DE60035691T2 - Verfahren zur Erkennung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen - Google Patents

Verfahren zur Erkennung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Description

  • Diese Erfindung betrifft Verbesserungen bei und zusammenhängend mit der Analyse von DNA, insbesondere, aber nicht ausschließlich, mit Techniken, die Einzelnucleotidpolymorphismen für Untersuchungszwecke verwenden.
  • Bei forensischen Untersuchungen und der Analyse für andere Zwecke ist es bekannt, bi-allelische Marker oder Einzelnucleotidpolymorphismen (SNPs) zu nutzen. SNPs stellen Einzelbasenorte dar, an denen Variationen der Sequenz bei einem Lebewesen und einem anderen auftreten können. Ein SNP kann z.B. das Vorhandensein von G oder C oder von A oder T in der Sequenz eines Individuums sein, wobei einige der Individuen eine der Optionen aufweisen und andere Individuen die andere Option aufweisen. Durch Betrachtung einer großen Zahl solcher SNPs an unterschiedlichen Orten bzw. Loki kann ein Satz von SNP-Ergebnissen für ein Individuum erhalten werden, der für Untersuchungszwecke nützlich ist. Die Ergebnisse können verglichen werden mit den Ergebnissen aus einer anderen Probe, mit dem statistischen Auftreten dieses Satzes von Ergebnissen innerhalb der Bevölkerung als Ganzes oder sie können auf andere Weise verwendet werden.
  • Da SNPs jeweils nur darin variieren können, dass sie eine von zwei Optionen sind, ist es nötig, eine wesentliche Zahl unterschiedlicher Orte, im Allgemeinen etliche 100 Loki, zu untersuchen, um einen Satz von Ergebnissen zu erlangen, der in Vergleichen oder anderen Verwendungen statistisch signifikant ist. Das Analysieren solch einer großen Zahl von Loki zum Bestimmen der Identität von SNPs darauf ist in hohem Maße zeitaufwändig, wenn die Loki einzeln betrachtet werden und bringt signifikante Kompatibilitäts- und Zuverlässigkeitsprobleme mit sich, wenn Multiplexe verwendet werden, um eine Zahl dieser Loki simultan zu untersuchen.
  • Die GB-A-2312747 stellt eine SNP-Untersuchungstechnik bereit. In einer späteren Amplifikationsstufe verwendet sie jedoch einen einzelnen Primer zum Amplifizieren aller Produkte aus den früheren Amplifikationen. Im Ergebnis wird eine vollständig separate bzw. abgetrennte und zusätzliche Stufe zum Untersuchen der SNP-Identitäten benötigt. Die WO-A-9325563 amplifiziert die das Ziel enthaltende Sequenz und sondiert bzw. untersucht dann spezifisch auf das Ziel unter Verwendung von Sonden, die eine individuelle Schwanzsequenz ("single tail sequence") haben. Eine Amplifikation unter Verwendung dieser Schwanzsequenz bedeutet wiederum, dass der Amplifikationsprozess selbst nicht zwischen Identitäten unterscheiden kann. Methods in molecular Biology, US, Humana press Inc., Clifton, N.J. (1991) Band 9, S. 77–84, XP775640 und Science, Band 280, 15.05.1998, S. 1077–1081, XP2089389 stellen beide eine Technik zur SNP-Untersuchung bereit, sprechen aber die von der vorliegenden Erfindung gelösten Probleme nicht an.
  • Die vorliegende Erfindung hat u.a. eine Technik zur Verbesserung SNP-basierter Untersuchungen, insbesondere solcher, bei denen die ursprünglichen Probenkonzentrationen sehr klein sind, zum Ziel. Verbesserungen der Spezifität der Ergebnisse und hinsichtlich der Einfachheit, mit der eine sehr große Zahl solcher SNPs gleichzeitig untersucht werden kann, werden in Betracht gezogen.
  • Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung stellen wir ein Verfahren zum Untersuchen von Einzelnucleotidpolymorphismen in einer DNA-Probe bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    In-Kontakt-Bringen der DNA-enthaltenden Probe mit einem ersten Primersatz, wobei die ersten Primersätze zwei oder mehr Primer, die einen lokusspezifischen Teil und einen weiteren Teil einschließen, wobei der weitere Teil mindestens eines der Primer unterschiedlich zu dem weiteren Teil mindestens eines der anderen Primer ist, enthalten,
    Amplifikation der DNA, wobei die Amplifikation die ersten Primersätze verwendet, um ein amplifiziertes Produkt zu liefern, wobei das amplifizierte Produkt eine zu dem lokusspezifischen Teil und weiteren Teil eines ersten Primersatzes komplementäre Sequenz einschließt,
    In-Kontakt-Bringen von mindestens einem Teil des amplifizierten Produkts mit mindestens einem zweiten Primersatz,
    Amplifikation des ersten amplifizierten Produkts, um ein weiter amplifiziertes Produkt durch Hybridisierung mindestens eines aus dem zweiten Primersatz an den Teil des ersten amplifizierten Produkts mit einer zu dem weiteren Teil komplementären Sequenz zu liefern, und
    Untersuchung einer oder mehrerer Eigenschaften des weiter amplifizierten Produkts durch Verwendung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Unterscheidungseinheit, die durch Hybridisierung eines Bestandteils, der die Unterscheidungseinheit enthält, an die zu dem weiteren Teil komplementäre Sequenz eingeführt wird.
  • Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung stellen wir eine Mehrzahl bzw. Vielzahl von Primer zur Untersuchung von Einzelnukleotidpolymorphismen in der DNA- Probe bereit, wobei die Mehrzahl bzw. Vielzahl von Primer zwei oder mehr Primer eines ersten Primersatzes und/oder zwei oder mehr Primer eines zweiten Primersatzes umfasst,
    wobei der erste Primersatz zwei oder mehr Primer, die einen lokusspezifischen Teil und einen weiteren Teil einschließen, wobei der weitere Teil mindestens eines der Primer unterschiedlich zu dem weiteren Teil mindestens eines der anderen Primer ist, einschließt,
    der zweite Primersatz mindestens einen Primer, der eine äquivalente Sequenz zum weiteren Teil mindestens eines des ersten Primersatzes hat, einschließt, und folglich mit einer Sequenz, die komplementär zum lokusspezifischen Teil und weiteren Teil eines Primers des ersten Satzes ist, hybridisieren wird.
  • Der/die erste und/oder zweite Gesichtspunkt(e) der Erfindung kann (können) beliebige der Merkmale, Optionen oder Möglichkeiten, die an anderer Stelle in dieser Anmeldung dargelegt sind, enthalten bzw. umfassen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung können einer oder mehrere, bevorzugt alle der ersten Primersätze zwei Forward-Primer bzw. Vorwärts-Primer und einen Reverse-Primer bzw. Rückwärts-Primer enthalten bzw. umfassen. Einer oder mehrere, bevorzugt alle der ersten Primersätze können aus zwei Forward- und einem Reverse-Primer bestehen. Die Forward-Primer und Reverse-Primer enthalten bzw. umfassen bevorzugt Sequenzen, die sich an die 3'- bzw. 5'-Seiten des SNP an dem Lokus, der den zu untersuchenden SNP enthält, anlagern.
  • In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung können ein oder mehrere, bevorzugt alle der ersten Primersätze einen Forward-Primer und einen Reverse-Primer enthalten. Einer oder mehrere, bevorzugt alle der ersten Primersätze können aus einem Forward-Primer und einem Reverse-Primer bestehen. Der Forward-Primer und der Reverse-Primer enthalten bzw. umfassen bevorzugt Sequenzen, die sich an die 3'- bzw. 5'-Seiten des SNP an dem Lokus, der den zu untersuchenden SNP enthält, anlagern bzw. damit paaren.
  • Der erste Primersatz kann einen oder mehrere Primer enthalten, die einen lokusspezifischen Teil und einen weiteren Teil enthalten. Bevorzugt werden die Forward-Primer so bereitgestellt. Bevorzugt ist der weitere Teil an das 5'-Ende des lokusspezifischen Teils gebunden, insbesondere im Falle von Forward-Primern. Das 3'-Ende des Forward-Primers ist bevorzugt mit einem SNP-identifizierenden Teil versehen. Der weitere Teil ist bevorzugt über einen SNP-verwandten Teil an den lokusspezifischen Teil gebunden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung schließt der lokusspezifische Teil bevorzugt eine Sequenz ein, die zu der Sequenz der Lokussequenz in der Nachbarschaft des zu untersuchenden SNP passt bzw. damit übereinstimmt. Die Übereinstimmung kann an 2 bis 10 Basen zu den jeweiligen Seiten des zu untersuchenden SNP auftreten. Bevorzugter passt die Sequenz zu der Lokussequenz für die an den zu untersuchenden SNP angrenzende Lokussequenz, und zwar idealerweise bis zu und einschließlich des Nucleotids vor dem SNP auf der 3'-Seite des SNP. Bevorzugt werden die Forward-Primer eines ersten Primersatzes mit identischen Sequenzen für den lokusspezifischen Teil bereitgestellt.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist der SNP-identifizierende Teil bevorzugt ein einzelnes Nucleotid. Der SNP-identifizierende Teil kann ein C zur Untersuchung eines SNP sein, wobei der SNP ein G-Nucleotid sein kann. Der SNP-identifizierende Teil kann ein G-Nucleotid zur Untersuchung eines SNP sein, wobei der SNP ein C-Nucleotid sein kann. Der SNP-identifizierende Teil kann ein T-Nucleotid zur Untersuchung eines SNP sein, wobei der SNP ein A-Nucleotid sein kann. Der SNP-identifizierende Teil kann ein A-Nucleotid zur Untersuchung eines SNP sein, wobei der SNP ein T-Nucleotid sein kann. Bevorzugt ist der SNP-identifizierende Teil für einen Forward-Primer eines Satzes eines aus C oder G oder A oder T, wobei der SNP-identifizierende Teil des anderen Forward-Primers des Satzes eines aus C oder G oder A oder T ist, jedoch vom SNP-identifizierenden Teil des ersten Forward-Primers des Satzes verschieden ist. Bevorzugt werden die SNP-identifizierenden Teile bereitgestellt, um die zwei möglichen Variationen des fraglichen SNP zu targetieren, z.B. C und T für die Primer zum Untersuchen von G oder A für den SNP, C oder G für den Primer zum Untersuchen von G oder C für den SNP usw.
  • Bevorzugt bildet der SNP-identifizierende Teil das 3'-Ende der Forward-Primer des ersten Satzes.
  • Eine Exonucleaseverdau-Verhinderungseinheit kann zum 3'-Ende der Forward-Primer hin bereitgestellt werden. Die Exonucleaseverdau-Verhinderungseinheit kann Phosphorthioat sein. Die Exonucleaseverdau-Verhinderungseinheit kann an der Verbindung des lokusspezifischen Teils und des SNP-identifizierenden Teils bereitgestellt werden.
  • Der weitere Teil umfasst bzw. schließt bevorzugt eine Sequenz ein, die nicht zu der Lokussequenz an der 3'-Seite der Lokussequenz des Lokus passt, die zu dem lokusspezifischen Teil des Primers passt. Bevorzugter passt die Sequenz nicht zu der Sequenz des Lokus in der Nachbarschaft des zu untersuchenden SNP. Idealerweise lagert sich die Sequenz nicht an und passt insbesondere nicht zu der Sequenz eines beliebigen publizierten Teils, idealerweise eines beliebigen Teils, der gesamten DNA-Sequenz der Entität bzw. Gesamtheit, aus der die DNA, die den zu untersuchenden SNP enthält, erhalten wurde, z.B. Homo Sapiens. Die Unfähigkeit der Sequenz des weiteren Teils, humane DNA zu amplifizieren, ist ein besonders bevorzugtes Merkmal. Vorzugsweise sind die Forward-Primer eines ersten Primersatzes mit identischen Sequenzen für den weiteren Teil ausgestattet.
  • Bevorzugt bildet der weitere Teil das 5'-Ende der Forward-Primer des ersten Satzes. Der weitere Teil von zwei oder mehr der Forward-Primer des ersten Satzes kann eine äquivalente Sequenz haben. Alle Forward-Primer des ersten Satzes können mit weiteren Teilen von äquivalenter Sequenz ausgestattet sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der weitere Teil mindestens eines Forward-Primers des ersten Satzes verschieden vom weiteren Teil mindestens eines der anderen Forward-Primer des ersten Satzes, zumindest teilweise. Bevorzugt ist der weitere Teil jedes Forward-Primers des ersten Satzes verschieden von dem weiteren Teil jedes der anderen Forward-Primer des ersten Satzes, zumindest teilweise. Es ist bevorzugt, dass die Forward-Primer von einander im Hinblick auf mindestens 25 % der Nucleotide, die den weiteren Teil der Forward-Primer bilden, verschieden sind. Unterschiede in der Sequenz, die von 25 % bis 100 % der Nucleotide reichen, die den weiteren Teil der Forward-Primer bilden, können eingesetzt werden. Die Unterschiede in der Sequenz können einen oder mehrere unterscheidende Teile bilden. Ein oder mehrere unterscheidende Teile können als der oder innerhalb des weiteren Teil(s) der Forward-Primer bereitgestellt werden. Ein unterscheidender Teil kann am 5'-Ende des weiteren Teils des Forward-Primers bereitgestellt werden. Der unterscheidende Teil kann am 3'-Ende des weiteren Teils des Forward-Primers bereitgestellt werden. Bevorzugt wird der unterscheidende Teil an einer intermediären Position innerhalb der Sequenz des weiteren Teils bereitgestellt. Bevorzugt definieren ein 5'-Ende-Teil, ein unterscheidender Teil und ein 3'-Ende-Teil den weiteren Teil der Forward-Primer.
  • Der weitere Teil von einem oder mehreren der Primer im ersten Satz kann mit einem oder mehreren Teilen, die einem oder mehreren Teilen im weiteren Teil eines oder mehrerer der anderen Primer im ersten Satz entsprechen, bereitgestellt werden. Die Nucleotide des weiteren Teils von einem oder mehreren der Forward-Primer können zu den Nucleotiden eines der anderen Forward-Primer äquivalent sein, und zwar außerhalb des unterscheidenden Teils des weiteren Teils. Insbesondere können der 5'-Ende-Teil und/oder 3'-Teil des weiteren Teils eines oder mehrerer der Forward-Primer äquivalent zu dem entsprechenden weiteren Teil eines oder mehrerer der anderen Forward-Primer sein. Bevorzugt sind alle Forward-Primer mit zueinander äquivalenten 5'-Ende- und/oder 3'-Ende-Teilen ausgestattet. Die äquivalenten Teile können zwischen 1 und 25 % der Sequenz des weiteren Teils der Primer bilden. Bevorzugt bilden die äquivalenten Teile zwischen 10 und 25 % der Sequenz der weiteren Teile. Die Reverse-Primer oder Primer des ersten Satzes können ebenfalls mit äquivalenten Teilen ausgestattet sein.
  • Der SNP-verwandte bzw. SNP-bezogene Teil ist bevorzugt ein einzelnes Nucleotid. Der SNP-verwandte Teil ist vorzugsweise zu dem SNP-identifizierenden Teil dieses Primers identisch. Vorzugsweise sind die zwei Forward-Primer mit SNP-verwandten Teilen ausgestattet, die hinsichtlich ihrer jeweiligen SNP-identifizierenden Teile identisch sind. Der SNP-verwandte Teil kann ein C zur Untersuchung eines SNP sein, wobei der SNP ein G-Nucleotid sein kann. Der SNP-verwandte Teil kann ein G-Nucleotid zur Untersuchung eines SNP sein, wobei der SNP ein C-Nucleotid sein kann. Der SNP-verwandte Teil kann ein T-Nucleotid zur Untersuchung eines SNP sein, wobei der SNP ein A-Nucleotid sein kann. Der SNP-verwandte Teil kann ein A-Nucleotid zur Untersuchung eines SNP sein, wobei der SNP ein T-Nucleotid sein kann. Vorzugsweise ist der SNP-verwandte Teil für einen Forward-Primer eines Satzes eines aus C oder G oder A oder T, wobei der SNP-verwandte Teil des anderen Primers des Satzes eines aus C oder G oder A oder T, jedoch verschieden von dem SNP-verwandten Teil des ersten Primers des Satzes ist. Vorzugsweise werden die SNP-verwandten Teile für die Primer eines Satzes bereitgestellt, um zu dem SNP-identifizierenden Teil ihrer jeweiligen Primer zu passen.
  • Während der Amplifikation resultiert der SNP-verwandte Teil bevorzugt in amplifizierten Kopien des Lokus, der den SNP enthält, wobei in diese eine SNP-Wiederholung eingeführt ist. Idealerweise weist die Wiederholung eine Basenidentität auf, die zu der des SNP identisch ist.
  • Vorzugsweise lagern sich der lokusspezifische Teil und der SNP-identifizierende Teil von einem der Forward-Primer an der 3'-Seite des Lokus mit dem zu untersuchenden SNP an. Vorzugsweise lagern sich der lokusspezifische Teil und der SNP-identifizierende Teil eines anderen, idealerweise des anderen der Forward-Primer nicht an der 3'-Seite des zu untersuchenden SNP an. Bevorzugt lagert sich der Anlagerungsprimer ("annealing primer") aufgrund einer Übereinstimmung zwischen dem SNP-identifizierenden Teil und der SNP-Stelle (z.B. C, das zu G passt) an. Vorzugsweise lagert sich der Nicht-Anlagerungs primer ("non-annealing primer") aufgrund einer fehlenden Übereinstimmung bzw. Fehlpaarung ("mis-match") zwischen dem SNP-identifizierenden Teil und der SNP-Stelle (z.B. T in Fehlpaarung mit T) nicht an.
  • Der zu untersuchende SNP kann ein Ort mit einer Variation zwischen Individuen von beliebigen zwei Basen, ausgewählt aus den Nucleotiden C oder G oder A oder T, sein. Zum Beispiel kann der zu untersuchende SNP ein Ort mit einer Variation zwischen Individuen von entweder einem T- oder A-Nucleotid, T- oder C-Nucleotid, T- oder G-Nucleotid, A- oder C-Nucleotid, A- oder G-Nucleotid oder C- oder G-Nucleotid sein. Eine mögliche Variation kann an einer oder mehreren Stellen untersucht werden, wobei eine oder mehrere potenzielle Variationen an einer oder mehreren Stellen untersucht werden.
  • Zwei oder mehr SNPs können unter Verwendung einer simultanen ersten Amplifikation und/oder einer simultanen zweiten Amplifikation und/oder einer simultanen Untersuchung von einem oder mehreren Merkmalen des weiter amplifizierten Produkts untersucht werden. Vorzugsweise werden mindestens die erste Amplifikation und die zweite Amplifikation simultan für eine Mehrzahl von SNP-Untersuchungen durchgeführt. Die Zahl von SNPs, die simultan in einer oder mehreren Stufen des Verfahrens untersucht werden, kann größer als 20, bevorzugt größer als 25, stärker bevorzugt größer als 50 und idealerweise größer als 100 sein.
  • Die Probe kann eine DNA-Probe, extrahiert aus einer gesammelten Quelle, sein. Die Probe kann mit dem ersten Primersatz in Kontakt gebracht werden durch Mischen der Probe und der Primer miteinander.
  • Die Probe kann ein Gemisch sein. Ein oder mehrere Beiträge zu der Probe können als die Probe selbst unter Verwendung der vorliegenden Erfindung analysiert werden. Die gemischte Probe kann männliche und weibliche DNA umfassen. Eines der Geschlechter der DNA, insbesondere das männliche, kann, bezogen auf das andere Geschlecht, in niedrigen Konzentrationen vorliegen. Zum Beispiel kann der DNA-Beitrag des minoren Geschlechts weniger als 1 % der Probe, potenziell weniger als 0,1 % und sogar weniger als 0,05 % der Probe darstellen. Die Probe kann Proben aus zwei oder mehr Quellen enthalten. Das Verfahren kann die minore Probe in einem Gemisch aus zwei oder mehr Quellen untersuchen. Die minore Probe kann weniger als 1 % der gemischten Probe, potenziell weniger als 0,1 % der gemischten Probe und sogar weniger als 0,05 % der gemischten Probe darstellen.
  • Die Untersuchung kann die Menge an DNA in einer gemischten Probe aus einer oder mehreren der Quellen angeben. Die Angabe kann auf einem Vergleich der experimentell bestimmten Ergebnisse basiert sein, z.B. der Konzentration bzw. dem Level einer vorhandenen Unterscheidungseinheit, verglichen mit einem Satz von Kalibrierungsergebnissen, die auf der Untersuchung von bekannten Mengen von DNA in einer Probe basieren.
  • Die erste Amplifikation wird bevorzugt mittels PCR durchgeführt. Die Amplifikation umfasst bevorzugt zwischen 18 und 60 Zyklen, stärker bevorzugt 20 bis 40 Zyklen.
  • Die Amplifikationszyklen, insbesondere wenn die ersten und zweiten Amplifikationsverfahren verwendet werden, können die folgenden Merkmale haben. Vorzugsweise umfassen die Amplifikationszyklen einen ersten Zyklussatz, in dem die Anlagerungstemperatur bzw. Annealing-Temperatur des Zyklus ähnlich oder oberhalb der Schmelztemperatur des ersten Primersatzes, insbesondere des lokusspezifischen Teils des ersten Primersatzes und/oder ähnlich oder oberhalb des zweiten Primersatzes ist. Die Amplifikationszyklen können einen zweiten Satz von Zyklen umfassen, wobei die Anlagerungstemperatur im zweiten Satz von Zyklen bevorzugt ähnlich oder unterhalb der Schmelztemperatur des ersten Primersatzes und/oder oberhalb der Schmelztemperatur des zweiten Primersatzes ist. Die Schmelztemperatur des ersten Primersatzes kann nach einem oder zwei Zyklen ansteigen. Die Amplifikationszyklen können einen dritten Satz von Zyklen umfassen, bei dem, bevorzugt, die Anlagerungstemperatur im dritten Satz von Zyklen unter der Schmelztemperatur des ersten Primersatzes und/oder ähnlich oder oberhalb der Schmelztemperatur des zweiten Primersatzes ist.
  • Es ist bevorzugt, dass der erste Satz von Zyklen zwischen 2 und 10 Zyklen bereitstellt. Es ist bevorzugt, dass der zweite Satz von Zyklen zwischen 3 und 15 Zyklen bereitstellt. Es ist bevorzugt, dass der dritte Satz von Zyklen zwischen 15 und 35 Zyklen bereitstellt. Bevorzugt überschreitet die Gesamtzahl der Zyklen, die im ersten, zweiten und dritten Satz bereitgestellt werden, 40 Zyklen nicht.
  • Es ist bevorzugt, dass die Denaturierungstemperatur für den ersten und/oder zweiten und/oder dritten Satz von Zyklen 92 bis 96°C, idealerweise 94°C, ist.
