, die komplementär zu einer Wildtyp- oder Mutantentyp-Sequenz an der spezifischen Nucleotid-Polymorphismus-Stelle in der Nucleinsäure ist, und die Markierung des Oligonucleotids Texas-Rot oder LightCycler RED 640 ist; (b) das Zulassen, dass die Nucleinsäure-spezifische Markierung auf das Gemisch des Oligonucleotids und der Nucleinsäure einwirkt, wobei die Nucleinsäure-spezifische Markierung ein Donor-Fluoreszenzfarbstoff ist, der in Doppelstränge interkaliert; (c) das Nachweisen einer Interaktion zwischen der Markierung des Oligonucleotids und der Nucleinsäure-spezifischen Markierung, wobei die Interaktion Fluoreszenzresonanzenergietransfer ist; und (d) das Auffinden eines Nucleotidpolymorphismus, wobei das Auffinden einen Unterschied auf Grund des Nucleotidpolymorphismus bei Bedingungen benutzt, unter denen das hybridisierte Oligonucleotid in einen Einzelstrang getrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bedingungen, unter denen das hybridisierte Oligonucleotid in einen Einzelstrang getrennt wird, Temperaturbedingungen sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Interaktion zwischen der Markierung des Oligonucleotids und der Nucleinsäure-spezifischen Markierung durch Messen eines Fluoreszenzsignals nachgewiesen wird, das aus der Interaktion zwischen dem Fluoreszenzfarbstoff und der Fluoreszenzmarkierung des Oligonucleotids in Schritt (c) entsteht, und ein Nucleotidpolymorphismus durch Bestimmen einer Temperatur auf Grund einer Änderung des in Schritt (d) gemessenen Fluoreszenzsignals nachgewiesen wird, bei der das Oligonucleotid nach Anstieg der Temperatur des Reaktionsgemisches in einen Einzelstrang getrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Donor-Fluoreszenzfarbstoff als die Nucleinsäure-spezifische Markierung eine Emissionswellenlänge in einem Bereich von 500 bis 600 nm hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure, die eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle enthält, zuvor in der Probe amplifiziert worden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Reaktionsgemisch, das zumindest ein Oligonucleotid zur Amplifikation, das markierte Oligonucleotid und die Nucleinsäure-spezifische Markierung enthält, um auf die Nucleinsäure einwirken gelassen wird, die eine spezifische Nucleotid-Polymorphismus-Stelle in der Probe enthält, um eine Amplifikationsreaktion durchzuführen, und der Nucleotidpolymorphismus nachgewiesen wird, indem das markierte Oligonucleotid und die Nucleinsäure-spezifische Markierung verwendet werden, die in dem Reaktionsgemisch enthalten sind.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Reaktionsgemisch eine DNA-Polymerase enthält.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die DNA-Polymerase in dem Reaktionsgemisch keine 5'-3'-Exonucleaseaktivität hat.