DE60305150T2

DE60305150T2 - Quantitativer nachweis der methylierung in dna proben

Info

Publication number: DE60305150T2
Application number: DE60305150T
Authority: DE
Inventors: Susan Seattle COTTRELL
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2002-02-06
Filing date: 2003-02-06
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2023-02-07
Also published as: EP1472369B1; EP1472369A2; AU2003205745A1; US20030148290A1; ATE325895T1; US6960436B2; US20060088866A1; WO2003066895A2; DE60305150D1; WO2003066895A3; JP2005516628A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Analyse von Nukleinsäuren, insbesondere die Analyse von Methylierungsmustern in genomischer DNA durch Bereitstellung eines Mittels zur Detektion von Nukleotiden, welche charakteristisch sind für methylierte Stellen nach der Bisulfit-Behandlung genomischer DNA. Das Verfahren nutzt die Inkorporation von Markern und die Detektion von Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) der amplifizierten Proben-DNA.
Stand der Technik
DNA-Methylierung
Die Beobachtungsebenen, die in den letzten Jahren in der Molekularbiologie untersucht worden sind, haben sich konzentriert auf Gene, die Translation dieser Gene in RNA und die Transkription der RNA in Protein. Es gab eine begrenztere Analyse der Regulationsmechanismen, die mit der Genkontrolle in Zusammenhang stehen. Die Genregulierung, beispielsweise in welchem Entwicklungsstadium des Individuums ein Gen aktiviert oder inhibiert wird, und die gewebsspezifische Natur dieser Regulierung, werden weniger gut verstanden. Jedoch kann sie mit einem hohen Grad an Wahrscheinlichkeit mit dem Ausmaß und der Natur der Methylierung des Gens oder Genoms korreliert werden. Durch diese Beobachtung ist es vertretbar zu folgern, dass pathogene genetische Störungen mittels irregulärer genetischer Methylierungsmuster detektiert werden können.
Die Bemühungen des Human-Genom-Projekts sind auf die Sequenzierung des menschlichen Genoms konzentriert. Es wird erwartet, dass sich daraus beträchtliche therapeutische und diagnostische Nutzen für die Behandlung von Krankheit ergeben. Jedoch war es bisher nicht möglich, diese Bemühungen auf einen signifikanten Aspekt genetischer Störun gen, den epigenetischen Faktor, auszurichten. Es hat sich gezeigt, dass die epigenetische Regulierung der Gentranskription viele Störungen hervorruft. Einer der signifikantesten epigenetischen Mechanismen, der bisher identifiziert wurde, war die Methylierung von Cytosin. Die Methylierung von Cytosin in der 5-Position ist die einzige bekannte Modifikation genomischer DNA. Obwohl die genauen Mechanismen unbekannt sind, durch welche die DNA-Methylierung die DNA-Transkription beeinflusst, ist der Zusammenhang zwischen Krankheit und Methylierung gut belegt worden. Insbesondere scheinen Methylierungsmuster von CpG-Inseln innerhalb von regulatorischen Regionen des Genoms äußerst gewebsspezifisch zu sein. Deshalb folgt daraus, dass die Fehlregulation von Genen durch einen Vergleich ihrer Methylierungsmuster mit phänotypischen "normalen" Expressionsmustern vorhergesagt werden kann. Die folgenden sind Beispiele von Krankheiten, die mit modifizierten Methylierungsmustern in Zusammenhang stehen.

– Hals- und Nackenkrebs (M. Sanchez-Cespedes et al. „Gene promoter hypermethylation in tumors and serum of head and neck cancer patients" Cancer Res. 15. Feb. 2000 15;60(4):892-5)
– Hodgkin-Krankheit (J. F. Garcia et al „Loss of p16 protein expression associated with methylation of the p16INK4A gene is a frequant finding in Hodgkin's disease" Lab invest Dez. 1999;79(12):1453-9)
– Magenkrebs (Y. Yanagisawa et al. „ Methylation of the hMLH1 promoter in familial gastric cancer with microsatellite instability" Int J Cancer 1. Jan. 2000; 85 (1):50-3)
– Prader-Willi/Angelman-Syndrom (Zeschnigh et al. „Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method" Human Mol. Genetics (1997) (6) 3 Seiten 387–395)
– ICF-Syndrom (Tuck-Muller et al „CMDNA hypomethylation and unusual chromosome instability in cell lines from ICF syndrome patients" Cytogenet Call Genet 2000; 89(1-2):121-8
– Dermatofibrom (T. C. Chen et al. „Dermatofibroma is a clonal proliferative disease" J Cutan Pathol Jan. 2000;27 (1):36-9)
– Hypertonie (S. D. Lee et al. „ Monoclonal endothelial cell proliferation is present in primary but not secondary pulmonary hypertension" J clin Invest 1. März 1998, 101 (5):927-34)
– Autismus (S. M. Klauck et al. „Molecular genetic analysis of the FMR-1 gene in a large collection of autistic patients" Human Genet Aug. 1997; 100 (2):224-9)
– Fragile-X-Syndrom (I. K. Hornstra et al., „High resolution methylation analysis of the FMR1 gene trinucleotide repeat region in fragile X syndrome" Hum Mol Genet Okt. 1993, 2(10):1659-65)
– Chorea Huntigton (J. Ferluga et al. „Possible organ and age related epigenetic factors in Huntington's disease and colorectal carcinoma" Med hyptheses Mai 1989; 29(1);51-4

