DE19819889A1 - Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, wobei eine aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung zur Isolierung eingesetzt wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Isolierung von Nucleinsäu­ ren aus einer Probe, insbesondere einem organischen oder anorganischen Material.

Die Isolierung von Nucleinsäuren aus bestimmten Ausgangsmaterialien spielt in einer Vielzahl von wissenschaftlichen, industriellen oder sonstigen Bereichen eine große Rolle. Derartige Bereiche sind zum Beispiel die Umweltanalytik, die Kriminaltech­ nik, die medizinische Diagnostik, die Grundlagen­ forschung oder ähnliches. Ebenso vielfältig wie die Anwendungsbereiche können die Ausgangsmaterialien für die Isolierung der Nucleinsäuren sein, bei­ spielsweise eukaryontische oder prokaryontische Zellen oder deren Homogenate, Bodenproben, Blutpro­ ben, Körperflüssigkeiten oder Gewebehomogenate. In Abhängigkeit von diesem Ausgangs- oder Probenmate­ rial müssen unterschiedliche Aufschlußverfahren eingesetzt werden, um die beispielsweise in Zellen und/oder Zellkernen vorhandenen Nucleinsäuren einer Isolierung zugänglich zu machen. Häufig eingesetzte Aufschlußverfahren sind zum Beispiel die Ultra­ schall- und/oder Enzymbehandlung. Nach Durchführung der Aufschlußbehandlung werden die Nucleinsäuren beispielsweise mittels Gelelektrophorese, Ultrazen­ trifugation oder Affinitätschromatographie iso­ liert.

Die Affinitätschromatographie beruht im wesentli­ chen auf der Fähigkeit von Nucleinsäuren, reversi­ bel an positiv geladene und/oder positivpolare Ma­ trizes zu binden. In der Regel wird zunächst eine anionische oder polare Bindung der Nucleinsäuren an die Matrix erwirkt und anschließend die Nucleinsäu­ re durch Einsatz geeigneter Lösemittel von Verun­ reinigungen befreit. In einem zweiten Schritt wird die an die Matrix gebundene Nucleinsäure unter Ein­ satz eines weiteren Lösemittels, beispielsweise mit höherer Ionenstärke, von der Matrix gelöst. An­ schließend muß die so isolierte Nucleinsäure im allgemeinen wieder deionisiert werden, um für wei­ tere Untersuchungen verwendet werden zu können.

Als nachteilig erweist sich dabei, daß je nach ein­ gesetztem Probenmaterial und durchgeführtem Auf­ schlußverfahren unterschiedliche Isolierungsstrate­ gien entwickelt und eingesetzt werden müssen.

Sowohl DNA als auch RNA wird herkömmlicherweise auch mittels Ultrazentrifugation isoliert, wobei häufig Protease- und Phenolbehandlungen durchge­ führt werden müssen. Diese Verfahrensweise weist den Nachteil auf, daß insbesondere hochmolekulare DNA selbst nach Durchführung der Isolierung häufig noch mit Proteinen verunreinigt sind und die Mole­ küle aufgrund der einwirkenden Scherkräfte der Ge­ fahr des Zerbrechens ausgesetzt sind. Zudem ist die Phenolbehandlung gesundheits- und umweltschädlich.

Auch die zur Nucleinsäureisolierung oftmals einge­ setzte Gelektrophorese weist unter anderem aufgrund der notwendigen vergleichsweise umständlichen Vor- und Nachbehandlung der Proben beziehungsweise Nucleinsäuren Nachteile auf.

Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem liegt also darin, ein kostengün­ stiges und einfach durchzuführendes Isolierungsver­ fahren für Nucleinsäuren bereitzustellen, das aus beliebigem organischen und anorganischen Probenma­ terial bereits während des Probenaufschlusses in einem einzigen Schritt hochspezifisch Nucleinsäuren in besonders reiner Form bereitstellt.