  • Es ist bevorzugt, dass die Anlagerungstemperatur für den ersten und/oder zweiten und/oder dritten Satz von Zyklen zwischen 60 und 62°C, idealerweise 61°C, ist. Es ist bevorzugt, dass die Anlagerungstemperatur für den zweiten Satz von Zyklen zwischen 70 und 78°C, idealerweise zwischen 72 und 75°C, ist.
  • Es ist bevorzugt, dass die Verlängerungstemperatur für den ersten und/oder zweiten und/oder dritten Satz von Zyklen zwischen 70 und 75°C, idealerweise 72°C, ist.
  • Die Amplifikation resultiert bevorzugt in der Verlängerung des angelagerten Forward-Primers von seinem 3'-Ende zum 5'-Ende der Zielsequenz. Die Amplifikation resultiert bevorzugt in der Verlängerung des Reverse-Primers von seinem 3'-Ende zum 5'-Ende seiner Zielsequenz. Bevorzugt resultieren weitere Zyklen der Amplifikation in der Verlängerung der Forward-Primersequenz zum 5'-Ende seines Ziels, einschließlich der Reverse-Primersequenz. Bevorzugt resultieren weitere Zyklen der Amplifikation in der Verlängerung der Reverse-Primersequenz gegen das 5'-Ende ihres Ziels, einschließlich einer oder mehrerer oder aller der Forward-Primersequenz(en) und insbesondere des SNP-identifizierenden Teils, lokusspezifischen Teils, SNP-verwandten Teils und des weiteren Teils.
  • Ein Teil des amplifizierten Produkts kann entfernt und separat mit dem zweiten Primersatz in Kontakt gebracht werden. Der Kontakt mit dem zweiten Primersatz kann in einem separaten Behälter zum Kontakt mit dem ersten Primersatz stattfinden. Dies ist besonders bevorzugt, wenn universelle Primer bzw. Universalprimer unter Einbau "Molecular Beacons" bzw. "molekulares Lichtsignal" verwendet werden. Bevorzugt wird ein Zwei-Röhrchen- und/oder ein verzweigtes PCR-Verfahren verwendet, wenn Universalprimer unter Einbau von Molecular Beacons eingesetzt werden. Die erste und zweite Amplifikation können im gleichen Behälter geschehen. Die erste und zweite Amplifikation können im Wesentlichen gleichzeitig geschehen. Bevorzugt umfasst das Verfahren das Zugeben von einem oder mehreren aus dem ersten Primersatz und einem oder mehreren aus dem zweiten Primersatz zu der zu amplifizierenden Probe vor der Durchführung von Amplifikationszyklen.
  • Der eine oder die mehreren ersten Primersätze können in einer Konzentration zwischen 20 und 80 nM, bevorzugter zwischen 40 und 60 nM und idealerweise bei 50 nM +/– 5 % bereitgestellt werden. Bevorzugt werden die Primer, die nicht konkurrieren und/oder bei denen keine örtliche Überlappung auftritt, bei diesen Konzentrationen bereitgestellt. Wo Primerkonkurrenz auftreten könnte und/oder wo eine örtliche Primerüberlappung auftritt, werden die relativen Konzentrationen der Primer gegeneinander abgewogen. Die Reverse-Primerkonzentration für ein derartiges simultanes Verfahren kann zwischen 75 nM und 125 nM, beispielsweise bei 100 nM +/– 10 % sein.
  • Der zweite Primersatz kann in einer Konzentration zwischen 20 und 80 nM, stärker bevorzugt zwischen 40 und 60 nM und idealerweise bei 50 nM +/– 5 % bereitgestellt werden. Die zugegebene Menge an zweitem Primersatz kann durch Cn × L definiert werden, wobei Cn die Konzentration der Primer ist und L die Zahl der Loki unter Betrachtung +/– 2 ist und idealerweise die Zahl der Loki unter Betrachtung ist, insbesondere wenn L weniger als 100 oder sogar weniger als 50 ist. Vorzugsweise ist die Maximalkonzentration des zweiten Primersatzes 1000 nM.
  • Wo der erste und zweite Primersatz zusammen vorliegen, ist es insbesondere bevorzugt, den zweiten Primersatz und den ersten Primersatz in einem Konzentrationsverhältnis von mindestens 5:1 bereitzustellen. Ein Verhältnis Konzentration des zweiten Satzes : Konzentration des ersten Satzes von mindestens 10:1, stärker bevorzugt mindestens 20:1 und idealerweise mindestens 30:1 kann bereitgestellt werden. Der erste Satz kann in einer Konzentration zwischen 5 und 400 nM, stärker bevorzugt zwischen 10 und 200 nM, bereitgestellt werden. Der zweite Satz kann in einer Konzentration zwischen 300 nM und 5.000 nM, stärker bevorzugt zwischen 400 und 4.000 nM, bereitgestellt werden.
  • Wo der erste und der zweite Primersatz zusammen vorliegen, ist es besonders bevorzugt, eine Anlagerungstemperatur, bei der mindestens 80 % des zweiten Primersatzes einzelsträngig bleiben, stärker bevorzugt eine Temperatur, bei der mindestens 95 % des zweiten Primersatzes einzelsträngig bleiben und idealerweise eine Temperatur, bei der mindestens 99 % des zweiten Primersatzes einzelsträngig bleiben, für einige der Zyklen des Amplifikationsverfahrens zu verwenden. Für andere Zyklen des Amplifikationsverfahrens kann eine niedrigere Anlagerungstemperatur verwendet werden. Vorzugsweise wird das Anlagern bzw. Annealing bei höherer Temperatur mindestens in den Zyklen 3 bis 30, stärker bevorzugt in den Zyklen 3 bis 40, verwendet. Eine niedrigere Anlagerungstemperatur kann in den ersten zwei Zyklen verwendet werden. Eine niedrigere Anlagerungstemperatur wird bevorzugt in mindestens den letzten zwei Zyklen verwendet. Die niedrigere Anlagerungstemperatur ist vorzugsweise eine Temperatur, bei der mindestens 80 %, stärker bevorzugt mindestens 90 %, und idealerweise mindestens 99 %, des zweiten Primersatzes sich anlagern.
  • Das amplifizierte Produkt kann mit dem zweiten Primersatz in Kontakt gebracht werden, indem die Probe und die Primer zusammengemischt werden.
  • Der zweite Primersatz kann einen, zwei, drei oder vier Forward-Primer umfassen. Ein Reverse-Primer kann vorhanden sein, dem zweiten Primersatz kann jedoch ein Reverse-Primer fehlen.
  • Die Erfindung kann (auch) nur einen zweiten bereitgestellten Primersatz bereitstellen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung besteht der eine zweite Primersatz bevorzugt aus zwei Forward-Primern und einem Reverse-Primer. Einer oder mehrere, bevorzugt alle der zweiten Primersätze können zwei Forward-Primer und einen Reverse-Primer einschließen. Einer der Forward-Primer des zweiten Satzes schließt bevorzugt eine Sequenz ein, die sich an den SNP-enthaltenden Strang an der 3'-Seite des SNP anlagert. Der Reverse-Primer des zweiten Satzes schließt bevorzugt eine Sequenz ein, die sich an die 3'-Seite der Basenpaarung mit dem SNP anlagert. Stärker bevorzugt schließt einer der Forward-Primer eine Sequenz ein, die sich an der 3'-Seite der SNP-Wiederholung anlagert. Vorzugsweise lagert sich der andere Forward-Primer oder die anderen Forward-Primer nicht an.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung kann der zweite Primersatz einen oder mehrere Primer, die einen zweiten weiteren Teil einschließen, einschließen bzw. umfassen. Vorzugsweise werden die Forward-Primer so bereitgestellt. Vorzugsweise wird der zweite weitere Teil mit einem zweiten SNP-identifizierenden Teil und/oder vorzugsweise einem SNP-Wiederholungs-identifizierenden Teil bereitgestellt bzw. ausgestattet. Der zweite SNP- oder SNP-Wiederholungs-identifizierende Teil kann, insbesondere im Falle von Forward-Primern, an das 3'-Ende des zweiten weiteren Teils gebunden sein. Das 5'-Ende des Forward-Primers ist bevorzugt mit einer Unterscheidungseinheit ("distinctive unit") ausgestattet.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung schließt der zweite weitere Teil bevorzugt eine Sequenz ein, die mit der Sequenz des amplifizierten Produkts in der Nachbarschaft des SNP-identifizierenden Teils und/oder, stärker bevorzugt, SNP-Wiederholungs-bezogenen Teils ("SNP repeat related portion") davon paart. Stärker bevorzugt passt die Sequenz des weiteren Teils, die an den SNP-verwandten Teil angrenzt, idealerweise bis zu und einschließlich des Nucleotids vor dem SNP-verwandten Teil zu der Sequenz des amplifizierten Produkts, die an die SNP-Wiederholung angrenzt, idealerweise bis zu und einschließlich des Nucleotids vor der SNP-Wiederholung. Vorzugsweise werden die Forward-Primer eines zweiten Primersatzes mit identischen Sequenzen für die zweiten weiteren Teile ausgestattet bzw. bereitgestellt.
  • In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung ist es bevorzugt, dass der eine Primersatz aus einem Forward-Primer und einem Reverse-Primer besteht. Einer oder mehrere, bevorzugt alle der zweiten Primersätze können aus einem Forward-Primer und einem Reverse-Primer bestehen. Vorzugsweise schließt der Forward-Primer des zweiten Satzes eine Sequenz ein, die sich an den SNP-enthaltenden Strang auf der 3'-Seite des SNP anlagert. Vorzugsweise schließt der Reverse-Primer des zweiten Satzes eine Sequenz ein, die sich an der 3'-Seite der Base, die mit dem SNP paart, anlagert. Am stärksten bevorzugt schließt der Forward-Primer eine Sequenz ein, die sich an der Sequenz anlagert, die mit der Sequenz, produziert durch das Kopieren des weiteren Teils des Forward-Primers, paart und/oder die der Sequenz des weiteren Teils des Forward-Primers des ersten Satzes entspricht.
  • In der alternativen Ausführungsform der Erfindung kann der zweite Primersatz einen Primer einschließen, der einen zweiten weiteren Teil einschließt und, stärker bevorzugt, aus einem zweiten weiteren Teil besteht. Vorzugsweise wird der Forward-Primer so bereitgestellt. Vorzugsweise wird der zweite weitere Teil mit einer Sequenz ausgestattet bzw. bereitgestellt, die mit der Sequenz des amplifizierten Produkts in der Nachbarschaft der Sequenz, die mit dem weiteren Teil des Forward-Primers des ersten Satzes paart, paart. Stärker bevorzugt schließt der zweite weitere Teil eine Sequenz ein, die zu der Sequenz des ersten weiteren Teils passt und/oder mit der Sequenz des amplifizierten Produkts, das zu dem ersten weiteren Teil passt, paart.
  • Vorzugsweise lagert sich die Sequenz des zweiten weiteren Teils nicht an die Sequenz eines beliebigen publizierten Teils, idealerweise eines beliebigen Teils der gesamten DNA-Sequenz der Entität, aus der die DNA, die den zu untersuchenden SNP enthält, erhalten wurde, z.B. Homo Sapiens, an und passt insbesondere nicht dazu, bzw. stimmt insbesondere nicht damit überein. Die Unfähigkeit der Sequenz des zweiten weiteren Teils, humane DNA zu amplifizieren, ist ein besonders bevorzugtes Merkmal. Vorzugsweise werden die Forward-Primer eines zweiten Primersatzes mit identischen Sequenzen für den zweiten weiteren Teil bereitgestellt bzw. ausgestattet.
  • In der einen Ausführungsform der Erfindung ist der zweite SNP-verwandte Teil vorzugsweise ein einzelnes Nukleotid oder zwei Nukleotide.
  • In der einen Ausführungsform der Erfindung ist oder umfasst der zweite SNP-verwandte Teil eines Primers des zweiten Satzes vorzugsweise ein Nucleotid, das mit dem SNP-identifizierenden Teil und/oder dem SNP-verwandten Teil eines Primers des ersten Satzes identisch ist. Vorzugsweise weist ein anderer, idealerweise der andere, Primer des zweiten Satzes einen zweiten SNP-verwandten Teil auf, der ein Nucleotid ist oder einschließt, das identisch ist mit dem SNP-identifizierenden Teil und/oder SNP-verwandten Teil eines anderen, idealerweise des anderen, Primers des ersten Satzes.
  • In der einen Ausführungsform der Erfindung, bei der ein einzelnes Nucleotid den zweiten SNP-bezogenen Teil darstellt, kann der zweite SNP-bezogene Teil ein C-Nucleotid sein, wenn ein Ziel amplifiziert wird, in dem der SNP oder die SNP-Wiederholung ein G-Nucleotid ist. Der zweite SNP-bezogene Teil kann ein G-Nucleotid sein, wenn ein Ziel amplifiziert wird, in dem der SNP oder die SNP-Wiederholung ein C-Nucleotid ist Der zweite SNP-bezogene Teil kann ein T-Nucleotid sein, wenn ein Ziel amplifiziert wird, in dem der SNP oder die SNP-Wiederholung ein A-Nucleotid ist. Der zweite SNP-bezogene Teil kann ein A-Nucleotid sein, wenn ein Ziel amplifiziert wird, in dem der SNP oder die SNP-Wiederholung ein T-Nucleotid ist. Der zweite SNP-bezogene Teil für einen Forward-Primer eines zweiten Satzes kann eines aus C oder G oder T oder A sein, wobei der zweite SNP-bezogene Teil eines anderen Primers des zweiten Satzes eines aus C oder G oder A oder T, aber verschieden von dem zweiten SNP-bezogenen Teil des ersten Primers des Satzes ist, bei dem der/die zu untersuchende SNP oder SNP-Wiederholung beliebige zwei aus den Nucleotiden C oder G oder T oder A sein könnten.
  • In der einen Ausführungsform der Erfindung kann der zweite SNP-bezogene Teil von zwei Nucleotiden gebildet werden. Vorzugsweise passt das Endnucleotid der zwei mit dem Nucleotid des SNP oder der SNP-Wiederholung von Interesse überein. Vorzugsweise ist das Nucleotid, das an das Endennucleotid des zweiten SNP-bezogenen Teils angrenzt, nicht in Übereinstimmung ("a mismatch") mit der Base, die an den SNP oder die SNP-Wiederholung in der Zielsequenz angrenzt.
  • In der ersten Ausführungsform der Erfindung bildet vorzugsweise der zweite SNP-bezogene Teil das 3'-Ende der Forward-Primer des zweiten Satzes.
  • Eine Exonucleaseverdau-Verhinderungseinheit kann zum 3'-Ende des Forward-Primers oder der Forward-Primer des ersten und/oder zweiten Satzes hin bereitgestellt werden. Die Exonucleaseverdau-Verhinderungseinheit kann Phosphorthioat sein. Die Exonucleaseverdau-Verhinderungseinheit kann am Ende des zweiten weiteren Teils und/oder der Verbindung des zweiten weiteren Teils und des zweiten SNP-bezogenen Teils bereitgestellt werden.
  • Vorzugsweise lagert/lagern sich der zweite weitere Teil und/oder der zweite SNP-bezogene Teil des Forward-Primers und/oder eines der Forward-Primer an der 3'-Seite des SNP oder der SNP-Wiederholung an. Bevorzugt lagert/lagern sich der zweite weitere Teil und/oder der zweite SNP-bezogene Teil eines anderen, idealerweise des anderen Forward-Primers und/oder des Forward-Primers nicht an der 3'-Seite des SNP und/oder der SNP- Wiederholung an. In einer Ausführungsform der Erfindung lagert sich der Anlagerungsprimer aufgrund einer Übereinstimmung zwischen dem zweiten SNP-bezogenen Teil und der SNP-Wiederholung und/oder dazu benachbarten Sequenzen an. Vorzugsweise lagert sich der Nicht-Anlagerungsprimer aufgrund einer fehlenden Übereinstimmung zwischen dem zweiten SNP-bezogenen Teil und der SNP-Wiederholung nicht an. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung lagert sich der Anlagerungsprimer aufgrund einer Übereinstimmung zwischen dem zweiten weiteren Teil und einer Sequenz, die mit dem ersten weiteren Teil paarte, an. Die zweite Amplifikation wird vorzugsweise mittels PCR durchgeführt. Die Amplifikation umfasst zwischen 18 und 30 Zyklen, stärker bevorzugt 20 bis 25 Zyklen.
  • Einer oder mehrere der Primer des ersten und/oder zweiten Satzes können mit einem oder mehreren Teilen ausgestattet bzw. bereitgestellt werden, der/die komplementär zu einem oder mehreren Teilen auf einem oder mehreren der anderen Primer in diesem Satz ist/sind. Der komplementäre Teil oder die komplementären Teile werden vorzugsweise im weiteren Teil des Primers des ersten Satzes bereitgestellt. Der komplementäre Teil oder die komplementären Teile werden vorzugsweise im zweiten weiteren Teil der Primer des zweiten Satzes bereitgestellt. Vorzugsweise wird ein komplementärer Teil auf jedem der Primer eines Satzes bereitgestellt. Vorzugsweise werden mindestens zwei komplementäre Teile auf jedem der Primer eines Satzes bereitgestellt. Vorzugsweise wird ein komplementärer Teil am 3'-Ende eines Primers, idealerweise aller der Primer bereitgestellt. Vorzugsweise wird ein komplementärer Teil am 5'-Ende eines Primers, idealerweise aller der Primer bereitgestellt. Vorzugsweise ist der komplementäre Teil am 3'-Ende eines Primers komplementär zu dem komplementären Teil am 5'-Ende eines anderen Primers, idealerweise aller der anderen Primer des Satzes und/oder beider Sätze. Vorzugsweise ist der komplementäre Teil am 5'-Ende eines Primers komplementär zum komplementären Teil am 3'-Ende eines anderen Primers, idealerweise aller der anderen Primer, des Satzes und/oder beider Sätze. Ein lokusspezifischer Teil kann auf dem weiteren Teil, der den komplementären Teil oder die komplementären Teile einschließt, insbesondere am 3'-Ende, bereitgestellt werden. Der weitere Teil und/oder der zweite weitere Teil kann/können eine Sequenz einschließen, die zu der Sequenz des zu betrachtenden Lokus bzw. Ortes passt, wobei diese insbesondere zwischen zwei komplementären Teilen bereitgestellt wird. Die komplementären Teile können mindestens drei Nucleotide, stärker bevorzugt zwischen 3 und 20 Nucleotide lang sein. Die komplementären Teile sind beide bevorzugt von der gleichen Länge. Die komplemen tären Teile können zwischen 5 und 40 % des weiteren Teils und/oder zweiten weiteren Teils darstellen. Einer, zwei, drei oder vier Primer eines Satzes können auf diese Weise bereitgestellt werden. Vorzugsweise werden der Reverse-Primer oder die Reverse-Primer auf ähnliche Weise bereitgestellt.
  • Das weiter amplifizierte Produkt oder ein Teil davon kann aus dem Behälter, in dem die Amplifikation durchgeführt wird, entfernt werden, um eines oder mehrere Merkmale zu untersuchen. Alternativ oder zusätzlich kann/können das eine oder die mehreren Merkmale untersucht werden, wobei das weiter amplifizierte Produkt in dem Behälter ist, in dem die Amplifikation durchgeführt wird.
  • Das eine oder die mehreren Merkmale des weiter amplifizierten Produktes kann/können mittels des Vorhandenseins und/oder Fehlens einer Unterscheidungseinheit im weiter amplifizierten Produkt untersucht werden. Die Unterscheidungseinheit kann in das weiter amplifizierte Produkt eingeführt werden oder damit assoziiert sein. Die Unterscheidungseinheit kann während des Amplifikationsverfahrens und/oder in einer anschließenden Stufe eingeführt werden. Die anschließende Stufe kann eine Hybridisierung z.B. einer Komponente mit der SNP-Base umfassen. Die Komponente kann ein Didesoxynucleotid, insbesondere ein Didesoxynucleotid, das eine Unterscheidungseinheit, wie z.B. einen Farbstoff, einbaut bzw. enthält, sein.
  • Die Unterscheidungseinheit kann eine Farbstoffmarkierung oder ein Farbe erzeugendes Molekül sein.
  • Die Unterscheidungseinheit kann eine DNA-Sequenz sein, z.B. ein Molecular Beacon bzw. molekulares Lichtsignal. Die DNA-Sequenz, z.B. ein Molecular Beacon, kann eine DNA-Sequenz umfassen, die ein Farbstoffmolekül einbaut bzw. enthält. Die DNA-Sequenz kann ein Einzelstrang sein. Die DNA-Sequenz kann durch Verbinden eines Teils der Sequenz mit einem anderen zur Schleife geschlossen sein ("looped"). Vorzugsweise ist das Farbstoffmolekül in der Schleife, stärker bevorzugt in einem Teil der Sequenz, der mit einem anderen verbunden ist. Vorzugsweise ist das Farbstoffmolekül in der Nähe eines Quencher-Moleküls. Vorzugsweise verhindert das Quencher-Molekül, dass die Farbstoffmolekülmerkmale, z.B. Fluoreszenz, sichtbar sind. Vorzugsweise wird das Farbstoffmolekül sichtbar, z.B. fluoreszent, sobald es aktiviert wird. Vorzugsweise wird die Aktivierung durch Primerverlängerung in die Sequenz des Molecular Beacon verursacht. Eine Aktivierung erfolgt vorzugsweise durch die Öffnung der Schleife. Die Sequenz des Molecular Beacon kann F-ACGCGCTCTCTTCTTCTTTTGCGCG-Q sein, worin F eine Unterschei dungseinheit, wie z.B. ein Farbstoff, ist und Q eine Quenching-Einheit ist, oder umgekehrt. Vorzugsweise sind die Teile der Molecular Beacon-Sequenz, die sich miteinander verbinden, die Stämme ACGCGC vom 5'-Ende und GCGCG vom 3'-Ende. Vorzugsweise enthält der universelle Primer bzw. Universalprimer, der das Molecular Beacon einbaut bzw. enthält, keine Phosphorthioatbindung. Vorzugsweise enthält keiner aus dem zweiten Primersatz eine Phosphorthioatbindung. Idealerweise enthält keiner der ersten oder zweiten Primer eine Phosphorthioatbindung. Wenn Molecular Beacon verwendet werden, kann das Amplifikationsprodukt auf eines oder mehrere Merkmale im Amplifikationsreaktionsbehälter untersucht werden. Zu diesem Zweck können z.B. der Roche Light CyclerTM oder andere entsprechende Instrumente verwendet werden.
  • Die Unterscheidungseinheit kann unter Tageslicht oder konventioneller Beleuchtung sichtbar sein und/oder sie kann fluoreszierend sein.
  • Die Unterscheidungseinheit kann ein Strahlungsemitter, z.B. ein charakteristisches Isotop, sein.
  • Die Unterscheidungseinheit wird bevorzugt am 5'-Ende eines der Primer, stärker bevorzugt auf einem Forward-Primer und idealerweise mit einer unterschiedlichen Unterscheidungseinheit für den anderen Forward-Primer des zweiten Satzes, bereitgestellt.