Bisulfit-Behandlung
Eine relativ neues und gegenwärtig das am häufigsten verwendete Verfahren zur Analyse von DNA auf 5-Methylcytosin basiert auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, welches durch nachfolgende alkalische Hydrolyse in Uracil überführt wird, welches in Bezug auf sein Basenpaarungsverhalten mit Thymidin korrespondiert. 5-Methylcytosin verbleibt jedoch unter diesen Bedingungen unmodifiziert. Infolgedessen wird die ursprüngliche DNA derart umgesetzt, dass Methylcytosin, das ursprünglich in seinem Hybridiserungsverhalten nicht von Cytosin zu unterscheiden war, nun als das einzige verbliebene Cytosin, unter Verwendung "normaler" molekularbiologischer Techni ken, zum Beispiel mittels Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung, detektiert werden kann. Alle diese Techniken basieren auf Basenpaarung, die nun vollständig ausgenutzt werden kann. Im Hinblick auf die Empfindlichkeit wird der Stand der Technik durch ein Verfahren bestimmt, welches die zu analysierende DNA in eine Agarose-Matrix einschließt, wodurch die Diffusion und Renaturierung der DNA verhindert werden (Bisulfit reagiert nur mit einzelsträngiger DNA), und welches alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (A. Olek, J. Oswald, J. Walter. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 15. Dez. 1996;24(24):5064-6). Unter Verwendung dieses Verfahrens ist es möglich, individuelle Zellen zu analysieren, was das Potenzial dieses Verfahrens veranschaulicht. Jedoch werden gegenwärtig nur individuelle Regionen von einer Länge bis ungefähr 3000 Basenpaaren analysiert, eine umfassende Analyse von Zellen auf Tausende mögliche Methylierungsereignisse ist nicht möglich. Dieses Verfahren kann jedoch auch nicht zuverlässig sehr kleine Fragmente aus kleinen Probenmengen analysieren. Diese gehen trotz des Diffusionsschutzes durch die Matrix verloren.
Einen Überblick über die weiteren bekannten Verfahren zur Detektion von 5-Methylcytosin kann dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: T. Rein, M. L. DePamphilis, H. Zorbas, Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
Bis heute, abgesehen von wenigen Ausnahmen (z. B. M. Zeschnigk, C. Lich, K. Buiting, W. Doerfler, B. Horsthemke. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 März-April;5(2):94-8) wird die Bisulfit-Technik nur in der Forschung eingesetzt. Es werden jedoch immer nur kleine, spezifische Fragmente eines bekannten Gens im An schluss an eine Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder vollständig sequenziert (A. Olek, J. Walter. The preimplantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. Nov. 1997; 17(3):275-6) oder es werden individuelle Cytosin-Positionen mittels einer Primer-Extensionsreaktion (M. L. Gonzalgo, P. A. Jones. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 15. Juni 1997;25(12):2529-31, WO Patent 9500669) oder mittels enzymatischen Verdaus detektiert (Z. Xiong, P. W. Laird. COBRA: A sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 15. Juni 1997;25(12):2532-4). Zusätzlich ist auch die Detektion mittels Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Verwendung der Bisulfit-Technik zur Methylierungsdetektion in individuellen Genen beschäftigen, sind: G. Grigg, S. Clark., Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. Juni 1994;16(6):431-6, 431; M. Zeschnigk, B. Schmitz, B. Dittrich, K. Buiting, B. Horsthemke, W. Doerfler. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. März 1997;6(3):387-95; R. Feil, J. Charlton, A. P. Bird, J. Walter, W. Reik. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 25. Feb. 1994;22(4):695-6; V. Martin, S. Ribieras, X. Song-Wang, M. C. Rio, R. Dante. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 19. Mai 1995;157(1-2):261-4; WO 97 46705, WO 95 15373 und WO 45560.
Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer(FRET)
Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) ist eine Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen, wobei der angeregte Zustand eines Moleküls (des Donors) Energie auf das andere Molekül (den Akzeptor) überträgt. Das Donor-Molekül ist ein Fluorophor während das Akzeptor-Molekül einer sein kann oder nicht. Der Energietransfer verläuft ohne die Emission von Photonen und basiert auf Dipol-Dipol-Wechselwirkungen zwischen den zwei Molekülen. Moleküle, die gewöhnlich beim FRET verwendet werden, schließen Fluoreszein, N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 4-(4'-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure (DABCYL) und 5-(2'-Aminoethyl)aminonaphthalin-1-sulfonsäure (EDANS) ein. Die grundlegenden Bedingungen für FRET schließen die folgenden ein:

– Nächste Nähe zwischen den Donor- und Akzeptor-Molekülen (gewöhnlich 10–100 Å).
– Das Emissionsspektrum des Donor-Moleküls muss mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptor-Moleküls überlappen. Die Übergangsdipol-Orientierungen der Donor- und Akzeptor-Moleküle müssen annähernd parallel sein.
– Das Ausmaß des Energie-Transfers ist abhängig vom Abstand zwischen den zwei Molekülen und der Überlappung der Donor- und Akzeptor-Spektren. Es kann durch die folgende Gleichung beschrieben werden: kt(r) = tD – 1·(R0/r)6worin r der Abstand zwischen dem Donor und dem Akzeptor ist tD die Lebensdauer des Donors in Abwesenheit von Energietransfer ist R0 als Förster-Abstand bezeichnet wird.