Die Erfindung löst dieses Problem durch die Bereit­ stellung eines Verfahrens zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, wobei eine immobili­ sierte nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA- Mischung mit der Probe so in Kontakt gebracht wird, daß eine Bindung beziehungsweise Hybridisierung von in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren an die immo­ bilisierte DNA-Mischung stattfinden kann und wobei die gebundenen Nucleinsäuren nach einem gegebenen­ falls erfolgenden Waschschritt von der immobili­ sierten DNA-Mischung abgelöst werden.

Die Erfindung stellt also ein affinitätschroma­ tographisches Verfahren zur Isolierung von Nuclein­ säuren bereit, bei dem in einer Probe enthaltene Nucleinsäuren mit einer immobilisierten, nur aus Zufallssequenzen bestehenden DNA-Mischung in Kon­ takt gebracht werden und diese DNA-Mischung spezi­ fisch die in der Probe enthaltenen Nucleinsäuren, zum Beispiel DNA oder RNA, bindet und damit von den anderen Probenbestandteilen wie Kohlenhydraten, Fetten etc. isoliert. Die dabei einzuhaltenden Hy­ bridisierungsbedingungen wie Temperatur und Puffer­ zusammensetzung hängen von der jeweiligen konkreten Isolieraufgabe ab.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer nur aus Zufallssequenzen bestehenden DNA-Mischung eine Mischung aus DNA-Zufallssequen­ zen, die auch als random primers bezeichnet werden, verstanden, die nicht spezifisch auf eine konkret zu isolierende Nucleinsäure zusammengestellt ist, sondern jede beliebige Nucleotidpermutation auf­ weist, so daß unterschiedslos alle in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren mit für eine Hybridisie­ rung ausreichende Kettenlänge gebunden werden. Die DNA-Zufallssequenzen weisen eine im wesentlichen einheitliche, aber beliebige Kettenlänge auf, vor­ zugsweise eine durchschnittliche Kettenlänge von 10. Die nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA- Mischung weist also eine Vielzahl von unterschied­ lichen DNA-Molekülen in Einzelstrangform auf, deren Sequenz jeweils zufallsgemäß zusammengesetzt ist.

Bei der Herstellung dieser DNA-Mischung wird so vorgegangen, daß im Verlauf der DNA-Synthese die vier am DNA-Aufbau beteiligten Nucleoside, das heißt Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxycytidin und Desoxythymidin sowie gegebenenfalls deren je­ weilige Synthone, das heißt deren strukturanaloge Modifikationen, pro DNA-Kettenverlängerungsschritt in einem Mischungsverhältnis von 1 : 1 : 1 : 1 eingesetzt werden. Das hat zur Folge, daß je Position in einer DNA-Molekülkette alle vier Nucleoside mit gleicher Wahrscheinlichkeit eingebaut werden. Eine DNA- Mischung mit DNA-Zufallssequenzen von jeweils bei­ spielsweise 10 Nukleotiden Länge, dargestellt durch die Abfolge 5'NNNNNNNNNN3', wobei N für Desoxyade­ nosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin und Desoxycy­ tidin steht, repräsentiert demnach eine Mischung aller einzelsträngiger DNA-Moleküle mit einer Ket­ tenlänge von 10 Nucleotiden, das heißt 4¹⁰ verschie­ dene DNA-Moleküle. Die Anzahl von unterschiedlichen DNA-Zufallsequenzen pro erfindungsgemäßer DNA- Mischung beträgt demnach 4^x, wobei x die Kettenlän­ ge oder Nucleotidanzahl der DNA-Zufallssequenz ist.

