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Bereich der
Erfindung
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Brustkrebs ist augenblicklich der
zweithäufigste
Typ von Krebs bei Frauen. Im Jahr 2001 wurden über 190.000 neue Fälle von
invasivem Brustkrebs und über
47.000 weitere Fälle
von in situ-Brustkrebs diagnostiziert. Das Auftreten und die Todesrate
nimmt mit dem Alter zu, für
die Zeitdauer 1994–1998
war das Auftreten von Brustkrebs unter Frauen im Alter zwischen
20 und 24 nur 1,5 pro 100.000 Einwohner. Das Risiko steigt jedoch
bis zu 498,7 innerhalb der Altersgruppe von 75–79 an. Die Mortalitätsraten
nahmen um ungefähr
5% über
das letzte Jahrzehnt hinweg ab und Faktoren, die die 5-Jahres-Überlebensraten
beeinflussen, schließen Alter,
Phase des Krebs, sozioökonomische
Faktoren und Rasse ein.
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Brustkrebs wird definiert als die
unkontrollierte Zellteilung von Zellen innerhalb der Brustgewebe.
Die Brüste
bestehen aus 15 bis 20 Lappen, die miteinander durch Gänge verbünden sind.
Krebs entsteht am häufigsten
in einem Gang, wird jedoch auch in den Lappen gefunden, wobei der
seltenste Typ von Krebs entzündlicher
Brustkrebs genannt wird.
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Es wird dem Fachmann ersichtlich
sein, daß ein
ständiger
Bedarf besteht, die Verfahren des frühen Nachweises, der Klassifikation
und Behandlung von Brustkrebs zu verbessern. Im Unterschied zum
Nachweis von einigen anderen verbreiteten Krebsarten, wie zum Beispiel
Cervix- und Hautkrebs, bestehen inhärente Schwierigkeiten bei der
Klassifizierung und dem Nachweis von Brustkrebs.
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Der erste Schritt jeder Behandlung
ist die Ermittlung des Zustands des Patienten im Vergleich zu definierten
Klassifikationen der Erkrankung. Der Wert eines solchen Systems
hängt jedoch
inhärent
von der Qualität
der Klassifizierung ab. Brustkrebs wird gemäß seiner Größe, seiner Lokalisierung und
des Auftretens von Metastasen eingestuft. Verfahren der Behandlung schließen die
Anwendung von Chirurgie, Bestrahlungstherapie und Hormontherapie
ein, die auch als Anschlußtherapien
an die Chirurgie angewendet werden.
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Prädiktoren, die bei der Beurteilung
von Brusttumoren verwendet werden (z. B. histologische Analyse, Östrogen-Rezeptor-Marker)
versagen oftmals, die Tumorentwicklung und das Verhalten richtig
vorherzusagen oder zu klassifizieren. Daher ist die Antwort des
Patienten auf die Behandlung und die Vorhersage des insgesamten
Ausgangs oft nicht genau möglich.
Die kontinuierliche Entwicklung von Brustkrebsanalysetechniken ist im
Augenblick auf die Untersuchung molekular biologischer Marker fokussiert.
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Die Entwicklung von molekularbiologischen
Markern als eine Alternative zu herkömmlicher histologisch-pathologischer
Analyse hat sich heutzutage auf die Analyse von „single nucleotide polymorphismen"
und einzelnen Genen fokussiert, wie zum Beispiel BRCA1 und BRCA2.
Weiterhin wurden zusätzlich
zu der Onkogenmutationen-Genamplifikation der Verlust der Heterozygotizität in invasivem
Brustkrebs (Callahan, et al., 1992; Cheickh, et al., 1992; Chen,
et al., 1992; und Lippman, et al., 1990) ebenfalls untersucht. Kürzlich hat die
Verwendung der Mikroarray-Technologie die gleichzeitige Analyse
von vielen Genen, sowie das genetische Expressions-Profiling durch
Analyse von RNA und Proteinen ermöglicht. Die Analyse von multiplen
Loci, um das Brustkrebsrisiko in Populationen vorherzusagen, wurden
durch Pharoah et. al.. „Polygenic
susceptibility to breast cancer and implications for prevention"
Nat Genet. Mai 2002, 31(1):33–6
diskutiert. Weiterhin verwendeten Friend et. al. („Gene expression
profiling predicts clinical outcome of breast cancer" Nature 415,
530 – 536
(2002)) das Genexpressions-Profiling, um den Ausgang der Behandlung
bei Brustkrebspatienten vorherzusagen, wobei deren Verfahren dazu
verwendet werden können,
um verbesserte post-Chirurgie-Behandlungsentscheidungen
zu ermöglichen.
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Jedoch, da erblicher Brustkrebs nur
für 5%
bis 10% der Fälle
verantwortlich ist, ist es möglich,
daß epigenetische
Mechanismen, sowie vererbliche Mutationen und Umweltfaktoren, die
Entwicklung von Brustkrebs beeinflussen.
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Die Niveaus der Beobachtung, die
durch die methodologischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie
untersucht wurden, sind die Gene selber, die Translation dieser
Gene in RNA und die daraus resultierenden Proteine. Die Frage, welches
Gen zu welchem Zeitpunkt im Verlauf der Entwicklung eines Individuums
angeschaltet wird, und wie die Aktivierung und Inhibierung von spezifischen
Genen in spezifischen Zellen und Geweben kontrolliert werden, ist
mit dem Ausmaß und
Charakter der Methylierung des Gens oder des Genoms korrelierbar.
In dieser Hinsicht können
sich pathogene Zustände
in einem veränderten
Methylierungsmuster von individuellen Genen oder des Genoms manifestieren.
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Die DNA-Methylierung spielt beispielsweise
eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischem
Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als
Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse.
5-Methylcytosin-Positionen
können
jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin
das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist, wie Cytosin. Darüber hinaus
geht bei einer PCR-Amplifikation die vom 5-Methylcytosin getragene
epigenetische Information vollständig
verloren.
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Eine relativ neue und die mittlerweile
am häufigsten
angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin
beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das
nach anschließender
alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem
Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin
wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird
die ursprüngliche
DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin,
welches ursprünglich
durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden
werden konnte, jetzt durch „normale"
molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin,
beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung,
nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung,
welche jetzt voll ausgenutzt werden kann. Der Stand der Technik,
was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert,
welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch
die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur mit
einzelsträngiger
DNA) verhindert und alle Fällungs-
und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald
J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based
cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064–6). Mit
dieser Methode können
einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode
veranschaulicht. Allerdings werden gegenwärtig nur einzelne Regionen
bis etwa 3000 Basenpaare Länge
untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausende von
möglichen
Methylierungsereignisse ist nicht möglich. Allerdings kann auch
dieses Verfahren kei ne sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen
zuverlässig
analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix
verloren.
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Eine Übersicht über die weiteren bekannten
Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin kann dem folgenden Übersichtsartikel
entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic
Acids Res. 1998, 26, 2255.
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Die Bisulfit-Technik wird bisher
bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler
W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman
and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences
at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar–Apr;5(2):94–8) nur in
der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines
bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder
komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny
of the H19 methylation imprint. 1997 Nr.v;17(3):275–6) oder
einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion"
(Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences
at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide
primer extension (Ms-SNuPE) Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529–31, WO
95/00669) oder durch enzymatischen Verdau (Xiong Z, Laird PW. COBRA:
a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids
Res. 1997 Jun 15;25(12):2532–4)
nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben
worden (Olek et al., WO 99/28498).
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Weitere Publikationen, die sich mit
der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei
einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine
residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431–6, 431;
Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler
W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation
patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined
by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387–95; Feil
R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on
individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic
sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695–6; Martin
V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing
indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region
of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines.
Gene. 1995 May 19;157(1–2):261–4; WO 97/46705,
WO 95/15373 und WO 95/15373.
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Eine Übersicht über den Stand der Technik in
der Oligomer Array Herstellung läßt sich
aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics
(Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort
zitierten Literatur entnehmen.
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Für
die Abtastung immobilisierter DNA-Arrays werden vielfach fluoreszenzmarkierte
Sonden verwendet. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist
das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der
jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten
Sonden kann beispielsweise über
ein Konfokalmikroskop erfolgen. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind,
neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
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Matrix-unterstützte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie
(MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse
von Biomolekülen
(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins
with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988
Oct 15;60(20):2299–301).
Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch
einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert
in die Gasphase befördert.
Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird
die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt
die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen
Massen werden die Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere
Ionen erreichen den Detektor früher
als größere.
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MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich
ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse
von Nukleinsäuren
ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations
and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit
etwa 100 mal schlechter als für
Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die
ein vielfach negativ geladenes Rückgrat
haben, ist der Ionisationsprozeß durch
die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie
spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption
von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden,
die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Mittlerweile gibt es
einige ansprechende Matrizes für
DNA, der Empfindlichkeitsunterschied wurde jedoch nicht verringert.
Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die
DNA chemisch so modifiziert wird, daß sie einem Peptid ähnlicher
wird. Phospho rothioatnukleinsäuren,
bei denen die gewöhnlichen
Phosphate des Rückgrats
durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache
Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG,
Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by
mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367–73). Die
Kopplung eines „charge
tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der
Empfindlichkeit auf das gleiche Niveau, wie es für Peptide gefunden wird. Ein
weiterer Vorteil von „charge tagging"
ist die erhöhte
Stabilität
der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter
Substrate stark erschweren.
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Genomische DNA wird von der DNA von
zellulären,
Gewebe- oder anderen Testproben unter der Verwendung von Standardverfahren
erhalten. Diese Standard-Methodologie kann in Literaturstellen,
wie zum Beispiel Fritsch and Maniatis eds.; Molecular Clonin: A
Laboratory Manual, 1989 gefunden werden.
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Beschreibung
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Die Erfindung stellt ein Verfahren
und Nukleinsäuren
zur Analyse von biologischen Proben auf Merkmale zur Verfügung, die
mit der Entwicklung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen
assoziiert sind. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure von
mindestens einem Mitglied der Gene gemäß Tabelle 1 mit einem Reagenz
oder Serien von Reagenzien in Kontakt gebracht wird/werden, die
in der Lage sind zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG-Dinukleotiden
innerhalb der genomischen Sequenz von Interesse zu unterscheiden.
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Die vorliegende Erfindung stellt
ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern
von genomischer DNA zur Verfügung.
Das Verfahren ist bei der verbesserten Diagnose, Behandlung und
der Überwachung
von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen brauchbar, zum Beispiel
durch Ermöglichen
der verbesserten Identifizierung von und Differenzierung zwischen
Klassen der Erkrankung und der genetischen Prädisposition für diese
Erkrankungen. Die Erfindung stellt Verbesserungen über den
Stand der Technik zur Verfügung,
indem sie eine hochspezifische Klassifizierung von proliferativen
Erkrankungen von Brustzellen ermöglicht,
wodurch ein verbesserte und sachkundige Behandlung von Patienten
ermöglicht
wird.
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Weiterhin ermöglicht das Verfahren die Analyse
von Cytosinmethylierungen und Single Nucleotide Polymorphismen.
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Die Gene, die die Basis der vorliegenden
Erfindung bilden, werden bevorzugterweise dazu verwendet, einen „Gen-Panel"
zu bilden, d.h. eine Sammlung, die die genannten genetischen Sequenzen
der Erfindung und/oder deren jeweilige informative Methylierungsstellen
umfaßt.
Die Bildung von solchen Gen-Panels erlaubt eine schnelle und spezifische
Analyse von spezifischen Aspekten von Brustkrebs. Die wie in dieser
Erfindung beschriebenen und verwendeten Gen-Panels können mit überraschend
hoher Effizienz für
die Diagnose, Behandlung und Überwachung
von und der Analyse einer Prädisposition
gegenüber
proliferativen Erkrankungen der Brustzellen verwendet werden.
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Zusätzlich ermöglicht die Verwendung von mehreren
CpG-Stellen aus einer diversen Anordnung von Genen ein relativ hohes
Ausmaß an
Sensitivität
und Spezifität
im Vergleich zu Einzelgen-diagnostischen und Nachweiswerkzeugen.
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Die Aufgabe der Erfindung wird mittels
der Analyse der Methylierungsmuster von einer oder mehrerer Sequenzen,
ausgewählt
aus der Gruppe umfassend SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 73 und SEQ
ID Nr. 366 gemäß Tabelle
1 gelöst.
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Verfahren durch in Kontakt bringen der Nukleinsäuresequenzen
in einer biologischen Probe, die von einem Subjekt erhalten wurde,
mit mindestens einem Reagenz oder einer Serie von Reagenzien gelöst, wobei
das Reagenz oder die Serie von Reagenzien zwischen methylierten
und nicht-methylierten CpG-Dinukleotiden innerhalb der jeweiligen
Zielnukleinsäure(n), d.
h. SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 73 und SEQ ID Nr. 366 unterscheidet.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
umfaßt
das Verfahren die folgenden Schritte:
In einem ersten Schritt
des Verfahrens muß die
genomische DNA-Probe aus Quellen isoliert werden, wie zum Beispiel
Zellinien, Gewebe oder Blutproben. Die Extraktion kann durch Mittel
erfolgen, die Standard für
den Durchschnittsfachmann sind, diese schließen die Verwendung von Detergenzlysaten,
die Beschallung und Vortexen mit Glasperlen ein. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert
wurden, wird die genomische Doppelstrang-DNA in der Analyse verwendet.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
kann die DNA vor dem nächsten
Schritt des Verfahrens gespalten werden, dies kann durch jedes Mittel
geschehen, das Standard im Stand der Technik ist, insbesondere, jedoch
nicht begrenzt auf, mit Restriktions-Endonukleasen.
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Im zweiten Schritt des Verfahrens
wird die genomische DNA Probe auf solch eine Weise behandelt, das
die Cytosinbasen, die an der 5'-Position nicht-methyliert sind,
zu Uracil, Thymin oder einer anderen Base konvertiert werden, die
im Hinblick auf das Hybridisierungsverhalten verschieden von Cytosin
ist. Dies wird hier im folgenden als „Vorbehandlung" verstanden.
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Die oben beschriebene Behandlung
der genomischen DNA wird bevorzugterweise mit Bisulfit (Sulfat, Disulfit)
und anschließender
alkalischer Hydrolyse durchgeführt,
die zu einer Konversion von nicht-methylierten Cytosin-Nukleobasen
zu Uracil oder einer anderen Base führt, die sich im Hinblick auf
das Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet. Falls eine
Bisulfitlösung
für die
Reaktion verwendet wird, findet eine Addition an den nicht-methylierten Cytosinbasen
statt. Darüber
hinaus muß ein
denaturierendes Mittel oder ein Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger vorhanden
sein. Eine anschließende
alkalische Hydrolyse ermöglicht dann
die Konversion von nicht-methylierten Cytosin-Nukleobasen zu Uracil.