Die Effizienz des Energietransfers (für ein einzelnes Donor-Akzeptor-Paar) ist gegeben durch: E = R06/(R06 + r6)
Förster-Abstände liegen gewöhnlich in dem Bereich von 30–60 Å. Deshalb kann FRET als hochempfindliches Verfahren zur Messung mikroskopischer Abstände verwendet werden, was insbesondere auf dem Gebiet der Molekularbiologie nützlich ist, wo er auf etlichen Arten und Weisen eingesetzt worden ist. Er ist bei der Untersuchung der Proteinstruktur, -anordnung, verteilung, konformation und von -wechselwirkungen verwendet worden, wie auch bei der Untersuchung von Zellmembranen und Immunassays. FRET ist auch auf etliche Arten und Weisen bei der Analyse von Nukleinsäuren verwendet worden. Diese schließen die Analyse der Struktur und Konformation von Nukleinsäuren, Hybridisierung, PCR, Sequenzierung und Primerextensions-Assays ein.
Eine andere Klasse von Sonden-Markern schließen Fluoressenz-Quencher ein. Die Emissionsspektren eines Quenchers überlappen mit einem Fluoreszenz-Farbstoff, so dass die Fluoreszenz des Fluoreszenz-Farbstoffs durch die Phänomene des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers „FRET" wesentlich vermindert oder gequencht wird (Clegg (1992) Meth. Enzymol., 211:353–388). Ein Fluoreszenz-Reporterfarbstoff und ein Quencher, die in einer Konfiguration verbunden miteinander sind, welche Energietransfer von dem Fluorophor zu dem Quencher gestattet, kann in einer Reduktion der Fluoreszenz des Fluoreszenz-Farbstoffs resultieren. Der Reporter ist eine lumineszierende Verbindung, die entweder durch chemische Reaktion, Erzeugung von Chemilumineszenz oder durch Lichtadsorption angeregt werden kann Fluoreszenz zu erzeugen. Der Quencher kann mit dem Reporter wechselwirken, um seine Lichtemission zu verändern, was gewöhnlich zu der verminderten Emissionseffizienz des Reporters führt. Die Effizienz dieses Quenching-Phänomens korreliert direkt mit dem Abstand zwi schen dem Reporter-Molekül und dem Quencher-Molekül (Yaron (1979) Analytical Biochemistry, 95:228-35).
Spezielle Quencher schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Rhodamin-Farbstoffe wie Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA) oder Tetrapropano-6-carboxyrhodamin (ROX) (Bergot, US-Patent Nr. 5 366 860).
Enzymatische Amplifikation
PCR ist eine allgemein verwendete Technik, die zum Beispiel in den US-Patenten der Nummern 4 683 195, 4 683 202 und 4 800 159 beschrieben worden ist. Kurz gesagt ist es die Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz durch wiederholte Zyklen von Primer-Annealing und -Extension an einzelsträngige Nukleinsäuren, gefolgt von der Denaturierung des resultierenden doppelsträngigen Moleküls. PCR (und Variationen davon) besitzt eine Vielzahl von Anwendungen und ist eine der Schlüsseltechnologien, die in die meisten Formen von Nukleinsäure-Analyse und -Manipulation involviert ist.
Eine wichtige Variation ist die Multiplex-PCR, bei der mehr als 2 spezifische Primer verwendet werden und eine Vielzahl verschiedener spezifischer Amplifikate in einer Reaktionskammer erhalten werden.
Es gibt verschiedene für gewöhnlich verwendete Verfahren zur Detektion von PCR-Produkten, wie Gelelektrophorese und die Verwendung markierter Primer-Oligonukleotide und Nukleosidtriphosphate. Die Verwendung von Fluoreszenzmarkierten Nukleotiden und Oligomeren bei der PCR zur Nukleinsäure-Analyse ist auch bekannt.
PNA-FRET-Sonden
PNA kann ihr Target-Komplement entweder in einer parallelen oder anti-parallelen Orientierung hybridisieren. Je doch ist die anti-parallele Duplex (wo der Carboxylterminus der PNA am 5'-Terminus der DNA angeordnet ist und der Amino-Terminus am 3'-Terminus der DNA angeordnet ist) üblicherweise stabiler (Egholm (1993) Nature, 365:566-68). Es ist bekannt, dass PNA-Sonden mit hoher Spezifität und Affinität an Target-DNA-Sequenzen binden (Coull, US-Patent Nr. 6 110 676). Die erfindungsgemäßen Beispiele der PNA-FRET-Sonde mit Reporter- oder Quencher-Anteil sind derart gestaltet, dass die PNA in der antiparallelen Orientierung an die Target-Sequenz hybridisiert.
PNA kann in jedem Maßstab mit automatisierten Synthesevorrichtungen synthetisiert werden. Die PNA-FRET-Sonden können auf vielen der üblicherweise verwendeten, festen Träger synthetisiert werden. Nachdem die Synthese abgeschlossen ist, kann die PNA von dem Träger abgespalten, gereinigt, analysiert und quantifiziert werden. Es hat sich gezeigt, dass Fluoreszenz-markierte PNA-Sonden wünschenswerte Eigenschaften bei Hybridisierungsassays besitzen (Hyldig-Nielsen, US-Patent Nr. 5 985 563).
Genomische DNA für die weitere Amplifikation wird aus DNA von Zellen, Gewebe oder anderen Testproben unter Verwendung von Standardverfahren erhalten. Diese Standardmethodologie wird in Referenzen wie Fritsch und Maniatis, Herausgeber, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, gefunden.
Echtzeit-PCR
Echtzeit-PCR-Überwachung unter Nutzung von Fluoreszenz ist auf verschiedene Arten beschrieben worden. Zuerst ermöglicht die Bindung von Fluoreszenz-Farbstoffen, die für doppelsträngige DNA spezifisch sind, wie Ethidiumbromid, die Überwachung der Akkumulation von PCR-Produkt mittels Korrelation mit der erhöhten Fluoreszenz. Ein zweites De tektionsverfahren, Polymerase-vermittelte Exonuklease-Spaltung, nutzt die 5'-Exonuklease-Aktivität von Polymerasen wie Taq. Eine Oligonukleotid-Sonde, die komplementär zu dem PCR-Produkt jedoch verschieden von dem PCR-Primer ist, wird mit einem FRET-Paar markiert, so dass das Donor-Molekül durch ein Akzeptor-Molekül gequencht wird. Während der PCR-Amplifikation setzt die 5'-Exonuklease den Verdau der Sonde fort, wodurch das FRET-Paar abgetrennt wird, was zu erhöhter Fluoreszenz führt. Eine Variation dieser Technologie verwendet eine Nukleinsäure, worin das FRET-Paar intern gequencht ist, beispielsweise indem sie eine Haarnadel-Konfiguration besitzt. Nach Hybridisierung an eine interessierende Sequenz wird das FRET-Paar abgetrennt und das Donor-Molekül emittiert Fluoreszenz. Diese Technologie kann zum Beispiel für die Analyse von SNPs verwendet werden.
Eine alternative Technologie basiert auf der Verwendung von zwei Spezies von Hybridisierungssonden, die jede mit einem Teil eines FRET-Paares markiert sind. Nach der Hybridisierung beider Sonden in angemessener Nähe an die Target-Sequenz wird ein Fluoreszenzsignal emittiert. Diese Technologie kann wiederum für die Detektion von SNPs verwendet werden.
Der Hautvorteil der Verwendung solcher FRET-basierten PCR-Technologien ist, dass die Reaktion als Reaktion im geschlossenen Gefäß überwacht werden kann, das für die Verwendung bei hohem und mittlerem Durchsatz geeignet ist, und die Wahrscheinlichkeit der Kontamination reduziert ist.
Weiterhin beschreibt P. Laird in WO 00/70090 (University of Southern California) ein quantitatives Verfahren mit hohem Durchsatz zur Bestimmung von Methylierungsmustern in genomischen DNA-Proben, basierend auf der Amplifikati on modifizierter Nukleinsäuren und der Detektion methylierter Nukleinsäure, die auf dem Amplifikationsabhängigen Austausch spezifisch hybridisierter Hybridisierungssonden basiert.
Ein diagnostisches Verfahren für Krebs, das auf Methylierungsunterschieden an spezifischen CpG-Stellen beruht, wird von M. Gonzalgo in WO 98/56952 (University of Southern California) beschrieben.
U. Landegren et al. ("Reading Bits of Genetic Information: Methods for Single-Nucleotide Polymorphism Analysis", Genome Research, Cold Spring Habor Laboratory Press, 1998, Seiten 769–776) und D. A. de Angelis ("Why FRET over genomics?", American Physiological Society, 1999, Seiten 93–99) beschreiben die Verwendung von FRET zur Bestimmung von Einzelnukleotid-Polymorphismen.
Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Cytosin-Methylierungs-Detektion in einer DNA-Probe bereitgestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) eine genomische DNA-Probe wird auf eine Weise behandelt, die geeignet ist methylierte von unmethylierten Cytosin-Basen zu unterscheiden;
b) die vorbehandelte DNA wird unter Verwendung wenigstens eines Oligonukleotid-Primers, einer Polymerase und eines Satzes von Nukleotiden amplifiziert, von denen wenigstens eines mit einem ersten Markertyp markiert ist;
c) ein sequenzspezifisches Oligonukleotid oder eine Oligonukleotid-Sonde wird an das Amplifikationsprodukt hybridisiert und es tritt ein FRET auf, wenn das Oligonukleotid oder die Oligonukleotid-Sonde, markiert mit einem zweiten Markertyp, in nächster Nähe zu einem der mar kierten Oligonukleotide bindet, die in das Amplifikationsprodukt inkorporiert wurden;
d) der Methylierungsgrad der Probe wird durch den Grad der Wechselwirkung zwischen dem genannten ersten und zweiten Markertyp bestimmt.