  • Vorzugsweise ist die Unterscheidungseinheit anzeigend für das am SNP vorliegende Nucleotid. Vorzugsweise liegt eine andere bzw. verschiedene Unterscheidungseinheit vor, wenn ein Nucleotid am SNP vorliegt und dann, wenn das andere Nucleotid am SNP vorliegt. Unterschiedliche Unterscheidungseinheiten können zum Anzeigen des SNP an einem Ort bzw. Lokus bereitgestellt werden im Vergleich zu den Unterscheidungseinheiten zum Anzeigen des SNP, der an einem anderen Ort vorliegt.
  • Die Untersuchung kann das Trennen des weiter amplifizierten Produkts, das mit einem SNP zusammenhängt, von den weiter amplifizierten Produkten aus einem oder mehreren anderen SNPs umfassen. Vorzugsweise werden die weiter amplifizierten Produkte für jeden SNP von einander getrennt. Elektrophorese kann verwendet werden, um ein oder mehrere der weiter amplifizierten Produkte von einander zu trennen. Die weiter amplifizierten Produkte können von einander auf der Grundlage der Größe der weiter amplifizierten Produkte getrennt werden, z.B. aufgrund der unterschiedlichen Länge der weiter amplifizierten Produkte.
  • Die Untersuchung kann das Analysieren der Reaktion des weiter amplifizierten Produkts, beispielsweise in dem Gefäß, in dem die Amplifikation durchgeführt wurde, auf Strahlung verschiedener Wellenlängen, z.B. Fluoreszenzlicht, umfassen.
  • Die Untersuchung kann die Verwendung von in kleinsten Abmessungen hergestellten Arrays ("micro-fabricated arrays") umfassen. Das weiter amplifizierte Produkt kann mit einem oder mehreren Bestandteilen bzw. Komponenten, die auf einem festen Träger (zurück) gehalten werden, in Kontakt gebracht werden. Eine oder mehrere der Komponenten können ein Oligonucleotid sein, wobei dies vorzugsweise mit seinem 5'-Ende an den Träger gebunden ist. Vorzugsweise hat das Oligonucleotid eine Sequenz, die mit der Sequenz mindestens eines, idealerweise nur eines der weiter amplifizierten Produkte paart/sich daran anlagert.
  • In einer Ausführungsform kann das Oligonucleotid eine Sequenz haben, die mit der Sequenz mindestens eines, idealerweise nur eines der weiter amplifizierten Produkte bis zu der Base vor der Base, die die SNP-Stelle ist, paart/sich daran anlagert. Nur ein Teil des weiter amplifizierten Produkts kann mit dem Oligonucleotid paaren/sich daran anlagern. Vorzugsweise paart/lagert sich ein bestimmter Typ des weiter amplifizierten Produkts mit/an ein bestimmtes Oligonucleotid an.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann das Oligonucleotid eine Sequenz haben, die mit der Sequenz mindestens eines, idealerweise nur eines der weiter amplifizierten Produkte entlang der Sequenz, die dem lokusspezifischen Teil und dem weiteren Teil entspricht, paart/sich daran anlagert. Vorzugsweise umfasst der weitere Teil des weiter amplifizierten Produkts eine Unterscheidungseinheit. Die Unterscheidungseinheit ist vorzugsweise ein Farbstoff. Vorzugsweise ist ein unterschiedlicher Farbstoff an jedem unterschiedlichen weiter amplifizierten Produkt vorhanden.
  • Eine Mehrzahl bzw. Vielzahl solcher Bestandteile, wie z.B. eine Mehrzahl von Oligonucleotiden, kann bereitgestellt werden. Eine Mehrzahl unterschiedlicher Oligonucleotide kann bereitgestellt werden, wobei jedes eine Sequenz hat, die mit einem weiter amplifizierten Produkt, idealerweise nur einem solchen Produkt, paart/sich daran anlagert. Es ist besonders bevorzugt, dass jeder Oligonucleotidtyp mit einem Typ des weiter amplifizierten Produkts, der von den anderen verschieden ist, paart/sich daran anlagert. Die Mehrzahl unterschiedlicher Typen von Oligonucleotiden kann an einer Mehrzahl unterschiedlicher, idealerweise diskreter Orte auf dem Träger bereitgestellt werden.
  • Der feste Träger kann Glas, Silizium, Kunststoffe, magnetische Kügelchen oder andere Materialien sein.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung kann das Oligonucleotid und gepaarte/angelagerte weiter amplifizierte Produkt mit einem oder mehreren weiteren Bestandteilen in Kontakt gebracht werden. Vorzugsweise schließt einer oder schließen mehrere der weiteren Bestandteile ein Didesoxynucleotid ein. Vorzugsweise schließt einer oder schließen mehrere der weiteren Bestandteile eine Unterscheidungseinheit, wie z.B. einen Farbstoff, ein. Vorzugsweise schließen unterschiedliche weitere Bestandteiltypen unterschiedliche Unterscheidungseinheiten ein. Zwei oder mehr Bestandteile, die zwei oder mehr unterschiedliche Didesoxynucleotide mit einer unterschiedlichen Unterscheidungseinheit, die an jedes von ihnen gebunden ist, umfassen, können bereitgestellt werden. Die Didesoxynucleotide können A, T, C oder G sein. Drei oder vier Didesoxynucleotide können bereitgestellt werden, vorzugsweise jedes mit einer unterschiedlichen Unterscheidungseinheit.
  • Einer oder mehrere, vorzugsweise nur einer der weiteren Bestandteile kann selektiv an die SNP-Base und/oder das 3'-Ende des Oligonucleotids anheften. Vorzugsweise basiert die Selektivität der Anheftung auf der Paarung der Identität des weiteren Bestandteils mit der SNP-Basenidentität, z.B. der Paarung der Didesoxynucleotididentität mit der SNP-Basenidentität. Vorzugsweise baut die Paarung die Unterscheidungseinheit in die Struktur ein. Vorzugsweise baut die Paarung die Unterscheidungseinheit in die Struktur ein. Vorzugsweise werden nicht-paarende weitere Bestandteile und ihre Unterscheidungseinheiten nicht in die Struktur eingebaut.
  • Die Identität der an die Komponente in der Struktur angehefteten Unterscheidungseinheit wird bevorzugt untersucht. Vorzugsweise ist die Identität des weiteren Bestandteils und/oder die Identität des SNP von der Identität der Unterscheidungseinheit abgeleitet.
  • In einer anderen Form der Erfindung kann das Oligonucleotid und das gepaarte/angelagerte weiter amplifizierte Produkt mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen in Kontakt gebracht werden. Der eine oder die mehreren zusätzlichen Bestandteile kann/können ein oder mehrere weitere Oligonucleotide sein. Vorzugsweise schließt/schließen eine oder mehrere der zusätzlichen Bestandteile eine Endbase, vorzugsweise an ihrem 5'-Ende, ein. Vorzugsweise schließen einer oder mehrere der zusätzlichen Bestandteile eine Unterscheidungseinheit, wie z.B. ein Farbstoff, ein. Vorzugsweise schließt/schließen unterschiedliche zusätzliche Bestandteiltypen unterschiedliche Unterscheidungseinheiten ein. Die zusätzlichen Bestandteile können zwei oder mehr verschiedene weitere Oligonucleoti de mit einer unterschiedlichen Unterscheidungseinheit und/oder Endbase, jeweils daran angeheftet, umfassen. Die Endbase der weiteren Oligonucleotide kann C, G, A oder T sein. Drei der vier weiteren Oligonucleotide können bereitgestellt werden, wobei jedes bevorzugt eine unterschiedliche Unterscheidungseinheit und/oder Endbase hat.
  • Eines oder mehrere, bevorzugt nur eines der weiteren Oligonucleotide kann/können sich selektiv an die SNP-Base und/oder das 3'-Ende des gebundenen Oligonucleotids anheften. Vorzugsweise basiert die Selektivität auf der Paarung der Identität der Endbase des weiteren Oligonucleotids mit der SNP-Basenidentität. Ligase kann im Kontakt mit dem gebundenen Oligonucleotid und/oder weiterem Oligonucleotid und/oder weiter amplifiziertem Produkt bereitgestellt werden. Vorzugsweise erfolgt eine Ligation (dort), wo die SNP-Base und die Endbase paaren, wodurch die Unterscheidungseinheit in die Struktur eingebaut wird. Vorzugsweise werden nicht-paarende weitere Bestandteile und die Unterscheidungseinheiten nicht in die Struktur eingebaut.
  • Die Identität der an die Komponente in der Struktur gebundenen Unterscheidungseinheit wird bevorzugt untersucht. Vorzugsweise ist die Identität des zusätzlichen Bestandteils und/oder die Identiät der Endbase des zusätzlichen Bestandteils und/oder die Identität des SNP von der Identität der Unterscheidungseinheit abgeleitet.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das weiter amplifizierte Produkt sich in eine Bindungseinheit bzw. Anheftungseinheit ("attachment unit") einbauen. Vorzugsweise erleichtert die Bindungseinheit die Anheftung des weiter amplifizierten Produkts an einen festen Träger. Der feste Träger kann Glas, Silicon, Kunststoffe, magnetische Kügelchen oder andere Materialien sein. Vorzugsweise wird die Anheftung mittels einer kovalenten Bindung bewirkt. Die Bindungseinheit kann eine Aminogruppe, vorzugsweise eine Aminogruppe, die am 5'-Ende des weiter amplifizierten Produkts bereitgestellt wird, sein. Es ist bevorzugt, dass der feste Träger in solchen Fällen ein Epoxysilan-behandelter Träger ist. Die Bindungseinheit kann eine Phosphorthiateinheit sein, die idealerweise am 5'-Ende des weiter amplifizierten Produkts bereitgestellt wird. In einem solchen Fall ist eine Bindung bzw. Anheftung an einen Bromacetamid-behandelten festen Träger bevorzugt.
  • Das weiter amplifizierte Produkt, das an einen festen Träger gebunden ist, wird vorzugsweise mit einer oder mehreren Sonden, die vorzugsweise eine zumindest teilweise von einander verschiedene Sequenz haben, in Kontakt gebracht. Vorzugsweise hat jede Sonde einen gemeinsamen Sequenzteil mit jeder anderen Sonde. Es ist besonders bevorzugt, dass dieser gemeinsame Sequenzteil in der Sequenz dem lokusspezifischen Teil des weiter amplifizierten Produkts entspricht. Vorzugsweise enthalten bzw. bauen die Sonden im Vergleich miteinander mindestens einen unterschiedlichen Sequenzteil (ein). Vorzugsweise entsprechen die unterschiedlichen Teile, zumindest einer der Sonden, der Universalprimerteilsequenz des weiter amplifizierten Produkts. Es ist bevorzugt, dass der Kontakt der Sonden mit dem weiter amplifizierten Produkt in der Hybridisierung einer der Sonden mit dem weiter amplifizierten Produkt resultiert, und zwar idealerweise ohne Hybridisierung der anderen Sonde oder Sonden. Vorzugsweise ist an jede Sonde eine Unterscheidungseinheit angeheftet bzw. gebunden, z.B. eine Farbstoffeinheit. Vorzugsweise werden für jede verschiedene Sonde verschiedene Unterscheidungseinheiten verwendet.
  • Die Probe kann mit einer anderen Probe verglichen werden. Der Vergleich kann auf dem Vergleichen von einem oder mehreren des einen oder der mehreren Merkmale des weiter amplifizierten Produkts für jede Probe beruhen. Die Proben können verglichen werden, um eine Übereinstimmung in den Merkmalen zwischen den Proben zu bestätigen. Die Proben können verglichen werden, um eine Übereinstimmung in den Merkmalen zwischen den Proben zu eliminieren. Das Auftreten des einen oder der mehreren weiteren Merkmals/Merkmalen für einen oder mehrere SNPs kann mit Information über die Häufigkeit des Auftretens des einen oder der mehreren weiteren Merkmale für den einen oder die mehreren SNPs in einer Population bzw. Bevölkerung verglichen werden. Die Population kann eine repräsentative Probe der Bevölkerung eines Landes, einer ethnischen Gruppe oder einer Datenbank sein.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung stellen wir ein Verfahren zur Untersuchung einer DNA-Probe bereit, wobei das Verfahren umfasst: In-Kontakt-Bringen der DNA-enthaltenden Probe mit zwei oder mehr Primer, Amplifizieren der DNA unter Verwendung jener Primer, um ein amplifiziertes Produkt zu ergeben und Untersuchen von einem oder mehreren Merkmalen des amplifizierten Produkts bei mindestens einem ersten Satz von Amplifikationsbedingungen und einem zweiten Satz von Amplifikationsbedingungen, die eingesetzt werden, wobei die Amplifikation durch einen oder mehrere der Primer wenigstens während der Verwendung von einem Satz oder den Sätzen der Amplifikationsbedingungen beeinträchtigt wird.
  • Vorzugsweise wird die Amplifikation durch einen oder mehrere der Primer während der Verwendung von mindestens einem der Sätze von Amplifikationsbedingungen inhibiert. Vorzugsweise wird die Anlagerung von einem oder mehreren Primer während der Verwendung von mindestens einem der Sätze von Amplifikationsbedingungen inhibiert. Vorzugsweise bleibt/bleiben einer oder mehrere der Primer während des Anlagerungsschritts bzw. Annealingschritts von einem oder mehreren der Sätze von Amplifikationsbedingungen einsträngig.
  • Der erste Satz von Amplifikationsbedingungen kann eine Amplifikation durch einen oder mehrere der Primer inhibieren. Der zweite Satz von Amplifikationsbedingungen kann eine Amplifikation durch einen oder mehrere der Primer inhibieren. Ein oder mehrere weitere Sätze von Amplifikationsbedingungen kann/können bereitgestellt werden. Einer oder mehrere des einen oder der mehreren weiteren Sätze von Amplifikationsbedingungen kann/können eine Amplifikation durch einen oder mehrere der Primer beeinträchtigen und/oder inhibieren.
  • In einer Ausführungsform kann der erste Satz von Amplifikationsbedingungen eine Amplifikation durch einen oder mehrere der Primer beeinträchtigen oder inhibieren. Vorzugsweise sorgt der zweite Satz von Amplifikationsbedingungen für eine Amplifikation durch den/die zuvor beeinträchtigten oder inhibierten einen oder mehrere Primer, insbesondere durch alle Primer.
  • In einer anderen Ausführungsform darf/kann der erste Satz von Amplifikationsbedingungen die Amplifikation durch die Primer nicht inhibieren oder beeinträchtigen, obwohl die Amplifikation durch einen oder mehrere der Primer durch andere Faktoren beeinträchtigt oder inhibiert werden kann, kann der zweite Satz von Bedingungen die Amplifikation durch einen oder mehrere der Primer inhibieren oder beeinträchtigen, und ein dritter Satz von Bedingungen kann bereitgestellt werden, in denen einer oder mehrere Primer, die durch den zweiten Satz von Bedingungen beeinträchtigt oder inhibiert wurden, nicht länger inhibiert oder beeinträchtigt sind.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform können einer oder mehrere Primer während des ersten Satzes von Amplifikationsbedingungen inhibiert sein, nicht inhibiert sein während eines zweiten Satzes von Amplifikationsbedingungen und nicht inhibiert sein während eines dritten Satzes von Amplifikationsbedingungen. Insbesondere in solch einem Fall bleiben einer oder mehrere andere Primer während des ersten und zweiten Satzes von Amplifikationsbedingungen, aber nicht während des dritten Satzes von Amplifikationsbedingungen inhibiert.
  • Ein Satz von Amplifikationsbedingungen kann eine Denaturierungsstufe, Annealing-Stufe bzw. Anlagerungsstufe und Verlängerungsstufe umfassen. Vorzugsweise wird ein Satz von Amplifikationsbedingungen für eine Anzahl von Zyklen angewendet. Die Verlängerungsstufe kann während der Zyklen von einem oder mehreren Sätzen von Bedingungen für 30 Sekunden bis 3 Minuten, bevorzugt 2 Minuten +/– 10 % bereitgestellt werden. Die Denaturierungsstufe kann während der Zyklen von einem oder mehreren Sätzen von Bedingungen für 15 bis 60 Sekunden, bevorzugt 30 Sekunden +/– 10 % bereitgestellt werden. Die Anlagerungsstufe kann während der Zyklen von einem oder mehreren Sätzen von Bedingungen für 15 bis 60 Sekunden, bevorzugt für 30 Sekunden +/– 10 % bereitgestellt werden. Eine Temperatur zwischen 70 und 80°C, stärker bevorzugt zwischen 74 und 78°C und idealerweise 76°C, wird bevorzugt für die Verlängerungsstufe bereitgestellt. Eine Denaturierungsstufe zwischen 85 und 98°C, stärker bevorzugt zwischen 92 und 96°C und idealerweise 94°C, wird bevorzugt bereitgestellt.
  • Eine Annealing-Temperatur bzw. Anlagerungstemperatur von weniger als 72°C wird vorzugsweise in einem Satz von Amplifikationsbedingungen, der die Anlagerung von zwei oder mehr Primern erlaubt und/oder jegliche Primeranlagerung nicht inhibiert, bereitgestellt. Vorzugsweise wird eine Temperatur von 72°C oder mehr in einem oder mehreren Sätzen von Amplifikationsbedingungen, die dafür gedacht sind, eine Amplifikation durch einen oder mehrere der Primer zu beeinträchtigen oder zu inhibieren, eingesetzt.
  • Das Amplifikationsverfahren kann für (eine Zahl von) 1 bis 20 Zyklen, insbesondere für die ersten 1 bis 3 Zyklen, wo einer oder mehrere der Primer beeinträchtigt sind oder an der Anlagerung gehindert werden, durchgeführt werden. Vorzugsweise werden zwischen 10 und 80 Zyklen eingesetzt, wenn die Primer nicht beeinträchtigt oder inhibiert sind. Das insgesamte Verfahren kann zwischen 40 und 80 Zyklen, stärker bevorzugt zwischen 45 und 70 Zyklen, idealerweise zwischen 50 und 70 Zyklen, umfassen.
  • Das Verfahren kann einen oder mehrere der Primer, vorzugsweise alle der Primer, die während aller Sätze von Bedingungen nicht inhibiert oder beeinträchtigt werden, in einer Konzentration zwischen 5 und 500 nM, stärker bevorzugt zwischen 10 und 200 nM, verwenden.
  • Zahlreiche Ausführungsformen der Erfindung werden nun, nur beispielsweise, und unter Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
  • 1a bis 1e die verschiedenen Teile der ersten Stufe eines erfindungsgemäßen Verfahrens erläutern;
  • 2a einen Forward-Primer erläutert, der zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist;
  • 2b einen zweiten Forward-Primer erläutert, der zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist und für eine Verwendung mit dem Primer von 2a gedacht ist;
  • die 3a bis 3e die verschiedenen Teile der zweiten Stufe eines erfindungsgemäßen Verfahrens erläutern;
  • 4a einen "universellen" Forward-Primer erläutert, der zur Verwendung in der zweiten Stufe der vorliegenden Erfindung geeignet ist;
  • 4b einen zweiten "universellen" Forward-Primer zur Verwendung in der zweiten Stufe der vorliegenden Erfindung erläutert, der zur Verwendung mit dem Primer von 4a gedacht ist;
  • 5 schematisch die Produkte des zweistufigen Verfahrens erläutert, wenn es in einem Multiplexsystem eingesetzt wird;
  • 6 die Amplifikation in der ersten Stufe unter Verwendung eines Primers gemäß der Erfindung erläutert;
  • 7a schematisch eine Struktur zur Bereitstellung eines untersuchbaren Merkmals für die weiteren Produkte der Erfindung erläutert;
  • 7b die Sequenz der Struktur von 7a erläutert;
  • 7c einen "universellen" Forward-Primer, der ein Molecular Beacon bzw. molekulares Lichtsignal einbaut bzw. enthält, mit einer universellen Primersequenz bzw. Universalprimersequenz erläutert;
  • 7d einen weiteren "universellen" Forward-Primer, der ein Molecular Beacon einbaut bzw. enthält, mit einer unterschiedlichen Primersequenz erläutert;
  • die 8a bis 8f ein alternatives Amplifikationsverfahren gemäß der Erfindung erläutern;
  • die 9a bis 9d eine Untersuchungstechnik mittels eines in kleinsten Abmessungen hergestellten Arrays ("micro-fabricated array investigation technique") zum Amplifizieren von Produkten gemäß der Erfindung, basierend auf "Genetic Bit"-Analyse, erläutern;
  • die 10a bis 10e eine Untersuchung für die amplifizierten Produkte der Erfindung mittels eines in kleinsten Abmessungen hergestellten Arrays auf der Basis einer Ligationstechnik erläutern;
  • 11 zwei Forward-Primer und einen Reverse-Primer erläutert, die zur Verwendung in einer Ausführungsform des Erststufen-Amplifikationsverfahrens der vorliegenden Erfindung geeignet sind;
  • die 12a bis 12e verschiedene Merkmale einer Hybridisierung, die auf der Untersuchung der Amplifikationsergebnisse beruht, erläutern, wobei der amplifizierte Strang an einen Glasobjektträger ("glass slide") gebunden ist;
  • die 13a und 13b einen weiteren Weg der Untersuchung der Ergebnisse durch Hybridisierung der amplifizierten Produkte mit Oligonucleotiden, die am Glasobjektträger gebunden sind, erläutern;
  • 14 Ergebnisse für drei Proben und eine Kontrolle an vier Loki unter Verwendung der vorliegenden Erfindung erläutert;
  • 15 die Sensitivität bzw. Empfindlichkeit und Spezifität der Technik der vorliegenden Erfindung erläutert;
  • 16a den Primer 416a, getestet gegen Gc 1S1S; 1F-1F; 2-2 und eine Negativkontrolle erläutert, wobei erläutert wird, dass nur 1F-1F ein Signal liefert und mit den anderen Proben kein Hintergrund (geräusch) beobachtet wurde;
  • 16b eine Simplexreaktion zum Testen der Spezifität des Forward-Primers 420G erläutert, der beide Gc1-Polymorphismen detektiert, wobei der Primer gegen eine Serie von Individuen, Gc1S-1S; 1F-1F; 2-2 und eine Negativkontrolle getestet wurde, wobei nur die ersten zwei Proben ein Signal lieferten und der Rest klar blieb;
  • 16c eine Simplexreaktion zum Testen der Spezifität des Forward-Primers 420T, der Gc2 detektiert, mit Proben, die von 1S-1S, 1F-1F, 2-2 und einer Negativkontrolle genommen wurden, erläutert, wobei wiederum kein Hintergrund (geräusch) detektiert wurde;
  • 16d die niedrigen Probenkonzentrationen zeigt, die detektiert werden können, wobei der Versuch an einer Reihe von Proben, die von einem 1S-1S-Individuum genommen und mit 1NG, 200PG, 400PG bzw. 8PG (Figuren in der Reihenfolge von oben nach unten) hergestellt wurden, mit einem Cocktail aus den GC420- und GC416-Primern und den in der PCR-Reaktion verwendeten Universalprimern durchgeführt wurde; die Ergebnisse zeigen an, dass, da beide Bits grün sind, das Priming mittels 416C und 420G durch und durch erfolgte, wobei dies mit dem Genotyp des Individuums konsistent und wobei folglich kein Hintergrundgeräusch) aus 416A oder 420T beobachtet wurde;
  • 17 ein Diagramm der Fluoreszenz versus Zyklenzahl für Proben ist, die mit dem Gc1s-Primer und variierenenden Konzentrationen an Zweitrunden-Universalprimer amplifiziert wurden;
  • 18 ein Minigel-Ergebnis für PCR-Produkte gemäß einer Amplifikation, die erfindungsgemäß durchgeführt wurde, ist;
  • 19 ein Diagramm der Fluoreszenz versus Zyklenzahl für verringerte Konzentrationen von Gc1s + ve DNA im Vergleich zu einer Kontrolle SDW ist;
  • 20a ein Diagramm der Fluoreszenz gegen die Amplifikationszyklenzahl für den Gc1-Primer mit dem Universal-G-"beacon" für die DNA-Proben 1, 2 und die Kontrollprobe 3 ist;
  • 20b ein Diagramm der Fluoreszenz gegen die Amplifikationszyklenzahl für den Gc2-Primer mit dem Universal-C-"beacon" für die Proben von 17a ist;
  • 20c ein Diagramm der Fluoreszenz gegen die Amplifikationszyklenzahl für den Gc1s-Primer mit dem Universal-G-"beacon" für die Proben von 17a ist;
  • 20d ein Diagramm der Fluoreszenz gegen die Amplifikationszyklenzahl für den Gc1f-Primer mit dem Universal-C-"beacon" für die Proben von 17a ist;
  • 21 eine Illustration der Primerbindungsstellen des Gc1f-Primers in Bezug auf die Codonpositionen 416 und 420 auf Proben ist, die Gc1s-, Gc1f- und Gc2-Phänotypen sind;
  • 22 ein Diagramm der Fluoreszenz gegen die Amplifikationszyklenzahl für eine männliche DNA-Probe mit dem amelo-Y-Primer und dem Universal-G-"beacon" ist;
  • 23a ein Diagramm der Fluoreszenz gegen die Amplifikationszyklenzahl für den Hauptbestandteil eines 2-DNA-Probengemischs, codierend für den Gc2-Polymorphismus, und variierende Verhältnisse von Haupt-zu-minorem Bestandteil ist;
  • 23b ein Diagramm der Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl ist, das die Detektion des minore Bestandteils eines 2-Proben-DNA-Gemischs, codierend für den Gc1s-Polymorphismus, mit variierenden Konzentrations-Verhältnissen von Haupt-zu-minorem Bestandteil zeigt;
  • 24 eine Illustration der Versuchsergebnisse mit Amplifikation bei verschiedenen Anlagerungstemperaturen ist, die eine ausgiebige Primerdimerbildung bei 70°C und 72°C zeigt, die durch die Primerdimerbildung bei 74°C verringert ist und zeigt im Wesentlichen keine Primerdimerbildung bei 76°C;
  • 25a Primer erläutert, die für eine Primerdimerbildung empfänglich sind;
  • 25b zwei Primer erläutert, bei denen keine Primerdimerbildung auftreten kann;
  • 25c Primersequenzen gemäß dem Konzept von 25b erläutert;
  • 26 ein Diagramm der Fluoreszenz versus Zyklenzahl für verschiedene Proben, die verschiedene DNA-Mengen enthalten, eine DNA-Negativprobe und zwei Proben von sterilem destilliertem Wasser ist;
  • 27 ein Diagramm der Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl für Proben ist, die unter Verwendung eines bestimmten Primersatzes amplifiziert wurden, wobei wiederum Proben, die verschiedene DNA-Konzentrationen enthalten, eine DNA-Negativprobe und zwei Proben von sterilem destilliertem Wasser gezeigt werden; und
  • 28 ein Diagramm der Fluoreszenz für Proben, die unter Verwendung eines bestimmten Primersatzes amplifiziert wurden, verschiedene Proben, die variierende DNA-Konzentrationen bereitgestellt enthalten, zusammen mit einer DNA-Negativprobe und zwei Proben von sterilem destilliertem Wasser zeigt.