In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfin­ dung betrifft die Erfindung ein vorgenanntes ver­ fahren, wobei die in der DNA-Mischung vorhandenen 4^x Zufallssequenzen in gleichen, vorzugsweise in im wesentlichen, molaren Mengenanteilen vorkommen. Die erfindungsgemäß eingesetzte DNA-Mischung ist also nicht im Hinblick auf eine konkrete Isolieraufgabe hin entwickelt, sondern stellt vielmehr eine für jede beliebige DNA- oder RNA-Isolieraufgabe ein­ setzbare DNA-Mischung ohne jegliche konkrete DNA- oder RNA-Spezifität dar. Die eingesetzte DNA- Mischung ist nur insoweit spezifisch, als daß sie Nucleinsäuren, das heißt DNA oder RNA, von anderen Stoffen wie zum Beispiel Proteinen, Zuckern oder ähnlichem trennen kann. Erfindungsgemäß kann jedoch vorgesehen sein, durch geeignete Auswahl der Binde- beziehungsweise Hybridisierungsbedingungen zwischen zu isolierender Nucleinsäure und DNA-Mischung oder der Lösebedingungen (Temperatur, Ionenstärke etc.) DNA von RNA zu unterscheiden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann also in vorteilhafter Weise DNA- oder RNA-spezifisch durchgeführt werden.

Selbstverständlich kann die erfindungsgemäß einzu­ setzende DNA-Mischung auch andere Nucleoside wie Desoxyinosin, Uridin, Pseudouridin, N²-Dimethyl­ guanosin, N⁶-Isopentenyladenosin enthalten. Erfin­ dungsgemäß kann auch vorgesehen sein, anstelle der Desoxyribosederivate, Ribosederivate, also RNA-Bau­ steine einzusetzen. Im Zusammenhang mit der vorlie­ genden Erfindung wird unter einer DNA-Mischung ge­ gebenenfalls also auch eine RNA-Mischung verstan­ den.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Probe jedes beliebige organische, anor­ ganische oder organisch/anorganisches Material ver­ standen, sofern dieses eine Nucleinsäure, also DNA oder RNA, enthält. Eine Probe kann demgemäß eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle oder ein Zellhomogenat, eine Virussuspension, Blut, Sperma, Lymph- oder sonstige Körperflüssigkeit, Organ- oder Gewebepräparat, Wasser- oder Bodenproben, Pflanzen­ homogenate, Bernstein oder sonstiges sein.

Die Erfindung weist den Vorteil auf, daß aus einer Probe bereits während des Probenaufschlusses in ei­ nem einzigen Schritt hochspezifisch Nucleinsäuren isoliert werden können und in reiner Form erhalten werden, so daß diese direkt für andere Analyse- oder Präparationsschritte, wie beispielsweise ein PCR-Verfahren, eingesetzt werden können. Die erfin­ dungsgemäße Vorgehensweise setzt in vorteilhafter Weise keine kosten- und zeitintensiven Anpassungs­ schritte des Verfahrens an die jeweilige Isolier­ aufgabe voraus. Vielmehr kann das erfindungsgemäße Verfahren direkt ohne weitere Modifikation für jede beliebige Isolieraufgabe eingesetzt werden. So kann das erfindungsgemäße Verfahren im Verlauf nahezu jeden chemischen, physikalischen oder chemisch­ physikalischen Aufschlusses organischen oder anor­ ganischen Materials eingesetzt werden.

In besonders vorteilhafter Weise kann vorgesehen sein, die mit der immobilisierten, nur aus Zu­ fallssequenzen bestehenden DNA-Mischung in Kontakt gebrachte Probe Ultraschalleinfluß, beispielsweise bei 20 bis 30 kHz, auszusetzen, um einen Probenauf­ schluß, insbesondere Zellaufschluß, zu erreichen. Dies führt gleichzeitig zu einer Erwärmung des Re­ aktionsgemisches aus Probe und immobilisierter DNA- Mischung, so daß die in der Probe enthaltende DNA denaturiert wird und beim Abkühlen an die immobili­ sierte DNA-Mischung binden kann.