Erfindungsgemäß ist bevorzugt, dass der erste Markertyp ein Donor-Fluorophor ist und der zweite Markertyp ein Akzeptor-Fluorophor ist und dass das Ausmaß des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) gemessen wird. Es ist weiterhin bevorzugt, dass der erste Markertyp ein Akzeptor-Fluorophor ist und der zweite Markertyp ein Donor-Fluorophor ist und dass das Ausmaß des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) gemessen wird.
Ein weiteres bevorzugtes erfindungsgemäßes Ausführungsbeispiel ist dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotide von Schritt b) einen Fluoreszenz-Anteil und die Sonde in Schritt c) einen Quencher-Anteil enthalten. Es ist auch erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Nukleotide von Schritt b) einen Quencher-Anteil und die Sonde in Schritt c) einen Fluoreszenz-Anteil enthalten.
Erfindungsgemäß ist es auch bevorzugt, dass die Polymerase keine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität besitzt, um den Abbau der Sonde zu verhindern.
Es ist ferner erfindungsgemäß bevorzugt, dass eine Änderung der Fluoreszenz-Intensität während der Amplifikationsreaktion in Echtzeit überwacht wird.
Es ist insbesondere auch erfindungsgemäß bevorzugt, dass eine Änderung der Fluoreszenz-Intensität am Endpunkt der Target-Amplifikation überwacht wird.
Gemäß einem anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel wird die Amplifikationsreaktion mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass die Sonde nur ein CpG enthält oder dass die Sonde mehrere CpGs enthält. Insbesondere in diesem Fall ist es weiterhin bevorzugt, dass jede Sonde für jedes CpG eine Fluoreszenzmarkierung besitzt.
In einem weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel kann die Sonde endmarkiert oder intern markiert sein.
Es ist auch erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Methylierungsinformation mittels der Änderung der Fluoreszenz-Intensität während nachfolgender PCR-Durchläufe oder -Zyklen bestimmt wird.
Es ist auch bevorzugt, dass die Proben-DNA nur durch ausgewählte PCR-Primer amplifiziert wird, wenn ein bestimmter Methylierungszustand an einer spezifischen Stelle in der Proben-DNA vorliegt.
Erfindungsgemäß ist ein Verfahren bevorzugt, worin die Proben-DNA nur amplifiziert wird, wenn ein bestimmter Methylierungszustand an einer spezifischen Stelle in der Proben-DNA vorgelegen hat, deren Sequenzkontext im Wesentlichen komplementär zu einem oder mehreren Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren ist, die zusätzlich bei der PCR-Reaktion verwendet wurden.
Es ist auch bevorzugt, dass die Amplifikation vom 3'-Ende der Sonde mittels Phosphorylierung blockiert ist.
Erfindungsgemäß ist es auch bevorzugt, dass eine Schmelzkurve am Ende der PCR erzeugt wird, um zusätzliche Daten zu sammeln.
Es ist insbesondere im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass der Fluoreszenz-Anteil ein Fluorescein-Farbstoff, ein Rhodamin-Farbstoff oder ein Cyanin-Farbstoff ist. Insbesondere bevorzugt ist auch, dass der Quencher-Anteil ein Rhodamin-Farbstoff ist.
Es ist ein insbesondere bevorzugtes Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass die Deaminierungsbehandlung der DNA mit einem Bisulfit-Reagenz durchgeführt wird.
Es ist erfindungsgemäß auch bevorzugt, dass die DNA-Probe vor der Deaminierungsbehandlung mit Restriktionsendonukleasen gespalten wird.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die DNA-Probe aus Säugetier-Quellen isoliert, z. B. Zell-Linien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, in Paraffin eingebettetem Gewebe, zum Beispiel Augengewebe, Darm, Niere, Gehirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Schnitten und allen möglichen Kombinationen.
Es ist ein anderes bevorzugtes erfindungsgemäßes Ausführungsbeispiel, eine vorbehandelte genomische DNA in dem erfindungsgemäßen Verfahren für die Bestimmung des Methylierungszustandes einer korrespondierenden genomischen DNA zu verwenden.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein diagnostisches Kit zur Detektion der Methylierung von Cytosin-Basen in genomischen DNA-Proben bereitzustellen, umfassend Reagenzien für die selektive Deaminierung von Cytosin-Basen in genomischer DNA, einen oder mehrere Primer und Nukleotide, markiert mit einem ersten Markertyp, für den Amplifikationsschritt, eine Sonde, markiert mit einem zweiten Markertyp, wobei ein Marker ein Akzeptor-Fluorophor und der andere ein Donor-Fluorophor ist, und optional Protokolle oder Instruktionen für eines der Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche.
Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit spezifischer CpG-Dinukleotide in einem DNA-Fragment unter Verwendung von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET). Dieser kann genutzt werden, um Information über Sequenz-Eigenschaften eines Proben-DNA-Fragments zu erhalten. Zum Beispiel könnte eine Punktmutation in einem Fragment identifiziert werden, wenn ein Nukleotid in dessen Sequenz als Ergebnis dieser Mutation vorliegt, welches im Wildtyp nicht vorliegt.
Das Verfahren wird bevorzugt verwendet, um Cytosin-Methylierung zu messen. Wie oben erwähnt, führt Bisulfit zur selektiven Deaminierung von Cytosin, wobei 5-Methylcytosin im Wesentlichen unverändert bleibt. Die Methylierung von Cytosin tritt nahezu ausschließlich im Sequenz-Kontext 5'-CG-3' auf. Deshalb treten nach der Bisulfit-Behandlung bestimmte Dinukleotide, die C enthalten, in einem Strang nicht mehr auf, sie können jedoch noch immer in dem komplementären Strang auftreten, der bei der Amplifikation von Bisulfit-behandelter DNA, zum Beispiel unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR), gebildet wird.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Visualisierung des Methylierungszustandes eines CpG in definierten Positionen, auf sehr empfindliche Art, mit sehr geringem Hintergrundsignal bereit.
In Kürze geasgt, umfasst das Verfahren die folgenden Schritte

a) Behandeln einer genomischen DNA-Probe auf eine Weise, die geeignet ist, methylierte von unmethylierten Cytosin-Basen zu unterscheiden;
b) Amplifizieren der vorbehandelten DNA unter Verwendung wenigstens eines Oligonukleotid-Primers, einer Polymerase und eines Satzes von Nukleotiden, von welchen wenigstens eines mit einem ersten Markertyp markiert ist;
c) Hybridisieren einer sequenzspezifischen Oligonukleotid- oder einer Oligomer-Sonde an das Amplifikationsprodukt, wobei ein FRET auftritt, wenn die Oligonukleotid- oder Oligomer-Sonde, markiert mit einem zweiten Markertyp, in nächster Nähe zu einem der markierten Nukleotide bindet, welches in das Amplifikationsprodukt inkorporiert wurde;
d) Bestimmen des Methylierungsgrades der Probe durch Messen des Grades der Wechselwirkung zwischen dem genannten ersten und zweiten Markertyp.