  • Die Nucleotidsequenz von Menschen und anderen biologischen Entitäten ist zu einem großen Teil zwischen Individuen konsistent. Jedoch sind Orte bekannt, an denen Variationen auftreten. Eine derartige Form von Variation ist als Einzelnukleotidpolymorphismus oder als bi-allelischer Marker bekannt, wobei die Identität eines Einzelnukleotids an einem spezifischen Ort eine von vier Möglichkeiten aus einer beliebigen der vier verfügbaren Basen, A, T, G oder C, ist. In vielen Fällen ist die Variation nur bi-allelisch und folglich treffen nur eine oder zwei Möglichkeiten zu. Somit können manche Individuen eine Sequenz aufweisen, die eine Base C an einer bestimmten Position enthält, während andere Individuen eine Base G an dieser Position aufweisen werden, wobei die umgebenden Sequenzen für beide Individuen identisch sind.
  • Die medizinische Diagnostik, forensische Untersuchungen und andere DNA-Tracing-Anwendungen nutzen solche Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) für Identifikationszwecke. Da die Variation zwischen Individuen nur eine von zwei Optionen bzw. Möglichkeiten sein kann, müssen eine beträchtliche Anzahl solcher Orte, Loki für ein statistisch signifikantes Ergebnis betrachtet werden, beispielsweise die statistische Signifikanz einer Übereinstimmung zwischen einer gesammelten Probe und der Ausstattung ("makeup") eines Individuums, die zu erhalten ist.
  • Die Untersuchung solch einer großen Zahl von Loki, häufig mehrere 100, auf einer individuellen Basis ist extrem zeitaufwändig. Um die benötigte Zeit zu verringern, könnte es möglich sein, Multiplexe zu konstruieren, die es erlauben, eine wesentliche Zahl von Loki simultan auf der Basis von PCR oder anderen amplifizierenden Techniken zu untersuchen. Die Konstruktion bzw. der Entwurf zuverlässiger Konstrukte für eine große Zahl von Loki ist jedoch extrem schwierig aufgrund der Probleme von Wechselwirkungen zwischen den Primern, die für die verschiedenen Loki benötigt werden, verschiedenen Bedin gungen für eine geeignetermaßen wirksame Amplifikation der verschiedenen Primer und einer Vielzahl anderer Gründe.
  • Die Technik der vorliegenden Erfindung ist dafür gedacht, SNP-basierte und andere Untersuchungen zu vereinfachen, und insbesondere die rasche Entwicklung von Multiplexen, die zur gleichzeitigen Untersuchung einer großen Zahl derartiger Loki geeignet sind, aufgrund der durch die vorliegende Technik angebotenen Flexibilität zu erleichtern.
  • Die Technik ist um zwei Amplifikationsstufen, die im Allgemeinen durch PCR erzielt werden, aufgebaut, wobei beide der Stufen Spezifität hinsichtlich der identifizierten und amplifizierten SNPs bieten. Die zwei Amplifikationsstufen können separat oder gleichzeitig durchgeführt werden, und die Amplifikationsprodukte können auf eine Vielfalt von Weisen analysiert werden.
  • 1 erläutert, gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, eine Reihe von Stufen, die an dem ersten Amplifikationsvorgang beteiligt sind, der um eine Zielmatrize 1 mit einem potenziellen C- oder G-Einzelnukleotidpolymorphismus 3 in einem Strang 5 dieser Zielmatrize 1 aufgebaut ist. Wie in Stufe A erläutert, hat der Zielmatrizenstrang 5 des zu untersuchenden speziellen Individuums ein Nucleotid C an der SNP-Stelle 3. Der erste Schritt in dieser Amplifikationsstufe umfasst das In-Kontakt-Bringen des Matrizenziels 1 mit zwei verschiedenen Forward-Primern 7 und 9 und einem Reverse-Primer 11. Die Forward-Primer 7 und 9 sind lokusspezifische Primer, die unten stehend detaillierter beschrieben werden.
  • Der lokusspezifische Forward-Primer 7 wird von einem Nucleotid G beendet, was ihn in Übereinstimmung mit dem Nucleotid C an der SNP-Stelle 3 bringt und in der Anlagerung dieses Primers 7 am Strang 5 resultiert. Der Reverse-Primer 11 ist unspezifisch und lagert sich an den anderen Strang 13 der Matrize 1 am geeigneten Ort an.
  • In Schritt B verlängern sich der spezifische Forward-Primer 7 und der Reverse-Primer 11, um die Stränge 14 und 16 durch Primerverlängerung zu produzieren.
  • Die Denaturierung der Stränge resultiert in der Trennung der Stränge 5, 13 von ihren jeweiligen kopierten Strängen 14 und 16. Der kopierte Strang 14 ist nur in Schritt C und der Illustration der anschließenden Schritte gezeigt.
  • Dann wird eine anschließende Primeranlagerung, Schritt D, durchgeführt, die wiederum die zwei Forward-Primer 7, 9 und den Reverse-Primer 11 verwendet. Da wir den Strang 14 betrachten, ist es der Reverse-Primer 11, der an den Strang 14 aufgrund seiner Sequenz bindet. Der spezifische Forward-Primer 7 würde an den Strang 16 binden, sobald er sich wiederum in Angleichung mit der Stelle der SNP 3 in der Sequenz dieses Stranges anlagert, wobei dies nicht gezeigt ist.
  • In der anschließenden Primerverlängerung, Stufe E, verlängert der Reverse-Primer 11 die Sequenz des neuen Stranges 18 mit der entsprechenden Sequenz, die von der Sequenz des Stranges 14 vorgegeben wird, einschließlich der Verlängerung zum Erzeugen des Schwanzteils 19, der entstand, als der Strang 14 den Schwanzteil 21 des spezifischen Forward-Primers 7 einschloss. Aufgrund der Base G in der Sequenz von Strang 14 umfasst der neue Strang 18 eine gegenüberliegende Base C, um so zu der Identität des SNP an der Stelle 3 im ursprünglichen Strang 5 zu passen. Aufgrund der Base G in der Sequenz von Strang 14, aufgrund der SNP-bezogenen Base 10, umfasst der neue Strang 18 eine gegenüberliegende Base C 20, um so zu der Identität der SNP-bezogenen Stelle 10 in dem ursprünglich kopierten Strang 14 zu passen.
  • Die Wiederholung der Schritte A bis E über 20 bis 25 Zyklen hinweg produziert viele Millionen Kopien der Sequenz, die die gleiche SNP-Identität, SNP-Wiederholung und umgebende Sequenz, wie die Zielmatrize 1 enthalten.
  • Die 2a und b illustrieren zwei lokusspezifische Forward-Primer, die zur Verwendung in der oben detailliert beschriebenen Stufe geeignet sind, zur Verwendung beim Untersuchen eines SNP, der entweder G oder C sein könnte. Jeder der lokusspezifischen Forward-Primer 30 besteht aus einem lokusspezifischen Teil 32, der eine Sequenz hat, die der Sequenz der Loki unter Betrachtung bis zu der SNP-Stelle entspricht. Das 3'-Ende 34 der lokusspezifischen Forward-Primer endet mit einem Nucleotid G 34a bei einem der Primer, 2a, und mit einem Nucleotid C 34b für den anderen Primer, 2b. Aufgrund dieses unterschiedlichen Nucleotids, das an der Position verwendet wird, die dem SNP entspricht, wird dann, abhängig von der Identität des tatsächlich angetroffenen SNP, sich einer der lokusspezifischen Forward-Primer daran anlagern, wobei der andere dies nicht wird. Somit ist es der Forward-Primer von 2a, der sich an das Ziel im Beispiel von 1 anlagert. Diese Selektivität bei der Anlagerung ergibt eine folgerichtige Spezifität in den anschließenden Amplifikationszyklen der ersten Stufe.
  • Zusätzlich zu dem lokusspezifischen Teil 32 schließt der lokusspezifische Forward-Primer 30 einen "Universal"-Primerteil 36 ein. Der "Universal"-Primerteil 36 besteht aus einer Nucleotidsequenz, die für jeden der zwei lokispezifischen Forward-Primer identisch ist, ausgespart ist eine Einzelnucleotidposition 38 an der Verbindung zwischen dem "Universal"-Primerteil 36 und dem lokispezifischen Teil 32 des Primers 30. Das Nucleotid an der Position 38 ist identisch mit dem 3'-Ende-Nukleotid 34 des lokusspezifischen Teils 32 des jeweiligen Primers 30. Somit baut der "Universal"-Primer von 2a G in seine Sequenz an der Position 38 ein, um das Nucleotid G, das am 3'-Ende 34 vorliegt, widerzuspiegeln. Der "Universal"-Primerteil von 2b schließt andererseits ein C an der Position 38 ein, um die Tatsache widerzuspiegeln, dass ein Nucleotid C das 3'-Ende 34 dieses Primers 30 bildet.
  • Während es der lokusspezifische Teil 32 des Forward-Primers 30 ist, der bestimmt, ob sich ein Primer an das Ziel anlagert oder nicht, in der zweiten und den anschließenden Kopierstufen des Amplifikationsvorgangs von Stufe 1, verursacht die Primerverlängerung auch das Kopieren des "Universal"-Primerteils 36 der Primersequenz und folglich auch das Kopieren der SNP-äquivalenten Nucleotididentität an Position 38.
  • Wie zuvor festgestellt, resultiert der Amplifikationsvorgang der ersten Stufe in einer großen Zahl kopierter Sequenzen, die das die SNP-Identität widerspiegelnde Nucleotid und das dazu passende Nucleotid an Position 38 einschließen.
  • In der zweiten Stufe der Amplifikation, in 3 erläutert, wird ein weiterer spezifischer Amplifikationsvorgang durchgeführt. Es ist stark bevorzugt, dass die zweite Stufe der Amplifikation im gleichen Behälter wie die erste, im Wesentlichen simultan mit dem ersten Amplifikationsvorgang, durchgeführt wird. Eine solche Möglichkeit wird detaillierter beschrieben.
  • Für diese Stufe wird ein Aliquot der Amplifikationsprodukte der ersten Stufe, oben stehend beschrieben, entnommen und in Kontakt gebracht mit einem Paar von "Universal"-Forward-Primern und einem "Universal"-Reverse-Primer. Diese "Universal"-Primer werden unten stehend detaillierter beschrieben.
  • In Schritt A werden die Stränge 40 und 42 (Kopienstränge, die zu den Strängen 14, 18, produziert in der ersten Stufe, wie oben stehend erläutert, äquivalent sind), die durch die erste Stufe 1 produziert werden, denaturiert und in Kontakt gebracht mit den zwei "Universal"-Forward-Primern 50, 52 und dem "Universal"-Reverse-Primer 54.
  • Die zwei "Universal"-Forward-Primer unterscheiden sich hinsichtlich des 3'-terminalen Endnucleotids 55 und hinsichtlich einer Farbstoffeinheit D oder einer anderen Form von Markierung, die am 5'-Ende 56 bereitgestellt wird. Das 3'-Endnucleotid 55 für die "Universal"-Forward-Primer in diesem Beispiel ist entweder C, "Universal"-Primer 50, oder G, "Universal"-Primer 52.
  • Da die Stränge 40 und 42, im Gegensatz zu den Strängen 14, 18, das Ergebnis des Herstellens von Kopien von Kopien der Originale darstellen, haben sie beide jeweils die Schwanzteile 44, 46, die durch das Kopieren der "Universal"-Primerteile des lokusspezifischen Forward-Primers und Reverse-Primers in der ersten Stufe entstehen.
  • Die "Universal"-Primer 50, 52 haben jeweils eine Sequenz, die dem "Universal"-Primerteil 34 des lokusspezifischen Primers 30 der ersten Stufe bis zu Position 38 des lokusspezifischen Forward-Primers 30 entspricht. An Position 55 haben die Forward-Primer 50, 52 der zweiten Stufe eine Base, die in der Identität der Identität der Nucleotidpaarung mit der SNP-Wiederholung im Stufe 1-Vorgang in einem Fall entspricht und im anderen Fall der Identität der anderen Möglichkeit für die SNP-Wiederholung entspricht. Die Nucleotididentität für die "Universal"-Primer 50, 52 an Position 55, entsprechend Position 38, ist somit für die zwei Primer 50, 52 verschieden, wobei einer eine der Möglichkeiten bereitstellt und der andere die andere bereitstellt.
  • Im erläuterten Beispiel trägt der Primer 50 ein Nucleotid C und der Primer 52 ein Nucleotid G an Position 55.
  • Die Sequenz der Primer 50, 52 und insbesondere die Identität an Position 55 bestimmt darüber, ob sich dieser Primer 50, 52 an den Schwanzteil 44 des Stranges 42 anlagert oder nicht. Im erläuterten Fall trägt der Strang 42 das SNP-Nucleotid C an der Stelle 63, da dies eine Kopie der Identität des SNP an der Stelle 3 im ursprünglichen Zielstrang 5 war. Die C-Identität wird auch in dem Schwanzteil 44 an Stelle 65 wiederholt, da diese(r) aufgrund des Kopierens des Schwanzes des ursprünglichen Primers 7 durch den Reverse-Primer 11 in der ersten Stufe kopiert wurde. Als Folge stellt die Sequenz des Schwanzteiles 44 von Strang 42 eine Anlagerungsstelle für den "Universal"-Primer 52, nicht aber für Primer 50, bereit. Der Reverse-Primer 54 lagert sich an den Schwanzteil 46 von Strang 40 aufgrund der Sequenzübereinstimmung an.
  • Die Primerverlängerung, Schritt B, resultiert in der Produktion von Strang 60 durch den übereinstimmenden, dazu passenden Strang 40, einschließlich der SNP-Stellenkopie C, und in der Produktion von Strang 62, einschließlich der Übereinstimmung für den SNP, G, durch den Übereinstimmungsstrang 42 durch den "Universal"-Reverse-Primer 54 bzw. den spezifischen "Universal"-Forward-Primer 52. Die SNP-Wiederholungen werden ebenfalls kopiert.
  • Dann wird eine thermische Denaturierung verwendet, um die Stränge zu trennen, Schritt C, und ab hier werden nur die Stränge 60 und 62 betrachtet, obwohl ähnliche Vorgänge auch auf die anderen Stränge zutreffen.
  • Im Anlagerungsschritt D lagert sich der spezifische "Universal"-Forward-Primer 52 an den Schwanz 64 von Strang 60 aufgrund des Vorhandenseins eines Nucleotids C an der relevanten Position 65 im Strang 60 und der folglichen Paarung mit dem "Universal"-Forward-Primer 52 an. Der Reverse-Primer 54 lagert sich an den Schwanzteil 66 des Stranges 62 an.
  • In dem weiteren Verlängerungsschritt E verlängert der Forward-Primer 52, der die Markierung D1 mit sich bringt, die Sequenz des neuen Stranges 68 einschließlich des Schwanzteiles 70. Der Reverse-Primer 54 verlängert die Sequenz des neuen Stranges 72 (wodurch die SNP-Identität an der Stelle 74 reproduziert wird), einschließlich des Schwanzteiles 76 (wodurch das Nucleotid, das der SNP-Wiederholung 75 entspricht, teilweise auch reproduziert wird). Strang 62 baut die Markierung D1 ab seinem Beginn als den Primer 52 in Stufe A ein.
  • Wiederum ergibt das Wiederholen der Stufen A bis E eine wesentliche Amplifikation der Sequenzen und produziert eine große Zahl von Sequenzen, die mit einem Farbstoff D1 markiert sind, wobei der Farbstoff selektiv aufgenommen wurde, da sich nur einer der Primer anlagert und somit den Farbstoff mit sich in die Sequenz nimmt bzw. einführt.
  • Wie oben stehend beschrieben, verwendet die zweite Stufe des Verfahrens ein Paar "Universal"-Primer in selbständiger Weise, wie in den 4a und 4b erläutert. Diese bestehen aus einem Teil 80 mit einer Sequenz, die mit dem "Universal"-Primerteil 36 des lokusspezifischen Primers 30 bis zur Einzelnukleotidvariation am Ende des "Universal"-Primerteils 36 identisch ist. Die Enden 82 der "Universal"-Primer der 4a und 4b sind voneinander verschieden und weisen eine Identität auf, die mit einer der zwei SNP-Möglichkeiten übereinstimmt, was auch der Fall ist für die Primer der 2a und 2b. Somit wird der eine "Universal"-Primer 52, 4a, mit G an seinem terminalen 3'-Ende 82 bereitgestellt und der andere "Universal"-Primer 50, 4b, wird mit C an seinem terminalen 3'-Ende 82 bereitgestellt.
  • Während der Stufe 2 des Verfahrens werden sich diese "Universal"-Primer selektiv an die Amplifikationsprodukte der ersten Stufe anlagern, wobei dies davon abhängt, ob die Schwanzteile, die während dieser Stufe verlängert und amplifiziert wurden, die G- oder C-Variation enthalten.
  • Selbstverständlich könnten äquivalente Primer mit T- oder A-Variationen in den oben stehend erwähnten Verfahren verwendet werden, um einen SNP mit einer potenziellen T- oder A-Variation zu untersuchen.
  • Es ist für beide, die "Universal"-lokusspezifischen Primer und die "Universal"-Primer, selbst wünschenswert, dass sie mit einem Phosphorthioatrest am 3'-Ende bereitgestellt werden, um die endständige Base gegen einen Exonucleaseverdau durch die Taq-Polymerase zu schützen. Dieses maximiert das Potenzial des Systems, Polymorphismen zu unterscheiden.
  • Die unterschiedlichen "Universal"-Forward-Primer werden mit unterschiedlichen Markierungen/Markern bereitgestellt, in diesem Falle eine JOE-Farbstoffmarkierung bzw. eine FAM-Farbstoffmarkierung. Die Farbstoffmarkierungen werden am 5'-Ende des Forward-Primers in der zweiten Stufe des Verfahrens bereitgestellt. Natürlich könnten andere Farbstoffe und andere Formen der Markierung, wie z.B. Radionuclide, verwendet werden.
  • Die "Universal"-Primer wurden vorsichtig konstruiert, um wünschenswerte Merkmale hinsichtlich ihrer Schmelztemperaturen, insbesondere einer Schmelztemperatur um 60°C, zu erhalten. Die Sequenzen wurden auch überprüft, um eine minimale Haarnadelstrukturbildung sicherzustellen und wurden auf eine minimale Primerdimerbildung überprüft. Die Sequenzen wurden auch gegen Human-DNA-Sequenzaufzeichnungen und/oder -Proben geprüft, um sicherzustellen, dass keine Human-DNA amplifiziert wird, und um jegliche Entsprechung zu einer beliebigen publizierten Sequenz und insbesondere einen beliebigen Teil der humanen DNA-Sequenz zu vermeiden. Die Primerdimerbildung wurde auch berücksichtigt, um eine derartige Bildung minimal zu halten.