In besonders bevorzugter Ausführungsform der Erfin­ dung ist vorgesehen, daß nach der Affinitätsbindung der in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren an die DNA-Mischung Verunreinigungen mittels geeigneter Pufferlösungen oder Wasser entfernt werden. Nach dem erfolgten Waschschritt kann die affinitätsge­ bundene Nucleinsäure durch Erhöhung der Umge­ bungstemperatur, beispielsweise auf mindestens 70°C, zum Beispiel Siedetemperatur, in Gegenwart eines geeigneten Lösemittels, zum Beispiel einer Pufferlösung oder Wasser, von der DNA-Mischung ab­ gelöst werden. Die Ablösung kann auch durch Erhö­ hung der Ionenstärke des Lösepuffers oder eine Ver­ änderung des pH-Wertes erfolgen. Die erhaltene Nucleinsäure ist frei von Verunreinigungen und kann insbesondere durch PCR-Verfahren, auch in Gegenwart der immobilisierten DNA-Mischung, amplifiziert wer­ den.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Vor­ richtung, insbesondere eine Affinitätsmatrix, zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, ins­ besondere zur Durchführung eines vorgenannten Ver­ fahrens, umfassend eine nur aus Zufallssequenzen bestehende, vorstehend beschriebene, DNA-Mischung, die an einer Matrix immobilisiert ist. Die Erfin­ dung sieht also eine Vorrichtung, insbesondere eine Affinitätsmatrix, vor, mit Hilfe derer das vorge­ nannte Verfahren durchgeführt werden kann, insbe­ sondere mit Hilfe derer Nucleinsäuren aus einer be­ liebigen Probe in einfacher und kostengünstiger Weise isoliert werden können.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt eine Ma­ trix, die beispielsweise als Membran, als Kügelchen (beads) oder Säulengel ausgeführt sein kann und als Träger oder Grundgerüst für die nur aus Zufallsse­ quenzen bestehende DNA-Mischung fungiert. Es kann auch vorgesehen sein, magnetische Partikel, zum Beispiel Kügelchen, als Matrix einzusetzen.

Die Erfindung sieht in vorteilhafter Weise vor, als Material für die Matrix ein chemisch und physika­ lisch weitgehend inertes Material einzusetzen, wie Glas oder Kunststoff, zum Beispiel Polystyrol oder Polypropylen.

Insbesondere muß das Material geeignet sein, Tempe­ raturunterschiede in einem Intervall zwischen 10°C und 90°C, pH-Unterschiede in einem Intervall zwi­ schen 0 bis 14 und Natrium- beziehungsweise Calium­ chloridionenkonzentrationen in einem Intervall von 10 mM bis 2 M ohne Veränderung der Materialeigen­ schaften zu tolerieren. Darüber hinaus muß das ein­ gesetzte Material unlöslich in Wasser Detergentien und Tensidmischungen sowie chemisch inert gegenüber chaotropen Reagenzien, wie zum Beispiel Isogua­ nidinthiocyanat, sein.

Die Matrix ist in vorteilhafter Weise auf ihrer Oberfläche modifiziert, beispielsweise durch das Aufbringen von Biomolekülen, die hochaffin an der Oberfläche des Matrixmaterials binden. Ein derarti­ ges auf der Matrix immobilisiertes Biomolekül kann zum Beispiel Streptavidin sein. Die Matrixoberflä­ che kann jedoch auch derart modifiziert sein, daß eine kovalente Bindung zwischen den Zufallssequen­ zen der DNA-Mischung und der Matrix ermöglicht wird. Demgemäß kann die Matrix Aminogruppen aufwei­ sen, die über einen Dialdehydspacer beziehungsweise ein Dialdehydverbindungsmolekül, zum Beispiel Glu­ tardialdedyd, unter Bildung einer Schiff'schen Base mit einer zum Beispiel am 5'-Ende der DNA-Zufalls­ sequenzen eingeführten Aminofunktion eine Bindung eingehen kann. Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, die Matrix vor Modifizierung ihrer Oberfläche zu reinigen, zum Beispiel mit Salpetersäure. Zudem sieht die Erfindung in vorteilhafter Ausführungs­ form vor, die Oberfläche der Matrix vor der Modifi­ zierung zu silanisieren.