In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel ist der erste Markertyp ein Donor-Fluorophor und der zweite Markertyp ein Akzeptor-Fluorophor und es wird das Ausmaß des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) gemessen.
In einem weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel ist der genannte erste Markertyp ein Akzeptor-Fluorophor und der zweite Markertyp eine Donor-Fluorophor und es wird das Ausmaß des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) gemessen.
Es ist bevorzugt, dass zwei oder mehr CpGs getrennt in einer Amplifikationsreaktion abgefragt werden.
Bevorzugt werden separate Sonden für jedes CpG verwendet, jede mit ihrer eigenen Fluoreszenzmarkierung.
Die gegenwärtige Erfindung ermöglicht auch, dass durch eine Multiplex-PCR schnell optimale Assay-Parameter bestimmt werden, und ein schnelles, kosteneffektives und genaues System zur quantitativen Analyse von Target-Analyten. Ein Multiplex-Assay kann beispielsweise in einem 96-Well-Mikrotiterplatten-Standard-Format bei Raumtemperatur unter Verwendung konventioneller Robotikysteme für die Probenzuführung und -Herstellung angelegt werden.
Bevorzugt umfassen die verwendeten Oligonukleotid- oder Oligomer-Sonden ein oder mehrere Nukleotid-Analoga, die aus einem Nukleobasen-Analogon, einem 2'-Deoxyribose-Analogon, einem Internukleotid-Analogon, PNA oder LNA ausgewählt sind.
Die bevorzugte Anwendung ist es, den Methylierungszustand bestimmter CpG-Positionen zu bestimmen, durch Bestimmen des Grades der Wechselwirkung zwischen einem nicht umgewandelten C in der Bisulfit-behandelten DNA und einem daran hybridisierten markierten Oligonukleotid. Dementsprechend kann Guanin im komplementären Strang (nach PCR) für den gleichen Zweck verwendet werden.
Es können auch die umgesetzten Positionen nach der Bisulfit-Behandlung durch Detektieren von Thymin (oder Adenin in dem komplementären Strang) an ausgewählten Positionen unter Verwendung dieser Technologie identifiziert werden. Jedoch wird das Design der Sonden schwieriger, weil es nicht möglich ist zu unterscheiden zwischen T, das in der genomischen Original-Sequenz war, und T-Positionen, die durch Bisulfit-Umsetzung erzeugt wurden, was das Nichtvorhandensein von Methylierung an den entsprechenden Cytosinen anzeigt.
Detaillierter beschrieben ist dieses Verfahren zur Detektion spezifischer Nukleotide in einer DNA-Probe dadurch gekennzeichnet, dass eine isolierte genomische DNA-Probe in einer Art behandelt wird, die geeignet ist, zwischen methylierten und unmethylierten Cytosin-Basen zu unterscheiden, und dass die vorbehandelte DNA unter Verwendung wenigstens eines Oligonukleotid-Primers, einer Polymerase und einem Satz von Nukleotiden amplifiziert wird, von denen wenigstens eines mit einem ersten Markertyp markiert ist, in einem ersten Ausführungsbeispiel einem Donor-Fluorophor und in einem zweiten Ausführungsbeispiel einem Akzeptor-Fluorophor.
Bevorzugt sind die Akzeptor- und Donor-Farbstoffe (Fluorophore) derart ausgewählt, dass die Emissionswellenlänge des Donor-Farbstoffs mit der Anregungswellenlänge des Akzeptor-Farbstoffs überlappt. Es ist bevorzugt, dass die Emissions- und Anregungsspektren scharfe Peaks sind und dass es unwahrscheinlich ist, dass die Emissionsspektren der Farbstoffe überlappen.
Es ist bevorzugt, dass die Polymerase keine 5'-3'-Exonukleaseaktivität besitzt, um den Abbau der Sonde zu verhindern.
Zum Beispiel wird dGTP mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert. Das markierte dGTP wird nur dort inkorporiert, wo sich ein methyliertes Cytosin in der Original-DNA-Probe befand. Alternativ kann das dCTP mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert sein.
Nach der Extensions-Phase wird die DNA denaturiert und man lässt sie dann hybridisieren.
Eine sequenzspezifische Oligonukleotid- oder Oligomer-Sonde (als Oligomer-Sonden bezeichnet, wenn DNA-Analoga wie PNA verwendet werden), markiert mit einem zweiten Markertyp, der in einem ersten Ausführungsbeispiel ein Akzeptor-Fluorophor und in einem zweiten Ausführungsbeispiel ein Donor-Fluorophor ist, hybridisiert an das Amplifikationsprodukt. Bevorzugt ist die Amplifikation vom 3'-Ende der Sonde durch Phosphorylierung (mit Didesoxynukleotiden) blockiert.
Die Marker werden in die Oligonukleotid-Sonden bevorzugt durch enzymatische Standardverfahren eingeführt, wie die Verwendung von 5'-markierten Amplifikations-Primern für die 5'-Markierung, oder Fluoreszenz-markierten Basen-Analoga für internes Markieren.
Eine FRET-Reaktion tritt auf, wenn das Fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid, in einem Ausführungsbeispiel bevorzugt ein Fluoreszenz-Anteil, in nächster Nähe zu einem Nukleotid bindet, das mit einem Quencher-Anteil markiert ist, welches in das Amplifikationsprodukt inkorporiert wurde, oder in einem anderen Ausführungsbeispiel ein Quencher-Anteil, in nächster Nähe zu einem Nukleotid bindet, das mit einem Fluoreszenz-Anteil markiert ist, welches in das Amplifikationsprodukt inkorporiert wurde (1).
Es ist bevorzugt, dass die Sonde an verschiedenen Stellen in Bezug auf das CpG positioniert wird. Die Konformation der DNA steuert den Abstand der zwei Fluoreszenz-Farbstoffe. Bevorzugt wird die Positionierung für jedes CpG optimiert.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Sonde von den Amplifikations-Primern getrennt, oder sie ist alternativ an das 5'-Ende eines der Primer gebunden.
Auf diese Weise kann der Methylierungsgrad bestimmt werden, indem die CG-Dinukleotide identifiziert werden. Wenn statt dessen ein TG-Dinukleotid vorliegt, wird kein FRET beobachtet. Deshalb kann dieses Verfahren direkt verwendet werden, um DNA-Methylierung zu überwachen (2).
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel wird eine Echtzeit-Überwachung des FRET-Signals während der Amplifikationsreaktion durchgeführt. Auf diese Weise kann der Fortgang der Amplifikation untersucht werden (3). Sehr bevorzugt ist die Amplifikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion (PCR), obwohl andere Amplifikationsverfahren, zum Beispiel Klonieren oder SDA ("Strand Displacement Amplification") auch bevorzugt sind.