Die konvertierte DNA wird dann für
den Nachweis von methylierten Cytosinen verwendet.
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Fragmente der vorbehandelten DNA
werden unter der Verwendung von Sets von Primer-Oligonukleotiden und einer bevorzugterweise
hitzebeständigen
Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktischen Überlegungen
werden bevorzugterweise mehr als zehn verschiedene Fragmente, die
eine Länge
von 100 – 2000
Basenpaaren aufweisen, amplifiziert. Die Amplifikation von verschiedenen
DNA-Segmenten kann gleichzeitig in ein- und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden.
Gewöhnlicherweise
wird die Amplifikation mittels einer Polymerasekettenreaktion (PCR)
durchgeführt.
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Der Aufbau solcher Primer ist dem
Durchschnittsfachmann ersichtlich. Diese sollten mindestens zwei Oligonukleotide
enthalten, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch
zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Segment der Basensequenzen,
die in dem Appendix angegeben sind (SEQ ID Nr. 74 bis SEQ ID Nr.
365 und SEQ ID Nr. 367 bis 370). Die Primeroligonukleotide sind
bevorzugterweise dadurch gekennzeichnet, daß sie keine CpG-Dinukleotide
enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird
die Sequenz der Primeroligonukleotide so aufgebaut, um selektiv
nur an die Brustzell-spezifische DNA von Interesse zu annealen und
diese zu amplifizieren, wodurch die Amplifikation von Hintergrund oder
nicht-relevanter DNA minimiert wird. Im Kontext der vorliegenden
Erfindung soll Hintergrund DNA genomische DNA bedeuten, die kein
relevantes Gewebe-spezifisches Methylierungsmuster aufweist, wobei
in diesem Fall das relevante Gewebe Brustzellen, sowohl gesunde,
als auch erkrankte, sind.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
ist es bevorzugt, daß während der
Amplifikation mindestens ein Primeroligonukleotid an eine feste
Phase gebunden ist. Die verschiedenen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen
können
auf einer festen Phase in Form eines rechteckigen oder hexagonalen
Gitters angeordnet werden, wobei die feste Phasen-Oberfläche bevorzugterweise
aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer,
Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt ist, wobei auch andere
Materialien, wie zum Beispiel Nitrozellulose oder Plastik als möglich verwendet
werden können.
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Die mittels Amplifikation erhaltenen
Fragmente können
einen direkt oder indirekt nachweisbaren Marker tragen. Bevorzugt
sind Marker in Form von Fluoreszenzmarkern, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten,
die eine typische Masse aufweisen, die in einem Massenspektrometer
nachgewiesen werden können,
wobei es bevorzugt ist, daß die
Fragmente, die produziert werden, eine einzelne positive oder negative
Nettoladung zum besseren Nachweis im Massenspektrometer aufweisen.
Der Nachweis kann durchgeführt
werden und visualisiert werden mittels Matrix-assistierter Laserdesorptions-Ionisierungs-Massenspektrometrie
(MALDI) oder unter der Verwendung von Elektronenspray-Massenspektrometrie
(ESI).
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Im nächsten Schritt werden die Nukleinsäureamplifikate
analysiert, um den Methylierungsstatus der genomischen DNA vor der
Behandlung zu bestimmen.
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Die post-Behandlungsanalyse der Nukleinsäuren kann
unter der Verwendung alternativer Verfahren durchgeführt werden.
Verschiedene Verfahren für
die Methylierungsstatus spezifische Analyse der behandelten Nukleinsäuren sind
unten beschrieben, andere alternative Verfahren werden dem Durchschnittsfachmann ersichtlich
sein.
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Unter der Verwendung verschiedener
im Stand der Technik bekannter Verfahren kann die Analyse während des
Amplifikationsschritts des Verfahrens durchgeführt werden. In einer solchen
Ausführungsform kann
der Methylierungsstatus von ausgewählten CpG-Positionen innerhalb
der Nukleinsäuren,
die SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 73 umfassen, durch die Verwendung
von Methylierungs-spezifischen Primeroligonukleotiden nachgewiesen
werden. Diese Technik („MSP")
wurde in US-Patent 6,265,171 von Herman beschrieben. Die Verwendung
von Methylierungsstatus-spezifischen Primern für die Amplifikation von mit
Bisulfit behandelter DNA ermöglicht
die Differenzierung zwischen methylierten und nichtmethylierten
Nukleinsäuren.
MSP-Primerpaare enthalten mindestens einen Primer, der an ein Bisulfit
behandeltes CpG-Dinukleotid hybridisiert. Daher umfaßt die Sequenz
des Primers mindestens ein CG-, TG- oder CA-Dinukleotid. Für nicht-methylierte
DNA spezifische MSP-Primer
enthalten ein „T"
an der 3'-Position der C-Position im CpG. Gemäß der vorliegenden Erfindung
ist es daher bevorzugt, daß die
Basensequenz der Primer erforderlicherweise eine Sequenz umfaßt, die
eine Länge
von mindestens 9 Nukleotiden aufweist, die an eine vorbehandelte
Nukleinsäuresequenz
gemäß SEQ ID
Nr. 74 bis SEQ ID Nr. 365 und dazu komplementären Sequenzen hybridisiert,
wobei die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CG-, TG- oder
CA-Dinukleotid umfaßt.
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In einer Ausführungsform des Verfahrens kann
der Methylierungsstatus der CpG-Positionen mittels Hybridisierungsanalyse
bestimmt werden. Bei dieser Ausführungsform
des Verfahrens werden die im zweiten Schritt erhaltenen Amplifikate
an eine Anordnung oder ein Set von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden
hybridisiert. In diesem Kontext findet die Hybridisierung auf die
wie folgt beschriebenen Weise statt. Das Set von Sonden, das während der
Hybridisierung verwendet wird, setzt sich bevorzugterweise aus mindestens
4 Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren zusammen. Im Verfahren dienen
die Amplifikate als Sonden, die an Oligonukleotide hybridisieren,
die vorher an eine feste Phase gebunden wurden. Die nicht-hybridisierten Fragmente
werden anschließend
entfernt. Die Oligonukleotide enthalten mindestens eine Basensequenz,
die eine Länge
von 10 Nukleotiden aufweist, die revers komplementär oder identisch
ist zu einem Segment der Basensequenzen, die im Appendix angegeben
sind, wobei das Segment mindestens ein CpG- oder ein TpG-Dinukleotid
enthält.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform
ist das Cytosin des CpG-Dinukleotids, oder im Fall von TpG das Thymidin,
das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 10-mers. Ein Oligonukleotid
existiert für
jedes CpG- oder TpG-Dinukleotid.
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Die nicht hybridisierten Amplifikate
werden dann entfernt. Im letzten Schritt des Verfahrens werden die hybridisierten
Amplifikate nachgewiesen. In diesem Kontext ist es bevorzugt, daß an die
Amplifikate angebrachte Marker an jeder Position der festen Phase
identifizierbar sind, an der eine Oligonukleotidsequenz lokalisiert
ist.
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In einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens kann der Methylierungsstatus der CpG-Positionen mittels
Oligonukleotidsonden ermittelt werden, die an die behandelte DNA
zusammen mit den PCR-Amplifikationsprimern hybridisiert werden (wobei
die Primer entweder Methylierungs-spezifisch oder Standard sein
können).
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Eine besonders bevorzugte Ausführungsform
dieses Verfahrens ist die Verwendung von Fluoreszenz-basierter Echtzeit-Quantitativer-PCR
(Heid et al., Genome Res. 6:986–994,
1996), die eine dual-markierte fluoreszente Oligonukleotidsonde
verwendet (TaqManTMPCR, unter der Verwendung
eines ABI Prism 7700 Sequenznachweissystems, Perkin Elmer Applied
Biosystems, Foster City, California). Die TaqManTMPCR-Reaktion
nutzt die Verwendung eines nicht-verlängerbaren Untersuchungs-Oligonukleotids,
das TaqManTM-Sonde genannt wird uns das
so aufgebaut ist, um an eine CpG-reiche Sequenz zu hybridisieren,
die zwischen den Vorwärts-
und Rückwärts-Amplifikationsprimern
lokalisiert ist. Die TaqManTM-Probe umfaßt weiterhin
eine fluoreszente „Reportergruppe"
und eine „Quenchergruppe",
die kovalent an Linkergruppen gebunden sind (z. B. Phosphoramidite),
die an die Nukleotide des TaqManTM-Oligonukleotids angebracht
sind. Zur Analyse von Methylierung innerhalb von Nukleinsäuren im
Anschluß an
die Bisulfitbehandlung ist es erforderlich, daß die Sonde Methylierungs-spezifisch ist, wie
in US 6,331,393 (hier durch Bezugnahme mit aufgenommen) beschrieben, was
auch als „MethylLight-Test"
bekannt ist. Variationen der TaqManTM-Nachweismethodologie,
die ebenfalls zur Verwendung mit der beschriebenen Erfindung brauchbar
sind, schließen
die Verwendung von dualer Sondentechnologie (LightcyclerTM) oder fluoreszenten Amplifikationsprimern
(SunriseTM-Technologie) ein. Diese beiden
Techniken können
auf eine geeignete Weise zur Verwendung mit Bisulfit behandelter
DNA ange paßt werden,
und darüber
hinaus zur Methylierungsanalyse innerhalb von CpG-Dinukleotiden.
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Ein weiter geeignetes Verfahren zur
Verwendung von Sonden-Oligonukleotiden zur Bestimmung von Methylierung
durch Analyse von Bisulfit behandelten Nukleinsäuren ist die Verwendung von
blockierenden Oligonukleotiden. Die Verwendung von solchen Oligonukleotiden
wurde in BioTechniques 23(4), 1997, 714–720 D. Yu, M. Mukai, Q. Liu,
C. Steinman beschrieben. Blockierende Oligonukleotidsonden werden
an die Bisulfit behandelte Nukleinsäure gemeinsam mit den PCR-Primern
hybridisiert. Die PCR-Amplifikation der Nukleinsäure bricht an der 5'-Position
der blockierenden Sonden ab, wodurch die Amplifikation einer Nukleinsäure unterdrückt wird,
wenn die komplementäre
Sequenz zu der blockierenden Sonde vorhanden ist. Die Sonden können so
aufgebaut sein, um an die Bisulfit behandelte Sonde auf einen Methylierungsstatus-spezifische
Weise zu hybridisieren. Zum Beispiel würde für den Nachweis von methylierten
Nukleinsäuren
innerhalb einer Population von nichtmethylierten Nukleinsäuren eine
Unterdrückung
der Amplifikation von Nukleinsäuren,
die an der fraglichen Position nichtmethyliert sind, durch die Verwendung
von blockierenden Sonden bewirkt werden, die ein „CG" an
der fraglichen Position umfassen, im Gegensatz zu einem „CA".
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In einer weiter bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens wird der Nachweis des Methylierungsstatus der CpG-Positionen
durch die Verwendung von Templat-gesteuerter Oligonukleotidverlängerung
durchgeführt,
wie zum Beispiel MS-SNuPE, wie durch Gonzalgo und Jones (Nucleic
Acids Res. 25:2529–2531)
beschrieben.
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In einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens wird die Bestimmung des Methylierungsstatus der CpG-Positionen
durch Sequenzierung und anschließende Sequenzanalyse des im
zweiten Schritt des Verfahrens erzeugten Amplifikats ermöglicht (Sanger
F., et al., 1977 PNAS USA 74:5463–5467).
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Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist
ein Verfahren zur Analyse des Methylierungsstatus von genomischer
DNA ohne den Bedarf für
eine Vorbehandlung. In den ersten und zweiten Schritten des Verfahrens
muß die
genomische DNA-Probe erhalten und aus dem Gewebe oder zellulären Quellen
isoliert werden. Solche Quellen können Zellinien, histologi sche
Schnitte, Körperflüssigkeit
oder in Paraffin eingebettetes Gewebe einschließen. Die Extraktion kann durch
Mittel erfolgen, die Standard für
den Fachmann sind, diese schließen
die Verwendung von Detergenzlysaten, Beschallung und Vortexen mit
Glasperlen ein. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert sind, wird
die genomische Doppelstrang-DNA in der Analyse verwendet.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
kann die DNA vor der Behandlung gespalten werden, dies kann durch
jedes Mittel erfolgen, das Standard im Stand der Technik ist, insbesondere
mit Restriktionsendonukleasen. In dem dritten Schritt wird die DNA
dann mit einem oder mehreren Methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen
verdaut. Der Verdau wird so ausgeführt, daß die Hydrolyse der DNA an
der Restriktionsstelle für
den Methylierungszustand eines spezifischen CpG-Dinukleotids informativ
ist.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Restriktionsfragmente amplifiziert. In einer weiter bevorzugten
Ausführungsform
wird dies unter der Verwendung der Polymerasekettenreaktion durchgeführt.
-
Im letzten Schritt werden die Amplifikate
nachgewiesen. Der Nachweis kann durch jedes Mittel, das Standard
im Stand der Technik ist, erfolgen, zum Beispiel, jedoch nicht begrenzt
auf, Gelelektrophorese-Analyse, Hybridisierungsanalyse, Inkorporation
von nachweisbaren Markern innerhalb des PCR-Produkts, DNA-Array-Analyse,
MALDI- oder ESI-Analyse.
-
Das oben erwähnte Verfahren wird bevorzugterweise
zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern
von genomischer DNA angewendet.
-
Um dieses Verfahren weiter zu ermöglichen,
stellt die Erfindung weiterhin die modifizierte DNA von Genen gemäß Tabelle
1 zur Verfügung,
sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen
innerhalb dieser Gene. Die vorliegende Erfindung basiert auf der
Entdeckung, daß genetische
und epigenetische Parameter und insbesondere die Cytosin-Methylierungsmuster
der genomischen DNAs insbesondere für die verbesserte Diagnose,
Behandlung und die Überwachung
von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen geeignet sind. Weiterhin
ermöglicht
die Erfindung die Unterscheidung zwi schen verschiedenen Subklassen
von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen oder den Nachweis
einer Prädisposition
für proliferative
Erkrankungen von Brustzellen.
-
Die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung
können
zur Analyse von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von
genomischer DNA verwendet werden.
-
Die Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung
wird durch die Verwendung einer Nukleinsäure, die eine Sequenz mit einer
Länge von
mindestens 18 Basen der vorbehandelten genomischen DNA gemäß einer der
SEQ ID Nr. 74 bis SEQ ID Nr. 365 und SEQ ID Nr. 367 bis 370 und
dazu komplementärer
Sequenzen enthält,
gelöst.
-
Die modifizierten Nukleinsäuren konnten
bis jetzt nicht mit der Ermittlung von Erkrankungsrelevanten genetischen
und epigenetischen Parametern in Zusammenhang gebracht werden.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder ein Oligomer zur Analyse
von vorbehandelter DNA zum Nachweis des genomischen Cytosin-Methylierungszustands
gelöst, wobei
das Oligonukleotid mindestens eine Basensequenz enthält, die
eine Länge
von mindestens 10 Nukleotiden aufweist, die an eine vorbehandelte
genomische DNA gemäß SEQ ID
Nr. 74 bis 365 und SEQ ID Nr. 367 bis 370 hybridisiert. Die Oligomersonden
gemäß der vorliegenden
Erfindung stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, die es zum
ersten Mal ermöglichen,
spezifische genetische und epigenetische Parameter während der
Analyse von biologischen Proben auf mit der Entwicklung von proliferativen
Erkrankungen von Brustzellen zusammenhängenden Merkmalen zu ermitteln.
Die Oligonukleotide ermöglichen
die verbesserte Diagnose, Behandlung und Überwachung von proliferativen
Erkrankungen von Brustzellen und den Nachweis einer Prädisposition
für diese
Erkrankungen. Weiterhin ermöglichen
sie die Unterscheidung von verschiedenen Subklassen von Brustkarzinomen.
Die Basensequenz der Oligomere enthält bevorzugterweise mindestens
ein CpG- oder TpG-Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA
(Peptid-Nukleinsäure) existieren,
die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Insbesondere
bevorzugt sind Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung,
in denen das Cytosin des CpG-Dinukleotids innerhalb des mittleren Drittels
des Oligonukleotids liegt, z. B. das 5. – 9. Nukleotid vom 5'-Ende
eines 13-mer-Oligonukleotids; oder im Fall eines PNA- Oligomers ist es
bevorzugt, daß das
Cytosin des CpG-Dinukleotids das 4. – 6. Nukleotid vom 5'-Ende
des 9-mers ist.
-
Die Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung
werden normalerweise in so genannten „Sets" verwendet, die mindestens
ein Oligomer für
jedes der CpG-Dinukleotide innerhalb von SEQ ID Nr. 74 bis SEQ ID Nr.
365 und SEQ ID Nr. 367 bis 370 enthalten.
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Im Fall der Sets der Oligonukleotide
gemäß der vorliegenden
Erfindung ist es bevorzugt, daß mindestens
ein Oligonukleotid an eine feste Phase gebunden ist. Es ist weiter
bevorzugt, daß alle
Oligonukleotide eines Sets an eine feste Phase gebunden sind.
-
Die vorliegende Erfindung betrifft
weiter ein Set von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren),
die zum Nachweis des Cytosin-Methylierungszustand von genomischer
DNA verwendet werden, durch Analyse der Sequenz oder behandelten
Versionen der Sequenz (gemäß SEQ ID
Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 366 und dazu komplementärer Sequenzen). Diese Sonden
ermöglichen
eine verbesserte Diagnose, Behandlung und Überwachung von proliferativen
Erkrankungen von Brustzellen. Insbesondere ermöglichen sie die Unterscheidung
zwischen verschiedenen Subklassen von proliferativen Erkrankungen
von Brustzellen und den Nachweis einer Prädisposition für diese
Erkrankungen.
-
Das Set von Oligomeren kann auch
dazu verwendet werden, Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) durch
die Analyse der Sequenz oder behandelten Versionen der Sequenz gemäß einer
der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 370 nachzuweisen.
-
Gemäß der vorliegenden Erfindung
ist es bevorzugt, daß eine
Anordnung von verschiedenen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren
(ein sogenanntes „Array")
durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird, und auf
eine solche Weise vorliegt, daß es
ebenfalls eine feste Phase gebunden ist. Diese Anordnung von verschiedenen
Oligonukleotid- und/oder
PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, daß sie an
der festen Phase in Form eines rechteckigen oder hexagonalen Gitters
angeordnet ist. Die feste Phase-Oberfläche ist
bevorzugterweise aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl,
Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt. Jedoch
können
Nitrozellulose, sowie Pla stikmaterialien, wie zum Beispiel Nylon,
die in Form von Pellets oder auch als Harz-Matrices vorliegen können, geeignete
Alternativen sein.
-
Daher ist ein weiterer Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines an einem
Trägermaterial
befestigten Arrays für
die verbesserte Diagnose, Behandlung und Überwachung von proliferativen
Erkrankungen von Brustzellen, die Differenzierung von verschiedenen
Unterklassen von Brustkarzinomen und/oder dem Nachweis der Prädisposition
gegenüber
proliferativen Erkrankungen von Brustzellen. In diesem Verfahren
wird mindestens ein Oligomer gemäß der vorliegenden
Erfindung an eine feste Phase gekoppelt. Verfahren zur Herstellung
solcher Arrays sind bekannt, zum Beispiel aus US-Patent 5,744,305
mittels Festphasen-Chemie und photolabilen Schutzgruppen.
-
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung betrifft einen DNA-Chip für die verbesserte Diagnose,
Behandlung und Überwachung
von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen. Weiterhin ermöglicht der
DNA-Chip den Nachweis einer Prädisposition
gegenüber
proliferativen Erkrankungen von Brustzellen und die Unterscheidung
zwischen verschiedenen Unterklassen von Brustkarzinomen. Der DNA-Chip
enthält
mindestens eine Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung. DNA-Chips sind zum Beispiel aus US-Patent 5,837,832 bekannt.
-
Darüber hinaus ist ein Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ein Kit, das zum Beispiel aus einem Bisulfit-enthaltenden
Reagenz, einem Set von Primeroligonukleotiden, das mindestens zwei
Oligomere, deren Sequenzen in jedem Fall einem 18 Basen langen Segment
der Basensequenzen, die im Appendix angegeben sind (SEQ ID Nr. 74
bis SEQ ID Nr. 365 und SEQ ID Nr. 367 bis 470) entsprechen oder
komplementär
dazu sind, Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren sowie Anweisungen zur Durchführung und
Evaluierung des beschriebenen Verfahrens zusammengesetzt ist.
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In einer weiter bevorzugten Ausführungsform
kann das Kit weiterhin Standardreagenzien zur Durchführung einer
CpG-Positions-spezifischen Methylierungsanalyse umfassen, wobei
die Analyse eine oder mehrere der vorliegenden Techniken umfaßt: MS-SNuPE,
MSP, Methyl light, Heavy Methyl und Nukleinsäuresequenzierung. Jedoch kann
ein Kit gemäß der vorliegenden
Erfindung auch nur einen Teil der oben genannten Komponenten enthalten.
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Die Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung
oder Arrays davon sowie ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung
sind für
die Anwendung bei der verbesserten Diagnose, Behandlung und Überwachung
von Brustzell-proliferativen Erkrankungen gedacht. Weiterhin erstreckt
sich die Verwendung der Erfindung auf die Unterscheidung von verschiedenen
Unterklassen von Brustkarzinomen und den Nachweis der Prädisposition von
proliferativen Erkrankungen von Brustzellen. Gemäß der vorliegenden Erfindung
wird das Verfahren bevorzugterweise für die Analyse von wichtigen
genetischen und/oder epigenetischen Parametern innerhalb genomischer
DNA verwendet, insbesondere zur Anwendung bei der verbesserten Diagnose,
Behandlung und Überwachung
von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen, dem Nachweis der
Prädisposition
für diese
Erkrankungen und der Unterscheidung zwischen Subklassen dieser Erkrankungen.
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Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
werden zum Beispiel für
die verbesserte Diagnose, Behandlung und Überwachung des Fortschreitens
von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen, des Nachweises
der Prädisposition
für diese
Erkrankungen und die Unterscheidung zwischen Subklassen dieser Erkrankungen
verwendet.
-
Die vorliegende Erfindung betrifft
darüber
hinaus die Diagnose und/oder Prognose von Ereignissen, die nachteilig
oder relevant für
die Patienten oder Individuen sind, in denen wichtige genetische
und/oder epigenetische Parameter innerhalb genomischer DNA, wobei
diese Parameter mittels der vorliegenden Erfindung erhalten wurden,
mit einem anderen Set von genetischen oder epigenetischen Parametern
verglichen werden können,
wobei die Unterschiede als eine Basis für die Diagnose und/oder Prognose
von Ereignissen dienen, die für
Patienten oder Individuen nachteilig oder relevant sind.
-
Die Gene und/oder Nukleinsäuren, die
die Basis der vorliegenden Erfindung bilden, können dazu verwendet werden,
ein „Gen-Panel"
zu bilden, d.h. eine Sammlung, die die bestimmten genetischen Sequenzen der
vorliegenden Erfindung und/oder deren jeweilige informative Methylierungsstellen
umfaßt.
Die Bildung von Gen-Panels ermöglicht
eine schnelle und spezifische Analyse der Erkrankungen, mit denen
sie in Zusammenhang stehen. Die wie in dieser Erfindung beschriebenen
und angewendeten Gen-Panels) können
mit überraschend
hoher Effizienz für
die Diagnose, Behandlung und Überwachung
von und die Analyse von einer Prädisposition
für die
hier beschriebenen Erkrankungen verwendet werden, basierend auf
der Analyse des Methylierungsstatus dieser Panels.
-
Die Verbindung von multiplen und
selektiven CpG-Stellen aus einer diversen Anordnung von Genen, die
proliferative Erkrankungen von Brustzellen regulieren, erlaubt zusätzlich ein überraschend
hohes Ausmaß an
Sensitivität
und Spezifität
im Vergleich zu diagnostischen und Nachweis-Werkzeugen auf der Basis
von einzelnen Genen. Darüber
hinaus kann das wie hier beschriebenen Panel im Vergleich zu Vielen
zur Anwendung bei der Analyse von vielen Erkrankungen angepaßt werden,
die alle durch die Regulation von proliferativen Erkrankungen von
Brustzellen beeinträchtigt
werden.
-
Unter dem Begriff "Hybridisierung"
im Sinne der vorliegenden Erfindung soll eine Bindung eines Oligonukleotids
unter Ausbildung einer Duplex-Struktur an eine vollständig komplementäre Sequenz
im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben-DNA verstanden
werden.
-
"Genetische Parameter" im Sinne der
vorliegenden Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von genomischer
DNA und zu ihrer Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Insbesondere
werden als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen,
Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single
Nucleotide Polymorphisms) bezeichnet.
-
"Epigenetische Parameter" im Sinne
der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Cytosin-Methylierungen. Weitere
epigenetische Parameter schließen
beispielsweise die Acetylierung von Histonen ein, die jedoch mit
dem beschriebenen Verfahren nicht direkt analysiert werden kann,
sondern wiederum mit der DNA-Methylierung korreliert.
-
Im folgenden wird die Erfindung genauer
auf der Basis der Sequenzen, Tabellen und der Beispiele beschrieben
werden, ohne darauf begrenzt zu werden.
-
SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 73 und
SEQ ID Nr. 366 stellen 5'- und/oder regulatorische Regionen und/oder
CpG-reiche Regionen der Gene gemäß Tabelle
1 da. Diese Sequenzen sind aus der Genbank abgeleitet und werden
als alle kleineren Variationen des Sequenzmaterials einschließend angesehen,
die im Augenblick noch nicht vorhersehbar sind, beispielsweise,
jedoch nicht begrenzt auf, kleinere Deletionen und SNPs.
-
SEQ ID Nr. 74 bis SEQ ID Nr. 365
und SEQ ID Nr. 367 bis 370 zeigen die vorbehandelte Sequenz von DNA,
die von den Genen gemäß Tabelle
1 abgeleitet wurde. Diese Sequenzen werden als alle kleineren Variationen
des Sequenzmaterials einschließend
angesehen, die im Augenblick nicht vorhersehbar sind, zum Beispiel,
jedoch nicht begrenzt auf, kleinere Deletionen und SNPs.
-
SEQ ID Nr. 371 bis SEQ ID Nr. 396
zeigen die Sequenzen von Primern und anderen Oligonukleotiden, die
bei der Analyse eines ausgewählten
Panels von Genen gemäß Tabelle
1 verwendet wurden, wie in den Ausführungsformen des Verfahrens
gemäß Beispielen
1 bis 4 beschrieben.
-
1 zeigt
die Analyse von Bisulfit-behandelter DNA unter der Verwendung der
Methyl Light- und Heavy Methyl-Tests, gemäß jeweils Beispielen 2 und
3 durchgeführt.
Die Ergebnisse des Heavy Methyl-Tests sind auf dem Balkendiagramm
linker Hand gezeigt und die Ergebnisse des Methyl Light-Tests sind
auf dem Balkendiagramm rechter Hand gezeigt. Die γ-Achse zeigt
den Prozentsatz an Methylierung an den CpG-Positionen, die durch
die Sonden abgedeckt wurden. Der dunkle schwarze Balken („A") entspricht
den Tumorproben, wohingegen der weiße Balken („B") dem normalen Kontrollgewebe
entspricht. Signifikanterweise sind die Tumorproben im wesentlichen
hypermethyliert, relativ zu normalem Kontrollgewebe.
-
2 zeigt
die Spiegel an Methylierung in Brusttumorzellen und gesundem Gewebe,
wie durch Beispiel 3 mittels Heavy Methyl-Tests ermittelt. Die γ-Achse zeigt
das Ausmaß von
Methylierung innerhalb der Region des untersuchten Calcitoningens.
Die Tumorproben sind durch schwarze Rauten dargestellt und die normalen
Brustgewebeproben durch weiße
Quadrate. Wie aus den Ergebnissen gesehen werden kann, wurde ein
signifikant höheres
Ausmaß an
Methylierung (Hypermethylierung) in Tumorproben relativ zu normalen
Gewebeproben beobachtet.
-
Tabelle
1
Beschreibung von Genen, die das Panel umfaßt
-
-
-
-
Beispiele
-
Um die Eignung von Genen zur Aufnahme
in das Panel zu etablieren, wurde jedes Gen mittels sowohl relativ
unspezifischer und hochsensitiver Verfahren untersucht. Die Methylierung innerhalb
des Calcitoningens wurde unter der Verwendung von drei verschiedenen
Verfahren, nämlich
Restriktionsenzym, MethylLight und kombiniertem Heavy Methyl-MethylLight-Tests analysiert.
-
Beispiel 1
-
Restriktionsenzym-Analyse
-
Die differentielle Methylierung wurde
ursprünglich
mittels Methylierungs-sensitiver Restriktionsenzymanalyse beobachtet.
Ein Fragment der Stromaufwärtsregion
des. Calcitoningens (SEQ ID Nr. 366) wurde durch PCR unter der Verwendung
von Primern CCTTAGTCCCTACCTCTGCT (SEQ ID Nr. 371) und CTCATTTACACACACCCAAAC
(SEQ ID Nr. 372) amplifiziert. Das erhaltenen Amplifikat, 378 bp
Länge,
enthielt ein informatives CpG an Position 165. Die Amplifikat-DNA
wurde mit der Methylierungs-sensitiven Restriktionsendonuklease
Nar I verdaut, wobei das Erkennungsmotiv GGCGCC war. Die Hydrolyse
durch die Endonuklease wird durch Methylierung des CpGs an Position
165 des Amplifikats blockiert. Der Verdau wurde als eine Kontrolle verwendet.
-
Die genomische DNA wurde aus Brustgewebe
und Brust-Tumorproben unter der Verwendung des DNA-WizzardTM DNA-Isolierungskits (Promega) isoliert.
Jede Probe wurde unter der Verwendung von Nar I gemäß den Empfehlungen
des Herstellers (New England Biolabs) verdaut.
-
Ungefähr 10 ng von jedem genomischen
Verdau wurden dann unter der Verwendung von PCR-Primern CCTTAGTCCCTACCTCTGCT
(SEQ ID NR. 371) und CTCATTTACACACACCCAAAC (SEQ ID NR. 372) amplifiziert.
Die PCR-Reaktionen wurden unter der Verwendung eines Thermocyclers
(Eppendorf GmbH) unter der Verwendung von 10 ng DNA, 6 pMol jedes
Primers, 200 μM
jedes dNTP, 1,5 mM MgCl2 und einer Einheit
HotstartTMTaq (Qiagen AG) durchgeführt. Die
anderen Bedingungen waren wie durch den Taq-Polymerase-Hersteller
empfohlen.
-
Unter der Verwendung der oben genannte
Primer wurden Genfragmente durch PCR amplifiziert, wobei ein erster
Denaturierungsschritt für
14 Minuten bei 96°C
durchgeführt
wurde, gefolgt von 30–45
Zyklen (Schritt 2: 60 Sek bei 96°C,
Schritt 3: 45 Sek bei 52°C,
Schritt 4: 75 Sek bei 72°C)
und einer anschließenden finalen
Elongation von 10 min bei 72°C.
Die Anwesenheit von PCR-Produkten wurde durch Agarosegelelektrophorese
analysiert.
-
PCR-Produkte waren bei isolierter
Nar I-hydrolisierter DNA nachweisbar, wobei das fragliche Gewebe hoch-methylierte
DNA enthielt, wenn Schritt 2 bis Schritt 4 des Zyklusprogramms 34-,
37-, 39-, 42- und 45-fach wiederholt wurden. Im Gegensatz dazu waren
PCR-Produkte nur
bei isolierter Nar I-hydrolisierter DNA aus herunter-methyliertem
Gewebe nachweisbar, wenn Schritte 2 bis Schritte 4 des Zyklusprogramms
42- und 45-fach wiederholt wurden. Die weitere Untersuchung des
Calcitoningens wurde dann mittels hoch sensitiver Tests durchgeführt, wie
in Beispiel 2 und 3 beschrieben.
-
Beispiel 2
-
Analyse von Methylierung
innerhalb Brustkrebs unter der Verwendung eines Methyl light-Tests
-
Die DNA wurde aus 21 Brustkarzinomproben
und 17 normalen Brustgeweben unter der Verwendung eines Qiagen-Extraktionskits
extrahiert. Die DNA von jeder Probe wurde unter der Verwendung einer
Bisulfitlösung
(Hydrogensulfit, Disulfit) gemäß dem Agarose-Perlen-Verfahren (Olek et
al.. 1996) behandelt. Die Behandlung erfolgt auf solche Art, daß alle nichtmethylierten
Cytosine innerhalb der Probe zu Thymidin überführt wurden. Im Gegensatz dazu
verbleiben 5-methylierte Cytosine innerhalb der Probe unmodifiziert.
-
Der Methylierungsstatus wurde mit
einem Methyl light-Test bestimmt, der für die CpG-Inseln von Interesse
konstruiert war und einem Kontrollfragment aus dem beta-Aktingen
(Eads et al., 2001). Der CpG-Insel-Test deckt CpG-Stellen in sowohl
den Primern und die Taqman-Art-Sonden
ab, während
das Kontrollgen dies nicht tun. Das Kontrollgen wird als ein Maß der gesamten
DNA-Konzentration verwendet und der CpG-Insel-Test (Methylierungstest)
bestimmt die Methylierungsspiegel an dieser Stelle.
-
Verfahren
-
Der Calcitoningen-CpG-Insel-Test
wurde unter der Verwendung der folgenden Primer und Sonden durchgeführt:
Primer:
AGGTTATCGTCGTGCGAGTGT (SEQ ID Nr. 373);
Primer: TCACTCAAACGTATCCCAAACCTA
(SEQ ID Nr. 374); und
Sonde: CGAATCTCTCGAACGATCGCATCCA (SEQ
ID Nr. 375).
-
Der entsprechende Kontrolltest wurde
unter der Verwendung der folgenden Primer und Sonden durchgeführt.
Primer:
TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT (SEQ ID Nr. 376);
Primer: AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA
(SEQ ID Nr. 377); und
Probe: ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA
(SEQ ID Nr. 378).
-
Die Reaktionen wurden in dreifachen
Ansätzen
mit jeder DNA-Probe mit den folgenden Testbedingungen durchgeführt:
-
Reaktionslösung
-
(900 nM Primer; 300 nM Sonde; 3,5
mM Magnesiumchlorid; 1 Einheit Taq-Polymerase; 200 mM dNTPs; 7 ml
DNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 ml).
-
Zyklusbedingungen
-
(95°C für 10 Minuten; 95°C für 15 Sekunden;
67°C für 1 Minute
(3 Zyklen)); (95°C
für 15
Sekunden, 64°C
für 1 Minute
(3 Zyklen)); (95°C
für 15
Sekunden, 62°C
für 1 Minute
(3 Zyklen)); und (95°C
für 15
Sekunden, 60°C
für 1 Minute
(40 Zyklen)). Die Daten wurden unter der Verwendung einer PMR-Kalkulation,
die früher in
der Literatur beschrieben wurde (Eads et al. 2001) analysiert.
-
Ergebnisse
-
Die mittlere PMR für normale
Proben war 0,94, mit einer Standardabweichung von 1,28. Die mittlere PMR
für Tumorproben
war 8,38, mit einer Standardabweichung von 11,18. Der Gesamtunterschied
bei den Methylierungsspiegeln zwischen Tumor- und normalen Proben
ist im t-Test signifikant (p=0,0065).
-
Experiment 3
-
Einzel-Genanalyse
-
Dieselben Proben wurden unter der
Verwendung des HeavyMethyl-MethyLight (oder HM MethyLight)-Tests,
der auch als der HeavyMethyl-Test bezeichnet wird, analysiert. Der
Methylierungsstatus wurde mit einem HM MethyLight-Test bestimmt,
der für
die CpG-Insel von Interesse konstruiert war, und einem Kontrollgentest.
Der CpG-Insel-Test deckt CpG-Stellen in sowohl den Blockierungs-
und Taqman-Art-Sonden ab, während
das Kontrollgen dies nicht tut.
-
Verfahren
-
Der CpG-Insel-Test (Methylierungstest)
wurde unter der Verwendung der folgenden Primer durchgeführt.
Primer:
GGATGTGAGAGTTGTTGAGGTTA (SEQ ID Nr. 379);
Primer: ACACACCCAAACCCATTACTATCT
(SEQ ID Nr. 380);
Probe: ACCTCCGAATCTCTCGAACGATCGC (SEQ ID
Nr. 381); und
Blocker: TGTTGAGGTTATGTGTAATTGGGTGTGA (SEQ ID
Nr. 382).
-
Die Reaktionen wurden in dreifachen
Ansätzen
mit jeder DNA-Probe mit den folgenden Testbedingungen durchgeführt:
-
Reaktionslösung
-
(300 nM Primer; 450 nM Sonde; 3,5
mM Magnesiumchlorid; 2 Einheiten Taq-Polymerase; 400 mM dNTPs; und
7 ml DNA, in einem finalen Reaktionsvolumen von 20 ml).
-
Zyklusbedingungen
-
(95°C für 10 Minuten); (95°C für 15 Sekunden,
67°C für 1 Minute
(3 Zyklen)); (95°C
für 15
Sekunden, 64°C
für 1 Minute
(3 Zyklen); (95°C
für 15
Sekunden, 62°C
für 1 Minute
(3 Zyklen)); und (95°C
für 15
Sekunden, 60°C
für 1 Minute
(40 Zyklen)).
-
Ergebnisse
-
Der mittlere PMR für normale
Proben war 0,58, mit einer Standardabweichung von 0,94. Der mittlere PMR
für Tumorproben
war 3,01, mit einer Standardabweichung von 3,91. Der Gesamtunterschied
in den Methylierungsspiegeln zwischen Tumor- und normalen Proben
ist in einem t-Test signifikant (p=0,0012).
-
Unter Berücksichtigung der Signifikanz
der Analysen wurde entschieden, die identifizierten CpG-Inseln mit
anderen informativen CpG-reichen Regionen in Form eines Gen-Panels
zur Verwendung als einen diagnostischen Test zu kombinieren. Dies
würde das
Ausmaß der
Spezifität
und Sensitivität
im Gegensatz zur Verwendung der identifizierten CpG-reichen Region
als ein Einzelgen-Markertyp diagnostischer Test verbessern.
-
Beispiel 4
-
Multiple "Gen-Panel"-Analyse
-
Die informative Region, wie in SEQ
ID Nr. 366 beschrieben, wurde in ein Panel von Genen für die Ermittlung
von Brusttumorproben eingeschlossen. Demzufolge wurde ein Test für die mittlere
Durchsatzanalyse von vielen CpG-Positionen in vielen Proben entwickelt,
wobei das gewählte
Format eine Mikroarray-Analyse war.
-
Alle Proben wurden unter der Verwendung
der in Beispiel 1 beschriebenen Bisulfit-Technik behandelt. Im Anschluß an die
Bisulfit-Behandlung wurden ausgewählte CpG-reiche Regionen aus
den Genen gemäß Tabelle
2 mittels Multiplex-Polymerasekettenreaktion amplifiziert, wobei
8 Fragmente pro Reaktion mit Cy5 fluoreszent-markierten Primern
gemäß Tabelle
2 amplifiziert wurden. Die folgenden Bedingungen wurden verwendet:
10
ng Bisulfit behandelte DNA
3,5 mM MgCl2
400 μM dNTPs
2
pMol jedes Primers
1 U Hotstart Taq (Qiagen)
-
Vierzig Zyklen wurden wie folgt durchgeführt. Denaturierung
bei 95°C
für 15
Min, gefolgt von Annealing bei 55°C
für 45
Sek., Primerverlängerung
bei 65°C
für 2 Min.
Eine finale Verlängerung
von 65°C
wurde für
10 Min durchgeführt.
-
Alle PCR-Produkte von jeder einzelnen
Probe wurden dann an Glasobjektträger hybridisiert, die ein Paar
von immobilisierten Oligonukleotiden für jede CpG-Position unter Analyse
trugen. Jedes dieser Nachweis-Oligonukleotide war so aufgebaut,
um an die Bisulfit-konvertierte Sequenz um eine CpG-Stelle herum
zu hybridisieren, die entweder ursprünglich unmethyliert (TG) oder
methyliert (CG) war. Die Hybridisierungsbedingungen wurden so gewählt, um
den Nachweis von Einzelnukleotid-Unterschiede zwischen den TG- und CG-Varianten
zu ermöglichen.
-
5 μl
Volumen jedes Multiplex-PCR-Produkts wurden in 10 × Ssarc
buffer (10 × Ssarc:
230 ml 20 × SSC, 180
ml Natriumlaurylsarcosinat-Lösung
20%, verdünnt
auf 1000 ml mit dH2O). Das Reaktionsgemisch
wurde dann an die Nachweis-Oligonukleotide wie folgt hybridisiert.
Denaturierung bei 95°C,
Abkühlen
auf 10°C,
Hybridisierung bei 42°C über Nacht,
gefolgt von Waschen mit 10 × Ssarc
dH2O bei 42°C.
-
Die Fluoreszenzsignale von jedem
hybridisierten Oligonukleotid wurden unter der Verwendung von Genepix-Scanner
und -Software nachgewiesen. Die Verhältnisse für die zwei Signale (von dem
CG-Oligonukleotid und dem TG-Oligonukleotid, die dazu verwendet
wurden, um jede CpG-Position zu analysieren) wurden basierend auf
dem Vergleich der Intensitäten
der Fluoreszenzsignale berechnet.
-
Die Information wird dann in eine
gewichtete Matrix gemäß den CpG-Methylierungsunterschieden
zwischen den zwei Klassen an Gewebe unter der Verwendung eines Algorithmus
sortiert. Um genau zwischen den zwei Gewebeklassen zu unterscheiden,
wurde ein Lern-Algorithmus (Support-Vektor-Maschine, SVM) trainiert.
Die SVM war wie diskutiert durch F. Model, P. Adorjan, A. Olek,
C. Piepenbrock, Feature selection for DNA methylation based cancer
classification. Bioinformatics. 2001 Jun; 17 Suppl 1:5157–64. Der
Algorithmus konstruiert eine optimale Unterscheidung zwischen zwei
Klassen von gegebenen Trainingsproben. In diesem Fall wird jede
Probe durch die Methylierungsmuster (CG-/TG-Verhältnisse)
an den untersuchten CpG-Stellen beschrieben. Die SVM wurde auf einem
Unterset von Proben jeder Klasse trainiert, die mit der angefügten Diagnose
präsentiert
wurden. Unabhängige
Testproben, die vorher der SVM nicht gezeigt wurden, wurden dann zur
Evaluierung präsentiert,
um zu etablieren, ob die Diagnose basierend auf dem in der Trainingsrunde
erzeugten Prädiktor
korrekt vorhergesagt werden konnte. Dieses Verfahren wurde verschiedene
Male unter der Verwendung von verschiedenen Positionen der Proben
wiederholt, ein Verfahren, das Kreuz-Validierung genannt wurde.
Es ist zu bemerken, daß alle
Runden ohne die Verwendung jegliches Wissens, das in vorhergehenden
Läufen
erhalten wurde, durchgeführt
wurden. Die Zahl von richtigen Klassifizierungen wurden über alle Läufe hinweg
gemittelt, was eine gute Abschätzung
von unserer Testgenauigkeit (Prozent von korrekt eingeordneten Proben über alle
Runden hinweg) ergibt. Tabelle
2
Gene und Primer gemäß Beispiel
4