  • Ein Beispiel eines geeigneten "Universal"-Forward-Primers wird durch die (5' nach 3' geschriebene)-Sequenz:
    CGA CGT GGT GGA TGTG CTAR
    bereitgestellt, worin R in Abhängigkeit von zu detektierenden SNP G oder C oder A oder T gleich ist; und ein geeigneter "Universal"-Reverse-Primer wird durch die (5'-nach-3'-geschriebene)-Sequenz:
    TGA CCT GG CTG ACT CGA CTG
    bereitgestellt.
  • Die Schmelzbedingungen für diese Primer bei 50 mM Primer und 50 mM Salz sind 59°C bei einem GC-Gehalt von 60 %.
  • Die Spezifität der Forward-Primer kann noch weiter gesteigert werden, indem das Ende für die Primer der ersten Stufe wie folgt erstellt wird: für einen G-detektierenden Primer-TC und/oder für einen C-detektierenden Primer-AG und/oder für einen T-detektierenden Primer-CT und/oder für einen A-detektierenden Primer-GA.
  • Aufgrund der verschiedenen Farbstoffe oder anderen Indikatoren, die auf den SNP-spezifischen "Universal"-Forward-Primern bereitgestellt werden, wird durch das amplifizierte Produkt ein Hinweis darauf gegeben, welche der möglichen SNP-Variationen am zu betrachtenden SNP auftritt.
  • Obwohl die Technik an jedem Lokus ein vorteilhaft geringes Hintergrundgeräusch hat, ist es möglich, eine oder mehrere typisierte Proben als Kontrollen einzubauen.
  • In 5 sind die Amplifikationsprodukte, die aus einer signifikanten Zahl solcher zweistufiger Verfahren hervorgehen, angegeben. In diesem Beispiel hat die dem Multiplex unterworfene Probe Amplifikationsprodukte erzeugt mit Hinweisen bzw. Anzeigen an:
    Lokus 1 mit dem SNP G, angezeigt durch den Farbstoff X, anstelle des Farbstoffs Y;
    Lokus 2 mit dem SNP T, angezeigt durch den Farbstoff W, anstelle des Farbstoffs V;
    Lokus 3 mit dem SNP C, angezeigt durch den Farbstoff Y, anstelle des Farbstoffs X;
    Lokus 4 mit dem SNP G, angezeigt durch den Farbstoff Z, anstelle des Farbstoffs U;
    Lokus 5 mit dem SNP G, angezeigt durch den Farbstoff X, anstelle des Farbstoffs Y;
    Lokus 6 mit dem SNP A, angezeigt durch den Farbstoff V, anstelle des Farbstoffs W.
  • Da die Längen der Sequenzen, die die Amplifikationsprodukte an unterschiedlichen Loki bilden, so konstruiert sind, dass sie von unterschiedlicher Länge sind, ist es möglich, jene Amplifikationsprodukte auf der Grundlage ihrer Größe, z.B. unter Verwendung von Elektrophoresetechniken, zu trennen und somit eine Reihe von Linien auf einem Gel zu erzeugen, deren Farbe anzeigend ist für die Variation an den speziellen Loki. Wo die Länge der Sequenz für einen Lokus nahe bei einer anderen liegen könnte, können unterschiedliche Farbstoffe für jede der Möglichkeiten verwendet werden. Im Beispiel von 5 können die Loki 1 und 5 die gleiche SNP-Variation aufweisen, sind aber hinreichend trennbar wegen der gleichen verwendeten Farbstoffe. Der Lokus 4 ist andererseits potenziell nahe zu den Lokus 5-Ergebnissen, und so werden unterschiedliche Farbstoffe für die Ergebnisse der Variation G, C für die Loki 4 und 5 verwendet.
  • 6 stellt eine detaillierte Erläuterung der Anlagerung des lokusspezifischen Primers und der nachfolgenden Verlängerung bereit, wobei der SNP in der Zielmatrize aus genomischer DNA einen C SNP aufweist und folglich an den G-enthaltenden lokusspezifischen Primer bindet.
  • Als eine weitere Modifikation gegenüber dem grundsätzlichen Einbau eines Farbstoffes in den Primer ist es möglich, ein sogenanntes "Molecular Beacon" bzw. ein "molekulares Lichtsignal" einzubauen. Dieses besteht aus einem einzelsträngigen DNA-Molekül, das eine Bäumchenstruktur ("stem and loop structure") besitzt. Wenn die in 7a illustrierte Haarnadelstruktur gebildet wird, wird das Farbstoffmolekül dicht in die Nähe des quenchenden Moleküls gebracht und fluoresziert als Folge davon nicht, wenn eine Untersuchung erfolgt. 5-Carboxyfluorescein (FAM) stellt einen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff zur Verwendung in einer derartigen Situation bereit, wobei 4-4'-Dimethylaminophenylazobenzoesäure (DABCYL) eine geeignete Quencher-Gruppierung darstellt. Methyl-Rot, insbesondere verzweigtes Methyl-Rot, könnte auch als alternativer Quencher verwendet werden.
  • Ein Molecular Beacon dieses Typs wird, wenn der Reverse-Primer in den Beacon-Stamm verlängert wird, destabilisiert und erzeugt eine Auffaltung des Moleküls. Dies entfernt die Fluoreszenzfarbstoffmarkierung hinreichend weit von dem quenchenden Molekül, so dass kein Quenchen des Farbstoffmoleküls mehr auftritt. Eine anschließende Untersuchung des Systems würde eine Fluoreszenz ergeben, weshalb die Fluoreszenz den speziellen Farbstoff und somit den speziellen betrachteten SNP anzeigt.
  • Die spezielle Sequenz und die Bestandteile der Struktur von 7a sind in 7b erläutert. Weitere Illustrationen der Universal-Primer in Verbindung mit "Molecular Beacons" sind in 7c erläutert, und zwar für ein Universal-"Molecular G Beacon" mit einer AG-Sequenz an seinem 3'-Ende, und in 7d für ein Universal-"Molecular C Beacon" mit TC an seinem 3'-Ende. Die reverse Universal-Primersequenz, die bei den universellen "Molecular Beacons" der 7c und 7d verwendet wird, ist:
    TGC CGT GGC TGA CCT GAG AC.
  • Es ist bevorzugt, dass keines der Primer enthaltenden bzw. einbauenden Universal-"Molecular Beacons" eine Phosphorthioatbindung enthält.
  • Eine Vielzahl von Wegen zum Implementieren der Technik ist möglich, und während PCR, gefolgt von direkter Prüfung der Ergebnisse mittels eines Instruments und/oder Prüfung nach elektrophoretischen Untersuchungen der Amplifikationsprodukte in Gelen durchgeführt werden könnte, ist die Technik auch zur Verwendung mit festen oder anderen Trägern geeignet. Feste Trägermedien umfassen Silizium, Glas, Kunststoffe und magneti sche Kügelchen. Insbesondere ist die Technik auch zur Implementierung des Systems von in kleinen Abmessungen hergestellten Arrays geeignet.
  • In kleinsten Abmessungen hergestellte Arrays zum Implementieren der vorliegenden Erfindung verwenden Oligonucleotide, die dazu konstruiert sind, an der Base zu enden, die die vorletzte zu dem SNP-Polymorphismus unter Betrachtung ist. Die Oligonucleotide werden an einen festen Träger, wie z.B. Glas, nach einem Verfahren, wie z.B. Z; Guilfoyle RA; Theil AJ; Wang R und Smith LM (1994) Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays an glass supports. Nucleic Acids Research (1994), Band 22: 5456–5465, gebunden.
  • In einem derartigen Verfahren werden Mikroskopobjektträger für 2 min in 1%ige 3-Aminopropyltrimethoxysilan-Lösung in 95 % Aceton/Wasser eingetaucht. Die Objektträger werden dann 10 mal mit Aceton gewaschen, 5 min pro Waschung, für 45 min bei 110°C getrocknet, für 2 h mit einer Lösung aus 0,2 % 1,4-Phenylendiisothiocyanat (PDC)-Lösung in 10 % Pyridindimethylformamid behandelt und mit Methanol und Aceton gewaschen.
  • Diese aktivierten Glasobjektträger können in einem Vakuumexsikkator unbegrenzt gelagert werden.
  • Die Oligonucleotide werden in einem Gittermuster auf dem Glasobjektträger abgelegt (unter Verwendung eines Roboters kann es möglich sein, etliche 100 verschiedene Oligonucleotide abzulegen). Das Oligonucleotid enthält eine Aminogruppe am 5'-Ende, eingeführt unter Verwendung des Reagenzes Trifluoracetyl-6-aminohexyl-2-cyanoethyl-N',N'-diisopropylphosphoamidit. Wenn das Oligonucleotid direkt auf den Glasobjektträger aufgebracht wird, bindet das 5'-Ende kovalent an das Glas.
  • Die in kleinsten Abmessungen hergestellten Arrays können auf eine Vielfalt von Weisen, von denen einige nachstehend detaillierter beschrieben sind, und häufig in Verbindung mit amplifizierten Produkten, die gemäß der folgenden Technik erzeugt wurden, verwendet werden. In der alternativen Technik ist, wie in 8a gezeigt, eine Zielprobe 800, die die SNP-Stelle 802, die die Identität einer C-Base aufweist, einschließt, unter Betrachtung in Verbindung mit dem korrespondierenden Strang 804. Um eine Amplifikation zu erreichen, werden ein lokusspezifischer Forward-Primer 806 und ein lokusspezifischer Reverse-Primer 808 eingeführt. Jeder dieser Primer ist von dem allgemeinen Typ, der oben stehend beschrieben wurde, umfassend einen lokusspezifischen Primerteil 810 bzw. 812 und einen Universalteil 814 bzw. 816. Die lokusspezifischen Teile 810 und 812 werden mit Sequenzen bereitgestellt, die zu den Sequenzen der Stränge 803 bzw. 804 passen, jedoch, im Gegensatz zu dem oben stehend beschriebenen Verfahren, entfernt von der Stelle 802 des SNP.
  • Im Einklang mit dem Format der oben stehend beschriebenen Forward- und Reverse-Primer (siehe beispielsweise die die 2a und 2b betreffende Beschreibung) weisen die Universalprimerteile eine Sequenz auf, die nicht mit dem fraglichen Lokus hybridisiert und vorzugsweise nicht mit einer beliebigen natürlicherweise vorkommenden DNA-Sequenz hybridisiert.
  • Sobald er hybridisiert hat, bewirkt die Verlängerung, wie in 8b gezeigt, dass der Forward-Primer 806 einen Kopienstrang 818 erzeugt und der Reverse-Primer 808 einen Kopienstrang 820 bildet. Der Strang 820 schließt eine Base ein, die eine Identität mit dem SNP aufweist, und der Strang 818 weist eine Basis auf, die mit den SNP-Identitäten paart.
  • Nach der Denaturierung dieser Stränge lagert sich, wie in 8c gezeigt, der Strang 818 an einen Reverse-Primer 808 an, und der Strang 820 lagert sich an den Forward-Primer 806 an.
  • Wie in 8d erläutert, resultiert die Primerverlängerung in einem weiteren Kopienstrang 822, der eine Kopie der SNP-Identität einschließt, und in Strang 824, der eine Kopie der Basenidentität, die mit dem SNP paart, einschließt. Diese Amplifikationsprodukte schließen auch die Schwanzteile 826, 828 ein, die den Sequenzen entsprechen, die durch die Universalteile der Forward- und Reverse-Primer während der früheren Stufen eingeführt wurden.
  • Im zweiten Amplifikationsverfahren der 8e und 8f, bei dem die Amplifikation im Wesentlichen simultan mit der ersten Stufe und/oder separat erfolgen kann, erfolgt eine weitere Amplifikation. In diesem Fall werden jedoch die Amplifikationsprodukte für die erste Stufe, die Stränge 824 und 822 aus der Illustration von 8d, mit einem Forward- und einem Reverse-Primer in Kontakt gebracht. In diesem Fall weist der Forward-Primer 830 eine Sequenz auf, die der Sequenz des Universalteils 814 des Forward-Primers 806 der ersten Stufe entspricht. Gleichermaßen weist der Reverse-Primer 832 eine Sequenz auf, die identisch ist mit dem Universalteil 816 des Reverse-Primers 808 der ersten Stufe. Als Folge dieser Sequenzen lagert sich der Forward-Primer an dem Schwanzteil 826 von Strang 822 an, und der Reverse-Primer 832 lagert sich an den Schwanzteil 828 von Strang 824 an.
  • Die Primerverlängerung, 8f, resultiert in weiteren Kopien der Stränge 824, 822, die als Stränge 834 bzw. 836 erzeugt werden.
  • In der zweiten Stufe des Verfahrens bedeutet, wie dies auch für das zuvor beschriebene Amplifikationsverfahren gilt, die Tatsache, dass die Amplifikationsprodukte aus einer großen Vielzahl von Loki die Schwanzteile der Erststufenprimer einschließen werden, dass ein einziger Forward- und Reverse-Primer verwendet werden können, um alle der vorliegenden Loki-Amplifikationsprodukte weiter zu amplifizieren, anstatt, dass Forward- und Reverse-Primer zu verwenden sind, die für die Loki spezifisch sind, um die Amplifikation zu erzielen. Dies macht die Technik besonders geeignet zum simultanen Amplifizieren einer großen Zahl von Zielsequenzen aus einer großen Zahl verschiedener Loki, ohne Bedenken hinsichtlich des Koordinierens von Schmelztemperaturen und anderer Eigenschaften.
  • Die Amplifikationsprodukte des oben stehend beschriebenen Verfahrens können auf eine Vielzahl von Weisen analysiert werden.
  • Beispielsweise, und unter Bezug auf die 9a bis 9d, ist es möglich, diese Amplifikationsprodukte unter Verwendung einer "Genetic Bit"-Analyse zu analysieren. In diesem Beispiel wird ein fester Träger 900, wie z.B. Glas, für das Array bereitgestellt. Gebunden an das Array ist, über sein 5'-Ende, ein maßgeschneidertes Oligonucleotid 902, das so konstruiert ist, dass es eine paarende Sequenz mit den Amplifikationsprodukten, die den SNP von Interesse enthalten, aufweist. Das gebundene Oligonucleotid 902 weist ein 3'-Ende 904 auf, das um die eine Base, die mit der SNP-Base paart, verkürzt ist.
  • In der Anwendung werden die Amplifikationsprodukte mit den Oligonucleotiden 902 des Arrays in Kontakt gebracht (eine wesentliche Zahl derartiger Oligonucleotide wird bereitgestellt, wobei die Illustrationen wegen der Klarheit nur ein derartiges Oligonucleotid wiedergeben). Als Ergebnis dieses Kontaktes hybridisiert das Amplifikationsprodukt, das beispielsweise durch den Strang 834 aus 8f wiedergegeben wird, mit dem gebundenen Oligonucleotid 902 aufgrund der paarenden Sequenz. Da das Oligonucleotid eine Base kürzer ist als die SNP-Position 906 erfolgt jedoch keine Basenpaarung mit dem SNP während dieses Hybridisierungsverfahrens.
  • In einem nachfolgenden Schritt, 9c, werden Didesoxynucleotide, die mit Farbstoffen markiert sind, eingeführt. Im Beispiel von 9c wird ein Didesoxynucleotid 908, das mit einem Farbstoff A markiert ist, bereitgestellt, und ein Didesoxynucleotid 910 wird mit einem Farbstoff B bereitgestellt. Das Didesoxynucleotid 908 ist eine Base C, während das Didesoxynucleotid 910 eine Base G ist. Das Zusetzen dieser Didesoxynucleotide zusammen mit TAQ bewirkt, dass die TAQ-Polymerase die geeignete Base an das gebundene Nucleotid 902 anfügt, wie in 9d gezeigt. In diesem Fall ist es, da die mit dem SNP paarende Base eine Base G ist, das Didesoxynucleotid 910, das hinzugefügt wird, und als eine Folge daraus, mit ihm der Farbstoff B.
  • In einer anschließenden Stufe, die nicht gezeigt ist, werden die nicht-fixierten Didesoxynucleotide und ihre Farbstoffe von den in kleinsten Abmessungen hergestellten Arrays abgewaschen und die Prüfung des Arrays deckt auf, dass der Farbstoff B ist und, als eine Folge davon, das Didesoxynucleotid 910 ist, das dem gebundenen Nucleotid 902 hinzugefügt worden ist, und dass folglich die Identität des SNP 906 eine Base C ist.
  • Untersuchungen auf andere Basen können simultan erzielt werden unter Verwendung verschiedener Farbstoffe für jede der vier Möglichkeiten und mit verschiedenen gebundene Oligonucleotiden, die an verschiedenen Positionen in in kleinsten Abmessungen hergestellten Arrays bereitgestellt werden. Somit kann eine wesentliche Zahl von Loki simultan untersucht werden, und zwar unter Verwendung lokispezifischer gebundener Nucleotide in Kombination mit einem verschiedenen Farbstoff, der an jedes der vier möglichen Didesoxynucleotide gebunden ist.
  • Das Verfahren der "Genetic Bit"-Analyse (GBA) wird verwendet, um die Polymorphismen zu detektieren, wie in Nikiforov TT; Rendle RB; Goelet P; Rogers YH, Kotewiez MI, Anderson S, Trainor GL, Knapp MR (1994) Genetic Bit Analysis: a solid Phase method for typing single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 22:4167–75 beschrieben.
  • In der Hybridisierungslösung können sich 4 Didesoxybasen (A, G, C, T) befinden, die mit unterschiedlichen Farbstoffen, z.B. TAMARA, JOE, FAM, HEX, farbstoffmarkiert sind. Taq- oder Klenow-Polymerase können vom Reaktionsgemisch umfasst sein. Diese verlängert das Oligonucleotid um genau eine Base mit dem komplementären Didesoxy(nucleotid), das anschließend über Fluoreszenz eine Farbe aufweist, die von der komplementären Base abhängig ist.
  • Als Alternative zu einer "Genetic Bit"-Analyse kann ein Ligationsassay verwendet werden, in dem derartige Arrays zum Untersuchen der Identität des SNP in dem Typ von Amplifikationsprodukt, das durch das oben stehende Verfahren in Zusammenhang mit den 8a bis 8f erzeugt wurde, zu untersuchen. In diesem Verfahren werden die gebundenen Oligonucleotide 1001 auf dem Träger 1003 bereitgestellt und ein in kleinsten Abmessungen hergestellter Array wird mit den Amplifikationsprodukten in Kontakt gebracht.
  • Da die gebundenen Oligonucleotide 1001 mit einer Sequenz bereitgestellt werden, die mit der Sequenz der SNP-enthaltenden Stränge, z.B. Strang 834 aus 8f, paart, hybridisiert dieser Strang mit dem gebundenen Oligonucleotid 1001. Die Sequenz des gebundenen Oligonucleotids 1001 stoppt eine Base vor der SNP-Stelle 1005. Als Folge ergibt sich, wie in 10b gezeigt, keine Basenpaarung mit der SNP-Stelle 1005, in diesem Fall die Base C.
  • Im nachfolgenden Schritt, erläutert in 10c, werden allelspezifische Primer mit dem gebundenen Oligonucleotid und dem hybridisierten Strang 834 in Kontakt gebracht. Diese Primer sind am 3'-Ende mit Basen ausgestattet, die die möglichen Basenidentitäten wiedergegeben, die mit der SNP-Base übereinstimmen würden. Somit ist das Oligonucleotid 1007 mit der Base G am 3'-Ende ausgestattet und das Oligonucleotid 1009 ist mit der Base C am 3'-Ende ausgestattet. Die Oligonucleotide 1007 und 1009 enthalten bzw. bauen voneinander verschiedene Farbstoffmoleküle ein. Indem diese Oligonucleotide 1007 und 1009 zusammen mit Ligase bereitgestellt werden, wird dann nur das Oligonucleotid 1007 oder 1009, das eine 3'-Basenpaarung mit der SNP-Basenidentität aufweist, am Ende des gebundenen Oligonucleotids 1001 eingeführt werden, siehe 10b.
  • Nach der erfolgreichen Ligation, wird in 10e gezeigt, wird die Temperatur erhöht, um die Oligonucleotide, die die nicht eingebauten Farbstoffe und das Amplifikationsprodukt, den Strang 834 selbst, tragen, abzuschmelzen. In der Folge verbleiben nur das gebundene Oligonucleotid 1001 und das Oligonucleotid 1007 unter Einbau seines Farbstoffs. Die Prüfung der Farben, die auf den zahlreichen Arrays des in kleinsten Abmessungen hergestellten Arrays vorliegen, deckt dann die Identität des Farbstoffs und folglich die 3'-Basenidentität für das Oligonucleotid und folglich die Basenidentität und den SNP 1001 für jedes der Amplifikationsprodukte unter Betrachtung auf.
  • Wiederum kann eine wesentliche Zahl von Loki gleichzeitig durch die Verwendung unterschiedlicher gebundener Oligonucleotide 1001 betrachtet werden. Die Grundtechnik der Erfindung könnte auch in Kombination mit Massenspektrometrie und/oder Mikrotiterplatten basierten Assays, einschließlich dem Taq-man-Assay und "Molecular Beacons" verwendet werden.
  • Um die Fähigkeit der Technik, Akurat-SNP-Unterschiede nach der Amplifikation zu unterscheiden, können die folgenden Modifikationen durchgeführt werden. In den oben stehend beschriebenen Techniken fügt der "Universal"-Primerteil der Forward-Primer der ersten Stufe in jedem Fälle äquivalente Sequenzen hinzu. Der einzige Unterschied lag in der Einzelnucleotididentität, die an der Verbindungsstelle zwischen dem Universalprimerteil und dem lokusspezifischen Teil der Primer lokalisiert ist. Bei dieser Modifikation wird jedoch der Universalprimerteil des Forward-Primers mit einer in jedem Fall verschiedenen bzw. eindeutigen Sequenz im Vergleich zu den anderen Forward-Primern für verschiedene SNP-Identitäten ausgestattet. Angesichts dessen, dass es nur ein Maximum von vier möglichen SNP-Identitäten gibt, ist für jeden beliebigen SNP ein Maximum von vier verschiedenen Forward-Primern, jeweils mit einem verschiedenen Universalprimerteil, erforderlich. Der Reverse-Primer schließt auch einen Universalprimerteil ein, der einen zu den Teilen der Forward-Primer verschiedenen Universalprimerteil aufweist. Die Funktion der Reverse-Primer und Forward-Primer während der Amplifikation ist äquivalent zu der, die oben stehend beschrieben wurde.
