DE10318048A1

DE10318048A1 - Nicht fluoreszierende, durch Proteolyse zur Fluoreszenz aktivierbare Reporterproteine und ihre Verwendung zur Detektion Protease-abhängiger Ereignisse

Info

Publication number: DE10318048A1
Application number: DE2003118048
Authority: DE
Inventors: Rico Dr. Laage; Moritz Dr. Rossner
Original assignee: Axaron Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2003-04-17
Filing date: 2003-04-17
Publication date: 2004-11-04
Also published as: WO2004092211A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, codierend für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein, welches an seinem N-Terminus mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz umfasst, sowie das von dieser Nukleinsäure kodierte Protein oder eines seiner Fusionsproteine. DOLLAR A Die Erfindung betrifft weiterhin eine Nukleinsäure, codierend für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein, welches mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz umfasst, die im Protein nach der Aminosäure mit der Position 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. 13, 14, 15, gezählt vom N-Terminus des Proteins, insertiert ist, sowie das von dieser Nukleinsäure kodierte Protein oder eines seiner Fusionsproteine. DOLLAR A In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Vektor, der eine der genannten Nukleinsäuren umfasst, sowie einen Kit, der einen dieser Vektoren bzw. ein Protein, welches von einem dieser Vektoren kodiert wird, umfasst. DOLLAR A Weiterhin umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Detektion oder zur Charakterisierung einer Protease-Aktivität in einer Zelle, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: DOLLAR A a) Transfektion einer Zelle mit einem rekombinanten Vektor, kodierend für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein, welches mindestens eine ein- oder beidseitig von ...

Description

Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäure codierend für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein, welches an seinem N-Terminus mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz umfasst, sowie das von dieser Nukleinsäure kodierte Protein oder eines seiner Fusionsproteine.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Nukleinsäure codierend für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein, welches mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz umfasst, die im Protein nach der Aminosäure mit der Position 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, gezählt vom N-Terminus des Proteins, insertiert ist, sowie das von dieser Nukleinsäure kodierte Protein oder eines seiner Fusionsproteine.
In einem weiteren Aspekt, betrifft die Erfindung einen Vektor, der eine der genannten Nukleinsäuren umfasst, sowie einen Kit, der einen dieser Vektoren bzw. ein Protein, welches von einem dieser Vektoren kodiert wird, umfasst.
Weiterhin umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Detektion oder zur Charakterisierung einer Protease-Aktivität in einer Zelle umfassend die folgenden Verfahrensschritte:

a) Transfektion einer Zelle mit einem rekombinanten Vektor, kodierend für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein, welches mindestens eine ein oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz am N-Terminus angehängt oder durch Insertion umfasst,
b) Aktivierung einer bislang inaktiven Protease in der Zelle oder Aktivierung der Expression einer Protease in der Zelle, wobei die Protease-Schnittstellen aus a) Substrate dieser Protease darstellen,
c) Generierung eines fluoreszierenden Proteins durch proteolytische Entfernung der mindestens einen ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierten Stör-Aminosäuresequenz aus a) aus dem nicht fluoreszierenden Protein aus a),
d) Detektion der Fluoreszenz des fluoreszierenden Proteins aus c).

Der Abbau bzw. die Spaltung von Proteinen in Organismen wird durch die Enzymfamile der Proteasen katalysiert. In den letzten Jahren zeigte sich, dass Proteasen über den reinen Proteinabbau hinaus ein weitreichendes Aufgabenspektrum in zellulären Systemen übernehmen. Zahlreiche Proteasen haben intrazellulär lokalisierte Substrate. So spielt beispielsweise das Proteasom, ein Multienzymkomplex, eine zentrale Rolle beim Abbau von Ubiquitin-markierten Proteinen. Auch apoptotische Signalkaskaden werden von Proteasen, den Caspasen und Calpainen initiiert und kontrolliert. Weiterhin sind proteolytische Aktivitäten zur Regulation des Zellzyklus notwendig, die Aktivität der Separase. Extrazelluläre bzw. sezernierte Proteasen regulieren beispielsweise Prozesse in der Embryonalentwicklung (Romboid), sind für Auswachsen von Zellfortsätzen von Bedeutung (insbesondere Metalloproteasen), dienen der Aktivierung von Enzymen und Signalkaskaden (insbesondere Plasminogen, Thrombin und Renin) oder katalysieren die Nahrungsverdauung (insbesondere Trypsin, Chymotrypsin).
Darüber hinaus sind Proteasen auch wichtige Angriffspunkte für pharmazeutische Substanzen. Insbesondere die Caspasen, deren Hemmung zur Verhinderung von Zelltod führt, oder die Familie der Secretasen, die bei der Entstehung der Alzheimerschen Krankheit eine Rolle spielen, stellen wichtige physiologische Targets für therapeutisch wirksame Substanzen dar. Weiterhin sind virale Proteasen interessante Targets für die Therapie von Krankheiten wie AIDS oder Hepatitis.
Aus den oben genannten Gründen kommt der spezifischen Analyse und Diagnostik von Proteasen eine besondere Bedeutung zu. Der in vivo-Nachweis von proteolytischen Aktivitäten erfolgt häufig über die Detektion des entsprechenden gespaltenen Substrats der betreffenden Protease. Hierbei haben sich insbesondere fluoreszenzbasierte Nachweisverfahren durchgesetzt (Twining, SS; Anal Biochem 1984 Nov 15;143(1):30-4). Diese beruhen meistens auf der Kopplung von einem Peptid, welches die spezifische Erkennungs- und/oder Schnittstelle für die Protease umfasst, und einem bzw. mehreren Fluoreszenzfarbstoffen. Die Farbstoffe ändern durch die Spaltung des Peptides ihre fluoreszierenden Eigenschaften. Diese modifizierten Fluoreszenzeigenschaften können anschließend durch eine entsprechende Fluoreszenz-Messung nachgewiesen werden.
Die einfachste Variante dieses Verfahrens ist die direkte Kopplung synthetischer Farbstoffmoleküle an den C- oder N-Terminus eines kurzen Substratpeptides. Der dabei entstehende Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET), bzw. ein auftretender „Selfquenching-Effekt" wird durch die Spaltung des Peptidsubstrates aufgehoben und kann durch eine vergleichende Fluoreszenz-Messung vor und nach der proteolytischen Spaltung des Substratpeptides gemessen werden (zB. Jones, LJ et al.; Anal Biochem 1997 Sep 5;251(2):144-52).
In einem ähnlichen Verfahren, das ebenfalls auf dem FRET-Effekt basiert, werden in einer Zelle fluoreszierende Fusionsproteine mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften exprimiert. Die Fusionsproteine umfassen hierbei insbesondere das „green fluorescent protein" (GFP) oder eine seiner Varianten und eine spezifische Substrat-Schnittstelle für eine Protease. Auch hier hebt die Spaltung der Substrat-Schnittstelle einen FRET Effekt auf und erlaubt somit die Messung der proteolytischen Aktivität (Pollok, BA; Trends Cell Biol 1999 Feb;9(2):57-60).
Bei diesen Verfahren zur Detektion Protease-abhängiger zellulärer Ereignisse unterscheidet man zwischen solchen Verfahren, bei denen das Nachweis-Substrat die Membran passieren kann oder nicht passieren kann. Kann das Nachweis-Substrat die Membran nicht durchdringen, so muß das Substrat der Protease einem Zell-Lysat bzw. einer Analyseprobe zugegeben werden. Die Aktivität wird dann in vitro bestimmt. Bei solchen Verfahren, bei denen die Substrate für die Protease die Zellmembran passieren können, können die nachzuweisenden Protease-Substrate direkt auf die Zellen gegeben. Die Protease-Substrate werden in diesem Fall von den Zellen aufgenommen und werden in vivo in der Zelle umgesetzt. Die proteolytische Aktivität kann somit ebenfalls in vivo – und ohne die Zugabe von chemischen Substanzen oder künstlich synthetisierten Peptiden – gemessen werden, was für viele Fragestellungen einen großen Vorteil darstellt.
Die Notwendigkeit zur Bereitstellung von Protease-Substraten, die die Zellmembran passieren können, wird bei in vivo-Messungen durch die direkte Expression des nachzuweisenden Protease-Substrates in den entsprechenden Zellen vermieden.
Die Entdeckung des GFPs als Werkzeug in der Zellbiologie hat sich bei der Analyse vieler intrazellulärer Prozesse als sehr hilfreich erwiesen (Chalfie, M et al.; Science. 1994 Feb 11;263(5148):802-5). Das Grün fluoreszierende Protein der Qualle Aequorea victoria ist 238 Aminosäuren lang. Die Wildtyp-Variante des Proteins (GFP) absorbiert bei 395 nm und 475 nm und emittiert bei 508 nm. Die Fluoreszenz wird verursacht durch die interne Ser-Tyr-Gly-Sequenz an der Aminosäure-Position 65-67, die mittels Ringbildung eine p-Hydroxybenzyliden-Imidazol-Struktur bildet.
Die Aufklärung der Kristallstruktur von GFP zeigte, dass GFP eine sehr stabile "β-barrel-Struktur" besitzt, in deren Zentrum sich der Fluorophor befindet. Der starre Aufbau des GFP größtenteils aus „β-Faltblattstrukturen" ist für die große Stabilität des GFPs verantwortlich.
In den vergangenen Jahren wurden durch die Einführung von Mutationen in die Wildtyp-Form des Proteins GFP zahlreiche Varianten des GFPs, unter anderem auch Farb-Varianten, entwickelt. Besonders zu erwähnen sind die Varianten mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften (Farb-Varianten), wie insbesondere das YFP (Yellow Fluorescent Protein), das CFP (Cyan Fluorescent Protein) und das BFP (Blue Fluorescent Protein), sowie Varianten des GFPs mit unterschiedlicher Expressionstärke und Lebensdauer, wie insbesondere EGFP (Enhanced green fluorescent protein), EYFP (Enhanced yellow fluorescent protein), ECFP (Enhanced cyan fluorescent protein), sowie pH-sensitive Varianten ( EP804457B ; EP886644 ; EP851874B ).
Darüber hinaus werden GFP und seine Varianten auch als Reporter-Gene für die Detektion von Protein-Protein-Interaktionen und durch Kopplung an entsprechende Sensormoleküle auch als Calcium-Indikatoren verwendet ( EP949269 ; WO9830715; WO0071565).
Wie oben bereits dargelegt, können GFPs auch zur Analyse der Aktivität von Proteasen verwendet werden. Die hierzu bekannten Verfahren beruhen auf dem FRET-Effekt. Hierbei werden in der Regel zwei Varianten des GFPs benutzt, bei denen sich das Emissions- und das Absorptionsspektrum überlagern. Befinden sich beide GFP-Varianten in großer räumlicher Nähe, so erfolgt nach Anregung der Variante A (z.B. CFP) durch FRET die Anregung der Variante B (z.B. YFP). Die Aminosäuresequenzen für beide Varianten sind durch eine entsprechende Protease-Schnittstelle miteinander verknüpft, so daß ein permanenter FRET-Effekt auftritt. Wird diese Verbindung durch Proteolyse getrennt, so verändert sich das Verhältnis der Emissionsmaxima der beiden GFP-Varianten, was anschließend gemessen werden kann (WO0073437).
Eine sehr ähnliche Methode zur Bestimmung von Proteaseaktivität mit Hilfe von GFP ist der Bioluminescence Resonanz Energie Transfer (BRET). BRET basiert generell auf dem selben Prinzip wie der beschriebene FRET-Sensor, die Energie wird lediglich nicht durch die Anregung einer GFP-Variante A erzeugt, sondern durch die Aktivierung eines chemielumineszierenden Proteins. Die Messung der Protease-Aktivität erfolgt hier wiederum über die Änderung des Emissionsmaximums von GFP.
Nachteil dieser FRET-basierten Verfahren ist in erster Linie der relativ große instrumentelle Aufwand bei der Detektion. Darüber hinaus sind die Unterschiede der Emissionspektra häufig sehr schwach und machen das System sehr anfällig für Fehler.
Den direkten Nachweis einer Proteaseaktivität mittels fluoreszierender Proteine erlaubt ein Verfahren, bei dem, in das ansonsten sehr proteolysestabile GFP, an bestimmten Stellen Protease-Schnittstellen insertiert werden. Diese Insertionen sind so gewählt, dass bei Proteolyse die Fluoreszenz verloren geht (Chiang, CF et al.; Arch. Biochem. Biophys. 2001, 394, 229). Dieses Verfahren erfordert jedoch eine sehr starke und eine über längere Zeit anhaltende Proteaseaktivität, um eine signifikante Abnahme der Fluoreszenz des permanent nachsynthetisierten GFPs zu detektieren. Dadurch wird die Vielfalt der analysierbaren Proteaseaktivitäten stark begrenzt. Insbesondere zeitlich kurz anhaltende, transiente und schwache Proteaseaktivitäten können mit Hilfe dieses Verfahrens nicht detektiert und analysiert werden.
Ein weiteres Verfahren, in welchem GFP zur Detektion benutzt wird, beruht auf der Änderung der Lokalisation eines fluoreszierenden Proteins. Dabei wird ein Fusionsprotein exprimiert, welches GFP oder eine seiner Varianten umfasst. Das GFP ist hierbei am N-Terminus über eine spezifische Protease-Schnittstelle mit einem Kernexportsignal fusioniert und am C-Terminus des Fusionsproteins befindet sich ein Kernimportsignal. Das Auftreten einer Protease-Aktivität führt zur Abspaltung des Kernexportsignals. Dies führt zur Akkumulation der Fluoreszenz im Kern (BD-Bioscience ApoAlert Caspase-3-sensor; Clontechniques, 2002, 4). Nachteil dieses Verfahrens ist, daß es eine entsprechend starke Protease-Aktivität voraussetzt, um ein eindeutig positives Signal zu erhalten. Die Sensitivität des Verfahrens ist somit begrenzt. Die automatische Detektion der Lokalisationsänderung des fluoreszierenden Proteins ist sehr aufwendig und ungenau, daher ist das Verfahren auch nur bedingt geeignet zum Hochdurchsatz-Screening.
Ein Verfahren, das den variablen Einsatz von Reportergenen erlaubt, ist das protease based gene switching system, das in WO 99/11801 beschrieben wird. Hierbei wird ein Transkriptionsaktivator über eine spezifische Protease-Schnittstelle an einer Transmembrandomäne verankert und somit inaktiviert. Proteolytische Spaltung führt zur Freisetzung des Aktivators, der anschließend die Transkription eines zuvor inserierten Reportergens anschaltet. Ein Nachteil der Methode ist die stabile Lokalisation des Substrates an der Zellmembran: die Lokalisation der Protease-Schnittstelle an der Membran erfordert, daß auch die Protease an der Membran lokalisiert ist bzw. in deren Nähe gelangt. Darüber hinaus bedeutet der Nachweis der Reportergen-Expression eine in vielen Fällen unerwünschte zeitliche Verzögerung zwischen dem zu analysierenden Ereignis, d.h. dem Proteolyse-abhängigen Ereignis in der Zelle, und dem Detektionssignal.
Die oben genannten Verfahren zur Detektion von Protease-Aktivitäten beinhalten jeweils mindestens einen der folgenden Nachteile:

– keine Detektion in vivo
– relativ großer instrumenteller Aufwand bei der Detektion im Rahmen der FRET-basierten Verfahren
– geringe Sensitivität des Verfahrens
– große Fehleranfälligkeit des Verfahrens
– zeitliche Verzögerung zwischen dem zu analysierenden Ereignis, d.h. dem Proteolyse-abhängigen Ereignis in der Zelle, und dem Detektionssignal
– geringe Eignung zum Hochdurchsatz-Screening.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Detektion von Protease-Aktivitäten bzw. von Protease-abhängigen Ereignissen in der Zelle bereitzustellen, welches zumindest einige der obigen Nachteile der Verfahren nach dem Stand der Technik überwindet. Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, Nukleinsäuren und Proteine zur Durchführung dieses Verfahrens bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird zum einen gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens, welches die Detektion eines fluoreszierenden Sensorproteins in Abhängigkeit von der Aktivität einer bestimmten Protease in vivo erlaubt. Grundlage des Systems ist die heterologe Expression einer nicht fluoreszierenden Variante eines in seiner Wildtyp-Version fluoreszierenden Proteins, wie insbesondere die heterologe Expression einer Variante der GFP-Familie, welche eine kurze, von Protease-Schnittstellen ein- oder beidseitig flankierte Domäne im N-terminalen Bereich des Proteins umfasst. Diese Domäne weist vorzugsweise eine α-helikale räumliche Struktur auf. Die von Protease-Schnittstellen ein- oder beidseitig flankierte, vorzugsweise α-helikale Stör-Domäne befindet sich hierbei entweder am unmittelbaren N-Terminus des Proteins oder am N-Terminus eines seiner N-terminal trunkierten Fragmente oder ist nach der Aminosäure mit der Position 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, vorzugsweise aber nach der Aminosäure mit der Position 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, gezählt vom N-Terminus des Proteins, ins Protein insertiert.
Durch die Anwesenheit der ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierten Stör-Domäne am unmittelbaren N-Terminus (Anhängen der Stör-Domäne) oder im Bereich des N-Terminus (Insertion der Stör-Domäne) verliert das Protein seine fluoreszierenden Eigenschaften bzw. wird seine Fluoreszenz derart in ihrer Intensität reduziert, dass Zellen, die dieses Protein exprimieren, mit Standardverfahren nicht mehr von solchen Zellen unterscheidbar sind, die dieses Protein nicht exprimieren. Das so modifizierte Protein erscheint somit – im Vergleich zum Wildtyp-Protein wie ein nicht fluoreszierendes Protein.
Nach der proteolytischen Entfernung der Stör-Domäne durch eine in der Zelle auftretende, zu detektierende Protease-Aktivität kommt es jedoch wieder zu einer drastischen Erhöhung der Fluoreszenz-Intensität bzw. erlangt das Protein seine fluoreszierenden Eigenschaften zurück. Die Fluoreszenz des Proteins kann somit in Abhängigkeit von dem Auftreten einer Protease-Aktivität in der betreffenden Zelle detektiert werden.
Dieses Verfahren erlaubt den unmittelbaren Nachweis einer proteolytischen Aktivität in lebendigen Zellen, Geweben oder Organismen in vivo. Weiterhin erlaubt ein solches Verfahren durch das Protease-abhängige „Umschalten" eines nicht fluoreszierenden Proteins in ein fluoreszierendes Protein eine relativ einfache Detektion des Fluoreszenz-Signals vor einem niedrigen Hintergrund-Rauschen, insbesondere im Vergleich zu der recht aufwendig zu messenden Fluoreszenzänderung bei den FRET-basierten Verfahren. Dies begründet die hohe Sensitivität und geringe Fehleranfälligkeit des Verfahrens, sowie dessen Eignung zum Hochdurchsatz-Screening. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens ist, daß es zwischen der Protease-Aktivität in der Zelle, d.h. zwischen dem zu analysierenden Ereignis und dem Detektionssignal zu keinerlei zeitlichen Verzögerung kommt. Da auch eine geringe oder transiente, d.h. zeitlich begrenzte Protease-Aktivität in der Zelle zu einem fluoreszierenden Protein in der Zelle führt, eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Detektion transienter Protease-abhängiger Ereignisse, was von großem Vorteil ist. Weiterhin kann das nicht fluoreszierende, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbare Protein an beliebigen Stellen in und außerhalb der Zelle lokalisiert werden, z.B. durch nukleäre Import- und Exportsignale, sowie durch membranständige Domänen oder Präsequenzen für sekretorische Proteine. Die Fluoreszenzdetektion dieser Sensorproteine ist damit nicht auf ein bestimmtes Kompartiment der Zelle beschränkt.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird zum anderen auch durch die Bereitstellung solcher Nukleinsäuren und Proteine gelöst, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendig sind.
So wird die Aufgabe insbesondere durch die Bereitstellung einer Nukleinsäure gelöst, die für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein kodiert, welches an seinem N-Terminus mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz umfasst.
Vorzugsweise umfasst hierbei das nicht fluoreszierende, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbare Protein eine Sequenz nach SEQ ID No. 1 oder nach SEQ ID No. 2 oder eines ihrer Fragmente mit mindestens 5 Aminosäuren Länge, an deren N-Terminus die ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz fusioniert ist.
Besonders bevorzugt wird hierbei als nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein eine natürliche oder artifizielle Variante der GFP-Familie aus Aequorea victoria, insbesondere EGFP (Acc. No. U76561), EYFP (Acc. No. AJ510163, kodiert von der Region 6103-6822), ECFP (Acc. No. AJ510158, kodiert von der Region 6058-6780), GFP (Acc. No. X83959 ), YFP (Acc. No. AY189981, kodiert von der Region 1603-2331) oder CFP (Acc. No. BD136947) eingesetzt, wobei diese Variante der GFP-Familie an ihrem N-Terminus eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz umfasst.
Alternativ wird die Aufgabe insbesondere durch die Bereitstellung einer Nukleinsäure gelöst, die für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein kodiert, welches mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz umfasst, die nach der Aminosäure mit der Position 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, vorzugsweise aber nach der Aminosäure mit der Position 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, gezählt vom N-Terminus des Proteins, im Protein insertiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die erfindungsgemäße Nukleinsäure für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein, welches an seinem N-Terminus eine Aminosäuresequenz nach Sequenz nach SEQ ID No. 1 umfasst und bei dem mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz nach der Aminosäure mit der Position 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15, gezählt vom N-Terminus des Proteins, insertiert ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kodiert die erfindungsgemäße Nukleinsäure für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein, welches an seinem N-Terminus eine Aminosäuresequenz nach Sequenz nach SEQ ID No. 2 umfasst und bei dem mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz nach der Aminosäure mit der Position 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9, gezählt vom N-Terminus des Proteins, insertiert ist.
Besonders bevorzugt sind solche Nukleinsäuren, die für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein kodieren, wobei dieses Protein eine natürliche oder artifizielle Variante der GFP-Familie aus Aequorea victoria ist, welche mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz umfasst, die nach der Aminosäure mit der Position 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15, vorzugsweise nach der Aminosäure mit der Position 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9, gezählt vom N-Terminus des Proteins, in die Variante der GFP-Familie insertiert ist. Die natürlichen oder artifiziellen Varianten der GFP-Familie aus Aequorea victoria sind insbesondere die GFP-Varianten: EGFP (Acc. No. U76561), EYFP (Acc. No. AJ510163, kodiert von der Region 6103-6822), ECFP (Acc. No. AJ510158, kodiert von der Region 6058-6780), GFP (Acc. No. X83959 ), YFP (Acc. No. AY189981, kodiert von der Region 1603-2331) oder CFP (Acc. No. BD136947).
Die Stör-Aminosäuresequenz kann generell jede beliebige Länge größer als 3 Aminosäure, vorzugsweise größer als 5 Aminosäuren, stärker bevorzugt als 7 Aminosäuren, insbesondere größer als 10 Aminosäuren besitzen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besitzt die Stör-Aminosäuresequenz eine Länge zwischen 5 und 100 Aminosäuren.
Die Stör-Aminosäuresequenz kann generell jede beliebige Aminosäuresequenz besitzen. Vorzugsweise besitzt die Stör-Aminosäuresequenz aber eine Aminosäuresequenz, die dazu neigt, α-Helix-Strukturen auszubilden. Um diese Voraussetzungen zu erfüllen, umfasst die Stör-Aminosäuresequenz vorzugsweise solche Aminosäuren, die „Helixbildner" sind, wie insbesondere Leucin und Methionin, sowie polare oder geladene Aminosäuren wie insbesondere Glutamat, Aspartat, Arginin und Lysin. Letztere sollen die Gesamthydrophobizität senken und das Entstehen einer Transmembrandomäne verhindern.
Insbesondere kann die Stör-Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID No. 3 oder ein mindestens 5 Aminosäuren langes Fragment dieser Aminosäuresequenz nach SEQ ID No. 3 besitzen.
Die Stör-Aminosäuresequenzen sind in den erfindungsgemäßen nicht fluoreszierenden, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbaren Proteinen ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankiert.
Als „Protease-Schnittstelle" wird eine kurze Aminosäuresequenz definiert, die von einer spezifischen Protease erkannt und spezifisch geschnitten wird. So wird beispielsweise die Protease-Schnittstelle „ENLYFQG" spezifisch von der NIa-Protease des Tobacco Etch Virus (im folgenden „TEV-Protease" oder „TEV" genannt) erkannt und zwischen Q und G spezifisch von der TEV-Protease geschnitten. Andere Proteasen besitzen hingegen andere spezifische Protease-Schnittstellen, die größtenteils dem Fachmann bekannt sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können als Protease-Schnittstellen generell alle bekannten spezifischen Protease-Schnittstellen eingesetzt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Man wird jeweils die Protease-Schnittstelle zur ein- oder beidseitigen Flankierung der Stör-Aminosäuresequenz einsetzen, deren zugehörige Protease-Aktivität im Rahmen des Verfahrens detektiert oder charakterisiert werden soll. Als Protease-Schnittstelle können vorzugsweise die spezifischen Schnittstellen der Serin-/Threonin-Proteasen, der Cystein-Proteasen, der Aspartat-Proteasen, der Metalloproteasen und der unklassifizierten Proteasen eingesetzt werden. Insbesondere können die Erkennungs- und Schnittstellen der Proteasen aus Tabelle 1 als Protease-Schnittstellen zur Flankierung der Stör-Aminosäuresequenz verwendet werden. Viele der entsprechenden Schnittstellen der Proteasen aus Tabelle 1 sind dem Fachmann aus der Fachliteratur bekannt.
Tabelle 1:
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind solche Nukleinsäuren, die für ein Fusionsprotein eines der oben genannten nicht fluoreszierenden, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbaren Proteine kodieren. Ein solches Fusionsprotein umfasst ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein, welches mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz entweder am N-Terminus angehängt oder als Insertion nach der Aminosäure mit der Position 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 enthält, fusioniert mit einem weiteren Protein oder mit einer weiteren Proteindomäne. Das weitere Protein oder die weitere Proteindomäne kann hierbei in der Regel sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus des Fusionsproteins lokalisiert sein. Die Fusion am C-Terminus ist lediglich insoweit bevorzugt, als daß eine am N-Terminus lokalisierte weitere Proteindomäne durch die Protease-Aktivität, die die von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz am N-Terminus abspaltet, auch zur Abspaltung der weiteren Proteindomäne führen würde.
„Weitere Proteindomänen" im Sinne der obigen Definition des Fusionsproteins können vorzugsweise verschiedene Lokalisationsdomänen sein, die für die Kompartimentierung des Fusionsproteins in der Zelle verantwortlich sind, wie insbesondere ein Kernlokalisationssignal („nuclear localization signal" NLS), ein Kernexportsignal („nuclear export signal" NES), eine Membrandomäne, enthaltend vorwiegend hydrophobe Aminosäuren, eine klassische Präsequenz, die das Protein als „sekretorisches Protein" kennzeichnet, sowie weitere bekannte Lokalisationssignale für verschiedene Zellkompartimente.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Expressionskassette, die eine der oben genannten Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäuresequenzen unter der Kontrolle eines Promoters umfassen.
Der Promoter kann hierbei jeder bekannte Promoter sein, der in der Wirtszelle, in die die Expressionskassette eingebracht werden soll, aktiv ist, d.h. in dieser Wirtszelle die Transkription des nachgeschalteten Reportergens aktiviert. Der Promoter kann hierbei ein konstitutiver Promoter sein, der das nachgeschaltete Reportergen ständig exprimiert, oder ein nicht-konstitutiver Promoter, der nur zu definierten Zeitpunkten im Laufe der Entwicklung oder unter bestimmten Umständen (insbesondere unter Einfluß eines Transkriptionsaktivators oder in Abwesenheit eines Transkriptionsrepressors) exprimiert. Erfindungsgemäße Expressionskassetten, die als Promoter beispielsweise den CMV-Promoter enthalten, eignen sich für die Expression des nachgeschalteten nicht fluoreszierenden, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbaren Reporter-Proteins in eukaryontischen, insbesondere in Säugetier-Wirtszellen und Hefe-Wirtszellen. Erfindungsgemäße Expressionskassetten, die als Promoter beispielsweise den lac-Promoter enthalten, eignen sich für die Expression des nachgeschalteten nicht fluoreszierenden, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbaren Reporter-Proteins in prokaryontischen, insbesondere in Bakterien-Wirtszellen.
Der Ausdruck „unter der Kontrolle" eines Promoters bedeutet, daß die Promotersequenz und die Sequenz kodierend für das zu exprimierende nicht fluoreszierende, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbare Reporter-Protein so miteinander verknüpft sind, daß die Expression des Reporter-Proteins möglich ist.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann gegebenenfalls weitere Kontrollsequenzen enthalten. Unter einer Kontrollsequenz wird eine beliebige Nukleotidsequenz verstanden, die die Expression des nicht fluoreszierenden, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbaren Reporter-Proteins beeinflußt, wie insbesondere der Promoter, eine Operatorsequenz, d.h. die DNA-Bindungstelle für einen Transkriptionsaktivator oder einen Transkriptionsrepressor, eine Terminator-Sequenz, eine Polyadenylierungssequenz oder eine Ribosombindungsstelle.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der eine der obigen erfindungsgemäßen Expressionskassetten enthaltend ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein umfasst.
Ein solcher rekombinanter Vektor kann zusätzlich eine Nukleotidsequenz enthalten, durch die der Vektor sich in der betreffenden Wirtszelle replizieren kann. Solche Nukleotidsequenzen werden in der Regel „origin of replication" (deut. Replikationsursprung) genannt. Beispiele für solche Nukleotidsequenzen sind der SV40-Replikationsursprung, der in Säugetier-Wirtszellen zum Einsatz kommt, und in Hefe-Wirtszellen die Hefe-Plasmid 2μ Replikationsgene REP 1-3.
Der rekombinante Vektor kann weiterhin einen oder mehrere Selektionsmarker enthalten. Unter einem Selektionsmarker versteht man ein Gen, welches unter der Kontrolle eines Promoters steht und welches für ein Protein kodiert, das einen physiologischen Defekt der Wirtszelle komplementiert. Selektionsmarker stellen insbesondere das Gen kodierend für die Dihydrofolat Reduktase (DHFR) dar, oder auch ein Gen, welches die Resistenz gegen Antibiotika, wie insbesondere Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Blasticidin, Gentamycin, Chloramphenicol, Neomycin oder Hygromycin bewirkt.
Eine große Anzahl von rekombinanten Vektoren zur Expression eines Zielproteins in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen sind nach dem Stand der Technik bekannt und viele sind auch kommerziell erhältlich.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Wirtszelle, die mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor transient oder stabil transformiert worden ist.
Die Auswahl der geeigneten Wirtszelle, hängt von einer großen Anzahl an Faktoren ab, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Faktoren beinhalten insbesondere den gewählten Vektortyp, die Toxizität des exprimierten Proteins für die betreffende Wirtszelle, die zu beantwortende Fragestellung, die Expressionscharakteristika und physiologischen Wechselwirkungen des betreffenden Zielproteins in der Wirtszelle, die Sicherheitsrisiken und Kosten. Generell kann jede beliebige pro- oder eukaryontische Zelle bzw. Organismus als Wirtszelle eingesetzt werden.
Beispiele für geeignete prokaryontische Wirtszellen sind gram-positive Bakterien wie insbesondere Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus brevis, Streptomyces lividans etc. oder gram-negative Bakterien wie insbesondere E. coli.
Beispiele für geeignete eukaryontische Wirtszellen sind die Spezies der Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisae.
Beispiele für Zelllinien, die von Säugetieren stammen und die ebenfalls als Wirtszellen in Frage kommen, sind insbesondere die Zelllinien COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO K1 (ATCC CCL 61), NIH 3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCCL 2), MRC-5 (ATCC CCL 171), HEK 293 (ATCC CRL1573).
Der rekombinante Vektor kann in die betreffende Wirtszelle durch jegliche Transfektions-, Transformations- oder Injektionstechnik, die dem Fachmann bekannt ist, eingeführt werden. Insbesondere kann der rekombinante Vektor durch eine der folgenden Techniken in die betreffende Wirtszelle eingeführt werden: Calciumphosphat-Präzipitation, Elektroporation, Protoplastenfusion, Nukleinsäure-Injektion, Lipofektion, „gene gun" unterstützte Techniken, Infektion mit Virus-Partikeln oder Virus-abgeleiteten Partikeln und Protein-Transduktion mit TAT oder TAT-ähnlichen Sequenzen.
Die Wirtszelle kann hierbei entweder transient oder stabil transformiert worden sein. Bei der „transienten Transformation" einer Zelle bleibt der eingeführte Vektor in der Zelle in der Regel autonom, d.h. er integriert sich nicht in das Wirtszellgenom. Bei Teilung der transient transformierten Zellen in Tochterzellen wird der Vektor nicht mit übertragen. Dies führt dazu, daß der eingeführte Vektor sich nach mehreren Wachstumscyclen der transformierten Zellen so lange „herausverdünnt" bis die meisten Zellen keinen Vektor mehr enthalten. Auch bei transient transformierten Zellen kann man den Verlust des Vektors nach mehreren Wachstumscyclen unterbinden, indem der Selektionsdruck auf die Gegenwart des rekombinanten Vektors, der einen Selektionsmarker wie oben definiert umfasst, aufrecht erhalten wird.
Bei der „stabilen Transformation" einer Zelle integriert sich der eingeführte Vektor, der meist in linearisierter Form eingeführt wird, in das Wirtsgenom der Zelle. Bei Teilung der stabil transformierten Zellen in Tochterzellen werden demnach die ursprünglichen Vektorsequenzen als Bestandteil des Wirtsgenoms mit übertragen. Eine auf einem rekombinanten Vektor befindliche Expressionskassette wird daher dauerhaft, d.h. über eine große Anzahl von Wachstumscyclen hinweg, in den Tochterzellen exprimiert.
Transiente, sowie stabile Transformationstechniken sind dem Fachmann bekannt und in gängigen Nachschlagewerken nachzulesen (Freshney, IR; Culture of Animal Cells, 2000, 4th Ed. Wiley-Liss).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit zur Detektion und/oder zur Analyse von von Protease-Aktivitäten oder von Protease-abhängigen Ereignissen, welcher mindestens eine der folgenden Komponenten umfasst:

a) eine Nukleinsäure kodierend für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Reporter-Protein, welches mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz entweder am N-Terminus angehängt oder als Insertion nach der Aminosäure mit der Position 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 enthält, oder eine Nukleinsäure kodierend für ein Fusionsprotein dieses Reporter-Proteins,
b) eine Expressionskassette umfassend eine Nukleinsäure nach a) unter der Kontrolle eines Promoters,
c) einen rekombinanten Vektor, der mindestens eine der Expressionskassetten nach b) umfasst,
d) eine Wirtszelle, die mit mindestens einem rekombinanten Vektor nach c) transient oder stabil transformiert worden ist,
e) ein Protein, welches von einer Nukleinsäure nach a), von einer Expressionskassette nach b) oder von einem rekombinanten Vektor nach c) kodiert wird oder welches von einer Wirtszelle nach d) exprimiert wird.

Die Detektion und/oder Analyse von Protease-Aktivitäten oder von Protease-abhängigen Ereignissen erfolgt vorzugsweise in vitro in dem Zellextrakt einer Zelle, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor transformiert worden ist, insbesondere aber in vivo in einer Zelle, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor transformiert worden ist.
Die Detektion und/oder Analyse von Protease-Aktivitäten oder von Protease-abhängigen Ereignissen erfolgt vorzugsweise mittels Fluoreszenzmikroskopie von Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor transformiert worden sind. Die Detektion und/oder Analyse von Protease-Aktivitäten oder von Protease-abhängigen Ereignissen kann weiterhin mittels Fluoreszenzspekroskopie bzw. mittels Fluorescence Aided Cell Sorting („FACS") erfolgen.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. mit Hilfe des erfindungsgemäßen Kits können beliebige Protease-Aktivitäten in Zellen, Zellextrakten, Zellüberständen, in Fraktionen von Zellextrakten oder Zellüberständen detektiert und analysiert werden.
Insbesondere können solche Protease-Aktivitäten detektiert und analysiert werden, die in der Zelle lediglich transient, d.h. vorübergehend und nur in kurzen Zeiträumen auftreten. Da auch eine nur kurzzeitig auftretende Protease-Aktivität in der Zelle zur proteolytischen Entfernung der Stör-Aminosäuresequenzen aus dem Reporter-Protein – und damit letztlich zum Umschalten von einem nicht fluoreszierenden Reporter in einen fluoreszierenden Reporter – führt, können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch vorzugsweise transient auftretende, sowie schwache Protease-Aktivitäten gemessen werden.
Verschiedenste physiologisch signifikante zelluläre Ereignisse bzw. Signaltransduktionswege beinhalten das Auftreten von Protease-Aktivitäten, insbesondere das Auftreten von transienten, d.h. kurzzeitigen Protease-Aktivitäten in der Zelle. Insbesondere die Apoptose ist ein solches physiologische relevantes zelluläres Ereignis, welches mit dem Auftreten von Protease-Aktivitäten, insbesondere mit der Aktivität der Caspasen und der Calpaine einhergeht. Durch die Detektion der Aktivität dieser Apoptoserelevanten Proteasen könnten daher insbesondere apoptotische Zellen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens als fluoreszierende Zellen detektiert werden.
Generell können jedoch mit den erfindungsgemäßen Kits und/oder Verfahren alle beliebigen Protease-abhängigen Ereignisse in der Zelle detektiert werden.
Weiterhin können mit den erfindungsgemäßen Kits und/oder Verfahren nicht nur Protease-Aktivitäten oder Protease-abhängige Ereignisse selbst, sondern auch solche zellulären Ereignisse detektiert und analysiert werden, die die Ursache für das Auftreten der Protease-Aktivität in der Zelle oder eine Folge des Auftretens der Protease-Aktivität in der Zelle sind. Die Ursache für das Auftreten einer bestimmten Protease-Aktivität in der Zelle kann insbesondere auch das Auftreten einer spezifischen Protein-Protein-Interaktion sein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein oder Fusionsprotein, welches von einer der oben definierten Nukleinsäuren kodiert wird.
Besonders bevorzugt sind solche Reporter-Proteine oder Reporter-Fusionsproteine, die ein Derivat einer natürlichen oder artifiziellen Variante der GFP-Familie aus Aequorea victoria, insbesondere ein Derivat der Varianten EGFP (Acc. No. U76561), EYFP (Acc. No. AJ510163, kodiert von der Region 6103-6822), ECFP (Acc. No. AJ510158, kodiert von der Region 6058-6780), GFP (Acc. No. X83959 ), YFP (Acc. No. AY189981, kodiert von der Region 1603-2331) oder CFP (Acc. No. BD136947) sind.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Detektion und/oder zur Charakterisierung einer Protease-Aktivität in einer Zelle, welche die folgenden Verfahrensschritte umfasst:

a) Transfektion einer Zelle mit dem oben genannten rekombinanten Vektor zur rekombinanten Expression eines nicht fluoreszierenden Proteins oder Fusionsproteins, welches mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz am N- Terminus angehängt oder durch Insertion in die oben genannten Protein-Positionen umfasst,
b) Aktivierung einer bislang inaktiven Protease in der Zelle oder Aktivierung der Expression einer Protease in der Zelle, wobei die in Schritt a) genannten Protease-Schnittstellen Substrate dieser Protease darstellen,
c) Generierung eines fluoreszierenden Proteins oder Fusionsproteins durch proteolytische Entfernung der mindestens einen ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierten Stör-Aminosäuresequenz aus Schritt a) aus dem nicht fluoreszierenden Protein oder Fusionsprotein aus a),
d) Detektion der Fluoreszenz des fluoreszierenden Proteins oder Fusionsproteins aus c).

In Schritt a) wird eine geeignete Wirtszelle mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor zur rekombinanten Expression eines nicht fluoreszierenden Proteins, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbaren Reporter-Proteins entweder transient oder stabil transformiert. Das nicht fluoreszierende Protein besitzt hierbei entweder mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz, welche unmittelbar am N-Terminus des Proteins angehängt ist, oder mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz, welche nach einer Aminosäure mit der Position 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 im Protein insertiert ist. Das nicht fluoreszierende Protein kann auch an seinem N-Terminus oder vorzugsweise an seinem C-Terminus mit einer weiteren Proteindomäne fusioniert sein. Die Transformation kann über alle dem Fachmann bekannten Transformations- und Transfektionstechniken erfolgen, so insbesondere durch Calciumphosphat-Präzipitation, Elektroporation, Protoplastenfusion, Nukleinsäure-Injektion, Lipofektion, „gene gun" unterstützte Techniken, Infektion mit Virus-Partikeln oder mit Virus-abgeleiteten Partikeln und Protein-Transduktion mit TAT oder TAT-ähnlichen Sequenzen. Der rekombinante Vektor besitzt hierbei vorzugsweise die oben bereits erläuterten Eigenschaften.
In Schritt b) erfolgt gegebenenfalls die Aktivierung einer bislang inaktiven Protease in der Zelle oder auch die Aktivierung der Expression einer Protease in der Zelle. Die in Schritt a) genannten Protease-Schnittstellen stellen hierbei Substrate dieser aktivierten oder exprimierten Protease aus Schritt b) dar.
Die Aktivierung einer bislang inaktiven Protease in der Zelle oder die Aktivierung der Expression einer Protease in der Zelle erfolgt vorzugsweise dadurch, daß die transformierte Zelle aus Schritt a) solchen Bedingungen ausgesetzt wird, unter denen die zu detektierende Protease-Aktivität in der Zelle oder das zu detektierende Protease-abhängige Ereignis in der Zelle auftreten kann. Solche Bedingungen umfassen insbesondere die Expression oder Aktivierung einer weiteren Komponente (insbesondere eines weiteren Proteins) in der Zelle, welche eventuell unmittelbar oder mittelbar zu der betreffenden Protease-Aktivität führen kann, die Zugabe von Substanzen zur unmittelbaren oder mittelbaren Inhibierung oder Aktivierung der betreffenden Protease-Aktivität, sowie das Bereitstellen bestimmter physikalisch-chemischer Bedingungen, wie beispielsweise Temperaturänderungen, pH-Änderungen etc., die unmittelbar oder mittelbar zu der betreffenden Protease-Aktivität führen können.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise zur Detektion und zur Charakterisierung von Apoptose-relevanten Protease-Aktivitäten eingesetzt. Hierbei könnten die transformierten Zellen aus Schritt a) im Rahmen von Schritt b) solchen Bedingungen ausgesetzt werden, die bekanntermaßen Apoptose verursachen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise zur Detektion und zur Charakterisierung von solchen Protease-Aktivitäten eingesetzt werden, die infolge einer spezifischen Protein-Protein-Interaktion in der betreffenden Zelle auftreten. Hierbei könnten die transformierten Zellen aus Schritt a) im Rahmen von Schritt b) mit einem oder mit zwei Expressionsvektoren transformiert werden, die für zwei verschiedene, eventuell interagierende Fusionsproteine kodieren.
In Schritt c) wird die mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierten Stör-Aminosäuresequenz aus Schritt a) aus dem nicht fluoreszierenden Protein oder Fusionsprotein aus Schritt a) in Abhängigkeit von dem Auftreten einer Protease-Aktivität in Schritt b) proteolytisch entfernt. Eine erfolgreiche proteolytische Entfernung der Stör-Aminosäuresequenz im zunächst nicht fluoreszierenden Reporter-Protein oder Fusionsprotein führt dazu, daß ein fluoreszierendes Reporter-Protein oder Fusionsprotein generiert wird, dessen Fluoreszenz detektierbar ist.
In Schritt d) wird die in Abhängigkeit von der Protease-Aktivität auftretende Fluoreszenz des Reporter-Proteins oder des Reporter-Fusionsproteins mittels geeigneter Meßmethoden detektiert. Im allgemeinen eignen sich zur Detektion des Fluoreszenz-Signals alle dem Fachmann bekannten Verfahren, die die folgenden Schritte beinhalten:

- Anregung mit Licht der Absorptionswellenlänge des fluoreszierenden Proteins
- Detektion von Licht mit der Emissionswellenlänge des fluoreszierenden Proteins.

Bei der Fluoreszenz-Detektion in vivo in lebenden Zellen eignet sich insbesondere die Fluoreszenzmikroskopie zur Detektion der Fluoreszenz-Signals. Weiterhin eignen sich zur Detektion des Fluoreszenz-Signals auch die Fluoreszenz-Spektroskopie, sowie die Detektion fluoreszierender Zellen mit Hilfe von FACS.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können sowohl endogene Proteasen, als auch exogene Proteasen, die in der Wirtszelle mit Hilfe eines rekombinanten Expressionsvektors exprimiert werden, detektiert und charakterisiert werden. Der rekombinante Expressionsvektor umfasst hierbei eine Nukleinsäuresequenz, die die betreffende Protease unter der Kontrolle eines Promoters kodiert. Unter einer „endogenen Protease" wird im folgenden eine Protease verstanden, die in der betreffenden Wirtszelle selbst entweder konstitutiv, d.h. fortdauernd, oder nicht konstitutiv, d.h. nur zu bestimmten Zeitpunkten oder unter bestimmten Bedingungen exprimiert wird. Unter einer „exogenen Protease" wird im folgenden eine Protease verstanden, die nicht vom Wirtsgenom selbst exprimiert wird, sondern mit Hilfe eines von außen durch Transformation eingebrachten Expressionsvektors in der betreffenden Wirtszelle exprimiert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann allgemein zur Detektion und zur Charakterisierung von Protease-Aktivitäten oder von Protease-abhängigen zellulären Ereignissen eingesetzt werden. Unter einem Protease-abhängigen zellulären Ereignis sind vorzugsweise auch „natürlich auftretende Protease-abhängige Signalkaskaden", wie insbesondere die Apoptose, die Blutgerinnung, bestimmte entwicklungsspezifische Signalkaskaden, der Protein-Abbau in der Zelle zu verstehen. Unter einem Protease-abhängigen zellulären Ereignis sind vorzugsweise auch „artifizielle Protease-abhängige Ereignisse" zu verstehen, die insbesondere dann stattfinden, wenn das Auftreten einer Protease-Aktivität experimentell von dem Auftreten eines anderen zellulären Ereignisses, wie beispielsweise einer spezifischen Protein-Protein-Interaktion abhängt.
Eine besonders bevorzugte Abwandlung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt werden und umfasst die folgenden Verfahrensschritte:

A) Expression eines ersten und eines zweiten Fusionsproteins in einer geeigneten Wirtszelle, wobei das erste Fusionsprotein eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kodierend für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Reporterprotein als erste Domäne und ein erstes interagierendes Protein als zweite Domäne umfasst, und wobei das zweite Fusionsprotein eine den flankierenden Protease-Schnittstellen entsprechende Protease als erste Domäne und ein zweites interagierendes Protein als zweite Domäne umfasst,
B) Interaktion des ersten interagierenden Proteins des ersten Fusionsprotein mit dem zweiten interagierenden Protein des zweiten Fusionsprotein,
C) proteolytische Entfernung der Stör-Aminosäuresequenz aus dem Reporterprotein des ersten Fusionsproteins durch die Protease des zweiten Fusionsproteins,
D) Detektion des fluoreszierenden Reporterproteins in Abhängigkeit von der spezifischen Interaktion zwischen den beiden interagierenden Domänen der beiden Fusionsproteine.

Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich nicht nur zur reinen Detektion von Protease-Aktivitäten, sondern auch zur näheren Charakterisierung von Protease-Aktivitäten oder von Protease-abhängigen Ereignissen. So können mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere auch solche Substanzen identifiziert werden, die eine definierte physiologische Protease-Aktivität in der Zelle inhibieren oder aktivieren. Solche Inhibitoren oder Aktivatoren definierter, physiologisch relevanter, insbesondere Krankheits-relevanter Protease-abhängiger Ereignisse könnten eine signifikante Bedeutung bei der Entwicklung neuer Arzneimittel haben.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Screening-Verfahren zur Identifikation oder zur Charakterisierung von Inhibitoren oder von Aktivatoren Protease-abhängiger Ereignisse in der Zelle. Ein solches Screening-Verfahren könnte die Verfahrensschritte a) bis d) umfassen, die in einem ersten Versuchsansatz in Anwesenheit und in einem zweiten Versuchsansatz in Abwesenheit mindestens einer Test-Substanz, die potentiell Inhibitor- oder Aktivator-Eigenschaften bezüglich des getesteten Protease-abhängigen Ereignisses haben könnte, durchgeführt werden. Letztlich kann die Fluoreszenz als Maß der in der Zelle aufgetretenen Protease-Aktivität zwischen dem ersten und dem zweiten Versuchsansatz quantitativ verglichen werden, um die tatsächlichen Inhibitor- oder Aktivator-Eigenschaften der mindestens einen Test-Substanz zu beurteilen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Screening-Verfahren zur Identifikation oder zur Charakterisierung von Inhibitoren oder von Aktivatoren definierter Protein-Protein-Interaktionen in der Zelle. Ein solches Screening-Verfahren könnte die Verfahrensschritte A) bis D) umfassen, die in einem ersten Versuchsansatz in Anwesenheit und in einem zweiten Versuchsansatz in Abwesenheit einer oder mehrerer Test-Substanzen, die potentiell Inhibitor- oder Aktivator-Eigenschaften bezüglich einer bestimmten Protein-Protein-Interaktion haben könnte, durchgeführt werden. Letztlich kann die Fluoreszenz als Intensitätsmaß der in der Zelle aufgetretenen Protein-Protein-Interaktionen zwischen dem ersten und dem zweiten Versuchsansatz quantitativ verglichen werden, um die tatsächlichen Inhibitor- oder Aktivator-Eigenschaften der Test-Substanzen) zu beurteilen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein transgenes nicht menschliches Tier, welches eine der oben genannten, erfindungsgemäßen Expressionskassetten in seinem Genom permanent integriert hat. Dieses transgene, nicht menschliche Tier ist vorzugsweise eine Maus oder eine Ratte. Ein solches transgenes, nicht menschliches Tier kann vorzugsweise zur Untersuchung von proteolytischen Vorgängen in vivo, insbesondere zur Analyse von Caspaseaktivitäten als Indikator für apoptotische Vorgänge eingesetzt werden.
Die Erfindung wird durch das Sequenzprotokoll erläutert, welches die folgenden Sequenzen umfasst:
SEQ ID NO. 1 enthält ein Fragment des Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP), welches die ersten 15 Aminosäuren des Proteins aus Aequorea victoria umfasst,
SEQ ID NO. 2 enthält ein Fragment des Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP), welches die ersten 9 Aminosäuren des Proteins aus Aequorea victoria umfasst,
SEQ ID NO. 3 enthält ein Beispiel für eine funktionale Stör-Aminosäuresequenz, die dazu neigt, α-Helix-Strukturen auszubilden und gleichzeitig überwiegend hydrophile Aminosäuren umfasst (wie insbesondere Glutamat, Aspartat, Arginin und Lysin),
SEQ ID NO. 4 enthält ein Beispiel für eine von Klonierungsstellen und TEV-Protease-Schnittstellen beidseitig flankierte, funktionale Stör-Aminosäuresequenz,
SEQ ID NO. 5 enthält die vollständige Nukleotidsequenz kodierend für das Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP),
SEQ ID NO. 6 enthält die vollständige Aminosäuresequenz des Enhanced Yellow Fluorescent Proteins (EYFP),
SEQ ID NO. 7 enthält die vollständige Nukleotidsequenz des SwitchEYFP-Klons swYFP-CS (Insertion zwischen die Aminosäuren 6 und 7 von EYFP),
SEQ ID NO. 8 enthält die vollständige Aminosäuresequenz des SwitchEYFP-Klons swYFP-CS (Insertion zwischen die Aminosäuren 6 und 7 von EYFP),
SEQ ID NO. 9 enthält die vollständige Nukleotidsequenz des SwitchEYFP-Klons swYFP-H3 (Insertion zwischen die Aminosäuren 9 und 10 von EYFP),
SEQ ID NO. 10 enthält die vollständige Aminosäuresequenz des SwitchEYFP-Klons swYFP-H3 (Insertion zwischen die Aminosäuren 9 und 10 von EYFP),
SEQ ID NO. 11 enthält den Sinn-Strang des Adapters aus Beispiel 1,
SEQ ID NO. 12 enthält den Gegensinn-Strang des Adapters aus Beispiel 1.
Die Erfindung wird weiterhin durch die folgende Zeichnung näher erläutert.
1 beschreibt die Klonierungsstrategie zur Herstellung der Insertionsmutagenese-Bibliothek. In Schritt 1 wird ein Nukleinsäurefragment kodierend für EYFP in den Vektor pCMV-EM7-Zeo-βGal einkloniert. Die Selektion erfolgt hierbei durch die EYFP-Fluoreszenz, die Resistenz gegen Zeocin und Ampicillin (Amp.). In einem zweiten Schritt erfolgt die zufällige Insertion des von PmeI-Schnittstellen flankierten Transposons (TN1-CmR-TN2, wobei CmR für das Chloramphenicol-Resistenz-vermittelnde Gen steht). Die Selektion erfolgt hierbei durch die Resistenz der Transposon-haltigen Vektoren gegen Chloramphenicol (Cm) und Ampicillin (Amp.). In Schritt 3 werden die durch Zufallsmutagenese modifizierten Vektoren mit der Restriktionsendonuklease PmeI geschnitten, wodurch das Transposon entfernt wird. In den so an zufälliger Stelle linearisierten Vektor wird ein Adapter umfassend die beidseitig von TEV-Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz einkloniert. Selektioniert werden Zellen, mit solchen Vektoren, die keine EYFP-Fluoreszenz mehr zeigen und die eine Resistenz gegen Zeocin aufweisen. In Schritt 4 werden die so selektionierten Vektoren gemeinsam mit Expressionsvektoren, die die TEV-Protease exprimieren, in PC12-Zellen kotransfiziert. Es werden hierbei solche Zellen selektioniert, die aufgrund der proteolytischen Entfernung der Stör-Aminosäuresequenz aus dem EYFP wieder fluoreszieren.
2 zeigt die erste Selektionsphase der Insertionsmutagenese. In dieser ersten Selektionsphase werden Expressionsvektoren, die EYFP unter der Kontrolle eines Promoters exprimieren, hergestellt, wobei die Nukleotidsequenz von EYFP an einer zufälligen Stelle von einer Nukleotidsequenz kodierend für eine von TEV-Protease- Schnittstellen beidseitig flankierten Stör-Aminosäuresequenz unterbrochen ist (T steht hier bei für eine TEV-Protease-Schnittstelle und S steht für die Stör-Aminosäuresequenz). Hierbei entstehen in Abhängigkeit von der Position der Insertionsstelle im EYFP entweder fluoreszierende EYFP-Reporterproteine (in 2 hell dargestellt) oder nicht fluoreszierende EYFP-Reporterproteine (in 2 grau dargestellt).
3 zeigt die zweite Selektionsphase der Insertionsmutagenese. In dieser zweiten Selektionsphase werden die in der ersten Selektionsphase aufgrund ihrer Insertionsposition als nicht fluoreszierend selektionierten Expressionsvektoren gemeinsam mit einem Expressionsvektor, der die TEV-Protease exprimiert, in PC12-Zellen kotransfiziert. Durch die hierbei bereitgestellte TEV-Protease-Aktivität in der Zelle wird die Stör-Aminosäuresequenz aus dem EYFP-Protein proteolytisch entfernt. Die verbleibenden Domänen des EYFP-Proteins können sich hierbei so neu falten bzw. anordnen, daß wieder ein funktionales, d.h. fluoreszierendes EYFP-Protein entsteht (hell dargestellt in 3) oder auch nicht (dunkel dargestellt in 3).
4 zeigt verschiedene Zellinien, die mit dem Expressionsvektor des switchEYFP-Klons swYFP-CS transfiziert worden waren (Spalten, die mit „–TEV" bezeichnet sind) bzw. mit dem Expressionsvektor des switchEYFP-Klons swYFP-CS und einem Expressionsvektor, der die TEV-Protease exprimiert, kotransfiziert worden waren (Spalten, die mit „+TEV" bezeichnet sind). Die 4A bis D zeigen hierbei HEK-Zellen, wobei 4A und 4B Phasenkontrastaufnahmen und 4C und 4D Fluoreszenzaufnahmen derselben Zellen sind. Die 4E bis 4H zeigen hierbei CHO-Zellen, wobei 4E und 4F Phasenkontrastaufnahmen und 4G und 4H Fluoreszenzaufnahmen derselben Zellen sind. Die 4I und 4J zeigen hierbei COS-Zellen, wobei 4I eine Phasenkontrastaufnahme und 4J eine Fluoreszenzaufnahme derselben Zellen ist. In allen Zellinien zeigt sich, daß die mit dem Vektor aus dem Klon swYFP-CS transfizierten Zellen in Abwesenheit der TEV-Protease nicht fluoreszieren, aber in Anwesenheit der TEV-Protease die Fluoreszenz wiederhergestellt wird. Damit kodiert der Vektor aus dem Klon swYFP-CS ein erfindungsgemäßes switchEYFP.
5 zeigt, daß die erfindungsgemäßen switchEYFPs auch an definierte Zellkompartimente gekoppelt werden können. Die obere Reihe von Abbildungen zeigen Phasenkontrastaufnahmen von PC12-Zellen, die mit einem switchEYFP-Expressionsvektor und mit einem Expressionsvektor, der die TEV-Protease exprimiert, kotransfiziert sind. Die untere Reihe von Abbildungen zeigen die entsprechenden Fluoreszenzaufnahmen. Der SwitchEYFP-Expressionsvektor, mit dem die Zellen aus Spalte A transfiziert worden waren, ist hierbei der Expressionsvektor aus dem Klon swYFP-CS. Wie aus dem Vergleich der Phasenkontrast- und der Fluoreszenzaufnahme aus A ersichtlich ist, fluoresziert in Spalte A – wie es zu erwarten wäre – die gesamte Zelle.