Die Zufallssequenzen der DNA-Mischung weisen demge­ mäß zum Zweck der Immobilisierung an der Matrix ebenfalls Modifikationen, vorzugsweise am 5'-Ende, auf. Derartige Modifikationen können beispielsweise mit dem 5'-Ende der DNA-Zufallssequenz verbundene Biomoleküle wie Biotin sein, die hochaffin an auf der Matrix immobilisierte andere Biomoleküle bin­ den, wie beispielsweise Streptavidin. Es kann auch vorgesehen sein, Aminofunktionen in die DNA- Zufallssequenzen einzuführen, so daß diese unter Bildung einer Schiff'schen Base mit an der Matrix immobilisierten Aldehydgruppen kovalent binden kön­ nen.

In jedem Fall werden die modifizierten DNA- Zufallssequenzen in Einzelstrangform, also die DNA- Mischung, und die modifizierten Matrix miteinander in Kontakt gebracht, so daß die DNA-Mischung an der Matrix immobilisiert wird. Die mit der erfindungs­ gemäß einzusetzenden DNA-Mischung beladene Matrix wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch als Affinitätsmatrix bezeichnet.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung oder Affinitätsma­ trix kann in vorteilhafter Weise auch auf der Ober­ fläche von Partikeln aufgebracht werden, die im Rahmen eines Aufschlusses dem Aufschluß zu- bezie­ hungsweise ausgesetzt werden.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer nur aus Zufallssequenzen bestehenden DNA-Mischung, insbesondere einer gleichteiligen Mischung, aus 4^x verschiedenen DNA-Zufallssequenzen, wobei x gleich der Kettenlänge der DNA-Zufallssequenz ist, vor­ zugsweise 10, zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen und dazugehöriger Figuren näher erläutert.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 eine Matrix einer erfindungsgemäßen Vor­ richtung,

Fig. 2 eine erfindungsgemäße Vorrichtung bezie­ hungsweise DNA-Affinitätsmatrix,

Fig. 3 ein Elektropherogramm und

Fig. 4 zwei Chromatogramme der Bindung von Stan­ dard-DNA an unbehandelte und behandelte Glasperlen.

Beispiel 1 Vorrichtung zur DNA-Isolierung

Die Fig. 1 zeigt eine Matrix 10, die in Form einer Membran 1 ausgeführt ist. Die Membran 1 ist auf ih­ rer Oberfläche mit Streptavidinmolekülen 3 be­ schichtet.

Die Fig. 2 stellt eine Affinitätsmatrix 100 dar, die hergestellt wurde, indem die Matrix 10 mit 5' modifizierten chemisch oder synthetisch hergestell­ ten DNA-Zufallssequenzen 7, 7', 7" einer DNA-Mi­ schung in Einzelstrangform in Kontakt gebracht wur­ de, wobei die 5'-Modifikation der DNA-Zufallsse­ quenz diese in die Lage versetzt, hochaffin an die Streptavidinmoleküle 3 zu binden. Die Fig. 2 stellt dar, daß die 5'-Enden der DNA-Zufallsse­ quenzen 7, 7', 7" jeweils an Biotin 5 gebunden sind. Die Biotinmodifikation am 5'-Ende der DNA- Zufallssequenzen 7, 7', 7" bindet hochaffin an die immobilisierten Spreptavidinmoleküle 3, so daß eine auf einer Matrix 10 immobilisierte DNA-Mischung mit den einzelnen DNA-Zufallssequenzen 7, 7', 7" ge­ bildet wird.

Beispiel 2 Isolierung von DNA aus einem Zellauf­ schluß A) Herstellung der Affinitätsmatrix