  • Beispiele geeigneter Forward-Primer, 1000 und 1002, sind in 11 zusammen mit einem geeigneten Reverse-Primer, 1004, erläutert. Der Forward-Primer 1000 ist lokusspezifisch für den α-1-Antitrypsin M1/S-Polymorphismus mit dem Ziel des Detektierens einer T-basierten Variation, wohingegen beabsichtigt ist, dass der Forward-Primer 1002 eine A-basierte Variation am SNP detektiert. Dies wird von den Identitäten des SNP-identifizierenden Teils 1006 bzw. 1008 widergespiegelt. Der lokusspezifische Teil, 1010 bzw. 1012, dieser zwei Forward-Primer ist an einen Universalprimerteil 1014 bzw. 1016 gebunden, wobei der Universalprimerteil in jedem Fall einen unterscheidenden Teil 1018 bzw. 1020 enthält. In diesem Beispiel werden die unterscheidenden Teile innerhalb der gesamten Sequenz des Universalprimerteils bereitgestellt, und zwar aus Gründen, die nachstehend detaillierter beschrieben sind. Jedoch könnte der gesamte Universalprimerteil oder ein Ende des Universalprimerteils dazu verwendet werden, die unterscheidende Sequenz bereitzustellen.
  • Eine ähnliche Struktur wird für den ersten Primer hinsichtlich der lokusspezifischen Sequenz 1022, dem Universalprimerteil 1024 und dem unterscheidenden Teil 1026 bereitgestellt.
  • Die Universalprimerteile sind bevorzugt voneinander um mindestens 6 Basen verschieden. Universalprimerteile mit einem Sequenzunterschied zwischen 25 und 100 % im Vergleich zueinander sind vorteilhaft.
  • Einer der Hauptvorteile dieser Änderung an der Sequenz des Universalprimerteils ist, dass sie mehrfache Basenänderungen in den Amplifikationsprodukten einführt und, als Folge davon, die Amplifikationsprodukte für die Untersuchung und Detektion unter Ver wendung einer Hybridisierung an festen Trägeroberflächen, wie z.B. Glas, geeigneter macht. Diese Technik ist nachfolgend detaillierter beschrieben.
  • Bei der Produktion von Amplifikationsprodukten, die hinsichtlich ihrer Basen voneinander wesentlich verschieden sind, sind die Amplifikationsprodukte für die Untersuchung und Analyse unter Verwendung des Typs der Technik, der in 12 erläutert ist, besonders geeignet.
  • Wie in 12a erläutert, besteht das Amplifikationsprodukt aus der Forward-Primersequenz 1200, einschließlich des Universalprimerteils 1202 und des lokusspezifischen Teils 1204, und dem Reverse-Primerteil 1206. Durch Bereitstellung einer Aminoendgruppe 1208 am terminalen 5'-Ende des Reverse-Primers kann der Strang kovalent an einen Epoxysilan-behandelten Glasobjektträger 1210 gebunden werden. Die Herstellung solcher Epoxysilan-Objektträger beruht auf dem Verfahren von Beatty et al., Molecular Biology, Band 4, 1995, 213–225.
  • Eine andere Anlagerungs- bzw. Bindungschemie, z.B. die Verwendung von 5'-Enden, die mit Phosphorthiat markiert sind, kann verwendet werden, um derartige Stränge z.B. an Bromacetamid-Objektträger zu binden.
  • Im Allgemeinen wird das amplifizierte Produkt, z.B. unter Verwendung einer Centricon-Filtration, gereinigt, um nicht eingebaute Primer und dNTPs zu entfernen. Es wird dann mit Wasser extrahiert, bevor es auf die Glasobjektträger z.B. unter Verwendung eines Micro Array-Spotters vom Typ Amersham Generation 3, auf die Glasobjektträger gespottet wird. Die Objektträger können in einer Kammer mit hoher Luftfeuchtigkeit für 30 Minuten bis 2 Stunden bei 20°C bis 40°C inkubiert werden vor Waschen in Wasser bei 95°C, 10 mM Triethylamin (pH 9,2) bei Raumtemperatur und zwei weiteren Waschschritten mit Wasser bei 60°C, bevor sie trocken bei Raumtemperatur gelagert werden.
  • Um den Detektionsschritt zu bewirken, müssen die Einzelstränge mit geeigneten fluoreszierenden Sondenkonstrukten in Kontakt gebracht werden. In 12b wird ein biallelisches System eingeführt und als eine Folge daraus werden zwei unterschiedliche floreszierende Sonden eingeführt. Jede fluoreszierende Sonde weist eine unterschiedliche Farbstoffmarkierung 1211, einen gemeinsamen lokusspezifischen Teil 1212 und unterschiedliche Universalteile 1214 bzw. 1216 auf. Die Hybridisierung wird bei niedriger Temperatur, 40°C, durchgeführt. Die Sondenspezifität wird kontrolliert bzw. gesteuert, indem Nachhybridisierungswaschschritte bei höheren Temperaturen durchgeführt werden.
  • Wie in 12c erläutert, ist nur eine der fluoreszierenden Sonden hinreichend komplementär, um völlig mit dem fixierten Strang zu hybridisieren. Indem die Nachhybridisierungswaschschritte bei einer hinreichend hohen Temperatur (60°C bis 75°C) durchgeführt werden, wird die Spezifität der Sonden aufrechterhalten, da die Tatsache, dass der lokusspezifische Teil 1212 der anderen fluoreszierenden Sonde korrespondiert, unzureichend ist, dass sie aufgrund des Unterschiedes zwischen dem Universalprimerteil 1202 und 1216 hybridisiert bleibt, 12d. Als Folge wird die zweite Fluoreszenzfarbstoffmarkierung von dem Einzelstrang nicht zurückgehalten.
  • Auf einer ähnlichen Basis, 12e, kann, wenn die Universalprimerteile komplementär sind, aber der lokusspezifische Bereich unterschiedlich ist, eine Fluoreszenzsonde für einen unterschiedlichen Lokus, keine Hybridisierung in hinreichender Weise erfolgen, dass die Fluoreszenzsonde auf einer ähnlichen Grundlage zurückgehalten wird.
  • Die Versuchsbedingungen für ein derartiges System sind nachstehend beschrieben.
  • Als alternative Analysentechnik können synthetische Oligonucleotide auf den Objektträger gespottet und daran unter Verwendung eines Aminolinkers am 5'-Ende kovalent gebunden werden. Ein derartiges Verfahren ist in 13a erläutert. Beim In-Kontakt-Bringen mit den Amplifikationsprodukten wird dann, in Fällen, in denen das Oligonucleotid 1300 eine Sequenz für seinen lokusspezifischen Teil 1302 aufweist, die zu dem lokusspezifischen Teil des amplifizierten Produkts 1304 passt, und der Universalprimerteil 1306 zu dem amplifizierten Produkt passt, Hybridisierung erfolgen. Die Universal-Reverse-Primersequenz 1308 nimmt nicht an der Hybridisierung teil. Wiederum kann das Farbstoffmarkierungsmolekül 1310 in derartigen Fällen geprüft werden, um die Identität zu zeigen.
  • BEISPIEL – Multiplexamplifikation
  • Wie das oben erwähnte Verfahren mit zwei verschiedenen Stufen, ist auch ein Einbehälterverfahren beabsichtigt. Dies umfasst das Zugeben aller ersten Reaktionsprimer in einer Konzentration von 50 nM, mit Ausnahme jeglicher Primer, bei denen Konkurrenz auftreten würde, z.B. aufgrund einer Überlappung in den Primerstellen. Dies wird beispielsweise durch die Forward-Primer Gc 420G/T und 416C/A der identifizierten spezifischen Primer veranschaulicht. Wenn möglicherweise eine Konkurrenz auftritt, ist es nötig, die Reaktion durch Versuch- und Irrtum-Experimente hinsichtlich der Konzentrationen auszugleichen. Für die oben stehend erwähnten spezifischen Beispiele war die Optimal konzentration für die Gc 416C/A-Primer 25 nM und für die 420G/T-Primer bei 50 nM. Die Optimalkonzentration der Reverse-Primer war in allen Fällen 100 nM.
  • Diesem Gemisch wurden dann die in der zweiten Stufe verwendeten Universalprimer zugesetzt. Als Daumenregel muss die Menge an Universalprimern gemäß der Zahl der eingesetzten Erstreaktions-Primersätze erhöht werden. Die Konzentration (Cn) jedes Universalprimers ist Cn × L, worin L die Anzahl der untersuchten Loki (oder SNPs) ist. Für ein 5-Lokus-System ist somit die Konzentration von jedem der Universalprimer 5 × 5 = 250 nM. Die DNA-Menge wird konstant bei 1 ng für eine optimale Amplifikation gehalten, aber es ist möglich, geringere DNA-Mengen zu analysieren. Bei höheren Zahlen von Loki wird angenommen, dass die Konzentration an Primer, die nützlicherweise angewendet wird, in ein Plateau übergehen wird.
  • Die gesamte Kombination wurde dann wie folgt dem Amplifikationsverfahren unterworfen:
  • Zusammenfassung der Bedingungen:
    • 50 μl PCR-Reaktionsgesamtvolumen
    • Puffer = Perkin-Elmer-PCR-Puffer
    • MgCl2 = 1,5 mM
    • DNTPs = jeweils 200 μM
    • Taq Gold (Perkin Elmer) 1,25 Units bzw. Einheiten
  • Cycling-Bedingungen:
    • 94°C für 30 Sekunden
    • 61°C für 30 Sekunden
    • 72°C für 90 Sekunden
    • 6 Zyklen
    • 94°C für 30 Sekunden
    • 72–75°C für 30 Sekunden
    • für 5 bis 10 Zyklen
    • 94°C für 30 Sekunden
    • 61°C für 30 Sekunden
    • 72°C für 90 Sekunden
    • für 24 bis 29 Zyklen
  • Die resultierenden amplifizierten Produkte wurden dann auf die oben stehend dargelegte Weise betrachtet, beispielsweise eine Elektrophorese-basierte Trennung, um festzustellen, welche Markierung und folglich welcher SNP an jedem der betrachteten Loki vorlagen.
  • Die zugrunde liegende Technik dieser Erfindung bietet eine signifikante Zahl von Vorteilen:
    • 1) Die Universalprimer selbst "primen" Human-DNA nicht, somit sind Artefakte, die durch Fehlpriming abgebauter DNA vermittelt werden, minimal und das erzeugte Artefakt ("pull-up artifact") wird leicht erkannt, da die elektrophoretischen Migrationsgeschwindigkeiten verschiedener SNPs verschieden sind.
    • 2) die Verwendung eines zweistufigen Reaktionsverfahrens verbessert die Spezifität;
    • 3) Fehlpriming ist praktisch vernachlässigbar, was Hintergrundgeräusch praktisch eliminiert und die Technik für Gemische mit sehr geringer Konzentration verwendbar macht;
    • 4) der Bedarf von nur Farbstoff- oder anderen Markierungen an den Universalprimern verringert die Produktionskosten für diese Reagenzien signifikant;
    • 5) große Zahlen unterschiedlicher Loki können in der zweiten Stufe des Verfahrens unter Verwendung nur eines Primersatzes amplifiziert werden, was das Multiplexen einer großen Zahl ermöglicht;
    • 6) die Verwendung von nur zwei Forward-Primern in der zweiten Stufe ergibt eine ausgewogene Reaktion ohne Konkurrenz zwischen den Primern;
    • 7) die Verwendung eines zweistufigen Verfahrens ermöglicht es, sehr kleine Konzentrationen des der ersten Stufe zugeführten Materials, Sub-Nanogramm-Konzentrationen, in einem Maß zu amplifizieren, in dem mehrere Aliquote zur Verwendung in möglicherweise unterschiedlichen Zweitstufenverfahren produziert sind;
    • 8) durch Bereitstellen einer Ein-Röhrchen-Reaktion wird die Durchführung der Reaktion vereinfacht und beschleunigt.
  • Diese und andere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung sind aus den folgenden praktischen Demonstrationen der Erfindung ersichtlich.
  • BEISPIEL – farbstoffbasiert
  • Mitochrondrien-DNA
  • Tully et al. (1996) Genomics 34, 107–113 beschrieb einen Minisequenzierungsansatz zum Analysieren von Mitochrondrien-DNA-SNPs. Die in Tabelle 1 aufgelisteten SNPs wurden unter Anwendung des oben stehend beschriebenen Ansatzes analysiert, wobei jedoch die Primer gemäß der vorliegenden Erfindung abgeändert waren, um universelles G oder universelles C, gebunden an das 5'-Ende der aufgelisteten Primer, bereitzustellen.
  • Die Größen jedes DNA-Fragments sind bekannt und, wenn sie auf einem Gel laufen gelassen werden, werden Banden, die einen Lokus anzeigen, erzeugt, und diese sind entweder JOE (grün) für den Universalprimer E oder FAM (blau) für den Univeralprimer C, die in Abhängigkeit von der SNP-Identität markiert sind, wodurch so die Visualisierung der Ergebnisse ermöglicht wird. TABELLE 1
    Position der Forward-Primer mit universellem C verwendete Primersequenz 3'-Polymorphismus, verwendet mit universellem G
    73 GTATTTTCGTCTGGGGGGTA G
    146 GTCTGTCTTTGATTCCTGCCC T
    152 TTTGATTCCTGCCTCATCCC T
    195 ATATTACAGGCGAACATACC T
    247 GCTTGTAGGACATAATAATAACAATTA G
    Reverse-Primer 326 CAGAGATGTGTTTAAGTGCTGT
  • Reaktionsbedingungen:
  • Für jede einzelne Reaktion:
    Die dNTPs lagen in einer Endkonzentration von 35 mM vor
  • Perkin-Elmer(PE)-Puffer wurde in einer Endkonzentration von 0,375 mM mit 0,375 mM MgCl2 verwendet.
  • Zu 50 μl Reaktion (S-Ansatz) wurden 0,25 AmpliTaq (PE) gegeben.
  • Die Primerkonzentrationen sind einzeln bei den angegebenen Beispielen aufgeführt.
  • Alle Phänotypen wurden durch eine unabhängige Analyse unter Verwendung des Minisequenzierungsverfahrens von Tully et al. (1996) verifiziert.
  • Beispiel 1
  • Multiplexierte Mitochrondrien-DNA
  • Reaktionsbedingungen:
    • Alle dNTPs bei 10 mM;
    • Endkonzentration von 35 mM PE-Puffer 15 mM 15 mM MgCl2 pro Reaktion MgCl2 = 0,375 mM. AmpliTaq = 0,25 μl in 50 μl
  • Im folgenden Beispiel wurden im Reaktionsgemisch 1 μM von jedem der Forward-Primer und 2 μM der Reverse-Primer, aufgelistet in Tabelle 4, verwendet. Eine 50 μl-Reaktion, enthaltend 0,3 ng genomische DNA, wurde durch 8 Zyklen bei 94°C für 30 s, 57°C für 30 s und 72°C für 90 s amplifiziert. Ein Aliquot von 5 μl des Reaktanden wurde dann in ein zweites Röhrchen, enthaltend 1 μM von jedem Universal-Forward-Primer und 1 μM des Universal-Reverse-Primers, transferiert. Dies wurde für 22 Zyklen bei 94°C für 30 s, 62°C für 30 s und 72°C für 90 s amplifiziert. Die Proben wurden auf einem automatischen Sequenziergerät vom Typ ABD 377 mit einem Größenstandard vom Typ Rox 500 elektrophoretisch getrennt. Die Negativkontrolle wurde unter den gleichen Bedingungen behandelt, abgesehen davon, dass der Reaktion keine DNA zugesetzt wurde.
  • Die Ergebnisse sind für die vier Proben in 11 erläutert, wobei jede der drei Proben durch ein Profil bzw. eine Spur wiedergegeben ist und wobei die Kontrollprobe (keine zugesetzte DNA) die vierte Spur ist. Die mit a markierten Peaks sind Größenstandards, jene die mit b markiert sind, zeigen grüne Markierungen an und jene, die mit c markiert sind, zeigen blau Markierung an. Die Proben wurden hinsichtlich 4 mitrochondrialer Loki 247, 195, 152, 146, analysiert. Die für die 4 Loki festgestellten Identitäten sind in der Tabelle 4 zusammengefasst. TABELLE 4
    Probe Lokus 247 Lokus 195 Lokus 152 Lokus 146
    Eins G T T T
    Zwei G C C C
    Drei G T C C
    Kontrolle keine keine keine keine
  • Beispiel 2
  • Aufklärung eines Gemisches, in dem der minore Bestandteil < 10 pu DNA (genomisches Äquivalent) ist.
  • Im nächsten Beispiel, dessen Ergebnisse in Fig. Y2 dargestellt sind, wurden Gemische hergestellt, wobei der Hauptbestandteil für den mt0073A-Polymorphismus codierte (2 ng genomische DNA) und der minore Bestandteil für den mt00326-Polymorphismus codierte (0–50 pg). Es wurde mit Forward-Primern, entweder mt0073-G oder mt0073-A (1 μM), und dem Reverse-Primer mt00326 (1 μM) amplifiziert, die Cycling-Bedingungen waren die gleichen, wie zuvor beschrieben, jedoch war die zweite Amplifikationsrunde lediglich 3 Zyklen.
  • In den ersten Experimenten, linke Reihe, (a) wurden die Primer mt0073-G (1 μM) und mt00326 (1 μM) verwendet, wohingegen in den Experimenten der rechten Reihe (b) die Primer mt0073-A (1 μM) und mt00326 (1 μM) waren. Die Ergebnisse (a) zeigten, dass selbst in Gegenwart eines großen Überschusses von mt0073-G-Matrize kein mt0073-A-Hintergrundprodukt detektiert wurde. Gleichermaßen wurde im Experiment (b), in dem eben der Primer m00O73A verwendet wurde, kein mt0073-G detektiert. Die hohe Spezifität der Reaktion zeigte die Unterscheidung minorer Bestandteile in Gemischen bis hinab zu extrem geringen Konzentrationen von 12,5 pg in einem Gesamt-Mischungs-Verhältnis von 1:200.
  • In den Figuren sind die Peaks a Größenstandards, die Peaks b zeigen eine grüne Antwort an, und die Peaks c zeigen eine blaue Antwort an.
  • Beispiel 3
  • Genomische DNA – Gruppenspezifischer Bestandteil (Gc)
  • Die Gc-Einzelnucleotidpolymorphismen sind gut charakterisiert worden (Braun et al., 1992) Hum Eanet, 89:401–406. Zusätzlich ist eine große Zahl seltener Varianten identifiziert worden – der hier beschriebene Versuch detektiert nur die verbreiteten Allele – Gc 2, Gc1F und Gc1S. Reynolds und Sensbaugh (1990) in Polesby et al. (Hrsg.) Advances in Forensic Haemogentics, Band 3, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, S. 158–161 compared cDNA sequences of Yang et al. (1985) Pioc-Nat-Accad. Sci. USA 82:7994–7998 and Cooke N.E. und David E. V. (1985) Serum D-binding Protein is a 3rd member of the albumin and alpha-feto Protein gene family, J. Clin. Invest., Band 76, S. 2420–2429. Obwohl Polymorphismen an 4 unterschiedlichen Stellen beobachtet wurden, sind die Informativsten an den Codons 416 und 420, wo Einzelbasenänderungen in einem Aminosäureaustausch resultieren. Bei Triple-416 codiert GAT für einen Asparaginsäurerest in den Gc2- und Gc1F-Phänotypen, während GCIS einen Glutaminsäurerest aufweist, der durch das Codon CAG bestimmt wird. Die Aminosäure 420 ist ein Lysinrest im Gc2-Phänotyp, codiert durch AAG, ein Threoninrest in beiden Gc1-Phänotypen wird durch ACG codiert.
  • Vier unterschiedliche Forward-Primer wurden verwendet, um zwischen den verschiedenen Polymorphismen zu unterscheiden (Tabelle A, B). Diese Primer waren am 5'-Ende an Universalprimer gebunden, wie vorher beschrieben.
    Codon Sequenz
    Forward-Primer
    420G/T 416C/A ACCAGCTTTGCCAGTTCCR TTCCGTGGGTGTGGCX
    Reverse-Primer GGCAGAGCGACTAAAAGCAAA
  • Tabelle A: Sequenz der Primer, die zum Detektieren der Gc1F-, Gc1S- und Gc2-Polymorphismen verwendet wurden. R=G oder T; X=C oder SA. 420T und 416A waren an FAM-markierte Universalprimer G gebunden; 420G und 416C waren an JOE-markierte Universalprimer C gebunden.
    416 420
    G T
    A Gc1F Gc2
    C Gc1S
  • Tabelle B: Die GC-Phänotypen sind abhängig von den detektierten Codonmutationen. Es ist zu bemerken, dass 416A und 420T nicht zusammen in Verbindung existieren. Der 420G-Primer detektiert die Gc1-Phänotypen; 420T detektiert Gc2; 416C detektiert Gc2 oder Gc1F (abhängig von der Sequenz von Codon 420); 416A detektiert Gc1S.
  • Unter Anwendung dieser Details wurde eine Reihe von Beispielen durchgeführt, wobei zwei Gesichtspunkte, Spezifität und Empfindlichkeit, untersucht wurden. Um die Spezifitätsuntersuchungen durchzuführen, wurde eine Reihe von Singleplex-Reaktionen durchgeführt. In 12a wurde gezeigt, dass der Primer 416A ein spezifischer Test für den Gc1F-Polymorphismus ist. Gleichermaßen war der Primer 420G spezifisch für den Gc1-Polymorphismus (12b); 420T war spezifisch für den Gc2-Polymorphismus (12c). Es wurde gezeigt, dass das System mit allen Primer in einem Cocktailgemisch arbeitet bzw. funktioniert, 12d. Ferner war die Empfindlichkeit der Detektion c. 8pg genomische DNA (12d). Ein Gemisch wurde analysiert; dies zeigte, dass Gemische auf einfache Weise interpretiert werden können, die verschiedene Molekulargewichte von FAM und JOE, verschiedene Molekulargewichte auf DNA-Fragmenten der gleichen Größe übertragen und dies die Interpretation erleichtert. Es ist einfach, die Artefakt-Erzeugung ("artefact pull-up") von einem echten Allel zu unterscheiden.
  • Reaktionsbedingungen
  • Die Reagenzkonzentrationen waren die gleichen, wie für Mitochrondrien-DNA beschrieben. Die verwendeten Primerkonzentrationen waren 125 nM für die lokusspezifischen Forward-Primer und die Reverse-Primer. Die Universal-Forward-Primer waren bei 100 nM und der Universal-Reverse-Primer bei 288 nM. Lokusspezifische und Universalprimer wurden in einer Ein-Röhrchen-Reaktion gemischt. Die Cycling-Bedingungen waren 94°C für 30 s, 61°C für 30 s; 72°C für 90 s für 35 Zyklen; gefolgt von 72°C für 10 min.
  • Alle Phänotypen wurden durch eine unabhängige Analyse unter Verwendung herkömmlicher isoelektrischer Fokussierung verifiziert.