In einem anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel wird die Änderung der Fluoreszenz-Intensität am Endpunkt der Target-Amplifikation überwacht. Endpunkt-Analyse der PCR bedingt eine Fluoreszenz-Farbstoff-Signalmessung, wenn das thermische Zyklisieren und die Amplifikation abgeschlossen sind. Die Ergebnisse werden in Form der Änderung der Fluoreszenz, d. h. Fluoreszenz-Intensitäts-Einheiten, des Signals des Fluoreszenz-Farbstoffs vom Beginn bis zum Ende der thermischen Zyklisierung der PCR angegeben, bevorzugt abzüglich jeglicher interner Steuersignale.
Es ist auch bevorzugt, dass eine Schmelzkurve am Ende der PCR erzeugt wird, um zusätzliche Daten zu sammeln.
In einem anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel tritt das CpG-Dinukleotid nur einmal in dem Amplifikationsprodukt auf. Wie oben umrissen ist das sehr hilfreich, wenn die Anwesenheit des FRET-Signals direkt verwendet wird, um daraus Schlussfolgerungen in Bezug auf die Sequenzcharakteristika der Proben-DNA zu ziehen.
Wenn beispielsweise nur ein markiertes CG in einem Amplifikationsprodukt einer Bisulfit-behandelten Probe vorliegt und eine Fluoreszenz-markierte Sonde in nächster Nähe zu diesem bindet, tritt eine FRET und es können direkt Schlussfolgerungen gezogen werden, dass ein methyliertes Cytosin in einer bestimmten Position in der genomischen DNA-Probe vorlag.
Wenn zum Beispiel mehrere markierte CGs in einem Amplifikationsprodukt einer Bisulfit-behandelten Probe vorliegen und Sonden in nächster Nähe zu diesen binden, jede mit ihrer eigenen Fluoreszenzmarkierung, treten mehrere FRET-Reaktionen auf und es können Schlussfolgerungen gezogen werden über die methylierten Cytosine aller involvierten Stellen.
In einem weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel wird die Methylierungsinformation mittels der Änderung der Fluoreszenz-Intensität während nachfolgender PCR-Zyklen bestimmt.
Bevorzugt wird die Probe während der Amplifikationsreaktion mit Licht geeigneter Wellenlänge beleuchtet.
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel werden vor der PCR entweder im Wesentlichen alle Cytosine in der DNA-Probe selektiv deaminiert, aber die 5-Methylcytosine verbleiben im Wesentlichen unverändert, oder es werden im Wesentlichen alle 5-Methylcytosine in der DNA-Probe selektiv deaminiert, aber die Cytosine verbleiben im Wesentlichen unverändert. Cytosin-Guanin(CpG)-Dinukleotide werden detektiert, wodurch Schlussfolgerungen ermöglicht werden über den Methylierungszustand der Cytosine in den genannten CpG-Dinukleotiden in der genannten DNA-Probe. Diese Deaminierung wird bevorzugt unter Verwendung eines Bisulfit-Reagenz durchgeführt.
Bevorzugt wird die Proben-DNA nur durch ausgewählte PCR-Primer amplifiziert, wenn ein bestimmter Methylierungszustand an einer bestimmten Stelle in der Proben-DNA vorliegt, deren Sequenzkontext im Wesentlichen komplementär zu einem oder mehreren der genannten, ausgewählten PCR-Primer ist. Das kann unter Verwendung von Primern geschehen, die selektiv an Bisulfit-behandelte DNA hybridisieren, welche in einer bestimmten Position entweder ein TG oder ein CG enthält, in Abhängigkeit vom Methylierungszustand in der genomischen DNA. Es können Primer für beide Fälle aufgebaut werden. Ein Primer könnte ein G an seinem 3'-Ende enthalten, weshalb er nur an eine DNA binden würde, die ein C an der entsprechenden Position enthält, und deshalb wird dieser Primer nur oder bevorzugt methylierte DNA amplifizieren, weil das C nach Bisulfit-Behandlung Indikativ für eine Methylierung in dieser Position ist. Dieses Verfahren ist als MSP, methylierungssensitive PCR, bekannt.
In einem anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel wird die DNA nur amplifiziert, wenn ein bestimmter Methylierungszustand an einer spezifischen Stelle in der Proben-DNA vorliegt, deren Sequenzkontext im Wesentlichen komplementär ist zu einem oder mehreren Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren, welche zusätzlich bei der PCR-Reaktion verwendet werden. Diese Oligonukleotide oder PNA-Oligomere binden selektiv an die Templat-DNA und verhindern deren Amplifikation in Abhängigkeit vom Methylierungszustand der DNA vor der Bisulfit-Umsetzung.
Bevorzugt ist der Fluoreszenz-Anteil ein Fluorescein-Farbstoff, ein Rhodamin-Farbstoff oder ein Cyanin-Farbstoff und der Quencher-Anteil ein Rhodamin-Farbstoff.
In einer anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Variante wird die DNA-Probe vor der Deaminierungs-(zum Beispiel Bisulfit-)-behandlung mit Restriktionsendonukleasen gespalten.
Bevorzugt ist auch ein Verfahren, wobei die enzymatische Amplifikation der DNA derart ist, dass nur ein Strang der DNA-Probe amplifiziert wird.
Bevorzugt wird die DNA-Probe aus Säugetier-Quellen isoliert, zum Beispiel Zell-Linien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, in Paraffin eingebettetem Gewebe, zum Beispiel Augengewebe, Darm, Niere, Gehirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Schnitten und allen möglichen Kombinationen.
Ein anderes erfindungsgemäßes Ausführungsbeispiel ist ein diagnostisches Kit für die Detektion der Methylierung von Cytosin-Basen in genomischen DNA-Proben, umfassend Reagenzien für die selektive Deaminierung von Cytosin-Basen in genomischer DNA, einen oder mehrere Primer, markiert mit einem ersten Markertyp, und Fluoreszenz-markierte Nukleotide, markiert mit einem zweiten Markertyp, wobei ein Marker ein Akzeptor-Fluorophor und der andere Typ ein Donor-Fluorophor ist, für den Amplifikationsschritt, und optional Protokolle oder Instruktionen für eines der Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche.
Dieses Kit kann auch mehrere zusätzliche Gegenstände umfassen, zum Beispiel detektierbare Sonden.
Als ein Beispiel könnten die Komponenten des genannten Kits Behälter für Folgende in ausreichender Menge, zur Durchführung des Verfahrens, enthalten:

1) Reagenzien für die Bisulfit-Umsetzung der Proben-DNA.
2) Reagenzien für die Amplifikation der umgesetzten Probe und Inkorporation von Fluorophor-markierten Nukleotiden, einschließend: a) Nukleinsäure-Primer und b) geeignete Mischung nicht markierter und Fluorophor-markierter Nukleotide und c) DNA-Polymerase, die imstande ist, die Fluorophormarkierten Nukleotide zu inkorporieren
3) Gebrauchsanweisungen

Der Begriff 'Gebrauchsanweisungen' soll konkrete Anweisungen erfassen, welcher die Reagenz-Konzentrationen für das Assay-Verfahren, Parameter wie die relativen Mengen von zu kombinierenden Reagenzien, Haltbarkeiten für Reagenzien/Proben-Mischungen, Temperatur, Pufferbedingungen und dergleichen beschreiben.
Im Folgenden werden Schritte bevorzugter erfindungsgemäßer Ausführungsbeispiele detaillierter beschrieben.
DNA-Isolierung
Die genomische DNA-Probe muss aus Gewebe oder zellulären Quellen isoliert werden. Bei Säugetieren, stärker bevorzugt Menschen, kann die DNA-Probe von jedem Gewebe genommen werden, von dem man erwartet, das es die Target-Stelle innerhalb des Genoms exprimiert, auch aus solchen wie Zell-Linien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Cerebrospi nalflüssigkeit, in Paraffin eingebettetem Gewebe; Gewebe des Darms, der Niere, des Gehirns, des Herzens, der Prostata, der Lunge, der Brust oder Leber, histologischen Schnitten, ist aber nicht auf jene begrenzt. Die Extraktion kann mit Mitteln geschehen, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind, diese schließen die Verwendung von detergenten Lysaten, Schallbehandlung und Vortexing mit Glasperlen ein. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert worden sind, wird die genomische, doppelsträngige DNA für die Analyse verwendet.
Bisulfit-Behandlung
Die Proben-DNA wird dann chemisch behandelt, um die unmethylierten Cytosin-Basen in Uracil zu überführen. Die chemische Modifikation kann zum Beispiel mittels einer Bisulfit-Lösung geschehen (ist aber nicht darauf beschränkt). Die genannte chemische Umwandlung kann in jedem Format stattfinden, das im Stand der Technik üblich ist. Das schließt die Modifikation innerhalb von Agarose-Gel oder in denaturierenden Lösemitteln ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
Dort wo die chemische Modifikation in Form einer Bisulfit-Behandlung der DNA geschieht, können sich die folgenden Schritte anschließen.
Die doppelsträngige DNA muss denaturiert werden. Das kann in Form einer Hitze-Denaturierung geschehen, die bei variablen Temperaturen durchgeführt wird. Bei DNA mit hohem Molekulargewicht ist die Denaturierungstemperatur gewöhnlich größer als 90°C. Jedoch kann die Analyse an kleineren Fragmenten geschehen, die keine derart hohen Temperaturen erfordern. Zusätzlich sinkt die Komplementarität zwischen den Strängen, wenn die Reaktion fortschreitet und die Cytosin-Reste in Uracil überführt werden. Deshalb kann ein zyklisches Denaturierungs-Protokoll aus variablen Denaturierungs-Temperaturen bestehen.
Die Bisulfit-Umwandlung besteht dann aus zwei wichtigen Schritten, der Sulfonierung des Cytosins und der anschließenden Deaminierung. Die Gleichgewichte der Reaktion sind für jede Stufe der Reaktion bei zwei verschiedenen Temperaturen auf der jeweils richtigen Seite. Wenn man die Kinetik der Reaktionen berücksichtigt, ist es bevorzugt, dass die Reaktion unter zyklischen Bedingungen, mit wechselnden Temperaturen, abläuft. Die Temperaturen mit welcher und die Dauer für welche jede Stufe durchgeführt wird, kann gemäß der spezifischen Erfordernisse der Situation variiert werden. Jedoch umfasst eine bevorzugte Variante des Verfahrens eine Änderung der Temperatur von 4°C (10 Minuten) auf 50°C (20 Minuten). Diese Form der Bisulfit-Behandlung ist Stand der Technik unter Bezugnahme auf WO 99/28498.
Die genannte chemische Umwandlung kann in jedem Format geschehen, das im Stand der Technik üblich ist. Das schließt die Modifikation innerhalb von Agarose-Gel, in denaturierenden Lösemitteln oder innerhalb von Kapillaren ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Die Bisulfit-Umsetzung in Agarose-Gel ist Stand der Technik und ist beschrieben worden von Olek et al., Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064–5066. Das DNA-Fragment wird in Agarose-Gel eingebettet und die Überführung von Cytosin in Uracil findet mit Hydrogensulfit und einem Radikalfänger statt. Die DNA kann dann amplifiziert werden, ohne dass weitere Reinigungsschritte erforderlich sind.
In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die Umsetzung der DNA ohne eine Agarose-Matrix stattfinden. Die DNA kann bei erhöhten Temperaturen mit Hydrogen sulfit und einem Radikalfänger inkubiert werden. Die genannte Reaktion findet in einem organischen denaturierenden Lösemittel statt. Beispiele denaturierender Lösemittel schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Polyethylenglycoldialkyl-polyethylenglycol-dialkylether, Dioxan und substituierte Derivate, Harnstoff oder Derivate, Acetonitril, primäre Alkohole, sekundäre Alkohole, tertiäre Alkohole, DMSO oder THF.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird die DNA-Probe vor der chemischen Behandlung in eine beheizbare Kapillare überführt, die für kleine Moleküle durchlässig ist. Die Reaktionsschritte der chemischen Modifizierung können dann in den Kapillarröhrchen durchgeführt werden mittels Zugabe und Entfernen von Reagenzien durch verbundene Kapillaren.
Im Anschluss an die chemische Behandlung können die zwei Stränge der DNA nicht länger komplementär sein.
Amplifikation und Inkorporation markierter Nukleotide Fraktionen der derart behandelten genomischen DNA werden dann unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern enzymatisch amplifiziert. Die Länge und das Design der genannten Primer kann spezifisch sein für den zu analysierenden Bereich des Genoms. Entsprechend ist eine große Auswahl von Primern für die Verwendung in diesem Verfahren geeignet. Ein solches Primer-Design gehört zum Stand der Technik.
Eine geeignete Fraktion der Nukleotide, die bei der Amplifikationsreaktion vorliegen, zum Beispiel die G-Nukleotide, werden entweder mit einem ersten oder zweiten Markertyp markiert, wobei der erste Typ ein Fluorophor ist und der zweite Typ ein Quencher ist, oder umgekehrt. Akzeptable Fluorophore zur Markierung der Nukleotide sind einem Durchschnittsfachmann wohlbekannt und schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Fluoreszein, Rhodamin, Cyanin, Phycoerythrin, Cy 5, Cy 5.5, Cy 7, LC Red 640 oder LC Red 705, wohingegen die akzeptablen Quencher Rhodamin-Farbstoffe sind. Die Verknüpfung dieser Farbstoffe mit den Nukleotiden gehört zum Stand der Technik.
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel wird die Probe während der Amplifikationsreaktion mit Licht geeigneter Wellenlänge beleuchtet.
Das Können der Erfindung liegt in der Interpretation eines FRET-Signals während Zuständen, wo eine sequenzspezifische Oligonukleotid-Sonde an ein Amplifikationsprodukt hybridisiert wird und ein FRET-Signal auftritt, wenn das Fluoreszenz-markierte Oligonukleotid in nächster Nähe zu einem der markierten Nukleotide bindet, die in das Amplifikationsprodukt inkorporiert wurden, um Kenntnisse über den Methylierungszustand der Probe zu erlangen.
Fortgeschrittene Datenverarbeitung Es wird erwartet, dass das Verfahren für die Analyse genomischer DNA-Proben mit hohem Durchsatz verwendet werden wird. Deshalb schließt die Erfindung auch die Analyse von Daten unter Verwendung einer Computervorrichtung ein. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die genannte Vorrichtung eine oder mehrere Datenbanken umfassen. In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die genannte Vorrichtung einen oder mehrere lernende Algorithmen umfassen.
Beschreibung der Zeichnungen
1
Legende:

1:

Bisulfit-Behandlung

2:

Inkorporation von markiertem Nukleotid

3:

Detektion des Targets mittels FRET

4:

Echtzeit-PCR

DNA, aus einem Gewebe extrahiert, wird mit Natriumbisulfit behandelt (A). In die Bisulfit-behandelte DNA (Einzelstrang (B)) werden dGTPs inkorporiert (C+D), welche mit einem Fluoreszenz-Farbstoff während einer Echtzeit-PCR markiert sind. Es tritt ein FRET auf, wenn das Fluorezenz-markierte Oligonukleotid in nächster Nähe zu einem der markierten Nukleotide bindet, das in das Amplifikationsprodukt inkorporiert wurde (E).
2
Legende:

I.