Für die Versuche wurden Ballotini Micro-Glaskugeln Typ 3000 der Firma Potters-Ballotini GmbH, Kirch­ heimbolanden verwendet. Ihre Größe war mit bis zu 50 µm angegeben. Um das Ausgangsmaterial zu reini­ gen und die Oberfläche für die Silanisierung vorzu­ bereiten, wurden die Glaskügelchen in Salpetersäure gekocht. 50 g der Glaskügelchen wurden in einen 1 l-Dreihalskolben mit Rücklaufkühler zu 500 ml circa 7%iger Salpetersäure gegeben. Über einen Heizpilz wurde bis zum Sieden erhitzt und 1 Stunde unter Rückfluß gekocht. Währenddessen wurde über einen Magnetrührer mit Rührfisch gerührt. Nach dem Erkalten wurde die überstehende Flüssigkeit abde­ kantiert. Die Glaskügelchen wurden dreimal mit Was­ ser in MilliQ-Qualität gewaschen und über eine Nut­ sche abfiltriert. Bei 95°C wurden sie über Nacht im Trockenschrank getrocknet. Da nach dem Trocknen mit bloßem Auge noch Verunreinigungen zu erkennen wa­ ren, wurde der gesamte Reinigungsvorgang nochmals wiederholt.

10 g der trockenen und gereinigten Glaskügelchen wurden zu 200 ml trockenem Methanol in einen 250 ml Einhals-Rundkolben gegeben. Der Kolben wurde mit Argon gespült. Es wurden 20 ml 3-Aminopropyltrime­ thoxysilan (Fluka) zugegeben. Als Katalysator wur­ den 0,5 ml Triethylamin zugesetzt. Der Ansatz wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reakti­ onslösung wurde abdekantiert und die Glaskügelchen mit Wasser (MilliQ) gewaschen und über eine Nutsche abfiltriert.

Zunächst wurde aus 160 ml 0,1 M K₂HPO₄ und 40 ml 0,1 M KH₂PO₄ ein Kaliumphosphatpuffer hergestellt und auf pH 7,5 eingestellt. Aus 10 ml 25%iger Glu­ tardialdehyd-Lösung und 90 ml des Kaliumphosphat­ puffers wurde eine 2,5%ige Glutardialdehyd-Lösung hergestellt. Zu 40 ml der 2,5%igen Glutardialdehyd- Lösung wurden 4 g der silanisierten Glaskügelchen zugegeben und circa 1 Stunde bei Raumtemperatur ge­ rührt. Die Glaskügelchen wurden anschließend mit Wasser, Kaliumphosphatpuffer und wieder gut mit Wasser gewaschen.

Oligonukleotide (1 µmol pro Ansatz) (15-mere, jedes 15-mer in gleicher Konzentration, das heißt, es liegt eine Verteilung sämtlicher theoretisch mögli­ cher Oligomere mit den Nucleotiden A, T, G und C in jeweils gleichen Anteilen vor, Firma Interactiva, Ulm, Deutschland) wurden in 1 ml Kaliumphosphatpuf­ fer aufgenommen. In einem 15 ml Röhrchen (Greiner GmbH) wurde zu 4 ml Kaliumphosphatpuffer 1 g der silanisierten und mit Glutardialdehyd aktivierten Glaskügelchen sowie 1 ml der Primer-Lösung zugege­ ben. Der Ansatz wurde kurz in Eis gekühlt. Über Nacht wurde das Röhrchen im Kühlraum auf einen Rol­ ler gelegt und dort 17 Stunden gerollt. Die Glaskü­ gelchen wurden in einer Minifuge (Heraeus) 5 Minu­ ten bei 1500 U/min abzentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert und zunächst im Kühlschrank auf­ bewahrt. Das Pellet wurde dreimal in circa 6 ml Ka­ liumphosphatpuffer aufgenommen und abzentrifugiert, um ungebundene Primer auszuwaschen. Die Kügelchen wurden mit Wasser (MilliQ) aufgeschlemmt und je zur Hälfte in zwei Eppendorfhütchen gegeben. Die eine Hälfte wurde so eingefroren, die andere Hälfte wur­ de in 3 Durchgängen zu je 10 Minuten in der Speed­ vac getrocknet und ebenfalls im Gefrierschrank ge­ lagert. Um abschätzen zu können, ob tatsächlich Primer gebunden wurden, wurden von der Primer- Stammlösung und vom Überstand nach dem Anfügen UV- Spektren bei 260 mm aufgenommen. Aus den Spektren wurde die jeweilige Primer-Konzentration ermittelt.

B) Zellaufschluß und DNA-Isolierung

In einem Reaktionsgefäß wurden 10² bis 10⁹ der auf­ zuschließenden Zellen in 0,05 bis 1 ml eines Puf­ fers der Zusammensetzung 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄ und 8,1 mM Na₂HPO₄, pH = 7,0, vorge­ legt. Anschließend wurden 50 bis 500 mg der Oligo­ nukleotid-beschichteten Affinitätsperlen zugegeben. Zum Aufschluß der Zellen wurde in die entstehende Mischung Ultraschall der Frequenz 20 bis 30 kHz über einen Becherresonator eingekoppelt. Das Reak­ tionsgemisch erwärmte sich dabei auf durchschnitt­ lich 80°C, was ausreichte, die freigesetzte doppel­ strängige DNA zu denaturieren, so daß sie beim Ab­ kühlen der Reaktionsmischung durch Hybridisierung an die Affinitätsmatrix zu binden vermochte. Durch Unterschichten des Reaktionsgemisches mit Chloro­ form wurde eine Phasentrennung herbeigeführt, wobei sich die Glasperlen, aufgrund ihres hohen spezifi­ schen Gewichtes in der Chloroformphase anreicher­ ten. Der wäßrige Überstand, der neben Zelltrümmern alle wasserlöslichen Bestandteile des Zellauf­ schlusses enthält, wurde abgenommen und die Glas­ perlen, denen die zu isolierende DNA anhaftete, im Vakuum getrocknet.

Wurde die Isolierung der DNA an Dynabeads durchge­ führt, wurden 50 µl Zellysat mit 50 µl konjugierten Dynabeads der Konzentration 5 mg/ml in einem Puffer der Zusammensetzung 20 mM Tris/HCl pH = 7,5, 1 M LiCl, 2 mM EDTA, versetzt. Das resultierende Ge­ misch inkubierte hier für 10 Minuten auf einem Rol­ ler und für weitere 10 Minuten im Stehen. Die mit DNA beladenen Partikel wurden magnetisch separiert und zweimal mit je 100 µl Waschpuffer nach Herstel­ lerangaben gewaschen.

C) Elution von DNA von der Affinitätsmatrix

Die DNA enthaltenden Affinitätsmatrices wurden wahlweise in Wasser oder einem Puffer der Zusammen­ setzung 10 mM Tris, 1 mM EDTA, ph = 8,0 aufgewärmt. Die resultierende Suspension wurde 10 Minuten zum Sieden erhitzt, wobei sich die an die Affinitätsma­ trix gebundene DNA löste und mit dem Überstand, in der Hitze, abgenommen werden konnte.

Beispiel 3 DNA-Isolierung und PCR

In einem ersten Experiment wurde die prinzipielle Durchführbarkeit der Isolierung von DNA an immobi­ lisierten DNA-Zufallssequenzen (15-mere, wie in Beispiel 2) gezeigt. Dazu wurden am 5'-Ende bio­ tinylierte DNA-Zufallssequenzen an kommerziell er­ hältliche Streptavidin-beschichtete magnetische Partikel immobilisiert und ihre DNA-Bindungseigen­ schaften mit den Bindungseigenschaften eines kom­ merziell erhältlichen DNA-Isolierungssystems (DYNAL Direct) verglichen. Als Referenz-DNA diente ein das MIF-Gen enthaltendes Plasmid, das aus intakten Escherichia coli Zellen durch chemischen Zellauf­ schluß freigesetzt wird. Nach der Plasmid- Isolierung wurde das MIF-Gen mit einem geeigneten Sondenpaar amplifiziert und die PCR-Produkte elek­ trophoretisch getrennt. Die Ergebnisse dieser Ver­ gleichsuntersuchungen sind in Fig. 3 dargestellt. Die Bahnen 3 und 4 des Elektropherogramms repräsen­ tieren das MIF-PCR-Produkt von Plasmid-DNA, die an DNA-Zufallssequenzen isoliert werden konnte. Dem sind in den Bahnen 5 und 6 die MIF-PCR-Produkte der mit Hilfe des kommerziellen Systems isolierten Plasmid-DNA gegenübergestellt. Es zeigt sich weder ein qualitativer, noch ein quantitativer Unter­ schied zwischen beiden Isolierungsstrategien.