Der SwitchEYFP-Expressionsvektor, mit dem die Zellen aus Spalte B transfiziert worden waren, entspricht hierbei dem Expressionsvektor aus dem Klon swYFP-CS mit der Ausnahme, daß das SwitchEYFP-Protein eine Kernlokalisationsdomäne (nuc) umfasst. Wie aus dem Vergleich der Phasenkontrast- und der Fluoreszenzaufnahme aus B ersichtlich ist, fluoresziert in Spalte B – wie es zu erwarten wäre – daher auch nur der Nucleus der Zelle.
Der SwitchEYFP-Expressionsvektor, mit dem die Zellen aus Spalte C transfiziert worden waren, entspricht dem Expressionsvektor aus dem Klon swYFP-CS mit der Ausnahme, daß das SwitchEYFP-Protein eine Membranlokalisationsdomäne aus dem Membranprotein Syntaxin (Syx) umfasst. Wie aus dem Vergleich der Phasenkontrast- und der Fluoreszenzaufnahme aus C ersichtlich ist, fluoresziert in Spalte C – wie es zu erwarten wäre – daher auch nur die Zellmembran der Zelle.
6 zeigt, daß nicht fluoreszierende, proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbare EYFPs (d.h. switchEYFPs) auch in prokaryontischen Zellen funktionell sind. Hierzu wurden E.coli-Zellen des Typs DH5α pBAD_TEV mit Expressionsvektoren kodierend für switchEYFPs unter der Kontrolle eines Minimalpromoters und mit einem Vektor, der die TEV-Protease unter der Kontrolle eines mit Arabinose induzierbaren Promotors exprimiert, kotransfiziert. Anschließend wurde durch die Zugabe von Arabinose zu den Zellen die Expression der TEV-Protease induziert. 6 zeigt, daß nur solche Zellen, die auf Arabinose-haltigem Medium gewachsen waren (6A und 6B, „+A" steht für Arabinose-haltiges Medium), deutlich fluoreszieren, und daß Zellen, die auf Medium ohne Arabinose gewachsen waren, nicht fluoreszieren (6C und 6D, „–A" steht für Medium ohne Arabinose). Dies bedeutet, daß auch in den prokaryontischen E.coli-Zellen die erfindungsgemäßen, nicht fluoreszierenden switchEYFPs durch Proteolyse zur Fluoreszenz „anschaltbar" sind.
7 zeigt die Deletionsmutanten A bis D des Expressionsvektors aus dem Klon swYFP-CS (Insertionsstelle zwischen Aminosäure 6 und 7 von EYFP), sowie Fluoreszenzaufnahmen von Zellen, die mit diesen „deletierten Expressionsvektoren" transiziert worden waren (in Abwesenheit der TEV-Protease).
Der Expressionsvektor E entspricht dabei dem Expressionsvektor aus dem Klon swYFP-CS (Insertionsstelle zwischen Aminosäure 6 und 7 von EYFP).
Der Expressionsvektor D umfasst die Nukleotidsequenz für ein EYFP-Protein unter der Kontrolle eines Promoters, wobei dieses EYFP-Protein erst mit der 7. Aminosäure (E an Position 7) beginnt und zusätzlich an seinem N-Terminus die folgende Aminosäuresequenz umfasst: die 11 Aminosäuren „RLMMALLTIHL" der Stör-Aminosäuresequenz nach SEQ ID No. 3, eine TEV-Protease-Schnittstelle (Aminosäuren „ENLYFQ'G") und die aus der Klonierung resultierenden Aminosäuren „SGKHE".
Der Expressionsvektor C umfasst die Nukleotidsequenz für ein EYFP-Protein unter der Kontrolle eines Promoters, wobei dieses EYFP-Protein erst mit der 7. Aminosäure (E an Position 7) beginnt und zusätzlich an seinem N-Terminus die folgende Aminosäuresequenz umfasst: eine TEV-Protease-Schnittstelle (Aminosäuren „ENLYFQ'G") und die aus der Klonierung resultierenden Aminosäuren „SGKHE".
Der Expressionsvektor B umfasst die Nukleotidsequenz für ein EYFP-Protein unter der Kontrolle eines Promoters, wobei dieses EYFP-Protein erst mit der 7. Aminosäure (E an Position 7) beginnt und zusätzlich an seinem N-Terminus mit einer Aminosäuresequenz umfassend lediglich die aus der Klonierung resultierenden Aminosäuren „SGKHE" fusioniert wird.
Der Expressionsvektor A umfasst die Nukleotidsequenz für ein EYFP-Protein unter der Kontrolle eines Promoters, wobei dieses EYFP-Protein erst mit der 7. Aminosäure (E an Position 7) beginnt und keine zusätzlichen Aminosäuresequenzen an seinem N-Terminus angehängt hat.
Lediglich PC12-Zellen, die mit dem Expressionsvektor E oder D transfiziert worden waren, zeigten keinerlei Fluoreszenz (7D und 7E). PC12-Zellen, die mit den Expressionsvektoren A, B oder C transfiziert worden waren, zeigten jedoch immer noch Fluoreszenz (7A, 7B, 7C). Daraus läßt sich schließen, daß für den Verlust der Fluoreszenz der switchEYFPs die Anwesenheit einer Stör-Aminosäuresequenz notwendig ist, deren minimale Länge eine Länge von 10 Aminosäuren deutlich unterschreitet.
8 zeigt die Ergebnisse des in Beispiel 7 beschriebenen Transkomplementations-Experimentes. Auf der Ordinate ist die Gesamtfluoreszenz F der positiven Zellen aufgetragen. Auf der Abzisse steht
„K" für Kontroll-Zellen, die lediglich mit dem Leervektor transfiziert worden sind,
„A" für Zellen, die mit einem Expressionsvektor, der eine vollständige TEV-Protease exprimiert, transfiziert worden sind,
„B" für solche Zellen, die mit einem ersten und einem zweiten Expressionsvektor transfiziert worden sind, wobei der erste Expressiosvektor ein Fragment der TEV-Protease, umfassend die Aminosäuren 1 bis 118, fusioniert mit der Interaktionsdomäne GCN4 exprimiert, und wobei der zweite Expressionsvektor ein Fragment der TEV-Protease, umfassend die Aminosäuren 119 bis 243, fusioniert mit einer weiteren Interaktionsdomäne GCN4 exprimiert,
„C" für solche Zellen, die mit einem ersten und einem zweiten Expressionsvektor transfiziert worden sind, wobei der erste Expressionsvektor ein Fragment der TEV-Protease umfassend die Aminosäuren 1 bis 118 exprimiert, und wobei der zweite Expressionsvektor ein Fragment der TEV-Protease umfassend die Aminosäuren 119 bis 243 exprimiert.
Alle Zellen K, A, B, C sind außer mit den oben bezeichneten Protease-Vektoren auch mit einem Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes switchEYFP exprimiert, kotransfiziert.
8 zeigt, daß die Aktivität einer Protease – und die dadurch bedingte Wiederherstellung der Fluoreszenz nach proteolytischer Entfernung der von TEV-Protease-Schnittstellen flankierten Stör-Aminosäuresequenz – sowohl durch eine intakte, vollständige TEV-Protease (siehe A aus 8) als auch durch eine Protein-Protein-Interaktions-abhängige Transkomplementation einer funktionalen TEV-Protease bereitgestellt werden kann (siehe B aus 8). Damit läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Detektion und Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen, sowie zum Screening von Inhibitoren oder Aktivatoren einer Protein-Protein-Interaktion verwenden.
Die Erfindung wird durch die folgenden experimentellen Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1: Herstellung bzw. Screening nach nicht fluoreszierenden, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbaren EYFP-Varianten durch Insertionsmutagenese
Zur Herstellung nicht fluoreszierender, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbarer EYFP-Reporterproteine wurde das offene Leseraster des Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP) mit den Oligonukleotid-Primern EYFP-Xhol-sense (Seq: gggctcgagaccatggtgagcaagggcgagga) und EYFP Xhol-antisense (Seq: gggctcgagcttgtacagctcgtccatgccga) mittels PCR amplifiziert und in den rekombinanten Vektor pCMV-EM7-Zeo-βGal kloniert. Der aus dieser Klonierung hervorgegangene rekombinante Vektor wird im folgenden als pCMV-EYZG bezeichnet. Der Vektor enthält den CMY-Promoter, eine SV40-Polyadenylierungssequenz sowie den bakteriellen Minimalpromoter EM7 zur Expression nachgeschalteter Gene in E.coli und in höheren eukaryontischen Zellen. Das Transkript des pCMV-EYZG kodiert für ein Fusionsprotein aus drei Domänen, nämlich aus EYFP, aus dem ZeoR-Protein, einem Protein, das Resistenz gegen Zeocin vermittelt, und aus dem β-Galaktosidase-Protein von E.coli. Die zur Klonierung verwendeten Schnittstellen waren hierbei so gewählt, dass ein durchgehendes Leseraster für alle drei Domänen des Fusionsproteins generiert wurde. (siehe 1). Die Funktionalität aller drei Einzelkomponenten des Fusionsproteins wurde durch Analyse der Epifluoreszenz in Bakterien und in eukaryontischen Zellen, durch Selektion mit Zeocin und durch einen kolorimetrischen β-Gal-Nachweis erbracht. Weiterhin wurde in den Vektor pCMV-EM7-Zeo-βGal ein EYFP-Leseraster in gegenläufiger Orientierung in Bezug auf das ZeoR-βGal-Leseraster als Kontrollvektor kloniert. Nach Transformation dieses Kontrollvektors in E.coli-Zellen oder auch nach Transfektion dieses Kontrollvektors in eukaryontische Zellen konnte weder Epifluoreszenz nachgewiesen, noch eine Resistenz gegen Zeocin vermittelt werden, was mit hoher Wahrscheinlichkeit durch die Unterbrechung des Leserasters des EYZG-Fusionsproteins begründet ist. Trotz der Unterbrechung des Leserasters des EYZG-Fusionsproteins konnte jedoch eine deutliche Aktivität der β-Galaktosidase im kolorimetrischen Test nachgewiesen werden. Daher wurden rekombinante Klone im nachfolgend beschriebenen Klonierungsverfahren zunächst mit Zeocin selektioniert und nachfolgend deren Epifluoreszenz analysiert.
Die Insertionsmutagenese zur Herstellung nicht fluoreszierenden, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbaren EYFP-Varianten wurde über die folgenden Verfahrensschritte durchgeführt:

1) Mit dem Plasmid pCMV-EYZG wurde eine Transposon-vermittelte Zufallsmutagenese mit Hilfe des GPS-LS Kit von New England Biolabs (NEB) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Hierbei wurden zunächst E.coli-Zellen mit dem Target-Plasmid pCMV-EYZG und mit dem Transprimer-Donor-Plasmid aus dem Kit transformiert. Durch eigentliche Mutagenese erfolgte durch die Anwesenheit der TnsABC-Transposase in der Zelle. Aus der Mutagenese gingen etwa 500 Ampicillin-, Zeocin- und Chlormphenicol-resistente rekombinante Bakterienklone hervor und wurden nach Kultivierung auf entsprechenden LB-Selektionsplatten amplifiziert. Etwa 1000 Bakterienkolonien der amplifizierten rekombinanten Bakterienklone wurden vereinigt und die Plasmid-DNA wurde nach Standardverfahren (Qiaprep, Qiagen) isoliert. Die Selektion auf Ampicillin-Resistenz garantiert hierbei, daß das Target-Plasmid in der Zelle anwesend ist. Die Selektion auf Zeocin-Resistenz garantiert hierbei, daß die Insertion des Transposons nicht zu einer Verschiebung des Leserasters geführt hat. Die Selektion auf Chloramphenicol-Resistenz garantiert hierbei, daß ein Transposon im Target-Plasmid anwesend ist.
2) Die in Schritt 1 gewonnene komplexe Plasmid-DNA-Mischung wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI (NEB) verdaut. Nach gelelektrischer Auftrennung wurde ein 1,9 kb langes Fragment umfassend das EYFP mitsamt zufällig inseriertem Transposon aus dem Gel eluiert (Qiaprep, Qiagen) und anschließend mit einem XhoI-linearisierten, dephosphorylierten pCMV-EM7 ZeoR-βGal-Vektor ligiert. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli-Zellen transformiert und auf Ampicillin- und Chloramphenicol-Resistenz selektioniert. Etwa 5000 erfolgreich selektionierte Bakterienkolonien wurden vereinigt. Anschließend wurde aus diesen Kolonien Plasmid-DNA nach Standardverfahren (Qiaprep, Qiagen) isoliert.
3) Die in Schritt 2 gewonnene komplexe Plasmid-DNA-Mischung wurde mit dem Restriktionsenzym PmeI (NEB) verdaut. Durch diesen Restriktionsschnitt wird ein großes Fragment aus dem Transposon entfernt, so daß nach dem PmeI-Restriktionsschnitt nur noch wenige flankierende Basen des Transposons, nämlich 15 bp (5 Aminosäuren auf Protein-Ebene, siehe Produktbeschreibung des Herstellers, GPS-LS Kit, NEB) an der Insertionsstelle verbleiben. Die Produkte wurden anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die an zufälligen Stellen des EYFP-Leserasters lineariserten Vektoren wurden aus dem Gel nach Standardmethoden isoliert (Qiaquick, Qiagen).
4) Es wurde ein Adapter mit einer von TEV-Protease-Schnittstellen flankierten Stör-Nukleotidsequenz kodierend für eine Stör-Aminosäuresequenz durch Hybridisierung der partiell überlappenden 5' phosphorylierten Oligonukleotide mit der Sequenz 5'P-agcggtgaaaacctatacttccaaggcctgctggcactgctgatgatg aaggccctgctgcgccgcctgctgaaggcact-3' (SEQ ID NO. 11) und mit der Sequenz 5'-accgctaccttggaagtacaggttttctaaatgaatagtcagcagtgccatcatcagc-3' (SEQ ID NO. 12) und durch Auffüllen der einzelsträngigen Bereiche mit dem Klenow-Enzym (Roche) hergestellt. Die flankierenden „TEV-Protease-Schnittstellen" stellen hierbei spezifische Erkennungs- und Spaltstellen der NIa TEV-Protease dar. Das Stör-Fragment kodiert in der angegebenen Orientierung für eine von TEV-Schnittstellen flankierte, starre, partiell geladene α-Helix. Die Analyse der vermutlichen Sekundärstruktur des Stör-Fragments wurde mit dem Programm Predator (EMBL) durchgeführt. Die linearisierten, dephosphorylierten Vektoren aus Schritt 3 wurden mit dem 5'-phosphorylierten Adapter mit der von TEV-Protease-Schnittstellen flankierten Stör-Nukleotidsequenz, im folgenden als 'Stör-Fragment' bezeichnet, ligiert (siehe Beispiel 1, Nr. 4). Die Ligationsprodukte wurden in E.coli-Zellen transformiert. Rekombinante Klone wurden mit Ampicillin und Zeocin selektioniert. 480 erfolgreich selektionierte Bakterienkolonien wurden einzeln amplifiziert. Anschließend wurde die Plasmid-DNA der Einzelklone nach Standardverfahren (Qiaprep, Qiagen) isoliert.
5) Die Plasmid-DNA der Einzelklone aus Schritt 4 wurde anschließend in PC12-Zellen analysiert. Für jeden Einzelklon wurden jeweils zwei Transformationsansätze durchgeführt. In dem ersten Transformationsansatz wurden je 1 μl der Plasmid-Präparationen mit Lipofectamin 2000 (Invitrogen) in PC12-Zellen transfiziert. In einem zweiten Transformationsansatz wurden je 1 μl der Plasmid-Präparationen und 0,1 μg eines Expressionsvektors, der die TEV-Protease unter der Kontrolle eines Promoters exprimieren kann (pCMV-TEV), mit Lipofectamin 2000 (Invitrogen) in PC12-Zellen transfiziert. Anschließend wurde überprüft, ob die transformierten PC12-Zellen des jeweils ersten und des jeweils zweiten Transformationsansatzes fluoreszieren oder nicht. Selektioniert wurden solche Klone, die in Abwesenheit der TEV-Protease (erster Transformationsansatz) aufgrund ihrer Insertion der Stör-Aminosäuresequenz im EYFP nicht fluoreszieren, aber in Gegenwart der TEV-Protease (zweiter Transformationsansatz) aufgrund der proteolytischen Abspaltung der Stör-Aminosäuresequenz aus dem EYFP fluoreszieren. Bei zwei Klonen konnte tatsächlich ohne TEV-Protease-Aktivität keine Epifluoreszenz detektiert werden, nach Kotransfektion der entsprechenden Plasmid-DNA und des TEV-Protease exprimierenden Vektors konnten jedoch fluoreszierende Zellen detektiert werden. Diese beiden Klone wurden als swYFP-H3 und swYFP-CS bezeichnet.

Das aus dem Klon swYFP-CS hervorgehende EYFP-Protein besitzt eine von TEV-Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz, die zwischen den Aminosäuren 6 und 7 inseriert worden ist. Das aus dem Klon swYFP-H3 hervorgehende EYFP-Protein besitzt eine von TEV-Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz, die zwischen den Aminosäuren 9 und 10 inseriert worden ist.
Somit scheint der N-Terminus des EYFP für die Insertion bzw. für das Anhängen einer Stör-Aminosäuresequenz zur Generierung eines nicht fluoreszierenden, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbaren Reporterproteins geeignet zu sein. Eine solche Stör-Aminosäuresequenz-Insertion, die als proteolytischer Schalter zwischen Fluoreszenz oder Nicht-Fluoreszenz eines Reporterproteins fungiert, kann für zahlreiche Assay-Varianten zur Detektion und/oder zur Charakterisierung von Protease-Aktivitäten oder von Proteaseabhängigen Ereignissen eingesetzt werden.
Beispiel 2: Feinanalyse der Insertionsstelle und der Länge der Killersequenz
Der kritische Bereich für die Insertion der Schaltersequenz ist der N-Terminus von EYFP. Zur genauen Bestimmung, welche Insertions-Positionen sich besonders zum „Ab- und Anschalten" der Fluoreszenz des Reporterproteins eignen, wurde die von TEV-Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz in getrennten Experimenten nach jeder der ersten 12 Aminosäuren des Proteins EYFP insertiert. Die so hergestellten EYFP-Varianten wurden anschließend durch Kotransfektion mit einem Vektor, der die TEV-Protease exprimiert, in PC12-Zellen getestet.
Tabelle 2 zeigt das Ergebnis dieser Experimente: so steht beispielsweise „switchEYFP_1_Störseq._2" für einen Expressionsvektor, der ein switchEYFP unter der Kontrolle eines Promoters umfasst, wobei das switchEYFP eine Insertion einer beidseitig von TEV-Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz nach SEQ ID No. 3 enthält. Das Ergebnis, welches in Tabelle 2 zusammengefaßt ist, zeigt, daß prinzipiell bei allen Insertionen zwischen den Aminosäuren 2 und 9 EYFP-Varianten entstehen, die proteolytisch „anschaltbar" bezüglich ihrer Fluoreszenz sind, d.h. diese Varianten führen in Abwesenheit einer Protease-Aktivität nicht zur Fluoreszenz, aber in Gegenwart einer Protease-Aktivität zur Fluoreszenz. Bei EYFP-Varianten, die zu einer weiteren Verkürzung von EYFP führen (10/11, 11/12 etc.), funktioniert das „proteolytische Anschalten" der Fluoreszenz des Proteins weniger gut, da die Minimalsequenz zur Ausbildung der Fluoreszenz unterschritten wird (Li et al.; J Biol Chem. 1997 Nov 7;272(45):28545-9).
Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß alternativ zur Insertion an beliebiger Position zwischen den Aminosäuren 2 und 9 die von TEV-Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz auch einfach an den N-Terminus des EYFPs angehängt werden kann. Hierbei können die ersten 1 bis 9 Aminosäuren des EYFPs auch durchaus deletiert und die flankierte Stör-Aminosäuresequenz direkt an den N-Terminus des entsprechenden restlichen EYFP-Fragments fusioniert sein.
Tabelle 2:
Beispiel 3: Unterschiedlich lokalisierte Varianten von nicht fluoreszierenden, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbaren Reporterproteinen
Nicht fluoreszierende, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbare Reporterproteine, die eine ein- oder zweiseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz am N-Terminus angehängt oder an den obigen Positionen insertiert haben, lassen sich auch durch Fusion an andere Proteine oder Proteindomänen an verschiedenen Stellen innerhalb der Zelle lokalisieren. So konnten beispielsweise eine switch-EYFP-Variante mit Kernlokalisation und eine switch-EYFP-Variante mit Membranverankerung in PC12-Zellen erfolgreich getestet werden.
Beispiel 3.1: Nicht fluoreszierendes, proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares EYFP mit Kernlokalisation
An den C-Terminus eines switch-EYFPs wurde ein Kernlokalisationssignal im Leseraster fusioniert (im folgenden „switchEYFPnuc" genannt). Dies führte dazu, daß das Protein bevorzugt in den Zellkern von eukaryontischen Zellen transportiert wird. In 5B werden PC12-Zellen gezeigt, welche mit einem Expressionsvektor, der switchEYFPnuc exprimiert, sowie mit einem Expressionsvektor, der die TEV-Protease exprimiert, kotransfiziert wurden. Es konnte eine von der Anwesenheit der TEV-Protease abhängige Fluoreszenz im Zellkern beobachtet werden.
Beispiel 3.2: Nicht fluoreszierendes, proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares EYFP mit Membranlokalisation
Ein switchEYFP wurde an den N-Terminus eines Fragmentes des synaptischen Membranproteins Syntaxin 1A (Aminosäure 1–147) fusioniert (im folgenden „switchEYFPsyx" genannt). Aufgrund der C-terminalen Transmembrandomäne wird das Fusionsprotein an der Zellmembran von eukaryontischen Zellen verankert. In 5C werden PC12-Zellen gezeigt, welche mit einem Expressionsvektor, der switchEYFPsyx exprimiert, sowie mit einem Expressionsvektor, der die TEV-Protease exprimiert, kotransfiziert wurden. Es konnte eine von der Anwesenheit der TEV-Protease abhängige Fluoreszenz hauptsächlich an der Peripherie der Zelle beobachtet werden. Diese Variante switchEYFPsyx läßt sich besonders gut durch Kotransfektion einer ebenfalls membranverankerten TEV-Protease aktivieren (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 4: Expression von nicht fluoreszierenden, proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbaren EYFP in weiteren eukaryontischen Zellen
Die Funktion der switchEYFPs wurden zusätzlich in weiteren Zelllinien getestet. In 4 wird gezeigt, daß die durch Proteolyse anschaltbare Fluoreszenz des EYFPs auch in CHO- Zellen (Chinese hamster ovary-Zellen) und in HEK293-Zellen (Human embryonic Kidney-Zellen) beobachtet werden kann. In allen getesteten Zelllinien waren die getesteten switchEYFPs nicht-fluoreszent und gewannen ihre Fluoreszenz erst durch die Kotransfektion eines Expressionsvektors kodierend für die TEV-Protease zurück.
Beispiel 5: Expression von nicht fluoreszierenden, proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbaren EYFP in Prokaryonten
Es sollte untersucht werden, ob nicht fluoreszierende, proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbare EYFPs (d.h. switchEYFPs) auch in prokaryontischen Zellen funktionell sind. Hierzu wurden E.coli-Zellen des Typs DH5αpBAD_TEV mit Expressionsvektoren kodierend für switchEYFPs transformiert. DH5αpBAD_TEV-Zellen enthalten ein Plasmid, welches die TEV-Protease unter der Kontrolle eines mit Arabinose induzierbaren Promotors exprimiert. Dieses Plasmid besitzt weiterhin einen „p15A-origin", so das Kotransformation mit „ColE1-Origin-Vektoren" möglich sind.
Diese E.coli-Zellen wurden mit einem Expressionsvektor kodierend für ein switchEYFP unter der Kontrolle des EM7-Minimalpromotors transformiert. Anschließend wurde durch die Zugabe von Arabinose zu den Zellen die Expression der TEV-Protease induziert. In 6 wird gezeigt, daß nur solche Zellen, die auf Arabinose-haltigem Medium gewachsen waren, deutlich grün fluoreszieren. Dies bedeutet, daß auch in den prokaryontischen E. coli-Zellen die erfindungsgemäßen nicht fluoreszierenden switchEYFPs durch Proteolyse zur Fluoreszenz „anschaltbar" sind.
Beispiel 6: Minimale Länge der von TEV-Protease-Schnittstellen flankierten Stör-Aminosäuresequenz
Bei den im Rahmen des Screening-Verfahrens (siehe Beispiel 1) zunächst identifizierten switchEYFP-Klonen swYFP-CS (Stör-Aminosäuresequenz insertiert zwischen Aminosäure 6 und 7 von EYFP) und swYFP-H3 (Stör-Aminosäuresequenz insertiert zwischen Aminosäure 9 und 10 von EYFP) sollte überprüft werden, welcher Anteil der Stör-Aminosäuresequenz für den Verlust der Fluoreszenz des EYFPs verantwortlich ist, bzw. wie lang die Stör-Aminosäuresequenz sein muß, um ihren Zweck, nämlich die Zerstörung der EYFP-Fluoreszenz und die Wiederherstellung der EYFP-Fluoreszenz nach ihrer proteolytischen Entfernung, zu erfüllen.
Dazu wurden die Deletionsmutanten A bis D des Vektors aus dem Klon swYFP-CS hergestellt. Bei diesen Deletionsmutanten wurden jeweils Teile der Stör-Aminosäuresequenz nach SEQ ID No. 3, gemeinsam mit einer TEV-Protease-Schnittstelle und der GPS-Linker Sequenz (SGKHE), an ein EYFP-Fragment angehängt, welches erst mit der 7. Aminosäure der EYFP-Sequenz beginnt (siehe 7A bis E).
Die Variante E aus 7 entspricht hierbei dem Expressionsvektor aus dem Klon swYFP-CS, d.h. in diesem Expressionsvektor ist die gesamte Stör-Aminosäuresequenz nach SEQ ID No. 3, gemeinsam mit einer TEV-Protease-Schnittstelle und der GPS-Linker Sequenz nach der Aminosäure 6 der EYFP-Aminosäuresequenz insertiert. Wie aus 7E ersichtlich, zeigen Zellen, die mit einem Expressionsvektor der Variante E transformiert wurden, keinerlei Fluoreszenz.
Bei der Variante D des Expressionsvektors aus 7 wurde lediglich eine Aminosäuresequenz umfassend die letzten 11 Aminosäuren der Stör-Aminosäuresequenz nach SEQ ID No. 3, die TEV-Schnittstelle und die GPS-Linkersequenz N-terminal an ein EYFP-Fragment angehängt, welches erst mit der 7. Aminosäure der EYFP-Sequenz beginnt. 7 D zeigt, daß Zellen, die mit einem Expressionsvektor der Variante D transformiert wurden, ebenfalls nicht fluoreszieren.
Bei der Variante C des Expressionsvektors wurde nur die TEV-Schnittstelle mit der GPS-Linkersequenz und bei der Variante B des Expressionsvektors lediglich die GPS-Linkersequenz alleine N-terminal an ein EYFP-Fragment ankloniert, welches erst mit der 7. Aminosäure der EYFP-Sequenz beginnt. Weiterhin wurde eine Variante A des Expressionsvektors hergestellt, die keine zusätzliche Sequenz trägt, die jedoch erst bei Aminosäure E7 startet (7).
Die Konstrukte A, B, C, D, E wurden durch Transfektion in PC12-Zellen getestet und mikroskopisch analysiert. 7A bis E zeigen die Fluoreszenz-Aufnahmen der mit den entsprechenden Expressionsvektoren A bis E transfizierten Zellen 24 Stunden nach der Transfektion. Lediglich die Zellen, die entweder mit einem Expressionsvektor umfassend EYFP mit der gesamten Stör-Aminosäuresequenz (Variante E) transfiziert worden waren oder die mit einem Expressionsvektor umfassend EYFP mit einem 11 Aminosäuren langen Fragment der Stör-Aminosäuresequenz (Variante D) transfiziert worden waren, zeigten keinerlei Fluoreszenz. Zellen, die mit den übrigen Expressionsvektoren (Varianten A, B, C) transfiziert worden waren und die demnach keine Stör-Aminosäuresequenz umfassen, zeigten hingegen auch in Abwesenheit einer Protease-Aktivität Fluoreszenz. Bei Zellen, die mit der Expressionsvektor D transfiziert worden waren („Expressionsvektor umfassend EYFP mit einem 11 Aminosäuren langen Fragment der Stör-Aminosäuresequenz"), war jedoch 24 Stunden nach der Transfektion – im Vergleich zu Zellen, die mit Expressionsvektor E transfiziert worden waren – eine schwache Fluoreszenz der transfizierten Zellen zu beobachten. Daraus läßt sich schließen, daß für den Verlust der Fluoreszenz der switchEYFPs die Anwesenheit einer Stör-Aminosäuresequenz notwendig ist, deren minimale Länge eine Länge von 10 Aminosäuren deutlich unterschreitet. Die erfindungsgemäßen Stör-Aminosäuresequenzen sollten daher eine Länge von mindestens 3 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens 5 Aminosäuren, bevorzugter von 7 Aminosäuren, insbesondere von 10 Aminosäuren umfassen.
Beispiel 7: SwitchEYFP als Interaktions-Sensor
Ein erfindungsgemäßes SwitchEYFP kann insbesondere auch als Indikator für Protein-Protein Interaktionen eingesetzt werden. Dabei sollte die spezifische Interaktion zwischen zwei Proteinen, zwischen einem Protein und einer Substanz oder zwischen zwei Proteinen und einer Substanz zur Aktivierung einer proteolytischen Aktivität führen. Diese Kopplung zwischen einer Protein-Protein-Interaktion und einer proteolytischen Aktivität kann vorzugsweise durch die Protein-Protein-Interaktions-abhängige Transkomplementation einer funktionalen Protease erreicht werden, wie in der prioritätsfrüheren und nachveröffentlichen Anmeldung (interne Bezeichnung DE 102 11 063.8 ) beschrieben. Hierbei werden zwei potentiell miteinander interagierende Proteine an jeweils ein nicht funktionales Fragment einer Protease, insbesondere der TEV-Protease (243 Aminosäuren lang) fusioniert unter Generierung zweier Fusionsproteine. Durch die Interaktion dieser Proteine, werden die Proteasefragmente in große räumliche Nähe zueinander gebracht, so daß die verlorengegangene Protease-Aktivität zurückerlangt wird.
Hierbei kann das erste Fusionsprotein insbesondere ein Fragment umfassend die Aminosäuren 1 bis 118 der TEV-Protease und ein erstes potentiell interagierendes Protein umfassen und das zweite Fusionsprotein kann insbesondere ein Fragment umfassend die Aminosäuren 119 bis 243 der TEV-Protease und ein zweites potentiell interagierendes Protein umfassen. Eine Teilung der TEV-Protease zwischen den Aminosäuren 118 und 119 zur Transkomplementation hat sich experimentell als günstig erwiesen, d.h. die hierbei generierten TEV-Protease-Fragmente sind für sich alleine nicht funktionell, bilden jedoch eine funktionale TEV-Protease, sofern diese sich durch die Interaktion der interagierenden Domänen der Fusionproteine räumlich aneinander annähern. Es sind jedoch auch Fusionsproteine mit anderen Proteasefragmenten als den oben beschriebenen oder auch Fusionsproteine mit überlappenden Proteasefragmenten zur Bereitstellung einer Protease-Aktivität durch Transkomplementation fähig.
Im Rahmen dieses Beispiels sollte die nach Transkomplementation zweier Proteasefragmente wiedererlangte Protease-Aktivität mit Hilfe eines erfindungsgemäßen switchEYFPs als Detektor nachgewiesen werden. Als Modell wurden die Interaktionsdomänen des GCN4-Leuzin-Zipper-Proteins verwendet, an deren C-Terminus die Protease-Fragmente Aminosäure 1 bis 118 und Aminosäure 119 bis 243 fusioniert worden waren. Die Interaktionsdomänen des GCN4-Leuzin-Zipper-Proteins sind dafür bekannt, Homodimere auszubilden. Die oben genannten Konstrukte, sowie eine positive und eine negative Kontrolle wurden jeweils gemeinsam mit einem Expressionsvektor, der eine beidseitig durch TEV-Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz, welche nach der Aminosäure 6 von EYFP insertiert ist (switchEYFP_6_Killer_7), in PC12-Zellen kotransfiziert.
8 zeigt das Ergebnis nach Auswertung der Fluoreszenz mittels FACS-Analyse. Die Kotransfektion der gesamten („ungeteilten") TEV-Protease und eines switchEYFPs führt zu einer Protease-Aktivität in der Zelle, zur proteolytischen Entfernung der Stör-Aminosäuresequenz und damit schließlich zur Fluoreszenz der Zelle. Die Kotransfektion eines switchEYFP und von Teilfragmenten der TEV-Protease jeweils fusioniert an die Interaktionsdomänen von GCN4 führt ebenfalls zu einer Protease-Aktivität in der Zelle, zur proteolytischen Entfernung der Stör-Aminosäuresequenz und letztlich zur Fluoreszenz der Zelle. Keine Aktivierung erfolgt bei der Kotransfektion eines switchEYFP und eines Leervektors bzw. der Vektors umfassend die TEV-Fragmente alleine ohne die Interaktionsdomänen von GCN4 (Negativ-Kontrollen).
SEQUENCE LISTING

Claims

Nukleinsäure, codierend für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein an seinem N-Terminus mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID No. 1 oder eines ihrer Fragmente umfasst, an deren N-Terminus eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz fusioniert ist.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein eine natürliche oder artifizielle Variante der GFP-Familie aus Aequorea victoria oder eines ihrer Fragmente ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die natürliche oder artifizielle Variante der GFP-Familie ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EGFP (Acc. No. U76561), EYFP (Acc. No. AJ510163, kodiert von der Region 6103-6822), ECFP (Acc. No. AJ510158, kodiert von der Region 6058-6780), GFP (Acc. No. X83959 ), YFP (Acc. No. AY189981, kodiert von der Region 1603-2331) oder CFP (Acc. No. BD136947).
Nukleinsäure, codierend für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz umfasst, die im Protein nach der Aminosäure mit der Position 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, gezählt vom N-Terminus des Proteins, insertiert ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren mit den Positionen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, gezählt vom N-Terminus des Proteins, die Aminosäuren nach SEQ ID No. 1 sind.
Nukleinsäure nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren mit den Positionen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, gezählt vom N-Terminus des Proteins, die Aminosäuren nach SEQ ID No. 2 sind.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein eine natürliche oder artifizielle Variante der GFP-Familie aus Aequorea victoria ist, welches mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz umfasst, die nach der Aminosäure mit der Position 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, gezählt vom N-Terminus des Proteins, in die Variante der GFP-Familie insertiert ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die natürliche oder artifizielle Variante der GFP-Familie aus Aequorea victoria ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EGFP (Acc. No. U76561), EYFP (Acc. No. AJ510163, kodiert von der Region 6103-6822), ECFP (Acc. No. AJ510158, kodiert von der Region 6058-6780), GFP (Acc. No. X83959 ), YFP (Acc. No. AY189981, kodiert von der Region 1603-2331) oder CFP (Acc. No. BD136947).
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Stör-Aminosäuresequenz ein- oder beidseitig von den Protease-Schnittstellen der TEV-Protease oder der Caspasen flankiert ist.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Stör-Aminosäuresequenz mindestens 5 Aminosäuren umfasst.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Stör-Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO. 3 oder ein mindestens 5 Aminosäuren langes Fragment dieser Sequenz nach SEQ ID No. 3 umfasst.
Nukleinsäure codierend für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Fusionsprotein, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Fusionsprotein eines der Proteine umfasst, die in einem der Ansprüche 1 bis 12 definiert sind.
Expressionskassette, die eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 13 unter der Kontrolle eines Promoters umfasst.
Rekombinanter Vektor, umfassend eine Expressionskassette nach Anspruch 14.
Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 15 transient oder stabil transformiert worden ist.
Kit zur Detektion von Protease-Aktivitäten oder zur Detektion Protease-abhängiger Ereignisse, umfassend den Vektor nach Anspruch 15 oder eine Wirtszelle nach Anspruch 16.
Der Kit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß dieser zur Detektion Proteaseabhängiger Ereignisse eingesetzt wird und daß dieses Protease-abhängige Ereignis die Apoptose ist.
Kit zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen in einer Zelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 15 oder die Wirtszelle nach Anspruch 16.
Nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein oder Fusionsprotein, welches von einer Nukleinsäure kodiert wird, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert ist.
Verfahren zur Detektion oder zur Charakterisierung einer Protease-Aktivität in einer Zelle umfassend die folgenden Verfahrensschritte: a) Transfektion einer Zelle mit einem rekombinanten Vektor nach Anspruch 15 zur rekombinanten Expression eines nicht fluoreszierenden Proteins oder Fusionsproteins, welches mindestens eine ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierte Stör-Aminosäuresequenz am N-Terminus oder durch Insertion umfasst, b) Aktivierung einer bislang inaktiven Protease in der Zelle oder Aktivierung der Expression einer Protease in der Zelle, wobei die Protease-Schnittstellen aus a) Substrate dieser Protease darstellen, c) Generierung eines fluoreszierenden Proteins oder Fusionsproteins durch proteolytische Entfernung der mindestens einen ein- oder beidseitig von Protease-Schnittstellen flankierten Stör-Aminosäuresequenz aus a) aus dem nicht fluoreszierenden Protein oder Fusionsprotein aus a), d) Detektion der Fluoreszenz des fluoreszierenden Proteins oder Fusionsproteins aus c).
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease aus Schritt b) eine endogene Protease ist.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease aus Schritt b) mit Hilfe eines rekombinanten Expressionsvektor exprimiert wird, der die Nukleinsäuresequenz codierend für die Protease unter der Kontrolle eines Promoters umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Detektion oder zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen, deren Auftreten in der Zelle zu einer Protease-Aktivität führt, eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Detektion oder zur Charakterisierung der Apoptose von Zellen verwendet wird.
Verwendung einer Nukleinsäure, kodierend für ein nicht fluoreszierendes, aber proteolytisch zur Fluoreszenz aktivierbares Protein oder Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 13, zur Detektion oder zur Charakterisierung von Protease-Aktivitäten oder von Protease-abhängigen zellulären Ereignissen.
Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Protease-abhängige zelluläre Ereignis die Apoptose ist.
Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Detektion und/oder zur Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen, deren Auftreten in der Zelle zu einer Protease-Aktivität führen.
Transgenes, nicht menschliches Tier, welches eine Expressionskassette nach Anspruch 14 in seinem Genom integriert hat.
Transgenes, nicht menschliches Tier nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Maus oder Ratte handelt.