  • BEISPIELE – "Molecular Beacon"-basiert
  • Um die Vorzüge der "Beacons" enthaltenden bzw. einbauenden Universalprimer zu zeigen, wurde eine Reihe von Versuchsanordnungen unter Verwendung eines Roche Light Cyclers zum Analysieren der resultierenden Fluoreszenz untersucht. Die Experimente wurden unter Verwendung einer Zwei-Röhrchen- oder verzweigten PCR-Herangehensweise durchgeführt, um die Amplifikationen der ersten und zweiten Runde zu ergeben.
  • Das folgende Protokoll zur Amplifikation in den PCRs sowohl der ersten als auch der zweiten Runde wurde für die verschiedenen Beispiele, die folgen, verwendet. PCR in der 1. Runde
    Primer Optimale Konzentration
    Forward-Primer der 1. Runde 200 nM
    Reverse-Primer der 1. Runde 200 nM
    MgCl2 1,5 mM
    BSA 0,2 μl/Reaktion
    PE-Puffer 10 %
    dNTPs 200 μM
    Taq Gold 0,1 μl/Reaktion
    DNA 2 ng/Reaktion
    SDW
    Reaktionsvolumen = 20 μl NB Final [MgCl2] = 3 mM
  • Die Amplifikation der 1. Runde wurde wie folgt durchgeführt:
    Figure 00500001
    PCR in der 2. Runde
    Primer Optimale Konzentration
    Forward-Beacon der 2. Runde 200 nM
    Reverse-Primer der 2. Runde 200 nM
    MgCl2 1,5 mM
    BSA 0,2 μl/Reaktion
    PE-Puffer 10 %
    dNTPs 200 μM
    Taq Gold 0,1 μl/Reaktion
    PCR-Produkt der 1. Runde 2 μl/Reaktion
    SDW
    Reaktionsvolumen = 20 μl NB Final [MgCl2] = 3 mM
  • Die Amplifikation der 2. Runde wurde wie folgt durchgeführt:
    Figure 00500002
  • Eine Fluoreszenzablesung wurde am Ende jeder 50°C-Haltestufe genommen.
  • Beispiel A
  • In der 1. Runde wurde DNA mit Primern amplifiziert, die gegen den Gc1s-Polymorphismus gerichtet waren. In der anschließenden PCR der 2. Runde war die Amplifikation gegen dieses Produkt der 1. Runde gerichtet, wobei steigende Konzentrationen (200 nM, 400 nM, 600 nM, 800 nM und 1000 nM) der Primer der 2. Runde verwendet wurden. Die jeweiligen Universal-Forward-Primer und -Reverse-Primer der 1. Runde und der ein "Molecular Beacon" enthaltende bzw. einbauende Universal-Primer und der Universal-Reverse-Primer der 2. Runde sind wie unten stehend aufgelistet. Der Stammteil des "Molecular Beacon" ist in der Universalprimersequenz, die das "Molecular Beacon" enthält bzw. einbaut, unterstrichen.
  • Diese Ergebnisse, gezeigt als Diagramm der Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl der Amplifikation der 2. Runde für die verschiedenen Konzentrationen an Primer der 2. Runde und einen Univeralprimer der 1. Runde gegen den Gc1s-Polymorphismus sind in 14 gezeigt. Eine sehr wesentliche Unterscheidung zwischen den Polymorphismus aufweisenden Proben und den Kontrollen ist ersichtlich.
  • Um den Befund, dass die Universalprimer-"Beacons" DNA-spezifisch amplifizieren, zu bestätigen, wurden alle PCR-Produkte auf einem 3%igen Nusieve-Minigel laufen gelassen. Wie aus den typischen Ergebnissen, die in 15 für das Minigel-Bild dargelegt sind, ersichtlich ist, ist bei der SDW-Kontrolle kein Produkt zu sehen, und es sind zwei Banden für jede DNA-Probe, 1a und 1b, vorhanden. Die obere Bandengröße ist bei 112 bp, was mit Gc1s-amplifiziertem Produkt übereinstimmt. Die zusätzliche Bande ist näherungsweise 12 bp kleiner, und es wird angenommen, dass sie das Ergebnis des einzelsträngigen PCR-Produkts der 2. Runde ist, in dem das "Beacon" seine intramolekulare Sekundärstruktur angenommen hat. Jedoch stört diese zusätzliche Bande die Interpretation nicht und sie scheint die PCR auf keine Weise zu beeinträchtigen. Primer der 1. Runde
    Primerbezeichnung Primersequenz
    Gc1s uni 9 G CGACGTGGTGGATGTGCTAGGTTCCGTGGGTGTGGCC
    Gc reverse uni 11 TGACGTGGCTGACCTGAGACGGCAGAGCGACTAAAAGCAAA
    Primer der 2. Runde
    Primerbezeichnung Primersequenz
    Universal-G-Beacon F-ACGCGCTCTCTTCTTCTTTTGCGCG-Q-CGACGTGGTGGATGTGCTAG
    Universal-11-reverse TGACGTGGCTGACCTGAGAC
  • Beispiel B
  • Die "Molecular Beacon"-Herangehensweise ist fähig, 2 ng DNA zu amplifizieren. Unter Verwendung genau der gleichen Herangehensweise wurde ein Experiment durchgeführt, um eine Messung der Empfindlichkeit des Verfahrens zu erhalten. Es wurden zahlreiche Verdünnungen von Gc1s + ve DNA-Probe erstellt und wie im vorherigen Beispiel beschrieben amplifiziert. Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt, die wiederum ein Diagramm der Fluoreszenz versus die Amplifikationszyklenzahl der 2. Runde für zahlreiche Konzentrationen von Gc1s + ve DNA im Vergleich zu einer Kontrolle, SDW, zeigt.
  • Während in der SDW-Kontrolle etwas unspezifische Fluoreszenz zu sehen ist, ist diese selbst von den 0,02 ng Gc1s DNA + ve deutlich unterscheidbar und hat deswegen keine Wirkung hinsichtlich der Interpretation von Proben, die sogar im Wesentlichen Sub-Nanogramm-Mengen an DNA enthalten. Somit können sehr geringe Probenkonzentrationen erfolgreich unter Verwendung dieser Technik analysiert werden.
  • Beispiel C
  • Wie oben gezeigt, kann der Universal-"G-Beacon" DNA eindeutig identifizieren und amplifizieren, die hauptsächlich unter Verwendung des Gc1s-Primers amplifiziert wird. Um seine wahrhaft universelle Anwendung zu zeigen, wird in diesem Beispiel gezeigt, dass sowohl das universelle "G-Beacon" als auch das universelle "C-Beacon" fähig sind, andere Produkte der 1. Runde zu amplifizieren, die von unterschiedlichen Amplifikationsprimern der 1. Runde stammen. Dazu wurden Amplifikationen der 1. Runde unter Verwendung von Gc1-, Gc2-, Gc1s- und Gc1f-Primern, wie sie nachstehend spezifiziert sind, durchgeführt, und die Amplifikation der 2. Runde wurde unter Verwendung von universellem "G-Beacon" oder "C-Beacon" zusammen mit Universal-11-reverse durchgeführt.
  • Die Amplifikationszyklenzahlen der 2. Runde wurden auf 20 verringert, um eine Überamplifizierung zu minimieren. Primer der 1. Runde
    Primerbezeichnung Primersequenz
    Gc1 uni 9 G CGACGTGGTGGATGTGCTAGACCAGCTTTGCCAGTTCCG
    Gc2 uni 9 C CGACGTGGTGGATGTGCTTCACCAGCTTTGCCAGTTCCT
    Gc1s uni 9 G CGACGTGGTGGATGTGCTAGGTTCCGTGGGTGTGGCC
    Gc1f uni 9 C CGACGTGGTGGATGTGCTTCGTTCCGTGGGTGTGGCA
    Gc reverse uni 11 TGACGTGGCTGACCTGAGACGGCAGAGCGACTAAAAGCAAA
    Primer der 2. Runde
    Primerbezeichnung Primersequenz
    Universal-G-Beacon F-ACGCGCTCTCTTCTTCTTTTGCGCG-Q-CGACGTGGTGGATGTGCTAG
    Universal-C-Beacon F-ACGCGCTCTCTTCTTCTTTTGCGCG-Q-CGACGTGGTGGATGTGCTTC
    Universal 11 TGACGTGGCTGACCTGAGAC
  • Die Ergebnisse dieses Beispiels sind in den 17a, 17b, 17c und 17d gezeigt. Die Ergebnisse aus 17a und 17b zeigen, dass Probe 1 einen Gc1-Polymorphismus aufweist und Probe 2 einen Gc2-Polymorphismus aufweist. Beispiel 3 ist eine SDW-Kontrolle, die durchwegs ein negatives Ergebnis erzeugt. Mit dem Gc1-Polymorphismus sind zwei bekannte Allele assoziiert, die als Gc1s und Gc1f bezeichnet werden, und ein Individuum kann entweder für Gc1s oder Gc1f homozygot oder für Gc1s1f heterozygot sein. Wie durch die 17c und 17d gezeigt wird, amplifiziert die Probe 1 in beiden Fällen und zeigt deshalb einen Gc1s-Phänotyp an. Da die Probe 2 nicht mit dem Gc1s-Primer amplifiziert, bestätigt dies ihre Zuordnung als Gc2-Phänotyp. Die Amplifikation von Probe 2 mit den Gc1f-Primern liegt an der spezifischen Bindungsstellenbasensequenz der Gc-Region. Ein Individuum, das Gc1 ist, weist eine Base C (an) Position 2 von Codon 420 auf, während ein Gc2-Individuum eine Base A an der gleichen Position aufweist. Gc1-Individuen werden in Gc1s und Gc1f-Phänotypen differenziert, die durch den Basenkern an Position 3 von Codon 416 gekennzeichnet sind, der ein G bzw. T ist. Individuen, die Gc2 sind, weisen nur eine Base T an Position 3 in Codon 416 auf, und deshalb ist der Gc1f-Primer dazu fähig, komplementär an dieser Position zu binden, obwohl er eine Basenfehlpaarung mit Codon 420 aufweist. Derartige Erscheinungen resultieren in einer unspezifischen Amplifikation, wie in 18 detaillierter erläutert.
  • Beispiel D
  • Weitere Untersuchungen wurden an einem anderen Lokus, nämlich Amelogenin, durchgeführt. Die Primer der 1. Runde sind wie folgt: Primer der 1. Runde
    Primerbezeichnung Primersequenz
    Amelo X CGACGTGGTGGATGTGCTTCTGAGCCAATGGTAAACCTGCC
    Amelo Y CGACGTGGTGGATGTGCTAGTGAGCCAATGGTAAACCTGCA
    Amelo reverse TGACGTGGCTGACCTGAGACCATAGGAAGXGTACTGGTGAGAAACA
    Primer der 2. Runde
    Primerbezeichnung Primersequenz
    Universal-G-Beacon F-ACGCGCTCTCTTCTTCTTTTGCGCG-Q-CGACGTGGTGGATGTGCTAG
    Universal-C-Beacon F-ACGCGCTCTCTTCTTCTTTTGCGCG-Q-CGACGTGGTGGATGTGCTTC
    Universal 11 TGACGTGGCTGACCTGAGAC
  • Die Amplifikationsbedingungen sind die gleichen wie zuvor. Eine männliche Probe wurde mit dem Amelo Y-Primer amplifiziert und unter Verwendung des Universal-"G-Beacons" detektiert. Die Ergebnisse sind in 19 illustriert.
  • Wiederum wurde das Produkt auf einem 3%igen Nusieve-Minigel laufen gelassen, um zu bestätigen, dass das amplifizierte Produkt von der richtigen Größe war. Wie es zuvor gesehen wurde, waren zwei Banden vorhanden, die sich um 12 bp unterschieden. Die längere der zwei Banden bestätigte, dass das Amplifikationsprodukt von der richtigen Größe war und bewies somit, dass die zusätzliche Bande wahrscheinlich das Ergebnis einer intermolekuren Modifikation war, wie sie zuvor dargelegt wurde. Das Vorhandensein dieses Phänomens bei zwei verschiedenen Loki impliziert, das es eher ein Merkmal der "Universal-Molecular-Beacon"-Primerstruktur als ein Artefakt ist, das von Fehlpaarung herrührt.
  • Das Universal-Reporter-Primerprinzip (URP) ist in klarer Weise dazu in der Lage, multiple Allele innerhalb eines gegebenen Lokus zu amplifizieren, um eine genaue Gentypisierung zu erleichtern. Ferner ermöglichen sie, dass multiple Loki bestimmt werden, was sie wahrhaft universell macht.
  • Beispiel E
  • Während die Empfindlichkeit der Technik(en) hinsichtlich der Befähigung zum Amplifizieren und Detektieren von Sub-Nanogrammkonzentrationen an DNA gezeigt worden ist, führt dieses Beispiel den Beweis im Zusammenhang mit der Empfindlichkeit und Spezifität der Technik hinsichtlich Gemischen einen Schritt weiter fort.
  • Im folgenden Beispiel wurden 2 DNAs in Verhältnissen von 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:16, 1:50, 1:100 und 1:300 zusammengemischt. In jedem Fall war die vorliegende Gesamtmenge an DNA 2 ng. Die Gemische wurden hergestellt, wobei der Hauptbestandteil für den Gc2-Polymorphismus codierte und der minore Bestandteil für den Gc1s-Polymorphismus codierte. Es wurde mit Forward-Primern, entweder Gc2 oder Gc1s, und einem Gc-Reverse-Primer amplifiziert, die Cycling-Bedingungen waren wie früher beschrieben. In der 2. Runde wurde das Produkt der 1. Runde entweder mit dem Universal-"C-Beacon" oder dem Universal-"G-Beacon" zusammen mit Universal 11 amplifiziert. Die Cycling-Bedingungen waren wie zuvor, jedoch wurde die tatsächliche Zahl der Zyklen für die 2. Runde auf 12 verringert. Die Ergebnisse sind in den Diagrammen der 20a und 20b gezeigt.
  • In 20a wurden alle Proben mit Ausnahme der männlichen -ve-Kontrolle und SDW amplifiziert. Alle anderen Proben wurden in der gleichen Zeit und mit der gleichen Rate amplifiziert. Geringe Unterschiede zwischen den Proben hinsichtlich ihrer absoluten Fluoreszenz werden der relativen Erhöhung des Hauptbestandteils zugeschrieben, da sich die Verhältnisse von 1:2 bis 1:300 (jeweils minorer Bestandteil zu Hauptbestandteil) verschieben.
  • 20b zeigt, dass, wenn der Anteil des minoren Bestandteils sinkt, die Zeit, die bei diesen Proben benötigt wird, um eine Amplifikation zu beginnen, ebenfalls sinkt, ebenso wie die Amplifikationsrate. Bei 1:300 ist die Menge an Ausgangsmaterial näherungsweise 6 pg, jedoch ist die Fluoreszenzerhöhung, die einer DNA-Amplifikation in diesem Gemisch zugeschrieben wird, klar oberhalb der Basislinie definiert.
  • Wie gezeigt, können wir sowohl den Hauptbestandteil als auch den minoren Bestandteil in Proben aus gemischten DNA-Quellen erfolgreich über einen weiten Bereich von Verhältnissen von minorem Bestandteil zu Hauptbestandteil unterscheiden und amplifizieren.
  • Diese Ergebnisse beweisen somit das Universal-Reporterprimer-Prinzip und die folgenden Vorteile:
    • a) Die universellen "Molecular Beacons" wie die Universalprimer primen Human-DNA nicht.
    • b) Eine zweistufige Reaktion oder verzweigte PCR kann das Verfahren der Wahl sein, und dies verbesserte die Spezifität.
    • c) Mispriming ist, unterstützt durch die verzweigte PCR-Herangehensweise vernachlässigbar, und dies eliminiert das Hintergrundgeräusch praktisch.
    • d) Die Fähigkeit der universellen Beacons, multiple Loki in der zweiten PCR zu amplifizieren, bedeutet, dass nur dieser eine Primersatz erforderlich ist. Dies hat eine Bedeutung hinsichtlich von Kosteneinsparungen.
    • e) Die universellen "Molecular Beacons" erleichtern die Echtzeitdetektion des PCR-Produkts ohne den Bedarf zusätzlicher aufklärender Techniken nach der PCR, z.B. Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE).
    • f) Es gibt einen deutlichen Vorteil bei der Verwendung dieser Technik, wenn die Probenmenge beschränkt ist (ein Problem, das gemeinhin in der forensischen Biologie an getroffen wird, wenn (nur) Sub-Nanogrammkonzentrationen an Material gewonnen werden können). Die PCR der 1. Runde erzeugt ein signifikantes Produkt. Aliquote dieses Produkts können dann für mehrere anschließende PCR-Reaktionen der 2. Stufe verwendet werden.
    • g) Die universellen Beacons sind in Bezug auf Gemische extrem empfindlich und können einen minoren Bestandteil, der einer 1:300-Verdünnung (6 pg) entspricht, genau bestimmen.
  • BEISPIEL – Verschiedene universelle Primerteile, Bindungen an Glasobjektträger und Hybridisierung
  • Wie oben stehend beschrieben, können besonders leistungsfähige Tests bzw. Versuche erhalten werden, wenn der erste Satz von Primern in deren Universalprimerteile unterscheidende Teile einschließt, wobei die nachfolgenden Amplifikationsprimer am Glasobjektträger gebunden sind und dann einer Hybridisierungs-basierten Analyse unterworfen werden.
  • Es folgen mehrere Details des experimentellen Verfahrens für ein derartiges System. PCR-BEDINGUNGEN
    Für Multiplex-Reaktionen
    Konzentrationen lokusspezifischer Primer 10 nM–40 nM
    Konzentrationen Universal-Reporterprimer 100–1000 nM
    Mg-Ionenkonzentration 1,5 nM
    Puffer Perkin Elmer PCR-Puffer X1–
    Konzentration
    DNA 1 ng
    Reaktionsvolumen 50 μl
    dNTPs 200 μM
    Taq-Gold 1,25 U/50 μl
    Cycling-Bedingungen:
    95°C für 10 Minuten – Taq-Aktivierung
    94°C für 30 Sekunden
    60°C für 30 Sekunden
    72°C für 90 Sekunden
    durchgeführt für 32 bis 40 Zyklen.
  • Hybridisierungsbedingungen
  • Die Hybridisierung wurde bei einer Temperatur von 40°C bis 60°C zum Fördern der Hybridisierung der Sonden durchgeführt. Die Hybridisierungslösung besteht aus einer Lösung, enthaltend 0,5 M Dinatriumhydrogenorthophosphat, pH 7,2, 1 mM EDTA und 7 % SDS. Die Hybridisierungssonden wurden in der Lösung in einer Konzentration von 0,1–5 μM gelöst. Ein Volumen von 80–120 μl Hybridisierungslösung wurde auf den Objektträger aufgebracht, welcher dann mit einem Deckglas abgedeckt und bei 40°C bis 60°C für 2 Stunden in eine feuchte Atmosphäre gegeben wurde.
  • Nach der Hybridisierung wurden die Objektträger in einer Lösung von 0,1 bis 4 × SSC und 0,1 % SDS bei 60°C bis 75°C gewaschen.
  • Als sie trocken waren, wurden die Objektträger mit einem "molecular dynamics erase"-Scanner abgetastet, um die fluoreszierende Sonde zu detektieren.
  • Multiplexanalyse
  • Derartige Systeme sind zur Verwendung unter Multiplex-Bedingungen geeignet. Die amplifizierten Produkte werden wie zuvor beschrieben auf einen Objektträger gespottet und dann wird jeder Spot unter Verwendung aufeinander folgender Hybridisierungen hinsichtlich spezifischer Loki sichtbar gemacht. Andere Loki, die in den Amplifikationsprodukten vorhanden sind, werden nicht hybridisieren und werden folglich nicht während jeder der jeweiligen Hybridisierungen und Untersuchungen zu den detektierten Ergebnissen beitragen. Nach der Bestimmung eines bestimmten Lokus können die Objektträger in eine geeignete Lösung eingetaucht werden, um alle der Hybridisierungssonden, die ausgehend von dieser Hybridisierung an der Ziel-DNA gefunden werden, zu entfernen. Die kovalente Bindung der Stränge bedeutet, dass sie auf dem Objektträger zurückgehalten werden.
  • Geeignete Kontrollen können verwendet werden, um zu zeigen, dass DNA tatsächlich in jedem Spot vorhanden ist. Beabsichtigt sind Kontrollen, die ein Gemisch von Oligonucleotiden, die zu jedem verwendeten Universalprimerteil (unter Auslassung der spezifischen Primerregion) komplementär sind, umfassen. Die Objektträger würden mit den Kontrollsonden hybridisieren, und das Signal würde proportional zu der tatsächlich in dem Spot vorhandenen DNA-Menge sein.
  • Um die vollen Vorzüge der Technik der vorliegenden Erfindung zu erhalten, ist es wünschenswert, sie in Multiplex-Reaktionen einzusetzen, so dass eine große Zahl von Loki gleichzeitig betrachtet werden kann. Ein Problem mit Multiplexreaktionen im Allgemeinen ist, dass es schwierig ist, eine signifikante Primerdimerbildung zu verhindern, da verschie dene Primer verwendet werden und da die Konzentration der Primer in dem Reaktionsgemisch ansteigt. Sobald sich ein Primerdimer bildet, neigt die PCR-Reaktion dazu, bevorzugt Primerdimer zu bilden, und die Reaktion wird folglich sehr unwirtschaftlich. Primerdimerformen entstehen, wenn Primer selbst komplementär zu anderen Primer im Multiplex-Reaktionsgemisch sind.
  • Zwei Techniken zum Angehen dieses Problems sind von der Anmelderin entwickelt worden und werden nun beschrieben.
  • In der ersten Technik werden lokusspezifische Primer in einem ersten Primersatz verwendet und Universalprimer werden in einem zweiten Satz verwendet. Beide Sätze werden jedoch in eine einzige Reaktion einbezogen. Der zweite Primersatz wird jedoch in einer weit höheren Konzentration als die lokusspezifischen Primer des ersten Satzes bereitgestellt. Konzentrationen von 400 nM–4000 nM im Vergleich zu 10–200 nM, werden in dem Reaktionsgemisch eingesetzt. Die Universalprimer des zweiten Satzes nutzen Farbstoffmarkierungen, wie sie vorstehend erwähnt wurden.
  • Der Schlüssel zum Vermeiden der Primerdimerbildung ist die Temperatur, die bei der PCR-Reaktion während der verschiedenen Zyklen eingesetzt wird.
  • Während der ersten zwei Zyklen der PCR-Amplifikation startet nur der lokusspezifische Teil der lokusspezifischen Universalprimer das Priming. Sobald die komplementäre Sequenz zum universellen Teil als Ergebnis der ersten zwei Zyklen gebildet worden ist, ist der gesamte Erststufenprimer dazu in der Lage, in anschließenden Amplifikationsrunden zu primen, da sowohl die lokusspezifischen als auch die Universalprimerteile des Primers im PCR-Produkt vorliegen.
  • Ein Erhöhen der Anlagerungsphasentemperatur auf 72°C bis 76°C während der frühen Amplifikationszyklen, z.B. die Zyklen 4 bis 24, bedeutet, dass das Priming aufgrund des Erststufenprimers stattfindet, dass aber die Anlagerung des Zweitstufenprimers, des Universalprimers, der die Farbstoffmarkierung trägt, vollständig inhibiert ist. Die Anlagerungstemperatur ist für das Anlagern des Zweitstufenprimers einfach zu hoch. Sobald eine hinreichende Amplifikation erfolgt ist, wird die Anlagerungstemperatur für die anschließenden Stufen auf etwa 60°C verringert, und dies erlaubt den Universalprimer zu primen. Als Folge resultieren die nachfolgenden Amplifikationszyklen im Priming auch dieses Zweitstufenprimers und folglich im Einbau der fluoreszierenden Farbstoffmarkierungen in die Amplifikationsprodukte. Üblicherweise werden nur einige Zyklen benötigt, um diesen Teil des Verfahrens zu bewirken.
  • Das insgesamte Ergebnis der Verwendung von niedrigen Konzentrationen und der ersten Primerstufe bei hohen Anlagerungstemperaturen, wobei die Universalprimer im Ergebnis ausgeschaltet sind, ist, dass die Primerdimerbildung minimiert ist. Die Auswirkung einer vorsichtigen Temperaturkontrolle bzw. -steuerung während der Anlagerung auf das Verfahren ist in 24 hervorgehoben, wo bei 70 und 72°C für die Anlagerungstemperatur eine sehr wesentliche Primerdimerbildung erfolgt. Durch 74°C für die Anlagerungstemperatur wird diese sehr wesentlich verringert und ist bei 76°C beinahe eliminiert.
  • Die geeignete Anlagerungstemperatur zum Erhalten eines solchen Vorteils für einen Primer kann durch eine Reihe von Experimenten bei verschiedenen Anlagerungstemperaturen etabliert werden.
  • Die Bereitstellung des Amplifikationsverfahrens auf diese Weise mit relativ niedrigen Konzentrationen der Erststufenprimer ist auch zum Angehen der Schwankung der Wirksamkeiten der Amplifikation, die zwischen Primern bestehen, hilfreich. Das Ausgehen von niedrigen Konzentrationen bedeutet, dass die wirksamsten Primer rasch verbraucht sein werden, wenn die Reaktion fortschreitet, wohingegen die weniger wirksamen Primer weniger rasch verbraucht sein werden. Dies ermöglicht es, die weniger wirksamen Primer über eine hinreichende Zahl von Reaktionszyklen hinweg aufzufangen und im Allgemeinen gleiche Amplifikationslevel bereitzustellen.
  • Als alternative oder zusätzliche Technik zum Helfen bei der Vermeidung von Primerdimerbildung ist es möglich, die Universalprimer der zweiten Stufe vorsichtig zu konstruieren. Eine Primerdimerbildung erfolgt, wenn zwei Primer miteinander derart hybridisieren können, dass die 5'-Enden überhängen, wodurch eine Verlängerung, ausgehend vom 3'-Ende ermöglicht wird, 25a. Eine Primerdimerbildung kann ausgehend von 3'-Ende-Überhängen nicht erfolgen, 25b. Als Folge zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, sicherzustellen, dass die Primer nur möglicherweise so miteinander hybridisieren können, dass sie 3'-Ende-Überhänge ergeben.
  • Der Konstruktionsprozess für die Universalprimer umfasst die Bereitstellung selbst komplementärer 3'-Ende- und 5'-Ende-Sequenzen. Wie in 25c gezeigt, werden zwei Universalprimer bereitgestellt, um eine biallelische Situation, die analysiert wird, anzusprechen. Wenn alle vier Möglichkeiten für den SNP zutreffen, können dann vier auf ähnliche Weise bereitgestellte Universalprimer eingesetzt werden.
  • Die Primer bestehen aus den zwei komplementären Endteilen und einer allelspezifischen Sequenz, die dazwischen bereitgestellt wird. Wenn eine Verwendung als Erststufen- Primer gewünscht wird, kann ein lokusspezifischer Primerteil an jedes 3'-Ende dieser Primer gebunden werden. Derartige Sequenzen sind in 11 oben illustriert, und dies ist der Grund, warum der unterscheidende Teil des weiteren Teils eine intervenierende Sequenz ist, anstatt am Ende bereitgestellt zu werden.
  • Beispiele – Fehlen des Reverse-Primers der zweiten Stufe
  • Als Verfeinerung einiger der oben stehend diskutierten Beispiele wurde eine Analyse unter Verwendung der gleichen Primer, wie auf Seite 38 oben beschrieben, durchgeführt, jedoch ohne den Universal-11-Reverse-Primer.
  • Die PCR-Bedingungen und -Zyklen sind wie folgt:
    Primer Optimale Konzentration
    "Beacon"-Assay Sybr-Green-Assay
    Forward-Primer der 1. Runde 40 nM 40 nM
    Reverse-Primer der 1. Runde 100 nM 100 nM
    Forward-Primer der 2. Runde 200 nM –
    Reverse-Primer der 2. Runde – – (in diesem Verfahren weggelassen)
    Sybr Green – 10 %
    MgCl2 1,5 mM 1,5 mM
    PE-Puffer 10 % 10 %
    dNTPs 200 μM 200 μM
    Taq-Gold 0,1 U/Reaktion 0,1 U/Reaktion
    DNA 2 ng/Reaktion 2 ng/Reaktion
    Reaktionsvolumen = 20 μl
    Denaturierung 95°C für 10 min
    Amplifikation 1
    95°C für 30 s
    60°C für 30 s
    72°C für 30 s
    50°C für 30 s
    für 50 Zyklen
    Abkühlen 35°C für 1 min
  • In diesem Beispiel wurden die folgenden DNA-Mengen (1 ng, 0,5 ng, 0,05 ng und 0,01 ng) mit überarbeiteten Gc1s-Primern in Gegenwart des "Molecular Beacon"-Assays amplifiziert. Ein Diagramm, das die Fluoreszenz gegen die Zykluszahl für die verschiedenen amplifizierten Probengrößen zeigt, ist in 26 illustriert.
  • Die "Beacons", die "Universal 9" enthalten bzw. einbauen, haben ein viel besseres Ergebnis unter dem revidierten Amplifikationsprotokoll ergeben. Alle Produkte weisen eine Größe von näherungsweise 112 bp auf, und das Vorhandensein von Primerdimer ist nicht detektierbar.
  • Der Ct-Wert ist definiert als die Zyklenzahl, bei der die Reporterfluoreszenz über einen Basislinien- oder Schwellenlevel steigt. Dieser Level wird üblicherweise auf eine Position direkt am Beginn der exponentionellen Amplifikation gesetzt, wenn die PCR-Amplifikation optimiert wird. Dieser Assay kann unzweideutig < 0,01 ng (10 pg) genomischer DNA von SDW unterscheiden. Es ist jedoch zu bemerken, dass die DNA-Negativkontrolle 2 ng eines Gc2-Individuums umfasst. Diese ist in einem großen Überschuss im Vergleich zu den analysierten DNA-Mengen. Bei dieser DNA-Menge wird unvermeidlicherweise eine kleine Menge an Mispriming auftreten. 2 ng an Gc2 ergeben eine scheinbare et, die äquivalent ist zu ca. 50 pg (was nur 1/40 der tatsächlichen Menge ist). In der wirklichen Arbeit an Fällen ist es, sehr unwahrscheinlich, dass derart große DNA-Mengen verwendet werden – dies bedeutet, dass der Test in hohem Maße Allel-spezifisch ist. Es ist zu bemerken, dass die Negativkontrollen aus sterilem destilliertem Wasser vollständig sauber sind.
  • SYBR GREEN-Assay
  • Es wurden die gleichen Primer, wie für den "Molecular Beacon"-Assay beschrieben, verwendet, abgesehen davon, dass das "Molecular Beacon" selbst nicht verwendet wurde. Alle anderen Protokolle, die beschrieben sind, wurden im vorherigen Abschnitt beschrieben.
  • Die Ergebnisse in 27 zeigen eine Empfindlichkeit, die sehr ähnlich ist zu der, die vorher für das vorher beschriebene "Molecular Beacon"-Experiment beschrieben wurde.
  • DARLEGUNG VON PRIMERN OHNE 5'-ENDE-ÜBERHANG FÜR EINEN SYBR GREEN-ASSAY
  • Es wurde den gleichen Protokollen, wie sie zuvor beschrieben wurden, gefolgt – die folgenden Primer werden verwendet:
  • Primersatz C
    • Gc1s URP 13.1 G CTAGCTGGTGGCTGTGCTAGGTTCCGTGGGTGTGGCC
    • Gc reverse URP 13.1 CTAGCTGGTGGCTGTGCTAGGGCAGAGCGACTAAAAGCAAA
  • Die Ergebnisse sind in 28 gezeigt. Wiederum sind die Ergebnisse sehr ähnlich zu jenen, die zuvor beschrieben wurden und erzielten gute Ergebnisse, sogar bei sehr kleinen Proben.
  • Um es zusammenzufassen, zeigen wir, dass die Sybr Green-, ein Farbstoff, und "Molecular Beacon"-Assays, die die oben dargelegten Prinzipien nutzen, dazu in der Lage sind, DNA-Konzentrationen von < 100 pg zu analysieren. Ferner zeigt die Reaktion eine beträchtliche Allelspezifität. Eine Negativkontrolle, die ein anderes Allel (Gc2) bei einem sehr hohen Level von 2 ng umfasst, zeigte eine kleine Menge an Mispriming mit dem Gc1s-Primer, und zwar näherungsweise auf dem 10 pg-Level.
  • Die Technik der vorliegenden Erfindung, wie insbesondere durch ihre zahlreichen Ausführungsformen veranschaulicht, ist zum Analysieren sehr niedriger DNA-Konzentrationen, die in einem Gemisch enthalten sind, geeignet. Diese Technik weist die Fähigkeit auf, DNA aus einer Quelle herauszusuchen, die mit großem Abstand ein minorer Beitrag zu einem Gemisch ist. Somit ermöglicht es die Technik Gemische erfolgreich zu durchsuchen, in denen eine Quelle nur im Verhältnis von 1:5000 zu der Probe beiträgt. Dies ist nützlich bei Proben aus gemischten Quellen, worin eine Seite wahrscheinlich nur eine kleine Menge beiträgt. Die Technik ist auch anwendbar zum Ermöglichen des Heraussuchens und Analysierens sehr kleiner Mengen an männlicher DNA in Gegenwart wesentlicher Mengen weiblicher DNA. Eine Probe, die 0,02 % männliche DNA oder sogar weniger umfasst, kann unter Anwendung dieser Erfindung erfolgreich analysiert werden, selbst wenn 99,98 % der Probe weibliche DNA ist.
  • In Fällen, in denen niedrige Probenkonzentrationen analysiert werden, kann die vorliegende Konzentration der Probe geprüft werden durch Vergleichen des aus der unbekann ten Probe hervorgehenden Fluoreszenzlevels mit einer Reihe von Kalibrationsergebnissen, Bilden einer Kurve mit jenen Ergebnissen, die auf verschiedenen DNA-Konzentrationen als ein Teil der insgesamten DNA-Probe basieren.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001
  • Figure 00730001
  • Figure 00740001
  • Figure 00750001
  • Figure 00760001
  • Figure 00770001
  • Figure 00780001

Claims (45)

  1. Verfahren zur Untersuchung von Einzelnucleotidpolymorphismen in einer DNA-Probe, wobei das Verfahren umfasst: In-Kontakt-Bringen der DNA-enthaltenden Probe mit einem ersten Primersatz, wobei die ersten Primersätze zwei oder mehr Primer, die einen lokusspezifischen Teil und einen weiteren Teil einschließen, wobei der weitere Teil mindestens eines der Primer unterschiedlich zu dem weiteren Teil mindestens eines der anderen Primer ist, enthalten, Amplifikation der DNA, wobei die Amplifikation die ersten Primersätze verwendet, um ein amplifiziertes Produkt zu liefern, wobei das amplifizierte Produkt eine zu dem lokusspezifischen Teil und weiteren Teil eines ersten Primersatzes komplementäre Sequenz einschließt, In-Kontakt-Bringen von mindestens einem Teil des amplifizierten Produkts mit mindestens einem zweiten Primersatz, Amplifikation des ersten amplifizierten Produkts, um ein weiter amplifiziertes Produkt durch Hybridisierung oder Anlagerung mindestens eines aus dem zweiten Primersatz an den Teil des ersten amplifizierten Produkts mit einer zu dem weiteren Teil komplementären Sequenz zu liefern, und Untersuchung einer oder mehrerer Eigenschaften des weiter amplifizierten Produkts durch Verwendung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Unterscheidungseinheit, die durch Hybridisierung oder Anlagerung eines Bestandteils, der die Unterscheidungseinheit enthält, in die zu dem weiteren Teil komplementäre Sequenz eingeführt wird.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem zwei oder mehr der Primer des zweiten Primersatzes einen zweiten weiteren Teil einschließen, wobei der zweite weitere Teil eines der Primer eine Sequenz einschließt, die zu den Sequenzen mindestens eines Teils des weiteren Teils eines der Primer des ersten Satzes passt, der zweite weitere Teil eines der Primer eine Sequenz einschließt, die zu der Sequenz mindestens eines Teils des weiteren Teils eines unterschiedlichen Primers der Primer des ersten Satzes passt.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, in dem die Unterscheidungseinheit während des Amplifikationsprozesses eingeführt wird.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, in dem die Unterscheidungseinheit in einem Schritt, der im Anschluss an den Amplifikationsprozess ist, eingeführt wird.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, in dem der Bestandteil eine Sonde für den weiteren Teil ist.
  6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem die ersten Primersätze aus zwei Forward-Primern und einem Reverse-Primer bestehen.
  7. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem der weitere Teil des ersten Primersatzes an das 5'-Ende des lokusspezifischen Teils gebunden ist.
  8. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem das 3'-Ende der Forward-Primer der ersten Primersätze mit einem SNP-identifizierenden Teil versehen ist.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, in dem der lokusspezifische Teil und SNP-identifizierende Teil eines der Forward-Primer an die 3'-Seite des Lokus, der den zu untersuchenden SNP aufweist, anlagern, und der lokusspezifische Teil und SNP-identifizierende Teil des anderen der Forward-Primer dieses ersten Satzes nicht an die 3'-Seite des zu untersuchenden SNP anlagern.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 8, in dem sich der Anlagerungsprimer wegen einer Übereinstimmung zwischen dem SNP-identifizierenden Teil und der SNP-Stelle der Probe anlagert und sich der Nicht-Anlagerungsprimer wegen einer fehlenden Übereinstimmung zwischen dem SNP-identifizierenden Teil und der SNP-Stelle der Probe nicht anlagert.
  11. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem nur ein zweiter Primersatz bereitgestellt wird.
  12. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem der zweite Primersatz aus zwei Forward-Primern und einem Reverse-Primer besteht.
  13. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem der zweite weitere Teil eine Sequenz einschließt, die zu der Sequenz des ersten weiteren Teils passt und/oder sich mit der Sequenz des amplifizierten Produkts, das zu dem ersten weiteren Teil passt, paart.
  14. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem eine Vielzahl von ersten Primersätzen bereitgestellt wird, um eine Vielzahl von SNP-Loki zu amplifizieren, wobei die resultierenden Amplifikationsprodukte verschiedene Längen haben.
  15. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem ein erster Satz von Amplifikationsbedingungen und ein zweiter Satz von Amplifikationsbedingungen eingesetzt werden, wobei der erste Satz der Amplifikationsbedingungen eine Amplifikation durch einen oder mehrere der Primer inhibiert.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 15, in dem der zweite Satz der Amplifikationsbedingungen für eine Amplifikation des/der zuvor inhibierten einen oder mehreren Primer sorgt.
  17. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem der erste und zweite Primersatz zusammen vorliegen und die Anlagerungstemperatur für mindestens einige Zyklen des Amplifikationsprozesses so ist, dass mindestens 80% des zweiten Primersatzes einzelsträngig bleiben.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 17, in dem die Anlagerungstemperatur mindestens in den Zyklen 3 bis 30 so zur Verfügung gestellt und verwendet wird.
  19. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem eine Anlagerungstemperatur in mindestens den letzten zwei Zyklen verwendet wird, wobei die Anlagerungstemperatur ermöglicht, dass sich mindestens 80% des zweiten Primersatzes anlagern.
  20. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem die Anlagerungstemperatur mindestens 72°C für die Zyklen 3 bis 30 des Amplifikationsprozesses ist.
  21. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem die Anlagerungstemperatur für mindestens die letzten zwei Zyklen des Amplifikationsprozesses 62°C oder niedriger ist.
  22. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem der erste und zweite Primersatz zusammen vorliegen und in dem die Konzentration des zweiten Primersatzes in einem Verhältnis von mindestens 5:1, relativ zu der Konzentration des ersten Primersatzes, zur Verfügung gestellt wird.
  23. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem der erste und zweite Primersatz zusammen vorliegen, der erste Primersatz in einer Konzentration zwischen 10 und 200 nM zur Verfügung gestellt wird und der zweite Satz in einer Konzentration zwischen 400 und 4000 nM zur Verfügung gestellt wird.
  24. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem die Unterscheidungseinheit ein Farbstoff, eine Farbstoffmarkierung, ein Farbe erzeugendes Molekül, molekulares Lichtsignal, Emitter von Strahlung, charakteristisches Isotop ist.
  25. Verfahren gemäß Anspruch 3 oder einem der davon abhängigen Ansprüche, in dem eine Unterscheidungseinheit während der Amplifikation eingeführt wird.
  26. Verfahren gemäß Anspruch 3 oder einem der davon abhängigen Ansprüche, in dem eine Unterscheidungseinheit an dem 5'-Ende der Forward-Primer des zweiten Primersatzes zur Verfügung gestellt wird, wobei eine andere Unterscheidungseinheit für jeden Forward-Primer in einem zweiten Satz zur Verfügung gestellt wird.
  27. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem die Unterscheidungseinheit eine Nucleotidpräsenz bei dem SNP aufzeigt.
  28. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem die Amplifikationsprodukte der zwei oder mehr ersten Primersätze und die der ein oder mehr zweiten Primersätze durch Verwendung einer Elektrophorese von einander getrennt werden.
  29. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder einem der davon abhängigen Ansprüche, in dem das weiter amplifizierte Produkt eine Bindungseinheit einschließt und die Bindungseinheit eine Bindung des weiter amplifizierten Produkts an einen festen Träger erleichtert.
  30. Verfahren gemäß Anspruch 29, in dem das gebundene weiter amplifizierte Produkt mit einer oder mehr Sonden, die zumindest zum Teil voneinander verschiedene Sequenzen haben, in Kontakt gebracht wird, wobei der Kontakt in einer Hybridisierung einer der Sonden mit dem weiter amplifizierten Produkt resultiert.
  31. Verfahren gemäß Anspruch 29 oder Anspruch 30, in dem jede Sonde einen gemeinsamen Sequenzteil hat, wobei der gemeinsame Sequenzteil in der Sequenz dem lokusspezifischen Teil des weiter amplifizierten Produkts entspricht.
  32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 29 bis 31, in dem die Sonden mindestens einen verschiedenen Sequenzteil verglichen mit einer anderen einschließen, wobei der verschiedene Sequenzteil mindestens einer der Sonden der Sequenz des weiteren Teils, der in die Sequenz des weiter amplifizierten Produkts eingeschlossen ist, entspricht.
  33. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 29 bis 32, in dem ein Kontakt der Sonden mit dem weiter amplifizierten Produkt in einer Hybridisierung einer der Sonden mit dem weiter amplifizierten Produkt resultiert, wobei jede Sonde in Bezug zu einer anderen eine Unterscheidungseinheit hat.
  34. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem einer oder mehrere aus dem ersten Primersatz mit einem SNP-identifizierenden Teil versehen sind, wobei der SNP-identifizierende Teil für jeden verschiedenen Primer verschieden ist, wobei sich der Primer mit einem SNP-Identitätsteil, der sich mit dem SNP paart, an eine Seite des SNP anlagert.
  35. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem der lokusspezifische Teil der Primer des ersten Satzes eine Sequenz einschließt, die zu der Sequenz der Lokussequenz in der Nachbarschaft des zu untersuchenden SNP passt, wobei die Übereinstimmung zwischen dem lokusspezifischen Teil und einer Sequenz des Lokus bei zwischen einer und zehn Basen an der jeweiligen Seite des zu untersuchenden SNP beginnt.
  36. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem der erste Primersatz einen Reverse-Primer einschließt und weiter einen Forward-Primer für jede mögliche Identität des zu untersuchenden SNP einschließt.
  37. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem der lokusspezifische Teil der Primer in einem Satz mit identischen Sequenzen in jedem Primer zur Verfügung gestellt wird.
  38. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem der weitere Teil eine Sequenz einschließt, die nicht zu der Lokussequenz an der 3'-Seite des Lokus, zu der der lokusspezifische Teil des Primers passt, passt.
  39. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem das weiter amplifizierte Produkt mit einem oder mehreren Bestandteilen, die auf einem festen Träger gehalten werden, in Kontakt gebracht wird, wobei der eine oder die mehreren Bestandteile eine Sequenz haben, die sich an mindestens einem Teil der Sequenz eines der weiter amplifizierten Produkte anlagert.
  40. Verfahren gemäß Anspruch 39, in dem sich der gehaltene Bestandteil an das weiter amplifizierte Produkt bis zu der Base vor der Base, die die SNP-Seite ist, anlagert.
  41. Verfahren gemäß Anspruch 39, in dem sich der gehaltene Bestandteil an das weiter amplifizierte Produkt entlang der Sequenz, entsprechend dem lokusspezifischen Teil und einem weiteren Teil des weiter amplifizierten Produkts, anlagert.
  42. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 39 bis 41, in dem eine Mehrzahl verschiedener gehaltener Bestandteile, bevorzugt PCR-Produkte und/oder Oligonucleotide, an dis kreten Orten auf einem Träger zur Verfügung gestellt werden, wobei sich verschiedene gehaltene Bestandteile an verschiedene weiter amplifizierte Produkte anlagern.
  43. Verfahren gemäß Anspruch 41, in dem der gehaltene Bestandteil und ein angelagertes weiter amplifiziertes Produkt mit einem oder mehreren weiteren Bestandteilen in Kontakt gebracht werden, um eine Unterscheidungseinheit einzuführen.
  44. Verfahren gemäß Anspruch 41, in dem der gehaltene Bestandteil und ein angelagertes weiter amplifiziertes Produkt mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen in Kontakt gebracht werden, wobei der eine oder die mehreren zusätzlichen Bestandteile ein oder mehrere weitere Oligonucleotide, die eine Unterscheidungseinheit einschließen, sind.
  45. Verfahren gemäß Anspruch 44, in dem die Endbase des weiteren Oligonucleotids eine der vier möglichen Identitäten für den SNP ist.
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