Beispiel 4 Affinitätschromatographie

Die als Affinitätsmatrix zur DNA-Isolierung herge­ stellten Glasperlen nach Beispiel 2 wurden in eine HPLC-Leersäule übergeführt und dort auf ihre DNA- Bindungskapazität untersucht. Ein wesentlicher Vor­ teil säulenchromatographischer Verfahren gegenüber sogenannten Batch-Verfahren ist ihre hohe Reprodu­ zierbarkeit und die Möglichkeit, die Versuchsbedin­ gungen (Flußrate, Laufmittel, Temperatur) auf ein­ fache Weise variieren zu können. Die Fig. 4 stellt Chromatogramme der Bindung von Standard-DNA (je­ weils 25 µg) bei 50°C und einem Puffer der Zusam­ mensetzung 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH = 8,0 an unbehandelte Glasperlen und an Glasper­ len mit immobilisierten DNA-Zufallssequenzen dar. Die Differenz der Flächen unter den Kurven (Kurve 1: Glasperlen ohne DNA-Zufallssequenz; Kurve 2: Glasperlen mit DNA-Zufallssequenz) entspricht der DNA-Bindungskapazität der Affini­ tätsmatrix. Die Flußrate betrug jeweils 0,1 ml/min. Unter den gewählten Bedingungen zeigte sich (vgl. Fig. 4), daß die DNA-Bindungskapazität der mit Zu­ fallssequenzen beschichteten Glasperlen die Bin­ dungskapazität unbeschichteter Glasperlen um das 7,16 fache übertraf.

Claims (13)

1. Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, wobei eine immobilisierte, nur aus Zu­ fallssequenzen bestehende DNA-Mischung mit der Pro­ be so in Kontakt gebracht wird, daß eine Bindung von in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren an die immobilisierte DNA-Mischung stattfinden kann und wobei die gebundenen Nucleinsäuren nach einem gege­ benenfalls erfolgenden Waschschritt von der immobi­ lisierten DNA-Mischung abgelöst werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die immobili­ sierte, nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA- Mischung unter Einfluß einer Ultraschallbehandlung mit der Probe in Kontakt gebracht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die ge­ bundenen Nucleinsäuren durch Erhöhung der Tempera­ tur, insbesondere auf 70°C, in Gegenwart eines Lö­ semittels abgelöst werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wo­ bei das Lösemittel, das Waschmittel oder beides Wasser oder eine Pufferlösung ist.

5. Vorrichtung zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfas­ send eine nur aus Zufallssequenzen (7, 7', 7") be­ stehende DNA-Mischung, die an einer Matrix (10) im­ mobilisiert ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei die DNA- Mischung 4^x verschiedene DNA-Zufallssequenzen (7, 7', 7") aufweist, mit x gleich der Anzahl der Nucleotide pro DNA-Zufallssequenz, vorzugsweise mit x gleich 10.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei in der DNA-Mischung die Zufallssequenzen (7, 7', 7") zu, vorzugsweise im wesentlichen, glei­ chen Anteilen vorhanden sind.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei jede Zufallssequenz (7, 7', 7") am 5'-Ende mo­ difiziert, insbesondere biotinyliert, ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei jede einzelne DNA-Zufallssequenz (7, 7', 7") am 5'-Ende eine Aminogruppe aufweist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei die Oberfläche der Matrix (10) immobilisierte Biomoleküle (3) zur Bindung der DNA-Mischung auf­ weist, insbesondere Streptavidin.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei die Oberfläche der Matrix (10) Aminogruppen aufweist, an die Dialdehydgruppen gebunden sind.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 11, wobei die Matrix (10) als Membran (1) oder Säulen­ gel ausgeführt ist.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 12, wobei die Vorrichtung auf der Oberfläche von Parti­ keln aufgebracht ist.