Bisulfit-Behandlung

2.

PCR mit markiertem dGTP

3.

Primer-Extension

4.

Denaturierung

5.

Annealing und Fluoreszenz-Überwachung

6.

Weitere Zyklen

Interessierende DNA wird chemisch behandelt, wobei die einzigen in der Sequenz verbleibenden Cytosine diejenigen sind, die in der Original-Probe methyliert waren. PCR-Primer, die gestaltet wurden um auf einen der DNA-Stränge abzuzielen, hybridisieren an das Templat und verlängern es durch Inkorporieren markierter Nukleotide (dGTP). Das markierte dGTP wird nur dort inkorporiert, wo ein methyliertes Cytosin in der Original-DNA-Probe vorlag. Nach der Extensionsphase wird die DNA denaturiert, man lässt sie renaturieren und es wird die Fluoreszenz überwacht. Mit jedem PCR-Durchlauf akkumulieren mehr Targets, die komplementär zur Sonde sind. Das Ausmaß der von der Sonde emittierten Fluoreszenz wird gemessen.
3
Legende:

1.

PCR mit nicht markiertem dCTP, dATP, dTTP und mar kiertem dGTP

2.

Hybridisieren von Fluoreszenz-markiertem, genspezifi schem Oligonukleotid

3.

FRET, Echtzeit-Fluoreszenz-Detektion

Es wird eine PCR mit Primern durchgeführt, die auf einen der DNA-Stränge abzielen. Der erste Primer hybridisiert an das Templat und verlängert es durch Inkorporieren der geeigneten Nukleotide. Eines der Nukleotide, in diesem Fall dGTP, ist mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert. Eine sequenzspezifische Oligonukleotid-Sonde hybridisiert an die interessierende Stelle. Wenn das markierte Guanin vorliegt, tritt eine FRET-Reaktion ein. Die von dem Guanin emittierte Energie wird auf den Marker der Sonde übertragen. Die von der Sonde emittierte Energie wird mittels Echtzeit-Fluoreszenz-Detektion detektiert. SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Detektion der Cytosin-Methylierung in einer DNA-Probe, die folgenden Schritte umfassend: a) eine genomische DNA wird derart chemisch behandelt, dass unmethylierte Cytosine in Uracil überführt werden; b) die vorbehandelte DNA wird amplifiziert unter Verwendung von wenigstens einem Oligonukleotid-Primer, einer Polymerase und einem Satz von Nukleotiden, von denen wenigstens eines mit einem ersten Markertyp markiert ist; c) eine sequenzspezifische Oligonukleotid- oder Oligomer-Sonde wird mit dem Amplifikationsprodukt hybridisiert und ein FRET findet statt, wenn die Oligonukleotid- oder Oligomer-Sonde, markiert mit einem zweiten Markertyp, in nächster Nähe zu einem der markierten Nukleotide gebunden wird, das in das Amplifikationsprodukt inkorporiert wurde; d) der Methylierungsgrad der Probe wird bestimmt durch den Grad der Wechselwirkung zwischen dem genannten ersten und zweiten Markertyp.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Markertyp ein Donor-Fluorophor ist und der zweite Markertyp ein Akzeptor-Fluorophor ist, und dass das Ausmaß des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) gemessen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Markertyp ein Akzeptor-Fluorophor ist und der zweite Markertyp ein Donor-Fluorophor ist, und dass das Ausmaß des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) gemessen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotide aus Schritt b) einen Fluoreszenz-Anteil besitzen und die Sonde in Schritt c) einen Quencher-Anteil besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotide aus Schritt b) einen Quencher-Anteil besitzen und die Sonde in Schritt c) einen Fluoreszenz-Anteil besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase keine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität besitzt, um einen Abbau der Sonde zu verhindern.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Änderung der Fluoreszenz-Intensität während der Amplifikationsreaktion in Echtzeit überwacht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Änderung der Fluoreszenz-Intensität am Endpunkt der Target-Amplifikation überwacht wird.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikations-Reaktion mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde nur ein CpG enthält.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde mehrere CpGs enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass jede Sonde für jedes CpG eine Fluoreszenzmarkierung besitzt.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde endmarkiert oder intern markiert sein kann.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylierungsinformation mittels der Änderung der Fluoreszenz-Intensität während nachfolgender PCR-Zyklen bestimmt wird.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-DNA nur durch ausgewählte PCR-Primer amplifiziert wird, wenn ein bestimmter Methylierungszustand an einer spezifischen Stelle in der Proben-DNA vorliegt.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-DNA nur amplifiziert wird, wenn ein bestimmter Methylierungszustand an einer spezifischen Stelle in der Proben-DNA vorgelegen hat, dessen Sequenzkontext im wesentlichen komplementär ist zu einem oder mehreren Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren, die zusätzlich bei der PCR-Reaktion verwendet werden.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation vom 3'-Ende der Sonde mittels Phosphorylierung blockiert ist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Schmelzkurve am Ende der PCR erzeugt wird, um zusätzliche Daten zu sammeln.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Fluoreszenz-Anteil ein Fluorescein-Farbstoff, ein Rhodamin-Farbstoff oder ein Cyanin-Farbstoff ist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Quencher-Anteil ein Rhodamin-Farbstoff ist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die chemische Behandlung der DNA mit einem Bisulfit-Reagenz durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die DNA-Probe vor der Deaminierungsbehandlung mit Restriktionsendonukleasen gespalten wird.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die DNA-Probe isoliert ist aus Säugetier-Quellen, z. B. Zell-Linien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, zum Beispiel Augengewebe, Darm, Niere, Gehirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Schnitten und allen möglichen Kombinationen.
Diagnostisches Kit für die Detektion der Methylierung von Cytosin-Basen in genomischen DNA-Proben, umfassend Reagenzien für die selektive Deaminierung von Cytosin-Basen in genomischer DNA, einen oder mehrere Primer und Nukleotide für den Amplifikationsschritt, markiert mit einem ersten Markertyp, eine Sonde, markiert mit einem zweiten Markertyp, wobei ein Marker ein Akzeptor-Fluorophor und der andere Typ ein Donor-Fluorophor ist, und optional Protokolle oder Instruktionen für eines der Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche.