DE69936103T2

DE69936103T2 - Fusionsproteine bestehend aus proteingerüst und bibliotheken von zufälligen peptiden

Info

Publication number: DE69936103T2
Application number: DE69936103T
Authority: DE
Inventors: David San Bruno ANDERSON; Jakob Maria San Mateo BOGENBERGER; Beau Robert San Francisco PEELLE
Original assignee: Rigel Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Rigel Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-10-08
Filing date: 1999-10-08
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2019-10-09
Also published as: ATE362528T1; US6596485B2; WO2000020574A2; JP2002526108A; DE69936103D1; WO2000020574A3; EP1119617A2; US6548249B1; EP1119617B1; US6562617B1; US6180343B1; WO2000020574A9; US20010003650A1; US6548632B1; AU1516400A; CA2345215A1; AU768126B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Gerüstproteinen, umfassend das grünfluoreszierende Protein (GFP), in Fusionskonstrukten mit Zufallspeptiden und definierten Peptiden sowie Peptidbibliotheken, um die zellulären Expressionsmengen zu erhöhen, den zellulären Katabolismus zu verringern, die Konformationsstabilität in Bezug auf lineare Peptide zu erhöhen und um die Gleichgewichtskonzentrationen der in Zellen exprimierten Zufallspeptide und Zufallspeptidbibliothek-Mitglieder mit dem Zweck der Detektion der Gegenwart der Peptide und dem Screening von Zufallspeptidbibliotheken zu erhöhen. N-terminale, C-terminale, duale N- und C-terminale und ein oder mehrere interne Fusionen werden alle in Betracht gezogen. Neue Fusionen, die selbstbindende Peptide verwenden, um eine bezüglich der Konformation stabilisierte Fusionsdomäne zu schaffen, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Gebiet des Biomolekül-Screenings für biologisch und therapeutisch relevante Verbindungen ist durch schnelles Wachstum gekennzeichnet. Relevante Biomoleküle, die den Fokus eines solchen Screenings auf der Suche nach Molekülen, welche die biologische Aktivität identifizierter Zielmoleküle entweder inhibieren oder verstärken, dargestellt haben, umfassen chemische Bibliotheken, Nucleinsäurebibliotheken und Peptidbibliotheken. Besonders mit Hinblick auf Peptidbibliotheken war die Isolation von Peptidinhibitoren von Zielen und die Identifikation formaler Bindungspartner von Zielen ein wichtiger Fokus. Ein bestimmtes Problem mit Peptidbibliotheken ist die Schwierigkeit des Beurteilens, ob ein bestimmtes Peptid exprimiert wurde und in welchem Ausmaß, und zwar vor der Bestimmung, ob das Peptid eine biologische Wirkung hat.
Grünfluoreszierendes Protein (GFP) ist ein 238-Aminosäure-Protein. Die Kristallstruktur des Proteins und einiger Punktmutationen wurde aufgeklärt (Ormo et al., Science 273, 1392-5 (1996); Yang et al., Nature Biotechnol. 14, 1246-51 (1996)). Das Fluorophor, bestehend aus einem modifizierten Tripeptid, ist innerhalb einer re lativ starren β-Fass-Struktur verborgen, wo es beinahe vollständig vor dem Kontakt mit dem Lösungsmittel geschützt ist. Die Fluoreszenz dieses Proteins reagiert auf eine Reihe an Punktmutationen empfindlich (G.N. Phillips, Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 821-27 (1997)). Die Fluoreszenz scheint ein empfindliches Indiz für die Konservierung der nativen Struktur des Proteins zu sein, da eine beliebige Zerschlagung der Struktur, die es dem Lösungsmittel ermöglicht, in Kontakt mit dem fluorophoren Tripeptid zu kommen, die Fluoreszenz quencht.
Abedi et al. (Nucleic Acids Res. 26, 623-30 (1998)) haben Peptide zwischen Reste insertiert, die in mehreren GFP-Schleifen enthalten waren. Inserts der kurzen Sequenz LEEFGS zwischen angrenzenden Resten an 10 internen Insertionsstellen wurden ausprobiert. Von diesen ergaben die Inserts an drei Stellen, zwischen den Resten 157-158, 172-173 und 194-195, eine Fluoreszenz von zumindest 1 % der des Wildtyp-GFP. Nur die Inserts zwischen den Resten 157-158 und 172-173 besaßen eine Fluoreszenz von zumindest 10 % des Wildtyp-GFP. Wurden SAG-Zufalls-20mer-GAS-Peptidsequenzen an verschiedenen Stellen im Inneren von GFP insertiert, so gaben nur zwei Stellen durchschnittliche Fluoreszenzintensitäten von 2 % oder mehr der GFP-Zufallspeptidsequenzen, die 10fach über der Hintergrundfluoreszenz lagen. Diese Stellen waren Insertionen zwischen den Resten 157-158 und 172-173.
Es ist ein Ziel der Erfindung, Zusammensetzungen von Fusionskonstrukte von Peptiden mit Gerüstproteinen, umfassend detektierbare Proteine, wie z.B. GFP, sowie Verfahren zur Verwendung solcher Konstrukte beim Screening von Peptidbibliotheken bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt eine Bibliothek an Fusionsproteins bereit, wie sie in den Ansprüchen dargelegt ist. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine Bibliothek an Fusionsproteinen bereit, wobei jedes Fusionsprotein Folgendes umfasst:

a) ein autofluoreszierendes Protein, das ein Renilla-GFP, ein Aequorea-GFP oder eine fluoreszierende Variante eines Aequorea-GFP ist;
(b) ein Peptid; sowie
(c) zumindest einen flexiblen Linker, der -(gly)n- umfasst, worin n ≥ 2 ist, und zwar zwischen dem Peptid und zumindest einem Abschnitt des autofluoreszierenden Proteins.

In einem Aspekt umfasst eine Bibliothek an Fusionsproteinen ein Gerüstprotein, ein Zufallspeptid, das an den N-Terminus des Gerüstpeptids fusioniert ist, sowie eine Repräsentationsstruktur, die das Zufallspeptid in einer bezüglich der Konformation eingeschränkten Form darstellt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist jedes der Zufallspeptide in der Bibliothek anders.
In einem Aspekt umfasst eine Bibliothek an Fusionsproteinen ein Gerüstprotein, ein Zufallspeptid, das an den C-Terminus des Gerüstproteins fusioniert ist, sowie eine Repräsentationsstruktur, die das Zufallspeptid in einer bezüglich der Konformation eingeschränkten Form darstellt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist jedes der Zufallspeptide in der Bibliothek anders.
In einem Aspekt der Erfindung stammt das GFP aus Aequorea, und das Zufallspeptid wird in die Schleife insertiert, welche die Aminosäuren 130 bis 135 des GFP umfasst.
In einem anderen Aspekt der Erfindung stammt das GFP aus Aequorea, und das Zufallspeptid wird in die Schleife insertiert, welche die Aminosäuren 154 bis 159 des GFP umfasst.
In einem anderen Aspekt der Erfindung stammt das GFP aus Aequorea, und das Zufallspeptid wird in die Schleife insertiert, welche die Aminosäuren 172 bis 175 des GFP umfasst.
In einem anderen Aspekt der Erfindung stammt das GFP aus Aequorea, und das Zufallspeptid wird in die Schleife insertiert, welche die Aminosäuren 188 bis 193 des GFP umfasst.
In einem anderen Aspekt der Erfindung stammt das GFP aus Aequorea, und das Zufallspeptid wird in die Schleife insertiert, welche die Aminosäuren 208 bis 216 des GFP umfasst.
In einem Aspekt der Erfindung stammt das GFP von einer Renilla-Spezies.
In einer Ausführungsform umfasst das Peptid ein Zufallspeptid. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der flexible Linker in eine Schleifenstruktur des autofluoreszierenden Proteins insertiert.
In einem Aspekt der Erfindung umfassen die Bibliothek an Fusionsproteinen und die Bibliothek an Nucleinsäuren zumindest 10⁵ verschiedene Mitglieder.
Die Erfindung stellt weiters Fusionsnucleinsäuren bereit, die für die Bibliothek an Fusionsproteinen kodieren.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Expressionsvektoren bereitgestellt. Die Expressionsvektoren umfassen eine oder mehrere der Nucleinsäuren, die für die Fusionsproteine kodieren, die operabel an Regulationssequenzen gebunden sind, die durch eine Wirtszelle erkannt werden, die mit den Nucleinsäuren transformiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Expressionsvektoren retrovirale Vektoren. Weiters werden hierin Wirtszellen bereitgestellt, welche die hierin bereitgestellten Vektoren und rekombinanten Nucleinsäuren umfassen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Screening auf bioaktive Peptide bereit, die einen bestimmten Phänotypen verleihen, und zwar unter Verwendung der in den Ansprüchen dargelegten Bibliotheken an Fusionsproteinen. Die Zel len werden Bedingungen unterzogen, worin das Fusionsprotein exprimiert wird. Die Zellen werden anschließend auf den Phänotypen getestet.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 beschreibt die Kristallstruktur von GFP, wobei die Temperaturfaktoren gezeigt werden, die verwendet wurden, um einige der Schleifen für die interne Insertion von Zufallspeptiden auszusuchen.
Die 2A, 2B, 2C, 2D, 2E und 2F zeigen die Resultate der Beispiele. 2A ist eine schematische Darstellung der Position der Schleifen. Die 2B–2F zeigen die Resultate und die durchschnittliche Fluoreszenz.
3 zeigt ein Helixraddiagramm einer parallelen superspiralisierten Helix. Für jede Helix befindet sich a oder a' am N-Terminus, und die Reste in der Sequenz sind abcdefg oder a'b'c'd'e'f'g', die wiederholt werden, um die einzelnen Helices abcdefg(abcdefg)nabcdefg oder a'b'c'd'e'f'g'(a'b'c'd'e'f'g')_na'b'c'd'e'f'g' zu ergeben. Der Kern der Helix ist a, a', d und d', wobei es sich dabei um Kombinationen hydrophober starker helixbildender Reste, wie z.B. ala/leu oder val/leu, handelt. Falls die Reste e und e' als glu und g und g' als lys festgesetzt werden, so würden Interhelix-Salzbrücken die Doppelwendelstruktur weiter stabilisieren.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Screening von kombinatorischen Bibliotheken potentieller Arzneimittel auf therapeutisch relevante Zielzellen ist ein schnell wachsendes und bedeutendes Gebiet. Peptidbibliotheken sind eine wichtige Untergruppe dieser Bibliotheken. Um jedoch das intrazelluläre Screening dieser Peptidbibliotheken zu erleichtern, muss eine Reihe an Hindernissen überwunden werden. Um funktionelle Peptide in Zellen zu exprimieren und danach zu screenen, müssen die Peptide in ausreichenden Mengen exprimiert werden, um katabolische Mechanismen, wie z.B. die Proteolyse und den Transport aus dem Zytoplasma in die Endosomen, zu überwinden. Die Peptide kön nen in Bezug auf lineare Peptide auch eine Konformationsstabilisierung aufweisen, um eine größere Bindungsaffinität für ihre zellulären Ziele zu ermöglichen. Zusätzlich dazu kann das Messen des Expressionsausmaßes dieser Peptide schwierig sein: es kann z.B. im Allgemeinen schwierig sein, die Expression von Peptiden in spezifischen Zellen zu verfolgen, um sich zu vergewissern, ob eine bestimmte Zelle ein Mitglied der Bibliothek exprimiert. Um diese Probleme zu überwinden, zielt die vorliegende Erfindung auf Fusionen von Gerüstproteinen, unter anderem Varianten und Zufallspeptide, die auf solch eine Art fusioniert sind, dass die Struktur des Gerüsts nicht signifikant gestört wird und das Peptid metabolisch einer Konformationsstabilisierung unterzogen wird. Dies ermöglicht die Erstellung einer Peptidbibliothek, die leicht zu beobachten ist, sowohl bezüglich der Gegenwart in Zellen als auch bezüglich ihrer Quantität. Daher werden die Peptide innerhalb eines Gerüstproteins oder jene, die an ein solches fusioniert sind, auf oder an der Oberfläche des Gerüsts dargestellt, wodurch sie für eine Wechselwirkung mit potentiellen funktionellen Zielen zugänglich sind.
Die Gerüstproteine fallen in zwei Hauptkategorien: Reporterproteine und Strukturproteine. Reporterproteine sind jene, die eine Unterscheidung von Zellen, welche die Reporterproteine enthalten, von jenen, die dies nicht tun, ermöglichen. Während die Bestimmung der Expression eines bestimmten Peptids schwierig ist, sind zahlreiche Verfahren nach dem Stand der Technik bekannt, um die Expression von größeren Proteinen oder die Expression von Genen, die für diese kodieren, zu messen. Die Expression eines Gens kann z.B. durch das Messen der Menge an produzierter RNA gemessen werden. Obwohl diese Analyse direkt ist, ist sie jedoch schwierig, normalerweise nicht sehr empfindlich und arbeitsintensiv. Ein etwas vorteilhafterer Ansatz wird durch das Messen der Expression von Reportergenen bereitgestellt. Die Reportergenexpression ist im Allgemeinen leichter zu beobachten, da in vielen Fällen der zelluläre Phänotyp verändert wird, und zwar entweder durch die Gegenwart von detektierbaren Veränderungen, wie z.B. die Gegenwart eines fluoreszierenden Proteins (das, wie hierin beschrieben wurde, sowohl die Verwendung von Fusionen an das detektierbare Gen selbst als auch die Verwendung von detektierbaren Genkonstrukten umfasst, die auf der Gegenwart des zu aktivierenden Gerüstproteins basiert, z.B. wenn das Gerüst ein Transkriptionsfaktor ist), durch die Addition eines Substrats, das durch das Reporterprotein verändert ist (z.B. chromogene (unter anderem fluorogene) Substrate für Reporterenzyme, wie z.B. Luciferase, β-Galactosidase, etc.), oder z.B. durch das Verleihen eines arzneimittelresistenten Phänotyps.
Reporterproteine fallen im Allgemeinen in eine von mehreren Klassen, unter anderem Detektionsgene, indirekt detektierbare Gene, Überlebensgene etc. Das heißt durch Insertieren einer Peptidbibliothek in ein Gen, das detektierbar ist, z.B. GFP oder Luciferase, kann die Expression der Peptidbibliothek beobachtet werden. Auf ähnliche Art und Weise ermöglicht die Insertion eines Gens in ein Überlebensgen, wie z.B. ein Antibiotika-Resistenzgen, die Detektion der Expression der Bibliothek.
In einigen Ausführungsformen ist ebenso wünschenswert, dass die Peptide verschiedene strukturelle Neigungen aufweisen, da verschiedene Proteine oder andere funktionelle Ziele Peptide mit verschiedenen spezifischen Strukturen erfordern können, um auf enge Art und Weise mit ihrer Oberfläche oder mit Spalt-Bindungsstellen wechselzuwirken. Daher können verschiedene Bibliotheken, jeweils mit einer anderen strukturellen Neigung, verwendet werden, um die Chancen auf Mitglieder mit hoher Affinität für eine Reihe verschiedener Ziele zu maximieren. Daher können z.B. Zufallspeptidbibliotheken mit einer Helixneigung oder einer Neigung zu verlängerter Struktur, wie untenstehend ausführlicher angeführt wird, durch Fusion an den N-Terminus und/oder an den C-Terminus gewisser Gerüstproteine hergestellt werden. Auf ähnliche Art und Weise können Zufallspeptidbibliotheken mit einer Neigung zu Doppelwendel durch Fusion an den N- und/oder den C-Terminus eines bestimmten Gerüstproteins hergestellt werden. Gestreckte Konformationen der Zufallsbibliothek können unter Verwendung von Insertionen zwischen dimerisierenden Gerüstproteinen hergestellt werden. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden Schleifenformationen durch Insertion in Schleifen in Gerüstproteinen; Aminosäurereste in den jeweiligen Schleifenstrukturen können durch die Zufallspeptidbibliothek ersetzt werden, oder die Zufallspeptidbibliothek kann zwischen zwei Aminosäurereste insertiert werden, die sich innerhalb einer Schleifenstruktur befinden.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung Fusionsproteine von Gerüstproteinen und Zufallspeptiden bereit. Mit „Fusionsprotein" oder „Fusionspolypeptid" oder grammatikalischen Äquivalenten ist hierin ein Protein gemeint, das aus einer Vielzahl an Proteinkomponenten besteht, die, während sie typischerweise in ihrem nativen Zustand nicht verbunden sind, typischerweise durch ihre jeweiligen Amino- und Carboxyl-Termini durch eine Peptidbindung gebunden sind, um ein einziges kontinuierliches Polypeptid zu bilden. „Protein" umfasst in diesem Kontext Proteine, Polypeptide und Peptide. Vielzahl umfasst in diesem Kontext zumindest zwei, wobei bevorzugte Ausführungsformen im Allgemeinen zwei Komponenten verwenden. Man weiß die Tatsache zu schätzen, dass die Proteinkomponenten direkt gebunden werden können oder durch einen Peptidlinker/Sacer gebunden werden können, wie unten stehend dargelegt. Zusätzlich dazu können, wie unten stehend dargelegt, zusätzliche Komponenten, wie z.B. Fusionspartner, unter anderem Präsentationsstrukturen, Zielsequenzen etc., verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt Fusionsproteine von Gerüstproteinen und Zufallspeptiden bereit. Mit „Gerüstprotein", „Gerüstpolypeptid", „Gerüst" oder grammatikalischen Äquivalenten davon ist hierin ein Protein gemeint, an das Aminosäuresequenzen, wie z.B. Zufallspeptide, fusioniert werden können. Die Peptide sind zum Gerüst exogen; d.h. sie sind normalerweise nicht im Protein vorhanden. Nach der Fusion ermöglicht das Gerüstprotein normalerweise die Darstellung der Zufallspeptide auf eine Art und Weise, so dass diese für andere Moleküle zugänglich sind.
Gerüstproteine fallen in mehrere Klassen, unter anderem Reporterproteine (die detektierbare Proteine, Überlebensproteine und indirekt detektierbare Proteine umfassen) sowie Strukturproteine.
Die vorliegende Erfindung verwendet Gerüstproteine, die autofluoreszierende Reporterproteine sind. Mit „Reporterprotein" oder grammatikalischen Äquivalenten ist hierin ein Protein gemeint, das durch seine Gegenwart in oder auf einer Zelle oder bei Sekretion in die Medien der Zelle ermöglicht, von einer Zelle unterschieden zu werden, die das Reporterprotein nicht enthält. Wie hierin beschrieben, umfasst die Zelle normalerweise ein Reportergen, das für das Reporterprotein kodiert.
Wie nach dem Stand der Technik bekannt ist, gibt es eine Reihe an bekannten autofluoreszierenden Proteinen; diese basieren im Allgemeinen auf dem grünfluoreszierenden Protein (GFP) aus Aequorea und Varianten davon; unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, GFP (Chalfie et al., „Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression", Science 263 (5148), 802-805 (1994)); verstärktes GFP (EGFP; Clontech-Genbank-Zugriffsnummer U55762); blaufluoreszierendes Protein (BFP; Quantum Biotechnologies, Inc., 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8. Stock, Montreal (Quebec), Canada H3H 1J9; R.H. Stauber, Biotechniques 24 (3), 462-471 (1998); R. Heim und R.Y. Tsien, Curr. Biol. 6, 178-182 (1996)), sowie verstärktes gelbfluoreszierendes Protein (EYFP; Clontech Laborstories, Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303). Zusätzlich dazu gibt es vor kurzem erschienene Berichte über autofluoreszierende Proteine aus Renilla-Spezies. Siehe WO 92/15673 ; WO 95/07463 ; WO 98/14605 ; WO 98/26277 ; WO 99/49019 ; U.S.-Patent Nr. 5.292.658 ; U.S.-Patent Nr. 5.418.155 ; U.S.-Patent Nr. 5.683.888 ; U.S.-Patent Nr. 5.741.668 ; U.S.-Patent Nr. 5.777.079 ; U.S.-Patent Nr. 5.804.387 ; U.S.-Patent Nr. 5.874.304 ; U.S.-Patent Nr. 5.876.995 und U.S.-Patent Nr. 5.925.558 .
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gerüstprotein das grünfluoreszierende Aequorea-Protein oder eines seiner Varianten; siehe Cody et al., Biochemistry 32, 1212-1218 (1993); und Inouye und Tsuji, FEBS Lett. 341, 277-280 (1994).
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung Fusionen von grünfluoreszierendem Protein (GFP) und Zufallspeptiden bereit. Mit „grünfluoreszierendem Protein" oder „GFP" ist hierin ein Protein mit zumindest 30 % Sequenzidentität mit GFP gemeint, das eine Fluoreszenz von 490 bis 600 nm zeigt. Das Wildtyp-GFP ist 238 Aminosäuren lang, enthält ein modifiziertes Tripeptid-Fluorophor, das innerhalb einer relativ starren β-Fass-Struktur verborgen ist, die das Fluorophor vor dem Lösungsmittel und dem dadurch ausgelösten Quenchen durch das Lösungsmittel schützt. Siehe Prasher et al., Gene 111 (2), 229-233 (1992); Cody et al., Biochem. 32 (5), 1212- 1218 (1993); Ormo et al., Science 273, 1392-1395 (1996); sowie Yang et al., Nat. Biotech. 14, 1246-1251 (1996)). In der Definition von GFP sind Derivate von GFP inkludiert, unter anderem Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und -deletionen. Siehe z.B. WO 98/06737 und U.S.-Patent Nr. 5.777.079 . Dementsprechend können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten GFP-Proteine kürzer oder länger als die Wildtyp-Sequenz sein. Daher sind in einer bevorzugten Ausführungsform in der Definition der GFP-Proteine Abschnitte oder Fragmente der Wildtyp-Sequenz inkludiert. GFP-Deletionsmutanten können z.B. hergestellt werden. Es ist bekannt, dass am N-Terminus nur die erste Aminosäure des Proteins ohne Verlust der Fluoreszenz deletiert werden kann. Am C-Terminus können bis zu 7 Reste ohne Verlust der Fluoreszenz deletiert werden; siehe Phillips et al., Current Opin. Structural Biol. 7, 821 (1997)).
In einer Ausführungsform sind die GFP-Proteine Derivat- oder Varianten-GFP-Proteine. Das heißt, wie unten stehend ausführlicher beschrieben wird, dass das Derivat-GFP-Protein zumindest eine Aminosäuresubstitution, -deletion oder -insertion enthält, wobei Aminosäuresubstitutionen besonders bevorzugt werden. Die Aminosäuresubstitution, -insertion oder -deletion kann an einem beliebigen Rest innerhalb des GFP-Proteins auftreten. Diese Varianten werden normalerweise durch ortspezifische Mutagenese von Nucleotiden in der DNA, die für das GFP-Protein kodiert, hergestellt, und zwar unter Verwendung einer Kassetten- oder PCR-Mutagenese oder anderer Verfahren, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind, um DNA zu erzeugen, die für die Variante kodiert, wonach die DNA in rekombinanter Zellkultur exprimiert wird, wie oben stehend beschrieben. Es können jedoch Varianten-GFP-Proteinfragmente mit bis zu etwa 100-150 Resten durch In-vitro-Synthese unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden. Aminosäuresequenzvarianten sind durch die vorherbestimmte Natur der Variation charakterisiert, ein Merkmal, das sie von natürlich vorkommenden Allel- oder Interspezies-Variationen der GFP-Protein-Aminosäuresequenz unterscheidet. Die Varianten zeigen typischerweise dieselbe qualitative biologische Aktivität wie das natürlich vorkommende Analogon, obwohl, wie unten stehend ausführlicher beschrieben wird, auch Varianten ausgewählt werden können, die modifizierte Merkmale aufweisen. Das heißt, in einer bevorzug ten Ausführungsform besitzt das Derivat, wenn ein Nicht-Wildtyp-GFP verwendet wird, vorzugsweise zumindest 1 % der Wildtyp-Fluoreszenz, wobei zumindest etwa 10 % bevorzugt werden, zumindest etwa 50-60 % insbesondere bevorzugt werden und 95 % bis 98 % bis 100 % noch weiters insbesondere bevorzugt werden. Im Allgemeinen ist es wichtig, dass genug Fluoreszenz vorhanden ist, um das Sortieren und/oder die Detektion über dem Hintergrund zu ermöglichen, z.B. unter Verwendung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortier-(FACS-)Maschine. In einigen Ausführungsformen ist es jedoch möglich, die Fusionsproteine nicht durch Fluoreszenz zu detektieren, z.B. unter Verwendung von Antikörpern, die entweder auf eine Epitop-Markierung (d.h. Reinigungssequenz) oder auf das GFP selbst gerichtet sind. In diesem Fall muss das GFP-Gerüst nicht fluoreszierend sein; auf ähnliche Art und Weise muss, wie unten stehend erklärt wird, keines der Gerüste biologisch aktiv sein, wenn gezeigt werden kann, dass sich das Gerüst korrekt und/oder reproduzierbar faltet.
Wie der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung zu schätzen weiß, können beliebige der Gerüstproteine oder der Gene, die für sie kodieren, von Wildtyp sein oder aber Varianten davon. Diese Varianten fallen in eine oder mehrere von drei Klassen: die Substitution, die Insertion oder die Deletion betreffende Varianten. Diese Varianten werden normalerweise durch ortspezifische Mutagenese von Nucleotiden in der DNA hergestellt, die für das Gerüstprotein kodiert, und zwar unter Verwendung der Kassetten- oder PCR-Mutagenese oder anderer Verfahren, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind, um DNA zu produzieren, die für die Variante kodiert, wonach die DNA in rekombinanter Zellkultur, wie hierin beschrieben, exprimiert wird. Proteinvarianten-Fragmente mit bis zu etwa 100-150 Resten können jedoch durch In-vitro-Synthese unter Verwendung der bekannten Verfahren hergestellt werden. Aminosäuresequenzvarianten werden durch die vorherbestimmte Natur der Variation charakterisiert, ein Merkmal, das sie von natürlich vorkommenden Allel- oder Interspezies-Variationen der Gerüstprotein-Aminosäuresequenz unterscheidet. Die Varianten zeigen typischerweise dieselbe qualitative biologische Aktivität wie das natürlich vorkommende Analogon, obwohl, wie unten stehend ausführlicher beschrieben wird, auch Varianten ausgewählt werden können, die modifizierte Merkmale aufweisen.
Während die Stelle oder Region für das Einführen einer Aminosäuresequenzvariation vorherbestimmt ist, muss die Mutation per se nicht vorherbestimmt sein. Um z.B. die Leistung einer Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, kann eine Zufalls-Mutagenese am Ziel-Codon oder in der Ziel-Region durchgeführt werden, und die exprimierten Gerüst-Varianten können auf die optimale Kombination der gewünschten Aktivität gescreent werden. Verfahren zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorherbestimmten Stellen in DNA mit einer bekannten Sequenz sind wohlbekannt, z.B. M13-Pimer-Mutagenese und PCR-Mutagenese. Das Screening der Mutanten wird unter Verwendung von Tests der Gerüstprotein-Aktivitäten durchgeführt.
Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise jene von einzelnen Resten; Insertionen befinden sich normalerweise im Bereich von etwa 1 bis 20 Aminosäuren, obwohl beträchtlich größere Insertionen toleriert werden können. Deletionen befinden sich im Bereich von etwa 1 bis etwa 20 Resten, obwohl in einigen Fällen die Deletionen viel größer sein können.

Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder eine beliebige Kombination davon können/kann verwendet werden, um zu einem Endderivat zu kommen. Im Allgemeinen werden diese Veränderungen auf einigen wenigen Aminosäuren ausgeführt, um die Veränderung des Moleküls zu minimieren. Größere Veränderungen können jedoch unter gewissen Umständen toleriert werden. Werden kleine Veränderungen der Merkmale eines Gerüstproteins, wie z.B. GFP, gewünscht, so werden Substitutionen im Allgemeinen gemäß der folgenden Tabelle durchgeführt: Tabelle 1

Ursprünglicher Rest	Beispielhafte Substitutionen
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gln, Glu
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Wesentliche Veränderungen der Funktion oder der immunologischen Identität werden durch Auswahl von Substitutionen durchgeführt, die weniger konservativ als jene sind, die in Tabelle 1 dargestellt sind. Es können z.B. Substitutionen gemacht werden, die mit größerer Signifikanz Folgendes beeinflussen: die Struktur der Polypeptid-Hauptkette im Bereich der Veränderung, z.B. die α-Helix- oder β-Faltblatt-Struktur; die Ladung oder die Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle; oder die Sperrigkeit der Seitenkette. Die Substitutionen, von denen im Allgemeinen erwartet wird, dass sie die größten Veränderungen der Eigenschaften des Polypeptids erzeugen, sind jene, bei denen (a) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl, substituiert ist; (b) ein Cystein oder Prolin für (oder durch) einen beliebigen anderen Rest substituiert ist; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, für (oder durch) einen elektronegativen Rest, z.B. Glutamyl oder Aspartyl, substituiert ist; oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, für (oder durch) einen Rest ohne Seitenkette, z.B. Glycin, substituiert ist.
Wie oben stehend beschrieben, zeigen die Varianten typischerweise dieselbe qualitative biologische Aktivität (d.h. Fluoreszenz), obwohl Varianten auch ausgewählt werden, um die Merkmale der Gerüstproteine je nach Bedarf zu modifizieren.
Zusätzlich dazu können Gerüstproteine hergestellt werden, die länger als der Wildtyp sind, z.B. durch die Addition von Epitop- oder Reinigungs-Markierungen, die Addition anderer Fusionssequenzen etc., wie unten stehend ausführlicher beschrieben wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gerüstprotein eine GFP-Variante, die eine geringe oder keine Fluoreszenz besitzt, jedoch in Säugetierzellen in einer Konzentration von zumindest etwa 10 nM, vorzugsweise in einer Konzentration von zumindest etwa 100 nM, noch bevorzugter in einer Konzentration von zumindest etwa 1 μM, noch weiter bevorzugt in einer Konzentration von zumindest etwa 10 μM und insbesondere bevorzugt in einer Konzentration von zumindest etwa 100 μM, exprimiert wird.
Ein Zufallspeptid wird an ein Gerüstprotein fusioniert, um ein Fusionspolypeptid zu bilden. Mit „fusioniert" oder „operabel gebunden" ist hierin gemeint, dass das Zufallspeptid, wie unten stehend definiert, und das Gerüstprotein, wie durch GFP hierin beispielhaft veranschaulicht, aneinander gebunden sind, und zwar auf solch eine Art und Weise, dass die Zerstörung der Stabilität der Gerüststruktur minimiert wird (d.h. dass die biologische Aktivität beibehalten werden kann). Im Fall von GFP behält das Gerüst vorzugsweise seine Fähigkeit zur Fluoreszenz oder behält eine Tm von zumindest 42°C bei. Wie unten stehend beschrieben, kann das Fusionspolypeptid (oder das Fusionspolynucleotid, das für das Fusionspolypeptid kodiert) auch weitere Komponenten umfassen, unter anderem multiple Peptide an mehrfachen Schleifen, Fusionspartner etc.
Das Fusionspolypeptid umfasst vorzugsweise zusätzliche Komponenten, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Fusionspartner und Linker.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Zufallspeptid an den N-Terminus des GFP gebunden. Die Fusion kann direkt sein, d.h. ohne zusätzliche Reste zwischen dem C-Terminus des Peptids und dem N-Terminus des GFP, oder indirekt, d.h. dass dazwischen liegende Aminosäuren verwendet werden, z.B. ein oder mehrere Fusionspartner, unter anderem ein Linker. In dieser Ausführungsform wird vorzugsweise eine Präsentationsstruktur verwendet, um dem Peptid etwas Konformationsstabilität zu verleihen. Besonders bevorzugte Ausführungsformen umfassen die Verwendung von Dimerisationssequenzen.
In einer Ausführungsform werden N-terminale Reste des GFP deletiert, d.h. eine oder mehrere Aminosäuren des GFP können deletiert werden und mit dem Peptid ersetzt werden. Wie oben angeführt, können jedoch Deletionen von mehr als 7 Aminosäuren die Fluoreszenz des GFP verringern, daher werden größere Deletionen im Allgemeinen nicht bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Fusion direkt an die erste Aminosäure des GFP.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Zufallspeptid an den C-Terminus des GFP fusioniert. Wie oben bei den N-terminalen Fusionen kann die Fusion direkt oder indirekt erfolgen, und die C-terminalen Reste können deletiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Peptide und Fusionspartner sowohl zum N- als auch zum C-Terminus des GFP hinzugefügt. Da sich der N- und der C-Terminus von GFP auf derselben „Fläche" des Proteins befinden, in räumlicher Nähe (innerhalb von 18 Å), ist es möglich, unter Verwendung der Komponenten der Erfindung ein nicht-kovalent „zirkuläres" GFP-Protein herzustellen. Daher kann z.B. die Verwendung von Dimerisationssequenzen ein nicht-kovalent zyklisiertes Protein ermöglichen; durch die Bindung einer ersten Dimerisationssequenz an entweder den N- oder den C-Terminus von GFP und durch das Hinzufügen eines Zufallspeptids und einer zweiten Dimerisationssequenz zum anderen Terminus kann eine große kompakte Struktur gebildet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Zufallspeptid an eine interne Position des GFP gebunden; d.h. das Peptid wird an einer internen Position von GFP insertiert. Während des Peptid an beinahe jeder beliebigen Position insertiert werden kann, umfassen bevorzugte Positionen die Insertion an den äußersten Spitzen der „Schleifen" auf der Oberfläche des GFP, um die Zerstörung der GFP-β-Fass-Proteinstruktur zu minimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Schleifen als jene ausgewählt, welche die höchsten Temperaturfaktoren in der Kristallstruktur aufweisen, wie in den Beispielen dargestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Zufallspeptid ohne eine Deletion der GFP-Reste insertiert. D.h. der Insertionspunkt liegt zwischen zwei Aminosäuren in der Schleife, wodurch die neuen Aminosäuren des Peptids und Fusionspartner, unter anderem Linker, hinzugefügt werden. Im Allgemeinen werden, wo Linker verwendet werden, die Linker direkt an das GFP fusioniert, wobei zusätzliche Fusionspartner, falls vorhanden, an die Linker und die Peptide fusioniert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Peptid in das GFP insertiert, wobei ein oder mehrere GFP-Reste deletiert werden; d.h. das Zufallspeptid (und Fusionspartner, unter anderem Linker) ersetzt einen oder mehrere Reste. Im Allgemeinen werden, wenn Linker verwendet werden, die Linker direkt an das GFP gebunden, d.h. es sind Linker-Reste, welche die GFP-Reste ersetzen, wiederum im Allgemeinen an der Spitze der Schleife. Im Allgemeinen werden, wenn Reste ersetzt werden, von einem bis zu fünf Reste des GFP deletiert, wobei die Deletionen von einer, zwei, drei, vier und fünf Aminosäuren alle möglich sind. Spezifische bevorzugte Deletionen werden unten stehend beschrieben. Für die Struktur von GFP siehe 1 und 2.
Die bevorzugten Insertionspunkte in Schleifen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Schleife 1 (Aminosäuren 130-135), Schleife 2 (Aminosäuren 154-159), Schleife 3 (Aminosäuren 172-175), Schleife 4 (Aminosäuren 188-193) und Schleife 5 (Aminosäuren 208-216).
Insbesondere bevorzugte Ausführungsformen umfassen die Insertion von Peptiden und assoziierten Strukturen in Schleife 1, Aminosäuren 130-135. In einer bevorzugten Ausführungsform wird/werden eine oder mehrere der Schleifen-Aminosäure(n) deletiert, wobei die Deletion von asp133 bevorzugt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Peptide (und Fusionspartner, falls vorhanden) in Schleife 2, Aminosäuren 154-159, insertiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird/werden eine oder mehrere der Schleifen-Aminosäure(n) deletiert, wobei die Deletion von sowohl lys156 als auch gln157 bevorzugt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Peptide (und Fusionspartner, falls vorhanden) in Schleife 3, Aminosäuren 172-175, insertiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird/werden eine oder mehrere der Schleifen-Aminosäure(n) deletiert, wobei die Deletion von asp173 bevorzugt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Peptide (und Fusionspartner, falls vorhanden) in Schleife 4, Aminosäuren 188-193, insertiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird/werden eine oder mehrere der Schleifen-Aminosäure(n) deletiert, wobei die gleichzeitige Deletion von gly189, asp190, gly191 und pro192 bevorzugt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Peptide (und Fusionspartner, falls vorhanden) in Schleife 5, Aminosäuren 208-216, insertiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird/werden eine oder mehrere der Schleifen-Aminosäure(n) deletiert, wobei die gleichzeitige Deletion von asn212, glu213 und lys214 bevorzugt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform können Peptide (umfassend Fusionspartner, falls zutreffend) auf einmal in mehr als eine Schleife des Gerüsts insertiert werden. Daher kann z.B. das Hinzufügen von Peptiden sowohl zu Schleife 2 als auch zu Schleife 4 des GFP die Komplexität der Bibliothek erhöhen, jedoch trotzdem die Präsentation dieser Schleifen auf derselben Fläche des Proteins ermöglichen. Auf ähnliche Art und Weise ist es möglich, Peptide zu einer oder mehreren Schleifen hinzuzufügen und andere Fusionspartner zu anderen Schleifen hinzuzufügen, wie z.B. abzielende Sequenzen etc.
Daher werden Fusionspolypeptide, die GFP umfassen, und Zufallspeptide bereitgestellt. Zusätzlich dazu stellt eine bevorzugte Ausführungsform zur Erleichterung der Einführung von Zufallspeptiden in das GFP GFP-Proteine mit einer Multistellen-Klonierungsstelle bereit, die in zumindest eine oben angeführte Schleife insertiert wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gerüst ein Renillla-GFP oder ein Aequorea-GFP.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein, welches das Gerüstprotein und die Zufallspeptidbibliothek umfasst, bioaktiv und besitzt z.B. enzymatische Aktivität. Wie jedoch hierin dargelegt, muss das Fusionsprotein keine solche bioaktive Funktion aufweisen. Eine bevorzugte Eigenschaft des Fusionsproteins ist jedoch das Präsentieren der Zufallspeptidsequenzen für potentielle Bindungspartner.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden mehrere Gerüste für die intrazelluläre (und extrazelluläre) Präsentation von Peptidbibliotheken mit einer Neigung zu verlängerten Peptiden verwendet. Verlängerte Konformationen sind für die molekulare Erkennung in einer Reihe an Peptid-Protein-Komplexen von Bedeutung [Siligardi und Drake, Biopolymers 37 (4), 281-92 (1995)], unter anderem bei der Peptidsubstrat- (und Inhibitor-)Bindung an eine große Reihe von Proteasen, Kinasen und Phosphatasen, bei der Peptidbindung an MHC-Klasse-I- und -II-Proteine, bei der Peptidbindung an Chaperone, bei der Peptidbindung an DNA und B-Zell-Epitope. Zusätzliche Beispiele an verlängerten gebundenen Peptiden umfassen das Troponin-Inhibierungspeptid, das an Troponin C bindet [Hernanderz et al., Biochemistry 38, 6911-17 (1999)], und ein von p21 abstammendes Peptid, das an PCNA bindet [Gul- bis et al., Cell 87, 297-306 (1996)]. Lineare Peptide sind eine einzigartige Sekundärstruktur und scheinen daher in einer Reihe an Peptid-Protein-Bindungswechselwirkungen von Bedeutung zu sein.
Der intrazelluläre Katabolismus von Peptiden ist ein einschränkender Faktor, der signifikante Gleichgewichtmengen an kleinen Peptiden vermeiden kann. Proteasen, wie z.B. Aminopeptidasen [Lee und Goldberg, Biopolymers 37, 281-92 (1992)], sowie Carboxypeptidasen und die Proteasome, wie sie unten stehend beschrieben werden, können in den Abbau von intrazellulären Peptiden involviert sein. Daher können lineare oder verlängerte Peptide nach ihrer intrazellulären Expression leicht abgebaut werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bibliothek so konstruiert, dass es den Mitgliedern der Zufallsbibliothek, die aus 18-30 Zufallsresten bestehen, ermöglicht wird, lineare/verlängerte Konfigurationen aufzuweisen, ohne sowohl freie N-Termini (was einen aminopeptidasevermittelten Abbau ermöglicht) als auch freie C-Termini (was einen carboxypeptidasevermittelten Abbau ermöglicht). In dieser Ausführungsform präsentiert das Gerüst die Zufallspeptide mit einer Neigung zu linearer/verlängerter Struktur (jedoch nicht als absolute Erfordernis) und ermöglicht eine signifikante Peptidflexibilität, während es den intrazellulären Katabolismus etwas einschränkt. Die Fusion von Proteinen an beide Enden der Bibliothek sollte die Zufallssequenzen vor Amino- und Carboxy-Peptidasen schützen.
Dementsprechend wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein duales Fusionsgerüst-Fusionsprotein mit folgender Form konstruiert: N-Terminus-Protein-1-Linker-1-Zufallspeptidbibiothek-Linker-2-Protein-2-C-Terminus.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei Protein 1 und Protein 2 um dasselbe Protein. Alternativ dazu sind Protein 1 und Protein 2 verschiedene Proteine.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei Linker 1 und Linker 2 um denselben Linker. Alternativ dazu sind Linker 1 und Linker 2 verschiedene Linker.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Protein 1 und Protein 2 aus einer Gruppe von Proteinen ausgewählt, die eine geringe Affinität füreinander aufweisen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Protein 1 und Protein 2 aus einer Gruppe von Proteinen ausgewählt, die in Säugetierzellen oder in der Zelle, in der die Zufallspeptidbibliothek getestet wird, gut exprimiert werden. Diese Ausführungsform umfasst Proteine mit einer langen intrazellulären Halbwertszeit, wie z.B. CAT und andere, die nach dem Stand der Technik bekannt sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist Protein 2 ein Selektionsprotein, wie z.B. DHFR oder ein beliebiges anderes, wie oben stehend beschrieben oder nach dem Stand der Technik bekannt. In dieser Ausführungsform kann die Selektion von Mitgliedern der Bibliothek voller Länge in Säugetierzellen oder in Zellen, in denen die Bibliothek getestet wird, erreicht werden. Selektionsverfahren wurden oben stehend beschrieben. Alternativ dazu ist Protein 1 ein Selektionsprotein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist Protein 2 ein autofluoreszierendes grünfluoreszierendes Reporterprotein. In dieser Ausführungsform kann die intrazelluläre Detektion und die Verfolgung von Bibliotheksmitgliedern voller Länge in Säugetierzellen oder in Zellen, in denen die Bibliothek getestet wird, erreicht werden. Die Reportergen-Produkt-Analysen wurden oben stehend beschrieben. Alternativ dazu ist Protein 1 ein Reporterprotein.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist Protein 1 ein Reporterprotein und Protein 2 ein Selektionsprotein, was sowohl die intrazelluläre Verfolgung als auch die Selektion von Bibliotheksmitgliedern voller Länge ermöglicht.
Die Linker 1 und 2 sollten keine hohe Selbstaffinität oder nichtkovalente Affinität aufweisen, weder für Protein 1 noch für Protein 2.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht/bestehen Linker 1 und/oder Linker 2 aus Resten mit einem oder mehreren Glycinen, um die Struktur aus Protein 1 und Protein 2 aus der Zufallsbibliothek zu entkoppeln.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt/stellen Linker 1 und/oder Linker 2 genug Reste bereit, die, wenn sie verlängert sind, 0,5-1 Protein-Durchmesser-Abstand zwischen den Zufallsresten und den Proteinen 1 und 2 bereitstellen. Dies würde etwa 15-30 Å oder 5-10 Resten entsprechen und würde die sterische Interferenz bei der Peptidbibliotheksmitgliederbindung an potentielle Ziele minimieren.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält/enthalten Linker 1 und/oder Linker 2 genug hydrophile Reste, so dass die Linker die Löslichkeit oder die Klebrigkeit des gesamten Fusionsproteins oder nur der Linkerregion nicht negativ beeinflussen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann eine relativ starre Struktur aus den Linkern gebildet werden, um die Zufallsreste dazu zu zwingen, sich von den Oberflächen der Proteine 1 und 2 wegzubewegen.
Die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung umfassen ein Gerüstprotein und ein Zufallspeptid. Die Peptide (und die Nucleinsäuren, die für diese kodieren) werden randomisiert, und zwar entweder vollständig randomisiert oder in ihrer Randomisierung beeinflusst, z.B. in der Nucleotid/Rest-Häufigkeit im Allgemeinen oder pro Position. Mit „randomisiert" oder grammatikalischen Äquivalenten ist hierin gemeint, dass jede Nucleinsäure und jedes Peptid im Wesentlichen aus Zufallsnucleotiden bzw. -aminosäuren besteht. Wie unten stehend ausführlicher beschrieben wird, werden die Nucleinsäuren, die zu den Peptiden führen, chemisch synthetisiert und können daher ein beliebiges Nucleotid an einer beliebigen Position umfassen. Daher kann, wenn die Nucleinsäuren exprimiert werden, um Peptide zu bilden, ein beliebiger Aminosäurerest an einer beliebigen Position inkorporiert werden. Das Syntheseverfahren kann kreiert werden, um randomisierte Nucleinsäuren zu erzeugen, um die Formation aller oder der meisten der möglichen Kombinationen über die Länge der Nuc leinsäure zu bilden, wodurch eine Bibliothek an randomisierten Nucleinsäuren gebildet wird.
Die Bibliothek sollte eine strukturell ausreichend diverse Population an randomisierten Expressionsprodukten bereitstellen, um einen Bereich zellulärer Reaktionen mit ausreichend hoher Wahrscheinlichkeit zu erzielen, um eine oder mehrere Zellen bereitzustellen, die eine gewünschte Reaktion aufweisen. Dementsprechend muss eine Wechselwirkungsbibliothek groß genug sein, so dass zumindest eines seiner Mitglieder eine Struktur besitzt, die ihm eine Affinität für ein gewisses Molekül, Protein oder einen anderen Faktor verleiht, dessen Aktivität für Vervollständigung des Signalwegs notwendig ist. Obwohl es schwierig ist, die erforderliche absolute Größe einer Wechselwirkungsbibliothek zu messen, stellt die Natur mit der Immunreaktion einen Hinweis bereit: eine Diversität von 10⁷-10⁸ verschiedenen Antikörpern stellt zumindest eine Kombination mit ausreichender Affinität bereit, um mit den meisten potentiellen Antigenen, denen ein Organismus ausgesetzt ist, wechselzuwirken. Veröffentlichte In-vitro-Selektionsverfahren haben auch gezeigt, dass eine Bibliotheksgröße von 10⁷ bis 10⁸ ausreichend ist, um Strukturen mit einer Affinität für das Ziel zu finden. Eine Bibliothek aller Kombinationen eines Peptids, das 7 bis 20 Aminosäuren lang ist, wie es z.B. hier für die Expression in Retroviren vorgeschlagen wurde, besitzt das Potential, für 20⁷ (10⁹) bis 20²⁰ zu kodieren. Daher ermöglichen die vorliegenden Verfahren mit Bibliotheken von 10⁷ bis 10⁸ pro ml retroviraler Partikel z.B. eine „Arbeits"-Untergruppe einer theoretisch vollständigen Wechselwirkungsbibliothek von 7 Aminosäuren sowie eine Untergruppe an Formen für die 20²⁰-Bibliothek. Daher können in einer bevorzugten Ausführungsform zumindest 10⁵, vorzugsweise zumindest 10⁶, noch bevorzugter zumindest 10⁷, noch weiter bevorzugt zumindest 10⁸ und insbesondere bevorzugt zumindest 10⁹, verschiedene Peptide gleichzeitig analysiert werden, wie hierin beschrieben.
Daher umfasst eine Bibliothek an Fusionsproteinen, wobei jedes Fusionsprotein ein Gerüstprotein und ein Zufallspeptid umfasst, zumindest 10⁵, vorzugsweise zumindest 10⁶, noch bevorzugter zumindest 10⁷, noch bevorzugter zumindest 10⁸ und insbesondere bevorzugt zumindest 10⁹, verschiedene Zufallspeptide.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein einzelnes Mitglied der Bibliothek an Fusionsproteinen analysiert, wie hierin beschrieben. Alternativ dazu kann mehr als ein einzelnes Mitglied der Bibliothek an Fusionsproteinen gleichzeitig analysiert werden.
Es ist wichtig, zu verstehen, dass in jedem Bibliothekssystem, das durch Oligonucleotidsythese kodiert wird, keine vollständige Kontrolle über die Codons möglich ist, die schlussendlich in die Peptidstruktur inkorporiert werden. Dies ist besonders im Fall von Codons der Fall, die für Stopp-Signale kodieren (TAA, TGA, TAG). In einer Synthese mit NNN als Zufallsregion gibt es eine Chance von 3/64 oder 4,69 %, dass es sich bei dem Codon um ein Stopp-Codon handelt. Daher gibt es bei einem Peptid mit 10 Resten die inakzeptable hohe Wahrscheinlichkeit, dass es bei 46,7 % der Peptide zu einer frühzeitigen Termination kommt. Für freie Peptidstrukturen ist dies wahrscheinlich kein Problem. Für größere Strukturen, wie z.B. jene, die hier in Betracht gezogen werden, führt eine solche Termination jedoch zu einer sterilen Peptidexpression. Um dies zu vermindern, werden Zufallsreste als NNK kodiert, worin K = T oder G ist. Dies ermöglicht das Kodieren für alle potentiellen Aminosäuren (wodurch ihre relative Repräsentation leicht verändert wird), verhindert jedoch das Kodieren von zwei Stopp-Resten TAA und TGA, was von großer Bedeutung ist. Daher besitzen Bibliotheken, die für ein 10-Aminosäure-Peptid kodieren, eine Chance von 15,6 % einer vorzeitigen Termination. Es ist jedoch anzumerken, dass die vorliegende Erfindung das Screening von Bibliotheken ermöglicht, die terminierte Peptide in einer Schleife enthalten, da das GFP nicht fluoresziert und diese Peptide daher nicht ausgewählt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Peptidbibliothek vollständig randomisiert, ohne Sequenzpräferenzen oder -konstanten an einer beliebigen Position. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bibliothek beeinflusst. D.h. einige Positionen in der Sequenz werden entweder konstant gehalten, oder sie werden aus einer limitierten Anzahl an Möglichkeiten ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nucleotide oder die Aminosäurereste z.B. innerhalb einer definierten Klasse von z.B. hydrophoben Aminosäuren, hydrophilen Resten, sterisch beeinfluss ten (entweder kleinen oder großen) Resten für die Kreation von Cysteinen, zur Vernetzung, Prolinen für SH-3-Domänen, Serinen, Threoninen, Tyrosinen oder Histidinen für Phosphorylierungsstellen etc. oder Purinen etc. randomisiert.
Einzelne Reste können z.B. in der Zufallspeptidsequenz des Inserts fixiert sein, um eine strukturelle Neigung zu kreieren, die dem unten stehend beschriebenen Konzept der Präsentationsstrukturen ähnelt. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet Inserts einer allgemeinen Struktur -gly_2-8-aa₁-aa₂-...-aa_n-gly_2-8-, wobei die Zufalls-Insert-Sequenz aa₁ bis aa_n ist. Diese Sequenz kann durch Fixieren einer oder mehrerer der n Reste als Proline (was den Konformationsraum der gesamten Schleife signifikant einschränkt), als sperrige Aminosäuren, wie z.B. W, R, K, L, I, V, F oder Y, oder Beeinflussung des Sets an Zufallsaminosäuren, um nur sperrige Reste, wie z.B. E, F, H, I, K, L, M, Q, R, T, V, W und Y, zu inkludieren, erzwungen werden. Aufgrund der größeren Größe der Seitenketten besitzen diese Reste weniger Möglichkeiten, in einen kleinen Raum zu passen, der durch jenen definiert ist, der für eine Schleife zugänglich ist, wodurch es weniger verfügbare Schleifenkonformationen gibt.
In einer alternativen Ausführungsform können die Zufallsbibliotheken zu einer bestimmten Sekundärstruktur beeinflusst werden, indem eine geeignete Anzahl an Resten (über die Glycin-Linker hinaus) inkludiert wird, welche die besondere Sekundärstruktur bevorzugen. Um z.B. eine α-Helix-Beeinflussung zu erzeugen, könnte das gesamte Schleifeninsert wie gly_2-8-Helixbildner_4-8-Zufallsreste-Helixbildner_4-8-gly_2-8- aussehen, wobei die 4-8 Helixbildner an jedem Ende der randomisierten Region eine α-Helix initiiert und die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass die Zufallsinserts helixartig sind; um diese Neigung zu verstärken, kann es der randomisierten Region an starken Helix-Brechern, wie z.B. pro und gly, fehlen; Beispiele starker helixbildender Reste umfassen M, A, K, L, D, E, R, Q, F, I und V.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Beeinflussung in Richtung der Peptide, die mit bekannten Klassen an Molekülen Wechselwirken. Es ist z.B. bekannt, dass zahlreiche der intrazellulären Signale über kurze Regionen von Polypeptiden ausgeführt werden, die mit anderen Polypeptiden durch kleine Peptiddomänen Wechselwirken. Von einer kurzen Region der zytoplasmatischen HIV-1-Hüll-Domäne wurde z.B. bereits gezeigt, dass sie die Wirkung von zellulärem Calmodulin blockiert. Regionen der zytoplasmatischen Fas-Domäne, die eine Homologie zum Mastoparan-Toxin von Wespen aufweisen, können auf eine kurze Peptidregion mit todinduzierenden apoptotischen oder G-Protein-induzierenden Funktionen eingeschränkt werden. Magainin, ein natürliches Peptid, das aus Xenopus stammt, kann eine starke Antitumor- und antimikrobielle Aktivität aufweisen. Von kurzen Peptidfragmenten eines Protein-Kinase-C-Isozyms (βPKC) wurde gezeigt, dass sie die Zellkern-Translokation von βPKC in Xenopus-Oozyten nach der Stimulation blockieren. Weiters wurden kurze SH-3-Ziel-Peptide als Pseudosubstrate für die spezifische Bindung an SH-3-Proteine verwendet. Dies ist natürlich eine kurze Liste der erhältlichen Peptide mit biologischer Aktivität, da die Literatur auf diesem Gebiet sehr ausführlich ist. Es gibt daher zahlreiche Präzedenzfälle bezüglich des Potentials von kleinen Peptiden im Hinblick auf eine Aktivität auf die intrazellulären Signalkaskaden. Zusätzlich dazu können auch Agonisten und Antagonisten einer beliebigen Anzahl an Molekülen als Basis der beeinflussten Randomisierung von Peptiden verwendet werden.
Daher sind eine Reihe von Molekülen oder Proteindomänen als Startpunkte für die Erzeugung von beeinflussten randomisierten Peptiden geeignet. Eine große Anzahl an kleinen Molekül-Domänen ist bekannt, die eine gemeinsame Funktion, Struktur oder Affinität verleihen. Zusätzlich dazu können, was nach dem Stand der Technik gewürdigt wird, Gebiete schwächerer Aminosäure-Homologie eine starke strukturelle Homologie aufweisen. Es sind eine Reihe dieser Moleküle, Domänen und/oder korrespondierenden Konsensus-Sequenzen bekannt, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, SH-2-Domänen, SH-3-Domänen, Pleckstrin, Todesdomänen, Protease-Spalt/Erkennungsstellen, Enzyminhibitoren, Enzymsubstrate, Traf etc. Auf ähnliche Art und Weise gibt es eine Reihe bekannter nucleinsäurebindender Proteine, die Domänen enthalten, die für die Verwendung in der Erfindung geeignet sind. Z.B. sind Leucin-Zipper-Konsensus-Sequenzen bekannt.
Im Allgemeinen müssen zumindest 4, vorzugsweise zumindest 10, noch bevorzugter zumindest 15, Aminosäure-Positionen randomisiert werden; es ist wieder darauf hinzuweisen, dass mehr bevorzugt werden, wenn die Randomisierung nicht ganz perfekt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Zufallsbibliothek Leucine oder Isoleucine aufweisen, die an jedem 7. Rest fixiert sind, um ihn zu einem Leucin- oder Isoleucin-Zipper-Motiv zu beeinflussen.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die optionalen C- oder N-Kappen-Reste im Fall einer helixbeeinflussten Bibliothek fixiert und nicht zufällig angeordnet sein, wobei sie wiederum starke Helixbildner wären. Für eine stärkere Helix-Beeinflussung könnte es zumindest 2-3 Runden an Verkappen der Reste oder bis zu 11-12 Aminosäuren geben. Dabei könnte es sich auch um (pro)_n handeln, um eine Poly-Prolin-Helix am C- oder N-Terminus bereitzustellen. Bildet der C- oder der N-Terminus eine stabile Sekundärstruktur, wie z.B. eine α-Helix oder eine Poly-Prolin-Helix, so ist sie gegen die Proteolyse resistent, was ein Vorteil für die Stabilität der Bibliothek innerhalb der Zelle wäre. Explizite N- und C-Kappen-Helix-Stabilisierungssequenzen oder -Reste können sowohl an den N-Termini oder an den C-Termini inkludiert werden [Betz und DeGrado, Biochem. 35, 6955-62 (1996); Doig et al., Prot. Sci. 6, 147-155 (1997); Doig und Baldwin, Prot. Sci. 4, 1325-36 (1995); Richardson und Richardson, Science 240, 1648-52 (1988)].
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bibliothek mit einer stärker verlängerten strukturellen Neigung konstruiert, worin schwächere Helixbildner an jedes Ende der Zufallsregion fusioniert würden oder worin ein oder mehrere Glycine in die Spacer-Region und die C- oder N-Kappen-Region inkludiert würden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Bibliothek mit einer stärker verlängerten strukturellen Neigung konstruiert, und zwar durch Auslassen der Helix-N- oder -C-Kappen-Reste. In dieser Ausführungsform würden die Zufalls-Reste aus allen 20 natürlichen L-Aminosäuren ausgewählt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Beeinflussung der zwei angrenzenden Zufallspeptidbibliotheken zu einer Doppelwendel weiter verstärkt, indem Positionen in der Sequenz so fixiert werden, dass eine Anzahl an Zufallsresten auf der Oberfläche der zwei Helices insertiert wird, während sich die fixierten Reste in der Sequenz an der Schnittstelle zwischen den zwei Helices in einer parellelen Doppelwendel befinden können. Für dieses Fusionsprotein können die zwei Helices, welche die Zufallspeptidbibliothek darstellen, der Länge nach in Registeranordnung angeordnet werden, und zwar durch die Insertion von einem oder mehreren helixbildenden Resten, je nach Eignung. 3 zeigt eine Helixrad-Repräsentation einer parallelen Doppelwendel (siehe Gradis et al., s.o.). Die Positionen a, a', d und d' wären dabei fixiert, da sie sich im Zentrum der Doppelwendel-Struktur befinden. Falls dies die einzigen fixierten Reste wären und n = 5 (siehe unten) wäre, so würde die Gesamtanzahl an Zufallsresten in der Bibliothek 18 betragen. Die Größe der Bibliothek kann daher durch n gesteuert werden. Reste an den Positionen c, c', f, f', b und b' können randomisiert werden und würden die Fläche der Helix darstellen, die für die Bindung an Ziele verfügbar ist. Daher wäre in jeder Doppelwendel-Bibliothek die Sequenz schematisch als folgende darstellbar: „BLA-Spacerreste-a-b-c-d-e-f-g-(a-b-c-d-e-f-g-)n-C-Kappenreste und/oder N-Kappen-Reste-a'-b'-c'-d'-e'-f'-g'-(a'-b'-c'-d'-e'f-g'-)n-Spacerreste-BLA.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind in diesem Schema die fixierten Reste a, a', d und d' Kombinationen von starken hydrohoben helixbildenden Resten, wie z.B. ala, val, leu, g und g' sind lys, und e und e' sind glu (oder alternativ dazu lys, wenn e und e' glu sind). Die Positionen e, e', g und g' können fixiert werden, um die Doppelwendel mit Salzbrücken weiter zu stabilisieren. Die Positionen b, b', c, c', f und f' können Zufallsreste sein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Bibliothek mit weniger Helixbeeinflussung und mehr Zufallsresten auf der Oberfläche der Helix erzeugt. In dieser Ausführungsform können die Positionen g und g' und e und e' auch Zufallsreste sein. In den oben stehend schematisch dargestellten Bibliotheken wäre n = 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine alternative Gruppe an fixierten Resten verwendet, um eine Neigung zu einer parallelen Doppelwendel zu erzeugen. Nach der Anordnung der zwei Helices (d.h. die Enden wurden in eine Registeranordnung gegeben) in der β-Lactamase-Struktur umfassen die fixierten Positionen ala in a und a', leu in d und d', glu in e und e', lys in g und g' sowie Zufallsreste an den verbleibenden Positionen. In dieser Ausführungsform können auch g und g' randomisiert sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden beeinflusste SH-3-domänenbindende Oligonucleotide/Peptide hergestellt. Von SH-3-Domänen wurde gezeigt, dass sie kurze Ziel-Motive erkennen (SH-3-domänenbindende Peptide), etwa zehn bis zwölf Reste in einer linearen Sequenz, die als kurze Peptide mit hoher Affinität für die Ziel-SH-3-Domäne kodiert werden können. Konsensus-Sequenzen für SH-3-domänenbindende Proteine wurden vorgeschlagen. Daher werden in einer bevorzugten Ausführungsform Oligos/Peptide mit den folgenden Neigungen hergestellt:

1. XXXPPXPXX, worin X ein randomisierter Rest ist.
2. (innerhalb der Positionen der Restpositionen 11 bis –2):

In dieser Ausführungsform wird von der N-Terminus-Flankenregion vorgeschlagen, dass sie die größten Wirkungen auf die Bindungsaffinität besitzt, und wird daher vollständig randomisiert. „Hyd" deutet auf eine Neigung hin zu einem hydrophoben Rest hin, d.h. Val, Ala, Gly, Leu, Pro, Arg. Um für einen hydrophob beeinflussten Rest zu kodieren, wird eine „sbk"-codonbeeinflusste Struktur verwendet. Eine Untersuchung der Codons innerhalb des genetischen Codes stellt sicher, dass dieser im Allgemei nen für die hydrophoben Reste kodiert, s = g, c; b = t, g, c; v = a, g, c; m = a, c; k = t, g; n = a, t, g, c.
Im Allgemeinen besitzen die Zufallspeptide einen Bereich von etwa 4 bis etwa 50 Resten in der Länge, wobei von etwa 5 bis etwa 30 bevorzugt wird und von etwa 10 bis etwa 20 insbesondere bevorzugt wird.
Das/die Zufallspeptid(e) kann/können in einer Reihe an Positionen an ein Gerüst fusioniert werden, wie hierin ausführlicher beschrieben, um Fusionspolypeptide zu bilden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung zusätzlich zum Gerüstprotein und dem Peptid zusätzliche Komponenten, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Fusionspartner, etwa Linker.
Mit „Fusionspartner" ist hierin eine Sequenz gemeint, die mit dem Zufallspeptid assoziiert ist, das allen Mitgliedern der Bibliothek in dieser Klasse eine gemeinsame Funktion oder Fähigkeit verleiht. Fusionspartner können heterolog sein (d.h. nicht nativ in Bezug auf die Wirtszelle) oder synthetisch (nicht nativ in Bezug auf eine beliebige Zelle). Geeignete Fusionspartner umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf: a) Präsentationsstrukturen, wie sie unten stehend definiert sind, welche die Peptide in einer bezüglich der Konformation eingeschränkten Form oder in einer stabilen Form bereitstellen; b) Targetingsequenzen, definiert wie unten, welche die Lokalisierung des Peptids in ein subzelluläres oder extrazelluläres Kompartiment ermöglichen; c) Rettungssequenzen, wie unten stehend definiert, welche die Reinigung oder Isolation entweder der Peptide oder der Nucleinsäuren, die für sie kodieren, ermöglichen; d) Stabilitätssequenzen, welche dem Peptid oder der Nucleinsäure, die für es kodiert, Stabilität oder Schutz vor Abbau verleihen, z.B. Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau; e) Linkersequenzen, welche die Zufallspeptidelemente vom Gerüst selbst konformationell abkoppeln, wobei sie das Peptid an einer Störung der Gerüstfaltung abhalten; oder f) eine beliebige Kombination von a), b), c), d) und e) sowie Linker-Sequenzen je nach Bedarf.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Fusionspartner eine Präsentationsstruktur. Mit „Präsentationsstruktur" oder grammatikalischen Äquivalenten ist hierin eine Sequenz gemeint, die, wenn sie an Peptide fusioniert ist, die Peptide dazu bringt, eine konformationell eingeschränkte Form anzunehmen. Proteine Wechselwirken miteinander, und zwar großteils durch konformationell eingeschränkte Domänen. Obwohl kleine Peptide mit frei rotierenden Amino- und Carboxyl-Termini starke Funktionen aufweisen können, wie nach dem Stand der Technik bekannt ist, ist die Umwandlung solcher Peptidstrukturen in pharmakologische Agenzien schwierig, und zwar aufgrund der Unfähigkeit, Seitenkettenpositionen für die peptidomimetische Synthese vorherzusagen. Daher bringt die Präsentation von Peptiden in den konformationell eingeschränkten Domänen für die spätere Erzeugung von Pharmakophor-Modellen und Pharmazeutika Vorteile und führt wahrscheinlich auch zu höheren Affinitätswechselwirkungen des Peptids mit dem Zielprotein. Diese Tatsache wurde in den kombinatorischen Bibliothekserzeugungssystemen unter Verwendung von biologisch erzeugten kurzen Peptiden in bakteriellen Phagensystemen erkannt. Eine Reihe von Arbeitern haben kleine Domänenmoleküle konstruiert, in denen randomisierte Peptidstrukturen präsentiert werden könnten.
Daher sind synthetische Präsentationsstrukturen, d.h. künstliche Polypeptide, in der Lage, ein randomisiertes Peptid als konformationell eingeschränkte Domäne zu präsentieren. Im Allgemeinen umfassen solche Präsentationsstrukturen einen ersten Abschnitt, der an das N-terminale Ende des randomisierten Peptids gebunden ist, sowie einen zweiten Abschnitt, der an das C-terminale Ende des Peptids gebunden ist; d.h. das Peptid wird in die Präsentationsstruktur insertiert, obwohl Variationen, wie zuvor beschrieben, gemacht werden können, in denen Elemente der Präsentationsstruktur in die Zufallspeptidsequenz inkludiert werden können. Um die funktionelle Isolation des randomisierten Expressionsprodukts zu erhöhen, werden die Präsentationsstrukturen ausgewählt oder so geschaffen, dass sie minimale biologische Aktivität aufweisen, wenn sie in der Zielzelle exprimiert werden.
Bevorzugte Präsentationsstrukturen maximieren die Zugänglichkeit zum Peptid, indem sie es auf einer äußeren Oberfläche, wie z.B. einer Schleife, präsentieren, und führen auch zu weiteren konformationellen Einschränkungen bei einem Peptid. Dementsprechend umfassen geeignete Präsentationsstrukturen, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt, Dimerisationssequenzen, Minikörperstrukturen, Schleifen auf β-Schleifen und Doppelwendel-Stammstrukturen, in denen Reste, die für die Struktur nicht entscheidend sind, randomisiert sind, sowie Zink-Finger-Domänen, cysteingebundene (Disulfid-)Strukturen, transglutaminasegebundene Strukturen, zyklische Peptide, β-Schleifen-Strukturen, Helix-Tonnen oder -Bündel, Leucin-Zipper-Motive etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Präsentationsstruktur um eine Doppelwendel-Struktur, welche die Präsentation des randomisierten Peptids auf einer äußeren Schleife ermöglicht. Siehe z.B. Myszka et al., Biochem. 33, 2362-2373 (1994), hierin durch Verweis aufgenommen. Unter Verwendung dieses Systems haben die Forscher Peptide isoliert, die zu einer hohen Affinitäts-Wechselwirkung mit dem geeigneten Ziel in der Lage sind. Im Allgemeinen ermöglichen Doppelwendel-Strukturen zwischen 6 und 20 randomisierte Positionen.
Eine bevorzugte Doppelwendel-Präsentationsstruktur ist folgende:
Die unterstrichenen Regionen stellen eine zuvor bereits definierte Doppelwendel-Leucin-Zipper-Region dar (siehe Martin et al., EMBO J. 13 (22), 5303-5309 (1994), hierin durch Verweis aufgenommen). Die fettgedruckte GRGDMP-Region stellt die Schleifenstruktur dar und kann, wenn sie auf geeignete Art und Weise mit randomisierten Peptiden ersetzt wurde (d.h. Peptide, die im Allgemeinen hierin als (X)_n dargestellt sind, worin X ein Aminosäurerest ist und n eine ganz Zahl von zumindest 5 oder 6 ist), eine variable Länge aufweisen. Die Ersetzung der fettgedruckten Region wird durch kodierende Restriktions-Endonucleasestellen in den unterstrichenen Regionen erleichtert, wodurch die direkte Inkorporation von randomisierten Oligonucleotiden an diesen Positionen ermöglicht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform kann z.B. eine Xhol-Stelle an der doppelt unterstrichenen LE-Stelle und eine HindIII-Stelle an der doppelt unterstrichenen KL-Stelle erzeugen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Präsentationsstruktur eine Minikörperstruktur. Ein „Minikörper" besteht im Wesentlichen aus einer minimalen Antikörper-Komplementaritätsregion. Die Minikörper-Präsentationsstruktur stellt im Allgemeinen zwei randomisierende Regionen bereit, die im gefalteten Protein entlang einer einzigen Fläche der Tertiärstruktur präsentiert werden. Siehe z.B. Bianchi et al., J. Mol. Biol. 236 (2), 649-59 (1994), sowie die dort angeführten Referenzen, von denen alle hierin durch Verweis aufgenommen sind). Die Forscher haben gezeigt, dass diese minimale Domäne in Lösung stabil ist, und haben Phagenselektionssysteme in kombinatorischen Bibliotheken verwendet, um Minikörper mit Peptidregionen auszuwählen, die eine hohe Affinität, Kd = 10^–7, für das Pro-Entzündungs-Zytokin IL-6 aufweisen.
Eine bevorzugte Minikörper-Präsentationsstruktur ist folgende:
Die fettgedruckten unterstrichenen Regionen sind jene Regionen, die randomisiert werden können. Das kursivgedruckte Phenylalanin muss in der ersten randomisierenden Region unverändert bleiben. Das gesamte Peptid wird in einer Drei-Oligonucleotid-Variation der Doppelwendel-Ausführungsform kloniert, wodurch die gleichzeitige Inkorporation von zwei randomisierenden Regionen ermöglicht wird. Diese Ausführungsform verwendet nichtpalindrome BstXI-Stellen an den Termini.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Präsentationsstruktur eine Sequenz, die im Allgemeinen zwei Cystein-Reste enthält, so dass eine Disulfidbindung gebildet werden kann, was zu einer konformationell eingeschränkten Sequenz führt. Diese Ausführungsform wird besonders ex vivo bevorzugt, z.B. wenn sekretorische Targetingsequenzen verwendet werden. Wie der Fachmann zu schätzen weiß, kann eine beliebige Anzahl an Zufallssequenzen, mit oder ohne Spacer- oder Linker-Sequenzen, mit Cystein-Resten flankiert werden. In anderen Ausführungsformen können wirksame Präsentationsstrukturen durch die Zufallsregionen selbst erzeugt werden. Die Zufallsregionen können z.B. mit Cystein-Resten „dotiert" sein, die, unter den geeigenten Redox-Bindungen, zu hochgradig vernetzten und strukturierten Konformationen führen können, die einer Präsentationsstruktur ähneln. Auf ähnliche Art und Weise können die Randomisierungsregionen dahingehend kontrolliert werden, dass sie eine gewisse Anzahl an Resten enthalten, um β-Faltblatt- oder α-Helix-Strukturen zu enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform verleiht die Präsentationssequenz die Fähigkeit, Metallionen zu binden, um die Sekundärstruktur zu verleihen. Daher werden z.B. C2H2-Zink-Finger-Sequenzen verwendet; C2H2-Sequenzen besitzen zwei Cysteine und zwei Histidine, die so platziert sind, dass ein Zinkion chelatisiert wird. Von Zink-Finger-Domänen ist bekannt, dass sie unabhängig in mehrfachen Zink-Finger-Peptiden auftreten, um strukturell unabhängige, flexibel gebundene Domänen bilden. Siehe J. Mol. Biol. 228, 619 (1992). Eine allgemeine Konsensussequenz ist (5 Aminosäuren)-C-(2 bis 3 Aminosäuren)-C-(4 bis 12 Aminosäuren)-H-(3 Aminosäuren)-H-(5 Aminosäuren). Ein bevorzugtes Beispiel wäre -FQCEEC-Zufallspeptid mit 3 bis 20 Aminosäuren-HIRSHTG-.
Auf ähnliche Art und Weise können CCHC-Boxen verwendet werden (siehe Biochem. Biophys. Res. Commun. 242, 385 (1998)), die eine Konsensussequenz-C-(2 Aminosäuren)-C-(4 bis 20 Zufallspeptide)-H-(4 Aminosäuren)-C- aufweisen (siehe Bavoso et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 242 (2), 385 (1998), hierin durch Verweis aufgenommen). Bevorzugte Beispiele umfassen (1) -VKCFNC-4 bis 20 Zufallsaminosäuren-HTARNCR-, basierend auf dem Nucleocapsid-Protein P2; (2) eine Sequenz, die aus jener des natürlich vorkommenden Zinkbindungspeptids aus der Lasp-1-LIM-Domäne modifiziert wurde (Hammarstrom et al., Biochem. 35, 12723 (1996)); und (3) -MNPNCARCG-4 bis 20 Zufallsaminosäuren-HKACF-, basierend auf dem nmr-Strukturensemble 1ZFP (Hammarstrom et al., Biochem. 35 U.S.C. 35 (39), 12723 (1996)).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Präsentationsstruktur eine Dimerisationssequenz, unter anderem selbstbindende Peptide. Eine Dimerisationssequenz ermöglicht die nichtkovalente Assoziation von zwei Peptidsequenzen, die dieselben oder unterschiedlich sein können, und zwar mit ausreichender Affinität, um unter normalen physiologischen Bedingungen assoziiert zu bleiben. Diese Sequenzen können auf mehrere Arten verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Terminus des Zufallspeptids an eine erste Dimerisationssequenz und der andere Terminus an eine zweite Dimerisationssequenz gebunden, die dieselbe wie die erste Sequenz sein kann oder sich von dieser unterscheiden kann. Dies ermöglicht die Bildung einer Schleife bei der Assoziation der Dimerisierungssequenzen. Alternativ dazu ermöglicht die Verwendung dieser Sequenzen wirksam das Anwachsen kleiner Bibliotheken an Zufallspeptiden (z.B. 10⁴) auf große Bibliotheken, wenn zwei Peptide pro Zelle erzeugt werden, die anschließend dimerisieren, um eine wirksame Bibliothek von 10⁸ (10⁴ × 10⁴) zu bilden. Es ermöglicht auch die Bildung von längeren Zufallspeptiden, falls notwendig, oder von strukturell komplexeren Zufallspeptidmolekülen. Die Dimere können Homo- oder Heterodimere sein.
Dimerisationssequenzen können eine einzelne Sequenz sein, die selbstaggregiert, oder zwei verschiedene Sequenzen, die assoziieren. D.h. Nucleinsäuren, die sowohl für ein erstes Zufallspeptid mit Dimerisationssequenz 1 kodieren als auch für ein zweites Zufallspeptid mit Dimerisationssequenz 2, so dass nach der Einführung in eine Zelle und Expression der Nucleinsäure die Dimerisationssequenz 1 mit der Dimerisationssequenz 2 assoziiert, um eine neue Zufallspeptidstruktur zu bilden. Die Verwendung von Dimerisationssequenzen ermöglicht die „Zirkularisierung" der Zufallspeptide; d.h. wenn eine Dimerisationssequenz an jedem Terminus des Peptids verwendet wird, kann die daraus resultierende Struktur eine Struktur vom Typ einer „Stamm-Schleife" bilden. Weiters bildet die Verwendung von dimerisierenden Sequenzen, die sowohl an den N- als auch an den C-Terminus des Gerüsts fusioniert sind, wie z.B. GFP, eine nicht kovalent zyklisierte Gerüst-Zufallspeptidbibliothek.
Geeignete Dimerisierungssequenzen umfassen eine große Bandbreite an Sequenzen. Eine beliebige Anzahl an Protein-Protein-Wechselwirkungsstellen sind bekannt. Zusätzlich dazu können Dimerisierungssequenzen auch unter Verwendung von Standardverfahren, wie z.B. des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems, traditioneller biochemischer Affinitätsbindungsstudien oder sogar unter Verwendung der vorliegenden Ver fahren, erklärt werden. Besonders bevorzugte Dimerisationspeptidsequenzen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, -EFLIVKS-, -EEFLIVKKS-, -FESIKLV- und -VSIKFEL-.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Fusionspartner eine Targetingsequenz. Wie ein Fachmann zu schätzen weiß, ist die Lokalisierung von Proteinen in einer Zelle ein einfaches Verfahren zur Erhöhung der wirksamen Konzentration und Bestimmung der Funktion. RAF1 kann z.B. bei Lokalisierung an die Mitochondrionmembran die anti-apoptotische Wirkung von BCL-2 inhibieren. Auf ähnliche Art und Weise induziert membrangebundenes Sos Ras-vermittelte Signale in T-Lymphozyten. Von diesen Mechanismen wird angenommen, dass sie auf dem Prinzip der Einschränkung des Suchraums für Liganden basieren, d.h. die Lokalisierung eines Proteins auf die Plasmamembran schränkt die Suche nach seinem Liganden auf diesen eingeschränkten Dimensionsraum in der Nähe der Membran im Gegensatz zum dreidimensionalen Raum des Zytoplasmas ein. Alternativ dazu kann die Konzentration eines Proteins auch einfach durch die Art der Lokalisierung erhöht werden. Das Befördern der Proteine in den Nucleus schränkt sie auf einen kleineren Raum ein, wobei die Konzentration erhöht wird. Schlussendlich kann der Ligand oder das Ziel einfach an ein spezifisches Kompartiment lokalisiert werden, und die Inhibitoren müssen dementsprechend lokalisiert werden.
Daher umfassen geeignete Targetingsequenzen, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt, Bindungssequenzen, die in der Lage sind, eine Bindung des Expressionsprodukts an ein vorherbestimmtes Molekül oder eine Klasse von Molekülen hervorzurufen, während die Bioaktivität des Expressionsprodukts beibehalten wird (z.B. unter Verwendung von Enzyminhibitor- oder -Substratsequenzen, um auf eine Klasse relevanter Enzyme abzuzielen); Sequenzen, die einen selektiven Abbau signalisieren, von sich selbst oder von co-gebundenen Proteinen; sowie Signalsequenzen, die in der Lage sind, die Peptide konstitutiv an einen vorherbestimmten zellulären Ort zu lokalisieren, unter anderem a) subzelluläre Positionen, wie z.B. Golgi, das endoplasmatische Retikulum, Nucleus, Nucleoli, Nuclearmembran, Mitochondrien, Chloroplasten, Sekretionsvesikel, Lysosome und zelluläre Membran; sowie b) extrazellu läre Positionen über ein Sekretionssignal. Besonders bevorzugt ist die Lokalisierung an entweder subzelluläre Positionen oder an das Äußere der Zelle durch Sekretion.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Targetingsequenz ein Nuclearlokalisierungssignal (NLS). NLSs sind im Allgemeinen kurze, positiv geladene (basische) Domänen, die dazu dienen, das gesamte Protein, in dem sie auftreten, zum Nucleus der Zelle zu steuern. Zahlreiche NLS-Aminosäuresequenzen wurden beschrieben, unter anderem einbasige NLSs, wie z.B. jene des SV40-(Affenvirus-)large-T-Antigens (Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val), Kalderon et al., Cell 39, 499-509 (1984); das menschliche Retinsäure-Rezeptor-β-Nuclearlokalisierungssignal (ARRRRP); NF_κB p50 (EEVQRKRQKL; Ghosh et al., Cell 62, 1019 (1990); NF_κB p65 (EEKRKRTYE; Nolan et al., Cell 64, 961 (1991); sowie andere (siehe z.B. Boulikas, J. Cell. Biochem. 55 (1), 32-58 (1994)), und zweibasige NLSs, veranschaulicht durch jenes des Xenopus-(Afrikanischer-Krallenfrosch-)Proteins, Nucleoplasmin (Ala Val Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Leu Asp), Dingwall et al., Cell 30, 449-458 (1982), und Dingwall et al., J. Cell Biol. 107, 641-849 (1988). Zahlreiche Lokalisierungsstudien haben gezeigt, dass NLSs, die in synthetische Peptide inkorporiert wurden oder auf Reporterproteine gepfropft wurden, die normalerweise nicht auf den Zellnucleus abzielen, eine Konzentration dieser Peptide und Reporterproteine im Nucleus hervorrufen. Siehe z.B. Dingwall und Laskey, Ann. Rev. Cell Biol. 2, 367-390 (1986); Bonnerot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6795-6799 (1987); Galileo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 458-462 (1990).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Targetingsequenz eine membranverankernde Signalsequenz. Dies ist besonders von Nutzen, da zahlreiche Parasiten und Pathogene an diese Membran binden, zusätzlich zu der Tatsache, dass zahlreiche intrazelluläre Vorkommnisse an der Plasmamembran entstehen. Daher sind membrangebundene Peptidbibliotheken sowohl für die Identifikation von wichtigen Elementen in diesen Prozessen von Nutzen als auch für die Entdeckung wirksamer Inhibitoren. Die Erfindung stellt Verfahren zur Präsentation des randomisierten Expressionsprodukts bereit, und zwar extrazellulär oder im zytoplasmatischen Raum. Für die extrazelluläre Präsentation wird eine membranverankernde Region am Car boxyl-Terminus der Peptid-Präsentationsstruktur bereitgestellt. Die randomisierte Expressionsproduktregion wird auf der Zelloberfläche exprimiert und dem extrazellulären Raum so präsentiert, dass sie an andere Oberflächenmoleküle binden kann (und ihre Funktion beeinflussen kann) oder an Moleküle, die im extrazellulären Medium vorhanden sind. Die Bindung solcher Moleküle konnte den Zellen, die ein Peptid exprimieren, welches das Molekül bindet, eine Funktion verleihen. Die zytoplasmatische Region konnte neutral sein oder eine Domäne enthalten, die, wenn die extrazelluläre randomisierte Expressionsproduktregion gebunden ist, den Zellen eine Funktion verleiht (Aktivierung einer Kinase, Phosphatase, Bindung anderer zellulärer Komponenten, um die Funktion auszuführen). Auf ähnliche Art und Weise konnte die randomisierte expressionsprodukthältige Region in einer zytoplasmatischen Region enthalten sein, und die Transmembranregion und die extrazelluläre Region bleiben konstant oder besitzen eine definierte Funktion.
Membranverankernde Sequenzen sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und basieren auf der genetischen Geometrie von Säugetier-Transmembranmolekülen. Peptide werden in die Membran basierend auf einer Signalsequenz (hierin als ssTM bezeichnet) insertiert und erfordern eine hydrophobe Transmembrandomäne (hierin TM). Die Transmembranproteine werden in die Membran insertiert, so dass die Regionen, die 5' der Transmembrandomäne kodieren, extrazellulär sind und die Sequenzen 3' intrazellulär werden. Natürlich dienen diese Transmembrandomänen, wenn sie 5' von der variablen Region platziert werden, dazu, diese als intrazelluläre Domäne zu verankern, etwas, das in einigen Ausführungsformen erwünscht sein kann. ssTMs und TMs sind für eine Vielzahl an membrangebundenen Proteinen bekannt, und diese Sequenzen können dementsprechend verwendet werden, entweder als Paare eines bestimmten Proteins oder so, dass jede Komponente von einem anderen Protein stammt, oder, alternativ dazu, können die Sequenzen synthetisch sein und vollständig von Konsensus als künstliche Anlieferungsdomäne abstammen.
Wie der Fachmann zu schätzen weiß, sind membranverankernde Sequenzen, unter anderem sowohl ssTM als auch TM, für eine Vielzahl an Proteinen bekannt, und jedes davon kann verwendet werden. Besonders bevorzugte membranverankernde Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, jene, die von CD8, ICAM-2, IL-8R, CD4 und LFA-1 abstammen.
Nützliche Sequenzen umfassen Sequenzen aus: 1) Klasse-I-Integral-Membranproteine, wie z.B. IL-2-Rezeptor-β-Kette (Reste 1-26 sind die Signalsequenz, 241-265 sind die Transmembranreste; siehe Hatakeyama et al., Science 244, 551 (1989), und von Heijne et al., Eur. J. Biochem. 174, 671 (1988)) und Insulin-Rezeptor-β-Kette (Reste 1-27 sind das Signal, 957-959 sind die Transmembrandomäne und 960-1382 sind die zytoplasmatische Domäne; siehe Hatakeyama, s.o., und Ebina et al., Cell 40, 747 (1985)); 2) Klasse-II-Integral-Membranproteine, wie z.B. neutrale Endopeptidase (Reste 29-51 sind die Transmembrandomäne, 2-28 sind die zytoplasmatische Domäne; siehe Malfroy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 144, 59 (1987)); 3) Typ-III-Proteine, wie z.B. menschliches Cytochrom-P450 NF25 (Hatakeyama, s.o.); sowie 4) Typ-IV-Proteine, wie z.B. menschliches P-Glycoprotein (Hatakeyama, s.o.). Besonders bevorzugt sind CD8 und ICAM-2. Die Signalsequenzen von CD8 und ICAM-2 liegen z.B. am äußersten 5'-Ende des Transkripts. Diese bestehen aus den Aminosäuren 1-32 im Fall von CD8 (MASPLTRFLSLNLLLLGESILGSGEAKPQAP; Nakauchi et al., PNAS USA 82, 5126 (1985)) und 1-21 im Fall von ICAM-2 (MSSFGYRTLTVALFTLICCPG; Staunton et al., Nature (London) 339, 61 (1989)). Diese Leitsequenzen liefern das Konstrukt an die Membran, während die hydrophoben Transmembrandomänen, die sich 3' von der Zufallspeptidregion befinden, als Anker für das Konstrukt in der Membran dienen. Diese Transmembrandomänen werden von Aminosäuren 145-195 von CD8 umfasst (PQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICYHSR; Nakauchi, s.o.) und 224-256 von ICAM-2 (MVIIVTVVSVLLSLFVTSVLLCFIFGQHLRQQR; Staunton, s.o.).
Alternativ dazu umfassen membranverankernde Sequenzen den GPI-Anker, der durch eine Glycosyl-Phosphatidylinosit-Bindung zu einer kovalenten Bindung zwischen dem Molekül und der Lipiddoppelschicht führt, z.B. in DAF (PNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT, und zwar mit dem fettge druckten Serin an der Stelle des Ankers; siehe Homans et al., Nature 333 (6170), 269-72 (1988), und Moran et al., J. Biol. Chem. 266, 1250 (1991)). Um dies zu tun, kann die GPI-Sequenz von Thy-1 3' von der variablen Region anstelle einer Transmembransequenz kassettiert werden.
Auf ähnliche Art und Weise können Myristylierungssequenzen als Membranankersequenzen dienen. Es ist bekannt, dass die Myristylierung von c-src dieses an die Plasmamembran rekrutiert. Dies ist ein einfaches und wirksames Verfahren zur Membranlokalisierung, da die ersten 14 Aminosäuren des Proteins nur für diese Funktion verantwortlich sind: MGSSKSKPKDPSQR (siehe Cross et al., Mol. Cell Biol. 4 (9), 1834 (1984); Spencer et al., Science 262, 1019-1024 (1993)). Von diesem Motiv wurde bereits gezeigt, dass es in der Lokalisierung von Reportergenen wirksam ist, und es kann verwendet werden, um die Zeta-Kette der TCR zu verankern. Dieses Motiv ist 5' von der variablen Region platziert, um das Konstrukt in der Plasmamembran zu lokalisieren. Andere Modifikationen, wie z.B. die Palmitoylierung, können verwendet werden, um Konstrukte in der Plasmamembran zu verankern; z.B. Palmitoylierungssequenzen aus der G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinase-GRK6-Sequenz (LLQRLFSRQDCCGNCSDSEEELPTRL, wobei die fettgedruckten Cysteine palmitoyliert sind; Stoffel et al., J. Biol. Chem. 269, 27791 (1994)); aus Rhodopsin (KQFRNCMLTSLCCGKNPLGD; Barnstable et al., J. Mol. Neurosci. 5 (3), 207 (1994)); sowie dem p21-H-ras-1-Protein (LNPPDESGPGCMSCKCVLS; Capon et al., Nature 302, 33 (1983)).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Targetingsequenz eine lysosomale Targetingsequenz, umfassend unter anderem eine lysosomale Abbausequenz, wie z.B. Lamp-2 (KFERQ, Dice, Ann. N.Y. Acad. Sci. 674, 58 (1992)); oder lysosomale Membransequenzen von Lamp-1 (MLIPIAGFFALAGLVLIVLIAYLIGRKRSHAGYQTI, Uthayakumar et al., Cell. Mol. Biol. Res. 41, 405 (1995)) oder Lamp-2 (LVPIAVGAALAGVLILVLLAYFIGLKHHHAGYEQF; Konecki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 205, 1-5 (1994)), von denen beiden die Transmembrandomäne in Kursivschrift und das zytoplasmatische Targetingsignal unterstrichen darstellen.
Alternativ dazu kann die Targetingsequenz eine Mitochondrion-Lokalisierungssequenz sein, umfassend Mitochondrien-Matrixsequenzen (z.B. Hefe-Alkohol-Dehydrogenase III; MLRTSSLFTRRVQPSLFSRNILRLQST; Schatz, Eur. J. Biochem. 165, 1-6 (1987)); innere Mitochondrienmembransequenzen (Hefe-Zytochrom-c-Oxidase-Untereinheit IV; MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLL; Schatz, s.o.); Mitochondrien-Intermembran-Raumsequenzen (Hefe-Zytochrom-c1;
MFSMLSKRWAQRTLSKSFYSTATGAASKSGKLTQKLVTAGVAAAGITASTLLYADSL TAEAMTA; Schatz, s.o.) oder äußere Mitochondrienmembransequenzen (äußeres 70-kD-Hefe-Membranprotein;
MKSFITRNKTAILATVAATGTAIGAYYYYNQLQQQQQRGKK; Schatz, s.o.).
Die Zielsequenzen können auch endoplasmatische-Retikulum-Sequenzen sein, unter anderem die Sequenzen aus Calreticulin (KDEL; Pelham, Royal Society London Transactions B, 1-10 (1992)) oder Adenovirus-E3/19K-Protein (LYLSRRSFIDEKKMP; Jackson et al., EMBO J. 9, 3153 (1990)).
Weiters umfassen Targetingsequenzen auch Peroxisom-Sequenzen (z.B. die Peroxisom-Matrixsequenz aus Luciferase; SKL; Keller et al., PNAS USA 4, 3264 (1987)); Farnesylierungssequenzen (z.B. P21-H-ras-1; LNPPDESGPGCMSCKCVLS, wobei das fettgedruckte Cystein farnesyliert ist; Capon, s.o.); Geranylgeranylierungssequenzen (z.B. Protein-rab-5A; LTEPTQPTRNQCCSN; wobei die fettgedruckten Cysteine geranylgeranyliert sind; Farnsworth, PNAS USA 91, 11963 (1994)); oder Zerstörungssequenzen (Cyclin B1; RTALGDIGN; Klotzbucher et al., EMBO J. 1, 3053 (1996)).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Targetingsequenz eine sekretorische Signalsequenz, die in der Lage ist, die Sekretion des Peptids durchzuführen. Es gibt eine große Anzahl an bekannten sekretorischen Signalsequenzen, die 5' von der Variablen Peptidregion platziert sind und von der Peptidregion gespalten werden, um die Sekretion in den extrazellulären Raum durchzuführen. Sekretorische Signalsequenzen und die Möglichkeit ihres Transfers hin zu nichtverwandten Proteinen sind wohlbekannt, z.B. Silhavy et al., Microbiol. Rev. 49, 398-418 (1985). Dies ist beson ders von Nutzen, um ein Peptid zu erzeugen, das in der Lage ist, an die Oberfläche einer Zielzelle zu binden oder ihre Physiologie zu beeinflussen, wobei die Zielzelle eine andere ist als die Wirtszelle, z.B. die Zelle, die mit einem Retrovirus infiziert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Fusionsprodukt so konfiguriert, dass es in Serie Sekretionssignalpeptid-Präsentationsstruktur-randomisierte Expressionsproduktregion-Präsentationstruktur enthält, siehe 3. Auf diese Art und Weise werden Zielzellen, die in der Nähe von Zellen gezüchtet wurden, die dazu gebracht wurden, die Peptidbibliothek zu exprimieren, in sekretiertem Peptid gebadet. Die Zielzellen, die eine physiologische Veränderung in Reaktion auf die Gegenwart eines Peptids zeigen, z.B. dadurch, dass das Peptid an einen Oberflächenrezeptor bindet oder dass es internalisiert wird und an intrazelluläre Ziele bindet, sowie die sekretierenden Zellen werden durch ein beliebiges einer Reihe an Selektionsschemata lokalisiert, und es wird das Peptid, das die Wirkung hervorruft, bestimmt. Beispielwirkungen umfassen auf verschiedene Art und Weise jene eines Designer-Zytokins (d.h. eines Stammzellenfaktors, der in der Lage ist, hämatopoetische Stammzellen dazu zu bringen, sich zu teilen und ihr Totipotential beizubehalten), eines Faktors, der Krebszellen zu einer spontanen Apoptose bringt, eines Faktors, der an die Zelloberfläche von Zielzellen bindet und diese spezifisch markiert, etc.
Geeignete Sekretionssequenzen sind bekannt, umfassend Signale aus IL-2 (MYRMQLLSCIALSLALVTNS; Villinger et al., J. Immunol. 155, 3946 (1995)), Wachstumshormon (MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPT; Roskam et al., Nucleic Acids Res. 7, 30 (1979)); Präproinsulin (MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN; Bell et al., Nature 284, 26 (1980)); sowie Influenza-HA-Protein (MKAKLLVLLYAFVAGDQI; Sekiwawa et al., PNAS 80, 3563)), wobei die Spaltung am Schnittpunkt des nicht unterstrichenen und des unterstrichenen Abschnitts zu finden ist. Eine besonders bevorzugte sekretorische Signalsequenz ist die Signal-Leitsequenz aus dem sekretierten Zytokin IL-4, das die ersten 24 Aminosäuren von IL-4 wie folgt umfasst: MGLTSQLLPPLFFLLACAGNFVHG.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Fusionspartner eine Rettungssequenz. Eine Rettungssequenz ist eine Sequenz, die verwendet werden kann, um entweder das Peptid oder die Nucleinsäure, die für es kodiert, zu reinigen oder zu isolieren. Daher umfassen z.B. Peptid-Rettungssequenzen Reinigungssequenzen, wie z.B. das His₆-Tag, zur Verwendung mit Ni-Affinitätssäulen und Epitop-Markierungen zur Detektion, Immunopräzipitation oder FACS (fluoreszenzaktivierte Zellsortierung). Geeignete Epitopmarkierungen umfassen myc (zur Verwendung mit dem im Handel erhältlichen 9E10-Antikörper), die BSP-Biotinylierungszielsequenz des bakteriellen Enzyms BirA, flu-Markierungen, lacZ, GST und Strep-Markierung I und II.
Alternativ dazu kann die Rettungssequenz eine einzigartige Oligonucleotidsequenz sein, die als Sonden-Zielstelle dient, um die schnelle und leichte Isolation des retroviralen Konstrukts zu ermöglichen, und zwar über PCR, verwandte Verfahren oder Hybridisierung.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Fusionspartner eine Stabilitätssequenz, die dem Peptid oder der Nucleinsäure, die dafür kodiert, Stabilität verleiht. Daher können z.B. Peptide durch die Inkorporation von Glycinen nach dem Initiationsmethionin (MG oder MGG0) stabilisiert werden, und zwar zum Schutz des Peptids vor der Ubiquitinierung nach der N-Ende-Regel nach Varshavsky, wodurch im Zytoplasma die lange Halbwertszeit verliehen wird. Auf ähnliche Weise vermitteln zwei Proline im C-Terminus Peptide, die im Großen und Ganzen gegen die Carboxypeptidase-Wirkung resistent sind. Die Gegenwart von zwei Glycinen vor den Prolinen verleiht Flexibilität und verhindert strukturinitiierende Vorkommnisse im Di-Prolin, das in die Peptidstruktur propagiert werden soll. Daher sind bevorzugte Stabilitätssequenzen wie folgt: MG(X)_n,GGPP, wobei X eine beliebige Aminosäure ist und n eine ganze Zahl von zumindest vier ist. Daher beziehen sich die Ausdrücke „N-Kappe", „N-Kappen-Reste", „N-Kappen-Sequenz" oder grammatikalische Äquivalente davon auf eine Sequenz, die Stabilität verleiht, besonders proteolytische Stabilität, wenn sie an den N-Terminus eines Peptids oder an den N-Terminus eines Gerüstproteins oder an den N-Terminus einer Präsentationsstruktur fusioniert ist. Auf ähnliche Art und Weise beziehen sich die Ausdrücke „C-Kappe", „C-Kappen-Reste", „C-Kappen-Sequenz" oder grammatikalische Äquivalente davon auf eine Sequenz, die Stabilität, besonders proteolytische Stabilität, verleiht, wenn sie an den N-Terminus eines Pep tids oder an den N-Terminus eines Gerüstproteins oder an den N-Terminus einer Präsentationsstruktur fusioniert ist.
Die Fusionspartner können überall in der Struktur positioniert werden (d.h. N-terminal, C-terminal, intern), je nachdem, wie es die biologischen Vorgaben und die Aktivität erlauben. Zusätzlich dazu ist es, während die Diskussion auf die Fusion von Fusionspartnern an den Peptid-Abschnitt des Fusionspolypeptids gerichtet war, auch möglich, einen oder mehrere dieser Fusionspartner an den Gerüstabschnitt des Fusionspolypeptids zu fusionieren. Daher kann z.B. das Gerüst an einer Position eine Targetingsequenz enthalten (entweder N-terminal, C-terminal oder intern, wie unten stehend beschrieben) sowie eine Rettungssequenz an derselben Stelle oder einer anderen Stelle auf dem Molekül. Daher kann eine beliebige Kombination der Fusionspartner und der Peptide und Gerüstproteine hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Fusionspartner eine Linker- oder eine Haltesequenz. Linkersequenzen zwischen verschiedenen Targetingsequenzen (z.B. Membran-Targetingsequenzen) und anderen Komponenten der Konstrukte (wie z.B. die randomisierten Peptide) können erwünscht sein, um den Peptiden eine ungehinderte Wechselwirkung mit potentiellen Zielen zu ermöglichen. Nützliche Linker umfassen z.B. Glycin-Polymere (G)_n, Glycin-Serin-Polymere (z.B. unter anderem (GS)_n, (GSGGS)_n und (GGGS)_n, worin n eine ganze Zahl von zumindest eins ist), Glycin-Alanin-Polymere, Alanin-Serin-Polymere und andere flexible Linker, wie z.B. die Bindung für den Schüttler-Kaliumkanal, sowie eine große Anzahl anderer flexibler Linker, wie der Fachmann nach dem Stand der Technik zu schätzen weiß. Glycin- und Glycin-Serin-Polymere sind bevorzugt, da beide dieser Aminosäuren relativ unstrukturiert sind und daher als neutrale Bindung zwischen Komponenten dienen können. Glycin-Polymere sind am meisten bevorzugt, da Glycin auf signifikant mehr phi-psi-Raum zugreift als dies sogar bei Alanin der Fall ist und um vieles weniger eingeschränkt ist als Reste mit längeren Seitenketten (siehe Scheraga, Rev. Computational Chem. III; 73-142 (1992)). Zweitens ist Serin hydrophil und daher in der Lage, zu solubilisieren, was eine kugelförmige Glycin-Kette sein könnte. Drittens wurde von ähnlichen Ketten gezeigt, dass sie bei der Bindung von Untereinheiten rekombinanter Proteine, wie z.B. Einzelketten-Antikörper, wirksam sind.
In der vorliegenden Erfindung ist das Peptid durch flexible Linker an das Gerüst gebunden, und zwar an einem oder beiden Enden des Peptids. D.h. es kann bei Bindung an entweder den N- oder den C-Terminus ein Linker verwendet werden. Ist das Peptid an einer internen Position insertiert, wie im Allgemeinen unten stehend beschrieben wird, so verwenden bevorzugte Ausführungsformen zumindest einen Linker und vorzugsweise zwei, wobei sich einer an jedem Terminus des Peptids befindet. Linker werden im Allgemeinen bevorzugt, um eine beliebige Insertionssequenz (d.h. das Peptid) aus der Gerüststruktur selbst konformationell zu entkoppeln, um lokale Verformungen in der Gerüststruktur zu minimieren, die entweder Faltungs-Zwischenprodukte destabilisieren können oder Zugang zum verborgenen GFP-Tripeptid-Fluorophor zu ermöglichen, wodurch die Fluoreszenz des GFP aufgrund des Aussetzens gegenüber exogenen Kollisionsfluoreszenz-Quenchern verringert (oder eliminiert) wird (siehe Phillips, Curr. Opin. Structural Biology 7, 821 (1997)). Die Linker umfassen die Aminosäuresequenz -(gly)_n-, worin n ≥ 2 ist und gegebenenfalls worin n zwei, drei, vier, fünf und sechs ist, obwohl Linker mit 7-10 oder mehr Aminosäuren auch möglich sind. Im Allgemeinen werden in dieser Ausführungsform keine Aminosäuren mit β-Kohlenstoffen in den Linkern verwendet.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst der Linker die Sequenz GQGGG. Alternativ dazu umfasst der Linker die Sequenz GQAGGGG. Wie hierin beschrieben, kann jeder Linker entweder an den N-Terminus oder an den C-Terminus eines Peptids oder eines Gerüstproteins fusioniert sein.
Zusätzlich dazu können die Fusionspartner, unter anderem die Präsentationsstrukturen, modifiziert, randomisiert und/oder gereift werden, um die Präsentationsausrichtung des randomisierten Expressionsprodukts zu verändern. Determinanten am untersten Teil der Schleife können z.B. modifiziert werden, um die interne Schleifenpep tid-Tertiärstruktur leicht zu modifizieren, während die randomisierte Aminosäuresequenz beibehalten wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Kombinationen an Fusionspartnern verwendet. Daher kann z.B. eine beliebige Anzahl an Kombinationen von Präsentationsstrukturen, Targetingsequenzen, Rettungssequenzen und Stabilitätssequenzen verwendet werden, und zwar mit oder ohne Linker-Sequenzen. Wie der Fachmann zu schätzen weiß, kann unter Verwendung eines Basisvektors, der eine Klonierungsstelle für das Aufnahmen von Zufalls- und/oder beeinflussten Bibliotheken enthält, in verschiedenen Fusionspartnern 5' und 3' von der Bibliothek kassettiert werden. Zusätzlich dazu ist es, wie hierin beschrieben, möglich, mehr als eine variable Region in einem Konstrukt aufzuweisen, entweder um zusammen eine neue Oberfläche zu bilden oder um zwei andere Moleküle zusammenzubringen. Auf ähnliche Art und Weise ist es, wie unten stehend ausführlicher beschrieben, möglich, Peptide an zwei oder mehr verschiedenen Schleifen des Gerüsts insertiert zu haben, vorzugsweise, jedoch nicht erforderlicherweise, auf derselben „Fläche" des Gerüsts.
Die Erfindung stellt weiters Fusions-Nucleinsäuren bereit, die für die Fusionspolypeptide der Erfindung kodieren. Wie der Fachmann zu schätzen weiß, kann aufgrund der Degeneration des genetischen Codes eine extrem große Anzahl an Nucleinsäuren hergestellt werden, von denen alle für die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung kodieren. Daher konnte der Fachmann nach der Identifikation einer bestimmten Aminosäuresequenz eine beliebige Anzahl an verschiedenen Nucleinsäuren herstellen, und zwar durch einfaches Modifizieren der Sequenz von einem oder mehreren Codons auf eine Art und Weise, welche die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins nicht verändert.
Unter Verwendung der Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung, die für ein Fusionsprotein kodieren, kann eine Reihe an Expressionsvektoren hergestellt werden. Die Expressionsvektoren können entweder selbstreplizierende extrachromosomale Vektoren sein oder Vektoren, die sich in ein Wirtsgenom integrieren. Im Allgemeinen umfassen diese Expressionsvektoren transkriptionale und translationale Regulati onsnucleinsäuren, die operabel an die Nucleinsäure gebunden sind, die für das Fusionsprotein kodieren. Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, umfassen z.B. einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosomen-Bindungsstelle. Von eukaryotischen Zellen ist bekannt, dass sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
Eine Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader ist z.B. operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die DNA-Sequenzen, die gebunden werden, zusammenhängend sind und, im Fall eines sekretorischen Leaders, zusammenhängend und in der Lese-Phase sind. Die Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Die Bindung wird durch Ligation an den geeigneten Restriktionsstellen erreicht. Falls solche Stellen nicht existieren, werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder -linker in Einklang mit der herkömmlichen Praxis verwendet. Die transkriptionale und translationale Regulationsnucleinsäure ist im Allgemeinen für die Wirtszelle geeignet, die verwendet wird, um das Fusionsprotein zu exprimieren; transkriptionale und translationale Regulationsnucleinsäuresequenzen aus Bacillus werden vorzugsweise verwendet, um das Fusionsprotein in Bacillus zu exprimieren. Zahlreiche Arten an geeigneten Expressionsvektoren und geeigneten Regulationssequenzen sind nach dem Stand der Technik für eine Reihe an Wirtszellen bekannt.
Im Allgemeinen können die transkriptionalen und translationalen Regulationssequenzen Folgendes inkludieren, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt: Promotorsequenzen, ribosomale Bindungsstellen, transkriptionale Start- und Stoppsequenzen, trans lationale Start- und Stoppsequenzen sowie Enhancer- und Aktivatorsequenzen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Regulationssequenzen einen Promotor und transkriptionale Start- und Stoppsequenzen.
Promotorsequenzen kodieren entweder für konstitutive oder induzierbare Promotoren. Die Promotoren können z.B. entweder natürlich vorkommende Promotoren oder Hybridpromotoren sein. Hybridpromotoren, die Elemente von mehr als einem Promotor kombinieren, sind nach dem Stand der Technik ebenfalls bekannt und sind in der vorliegenden Erfindung von Nutzen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Promotoren starke Promotoren, die eine hohe Expression in Zellen ermöglichen, besonders in Säugetierzellen, wie z.B. der CMV-Promotor, insbesondere in Kombination mit einem Tet-Regulationselement.
Zusätzlich dazu kann der Expressionsvektor zusätzliche Elemente umfassen. Der Expressionsvektor kann z.B. zwei Replikationssysteme besitzen, was es ihm ermöglicht, in zwei Organismen erhalten zu werden, z.B. in Säugetier- oder Insektenzellen zur Expression und in einem prokaryotischen Wirt für das Klonieren und die Amplifikation. Weiters enthält der Expressionsvektor für die Integration von Expressionsvektoren zumindest eine Sequenz, die homolog zum Wirtszellengenom ist, und vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren. Der integrierende Vektor kann auf einen spezifischen Locus in der Wirtszelle gerichtet sein, und zwar durch Auswahl der geeigneten homologen Sequenz zur Inklusion in den Vektor. Konstrukte für integrierende Vektoren sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt.
Zusätzlich dazu enthält der Expressionsvektor in einer bevorzugten Ausführungsform ein selektierbares Markergen, um die Selektion von transformierten Wirtszellen zu ermöglichen. Selektionsgene sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und variieren je nach verwendeter Wirtszelle.
Ein bevorzugtes Expressionsvektorsystem ist ein retrovirales Vektorsystem, wie es z.B. im Allgemeinen in WO 97/27212 und WO 97/27213 beschrieben ist.
Die Kandidatennucleinsäuren werden für das Screening in die Zellen eingeführt, wie unten stehend ausführlicher beschrieben wird. Mit „eingeführt in" oder grammatikalischen Äquivalenten ist hierin gemeint, dass die Nucleinsäuren auf eine für die nachfolgende Expression der Nucleinsäure geeignete Art und Weise in die Zellen eindringen. Das Einführungsverfahren hängt dabei großteils vom Zelltyp ab, auf den abgezielt wird, wie unten stehend beschrieben. Beispiele für Verfahren umfassen CaPO₄-Präzipitation, Liposomenfusion, Lipofectin^®, Elektroporation, virale Infektion etc. Die Kandidatennucleinsäuren können sich stabil in das Genom der Wirtszelle integrieren (z.B. durch retrovirale Einführung, unten stehend beschrieben), oder sie können entweder vorübergehend oder stabil im Zytoplasma existieren (d.h. durch die Verwendung von herkömmlichen Plasmiden, unter Verwendung von Standard-Regulationssequenzen, Selektionsmarkern etc.). Da viele pharmazeutisch bedeutende Screeningverfahren menschliche oder Modell-Säugetier-Zellziele erfordern, werden retrovirale Vektoren bevorzugt, die in der Lage sind, solche Ziele zu transfizieren.
Die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung werden durch das Züchten einer Wirtszelle hergestellt, die mit einem Expressionsvektor, enthaltend eine Nucleinsäure, die für ein Fusionsprotein kodiert, transformiert wurde, und zwar unter Bedingungen, die geeignet sind, um die Expression des Fusionsproteins zu induzieren oder hervorzurufen. Die Bedingungen, die für die Fusionsprotein-Expression geeignet sind, variieren mit der Auswahl des Expressionsvektors und der Wirtszelle und sind vom Fachmann durch Routine-Experimente leicht festzustellen. Die Verwendung von konstitutiven Promotoren im Expressionsvektor erfordert z.B. das Optimieren des Wachstums und der Proliferation der Wirtszelle, während die Verwendung eines induzierbaren Promotors die geeigneten Wachstumsbedingungen zur Induktion erfordert. Zusätzlich dazu ist in einigen Ausführungsformen die Zeitplanung der Ernte von Bedeutung. Die Baculovirus-Systeme, die bei der Insektenzellen-Expression verwendet werden, sind z.B. lytische Viren, daher kann die Auswahl des Erntezeitpunkts für die Produktausbeute entscheidend sein.
Geeignete Wirtszellen umfassen Hefe-, Bakterien-, Archebacteria-, Pilz- und Insekten- sowie Tier-Zellen, unter anderem Säugetier-Zellen. Von besonderem Interesse sind Drosophila-melanogaster-Zellen, Saccharomyces cerevisiae und andere Hefearten, E. coli, Bacillus subtilis, SF9-Zellen, C129-Zellen, 293-Zellen, Neurospora, BHK, CHO, COS und HeLa-Zellen, Fibroblasten, Schwanoma-Zelllinien, immortalisierte Säugetier-Knochenmark- und -Lymph-Zelllinien, Jurkat-Zellen, Mastzellen und andere endokrine und exokrine Zellen sowie neuronale Zellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Fusionsproteine in Säugetierzellen exprimiert. Säugetier-Expressionssysteme sind nach dem Stand der Technik ebenfalls bekannt und umfassen retrovirale Systeme. Ein Säugetierpromotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die in der Lage ist, Säugetier-RNA-Polymerase zu binden und die Stromab-(3'-)Transkription einer kodierenden Sequenz für das Fusionsprotein in mRNA zu initiieren. Ein Promotor besitzt eine transkriptionsinitiierende Region, die sich normalerweise proximal vom 5'-Ende der kodierenden Sequenz befindet, sowie eine TATA-Box, wobei 25-30 Basenpaare stromauf der Transkriptionsinitiationsstelle verwendet werden. Von der TATA-Box wird angenommen, dass sie die RNA-Polymerase II steuert, so dass diese die RNA-Synthese an der korrekten Stelle beginnt. Ein Säugetier-Promotor enthält auch ein stromauf gelegenes Promotor-Element (Enhancer-Element), das typischerweise innerhalb von 100 bis 200 Basenpaaren stromauf der TATA-Box gelegen ist. Das stromauf gelegene Promotorelement bestimmt die Geschwindigkeit, mit der die Transkription initiiert wird, und kann in jeder Ausrichtung agieren. Besonders nützlich als Säugetierpromotoren sind die Promotoren von viralen Säugetier-Genen, da die viralen Gene oftmals in hohem Ausmaß exprimiert werden und einen breiten Wirtsbereich haben. Beispiele umfassen den frühen SV40-Promotor, den Maus-Mammatumor-Virus-LTR-Promotor, den späten Adenovirus-Hauptpromotor, den Heeres-simplex-Virus-Promotor und den CMV-Promotor.
Typischerweise sind die Transkriptionsterminations- und die Polyadenylierungssequenzen, die von Säugetierzellen erkannt werden, Regulationsregionen, die sich 3' vom Translations-Stopp-Codon entfernt befinden und daher zusammen mit den Promotorelementen die kodierende Sequenz flankieren. Der 3'-Terminus der reifen mRNA wird durch ortspezifische posttranslationale Spaltung und Polyadenylierung gebildet. Beispiele von Transkriptionsterminator- und Polyadenylierungssignalen umfassen jene, die von SV40 abstammen.
Die Verfahren zur Einführung von exogenen Nucleinsäuren in Säugetierwirte sowie in andere Wirte sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und variieren je nach verwendeter Wirtszelle. Die Verfahren umfassen dextranvermittelte Transfektion, Calcium-Phosphat-Präzipitation, polybrenvermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, virale Infektion, Einkapselung des/der Polynucleotids/Polynucleotide in Liposomen sowie direkte Mikroinjektion der DNA in Nuclei. Wie hierin beschrieben, verwendet ein besonders bevorzugtes Verfahren retrovirale Infektion, wie in PCT US 97/01019 , durch Verweis aufgenommen, angegeben.
Wie der Fachmann zu schätzen weiß, kann die Art an Säugetierzellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, großflächig variieren. Im Grunde können beliebige Säugetierzellen verwendet werden, wobei Maus-, Ratten-, Primaten- und menschliche Zellen insbesondere bevorzugt werden, obwohl, wie der Fachmann zu schätzen weiß, Modifikationen des Systems durch Pseudotypisierung eine Verwendung aller eukaryotischen Zellen, vorzugsweise höherer Eukaryoten, ermöglichen. Wie unten stehend ausführlicher beschrieben wird, kann ein Screening durchgeführt werden, so dass die Zellen einen selektierbaren Phänotypen in Gegenwart eines bioaktiven Peptids aufweisen. Wie unten stehend ausführlicher beschrieben, sind die Zelltypen, die in eine große Bandbreite von Erkrankungszuständen involviert sind, besonders nützlich, solange ein geeignetes Screening entwickelt werden kann, um die Auswahl der Zellen zu ermöglichen, die als Konsequenz der Gegenwart eines Peptids innerhalb der Zelle einen veränderten Phänotypen aufweisen.
Dementsprechend umfassen geeignete Zellarten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Tumorzellen aller Arten (insbesondere von Melanomen, myeloischer Leukämie, Karzinomen der Lunge, Brust, der Eierstücke, des Kolon, der Nieren, der Prostata, des Pankreas und der Hoden), Cardiomyozyten, Endothelzellen, Epithelzellen, Lymphozyten (T-Zellen und B-Zellen), Mastzellen, Eosinophile, vaskuläre intimale Zellen, Hepatozyten, Leukozyten, unter anderem mononukleare Leukozyten, Stammzellen, wie z.B. hämatopoetische, neurale, Haut-, Lungen-, Nieren-, Leber- und Myozyten-Stammzellen (zur Verwendung im Screening auf Differenzierungs- und Dedifferenzierungsfaktoren), Osteoblasten, Chondrocyten und andere Bindegewebszellen, Keratinozyten, Melanozyten, Leberzellen, Nierenzellen und Adipozyten. Geeignete Zellen umfassen auch bekannte Forschungszellen, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Jurkat-T-Zellen, NIH3T3-Zellen, CHO, Cos etc. Siehe den ATCC-Zelllinienkatalog, der hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen ist.
In einer Ausführungsform können die Zellen zusätzlich dazu gentechnisch verändert worden sein, d.h. eine andere exogene Nucleinsäure enthalten als die Fusionsnucleinsäure.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Fusionsproteine in bakteriellen Systemen exprimiert. Bakterielle Expressionssysteme sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt.
Ein geeigneter bakterieller Promotor ist eine beliebige Nucleinsäuresequenz, die in der Lage ist, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Stromab-(3'-)Transkription der kodierenden Sequenz des Fusionsproteins in mRNA zu initiieren. Ein bakterieller Promotor besitzt eine Transkriptionsinitiationsregion, die normalerweise proximal zum 5'-Ende der kodierenden Sequenz platziert ist. Diese Transkriptionsinitiationsregion umfasst typischerweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptionsinitiationsstelle. Sequenzen, die für Stoffwechselweg-Enzyme kodieren, stellen besonders nützliche Promotorsequenzen bereit. Beispiele umfassen Promotorsequenzen, die von Zucker-metabolisierenden Enzymen, wie z.B. Galactose, Lactose und Maltose, abstammen, sowie Sequenzen, die von biosynthetischen Enzymen abstammen, wie z.B. Tryptophan. Promotoren aus Bakteriophagen können auch verwendet werden und sind nach dem Stand der Technik bekannt. Zusätzlich dazu sind auch synthetische Promotoren und Hybridpromotoren von Nutzen; z.B. der tac-Promotor ist ein Hybrid der trp- und lac-Promotor-Sequenzen. Weiters kann ein bakterieller Promotor natürlich auftretende Promotoren nicht bakteriellen Ursprungs umfassen, welche die Fähigkeit besitzen, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren.
Zusätzlich zu einer funktionierenden Promotorsequenz ist eine wirksame Ribosomenbindungsstelle wünschenswert. In E. coli wird die Ribosomenbindungsstelle als Shine-Dalgarno-(SD-)Sequenz bezeichnet und umfasst ein Initiationscodon und eine Sequenz, die 3-9 Nucleotide lang ist und sich 3-11 Nucleotide stromauf des Initiationscodons befindet.
Der Expressionsvektor kann auch eine Signalpeptidsequenz umfassen, die für die Sekretion des Fusionsproteins in Bakterien sorgt. Die Signalsequenz kodiert typischerweise für ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern, wie nach dem Stand der Technik wohlbekannt ist. Das Protein wird entweder in die Wachstumsmedien sekretiert (grampositive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum, der zwischen der inneren und der äußeren Membran der Zelle zu finden ist (gramnegative Bakterien).
Der bakterielle Expressionsvektor kann auch ein selektierbares Markergen enthalten, um die Auswahl bakterieller Stämme zu ermöglichen, die transformiert wurden. Geeignete Selektionsgene umfassen Gene, welche die Bakterien gegenüber Arzneimittel, wie z.B. Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetrazyklin, resistent machen. Selektierbare Marker umfassen auch biosynthetische Gene, wie z.B. jene in den biosynthetischen Histidin-, Tryptophan- und Leucin-Wegen.
Diese Komponenten werden zu Expressionsvektoren assembliert. Expressionsvektoren für Bakterien sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und umfassen unter anderem Vektoren für Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris und Streptococcus lividans.
Die bakteriellen Expressionsvektoren werden unter Verwendung von Verfahren, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind, wie z.B. Calciumchloridbehandlung, Elektroporation und anderer, in bakterielle Wirtszellen transformiert.
In einer Ausführungsform werden Fusionsproteine in Insektenzellen produziert. Expressionsvektoren für die Transformation von Insektenzellen und insbesondere baculovirusbasierte Expressionsvektoren sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fusionsprotein in Hefezellen produziert. Hefe-Expressionssysteme sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und umfassen Expressionsvektoren für Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans und C. maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis und K. lactis, Pichia guillerimondii und P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica. Bevorzugte Promotorsequenzen für die Expression in Hefe umfassen den induzierbaren GAL1,10-Promotor, die Promotoren aus Alkoholdehydrogenase, Enolase, Glucokinase, Glucose-6-Phosphatisomerase, Glyeraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase und das saure-Phosphatase-Gen. Selektierbare Hefe-Marker umfassen ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7, der Resistenz gegen Tunicamycin verleiht; das Neomycin-Phosphotransferase-Gen, das Resistenz gegen G418 verleiht; sowie das CUP1-Gen, das es der Hefe ermöglicht, in Gegenwart von Kupferionen zu wachsen.
Zusätzlich dazu können die Fusionspolypeptide der Erfindung, falls gewünscht, weiter an andere Proteine fusioniert werden, z.B. um die Expression zu erhöhen.
In einer Ausführungsform werden die Fusionsnucleinsäuren, Proteine und Antikörper der Erfindung mit einer anderen Markierung als dem Gerüst markiert. Mit „markiert" ist hierin gemeint, dass eine Verbindung zumindest ein Element, Isotop oder eine chemische Verbindung an sich gebunden hat, um die Detektion der Verbindung zu ermöglichen. Im Allgemeinen gehören Markierungen drei Klassen an: a) isotopische Markierungen, die radioaktive oder schwere Isotope sein können; b) Immunmarkierungen, die Antikörper oder Antigene sein können; und c) gefärbte oder fluoreszie rende Farbstoffe. Die Markierungen können an einer beliebigen Position in die Verbindung inkorporiert werden.
Die Fusionsnucleinsäuren werden in die Zellen eingeführt, um auf Peptide zu screenen, die in der Lage sind, den Phänotypen einer Zelle zu verändern.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine erste Vielzahl an Zellen gescreent. D.h. die Zellen, in welche die Fusionsnucleinsäuren eingeführt werden, werden auf einen veränderten Phänotypen gescreent. Daher zeigt sich in dieser Ausführungsform die Wirkung des bioaktiven Peptids in denselben Zellen, in denen es produziert wird; d.h. eine autokrine Wirkung.
Mit einer „Vielzahl an Zellen" sind hierin ungefähr von etwa 10³ Zellen bis 10⁸ oder 10⁹ gemeint, wobei 10⁶ bis 10⁸ bevorzugt ist. Diese Vielzahl an Zellen umfasst eine zelluläre Bibliothek, worin im Allgemeinen jede Zelle in der Bibliothek ein Mitglied der molekularen Peptidbibliothek enthält, d.h. ein anderes Peptid (oder eine Nucleinsäure, die für das Peptid kodiert), obwohl, wie der Fachmann zu schätzen weiß, einige Zellen in der Bibliothek kein Peptid enthalten können und einige mehr als eine Art an Peptid enthalten können. Werden andere Verfahren als die retrovirale Infektion verwendet, um die Kandidatennucleinsäuren in eine Vielzahl an Zellen einzuführen, kann die Verteilung der Kandidatennucleinsäuren innerhalb der einzelnen Zellmitglieder der zellulären Bibliothek stark variieren, da es im Allgemeinen schwierig ist, die Anzahl der Nucleinsäuren zu kontrollieren, die während der Elektroporation etc. in eine Zelle eindringen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Fusionsnucleinsäuren in eine erste Vielzahl an Zellen eingeführt, und die Wirkung des Peptids wird in einer zweiten oder dritten Vielzahl an Zellen gescreent, die sich von der ersten Vielzahl an Zellen unterscheidet, d.h. im Allgemeinen ein anderer Zelltyp ist. D.h. die Wirkung des bioaktiven Peptids ist auf eine extrazelluläre Wirkung auf einer zweiten Zelle zurückzuführen; d.h. eine endokrine oder parakrine Wirkung. Dies wird unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt. Die erste Vielzahl an Zellen kann in oder auf einem Medium gezüchtet werden, und es wird dem Medium ermöglicht, eine zweite Vielzahl an Zellen zu berühren, schließlich wird die Wirkung gemessen. Alternativ dazu kann es einen direkten Kontakt zwischen den Zellen geben. Daher ist das „Kontaktieren" ein funktioneller Kontakt und umfasst sowohl die direkte als auch die indirekte Art. In dieser Ausführungsform kann die erste Vielzahl an Zellen gescreent werden oder auch nicht.
Falls notwendig, werden die Zellen unter Bedingungen behandelt, die für die Expression des Peptids geeignet sind (z.B. wenn induzierbare Promotoren verwendet werden).
Daher umfassen die Verfahren der vorliegenden Erfindung das Einführen einer Molekularbibliothek an Fusionsnucleinsäuren, die für randomisierte Peptide kodieren, die an ein Gerüst fusioniert sind, in eine Vielzahl an Zellen, eine zelluläre Bibliothek. Jede der Nucleinsäuren umfasst eine andere Nucleotidsequenz, die für ein Gerüst mit einem Zufallspeptid kodiert. Die Vielzahl an Zellen wird anschließend gescreent, wie unten stehend ausführlicher beschrieben wird, und zwar auf eine Zelle, die einen veränderten Phänotyp aufweist. Der veränderte Phänotyp ist auf die Gegenwart eines bioaktiven Peptids zurückzuführen.
Mit „verändertem Phänotyp" oder „veränderter Physiologie" oder anderen grammatikalischen Äquivalenten ist hierin gemeint, dass der Phänotyp der Zelle auf eine gewisse Art und Weise verändert wird, vorzugsweise auf eine gewisse detektierbare und/oder messbare Art und Weise. Wie man nach dem Stand der Technik zu schätzen weiß, ist die große Bandbreite an Zelltypen und potentiellen phänotypischen Veränderungen, die unter Verwendung der vorliegenden Verfahren getestet werden können, eine Stärke der vorliegenden Erfindung. Dementsprechend können jegliche phänotypische Veränderungen, die beobachtet, detektiert oder gemessen werden können, die Basis der hierin enthaltenen Screeningverfahren sein. Geeignete phänotypische Veränderungen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Folgende: starke physikalische Veränderungen, wie z.B. Veränderungen der Zellmorphologie, des Zellwachstums, der Zelllebensfähigkeit, der Adhäsion an Substrate oder andere Zellen sowie der Zelldichte; Veränderungen in der Expression von einer oder mehreren RNAs, Proteinen, Lipiden, Hormonen, Zytokinen oder anderen Molekülen; Veränderungen im Gleichgewichtszustand (d.h. Halbwertszeit) einer oder mehrerer RNAs, Proteine, Lipide, Hormone, Zytokine oder anderer Moleküle; Veränderungen in der Lokalisierung einer oder mehrerer RNAs, Proteine, Lipide, Hormone, Zytokine oder anderer Moleküle; Veränderungen der Bioaktivität oder der spezifischen Aktivität einer oder mehrerer RNAs, Proteine, Lipide, Hormone, Zytokine, Rezeptoren oder anderer Moleküle; Veränderungen der Sekretion von Ionen, Zytokinen, Hormonen, Wachstumsfaktoren oder anderer Moleküle; Veränderungen der zellulären Membranpotentiale, Polarisierung, Integrität oder des Transports; Veränderungen der Infektiosität, Anfälligkeit, Latenz, Adhäsion und Aufnahme von Viren und bakteriellen Pathogenen etc. Mit „in der Lage, den Phänotypen zu verändern", ist hierin gemeint, dass das bioaktive Peptid den Phänotypen der Zelle auf eine gewisse detektierbare und/oder messbare Art und Weise verändern kann.
Der veränderte Phänotyp kann durch eine große Bandbreite an Arten detektiert werden, wie unten stehend ausführlicher beschrieben wird, und hängt im Allgemeinen vom Phänotypen ab, der verändert wird, und entspricht diesem. Im Allgemeinen wird der veränderte Phänotyp z.B. unter Verwendung folgender Verfahren detektiert: mikroskopische Analyse der Zellmorphologie; Standard-Zelllebensfähigkeitstests, umfassend sowohl erhöhten Zelltod als auch erhöhte Zelllebensfähigkeit, z.B. Zellen, die nun resistent gegen Zelltod durch ein Virus, Bakterium oder bakterielle oder synthetische Toxine sind; Standard-Markierungstests, wie z.B. fluorometrische Indikatortests auf die Gegenwart oder die Menge einer bestimmten Zelle oder eines bestimmten Moleküls, unter anderem FACS oder andere Anfärbungsverfahren; biochemische Detektion der Expression von Zielverbindungen nach dem Abtöten der Zellen; etc. In einigen Fällen, wie hierin ausführlicher beschrieben wird, wird der veränderte Phänotyp in der Zelle detektiert, in die die Fusionsnucleinsäure eingeführt wurde; in anderen Ausführungsformen wird der veränderte Phänotyp in einer zweiten Zelle detektiert, die auf ein gewisses molekulares Signal aus der ersten Zelle reagiert.
Ein veränderter Phänotyp einer Zelle deutet auf die Gegenwart eines bioaktiven Peptids hin, das vorzugsweise auf eine transdominante Art und Weise agiert. Mit „transdominant" ist hierin gemeint, dass das bioaktive Peptid den veränderten Phänotypen indirekt hervorruft, und zwar durch Wirkung auf ein zweites Molekül, das zu einem veränderten Phänotypen führt. D.h. ein transdominantes Expressionsprodukt besitzt eine Wirkung, die nicht cis ist, d.h. ein trans-Vorkommnis, wie es in genetischen oder biochemischen Begriffen definiert ist. Eine transdominante Wirkung ist eine durch eine Molekulareinheit (d.h. das kodierte Peptid oder die RNA) unterscheidbare Wirkung auf ein bestimmtes getrenntes oder unterscheidbares Ziel; d.h. keine Wirkung auf die kodierte Einheit selbst. Als solche umfassen transdominante Wirkungen zahlreiche bekannte Wirkungen von pharmakologischen Wirkstoffen auf Zielmoleküle oder Wege in Zellen oder physiologischen Systemen; z.B. die β-Lactam-Antibiotika besitzen eine transdominante Wirkung auf die Peptidoglycan-Synthese in bakteriellen Zellen durch die Bindung an penicillinbindende Proteine und die Unterbrechung ihrer Funktionen. Ein Beispiel für eine transdominante Wirkung durch ein Peptid ist die Fähigkeit, NF-_κB-Signale durch Bindung an I_κB-α an einer Region zu inhibieren, die für ihre Funktion entscheidend ist, so dass in Gegenwart ausreichender Mengen des Peptids (oder der molekularen Einheit) die Signalwege, die normalerweise zu der Aktivierung von NF-_κB durch Phosphorylierung und/oder Abbau von I_κB-α führen, inhibiert werden, an I_κB-α zu agieren, und zwar aufgrund der Bindung des Peptids oder der molekularen Einheit. In einem weiteren Fall werden Signalwege, die normalerweise aktiviert werden, um IgE zu sekretieren, in Gegenwart des Peptids inhibiert. Es können aber auch Signalwege in adipösen Gewebezellen, normalerweise ruhend, aktiviert werden, um Fett zu metabolisieren. Oder es werden in Gegenwart eines Peptids intrazelluläre Mechanismen für die Replikation gewisser Viren, wie z.B. HIV-1 oder Herpes-viridae-Familienmitglieder oder das respiratorische Synzytial-Virus, inhibiert.
Eine transdominante Wirkung auf ein Protein oder einen molekularen Weg ist klar von der Randomisierung, Veränderung oder Mutation einer Sequenz in einem Protein oder Molekül bekannter oder unbekannter Funktion unterscheidbar, um eine bio chemische Fähigkeit, die das Protein oder Molekül bereits aufweist, zu verstärken oder zu verringern. Ein Protein, dass z.B. β-Lactam-Antibiotika enzymatisch spaltet, eine β-Lactamase, konnte in seiner Aktivität durch Mutation von Sequenzen im Inneren seiner Struktur, welche die Fähigkeit dieses Enzyms verstärken oder verringern, auf β-Lactam-Antibiotika zu wirken und diese zu spalten, verstärkt oder verringert werden. Dies würde eine cis-Mutation am Proteins genannt werden. Die Wirkung dieses Proteins auf β-Lactam-Antibiotika ist eine Aktivität, die das Protein in einem unterscheidbaren Ausmaß bereits aufweist. Auf ähnliche Art und Weise würde eine Mutation in der Leitsequenz, die den Export dieses Proteins in die extrazellulären Räume verstärken würde, wo es leichter β-Lactam-Moleküle antreffen würde, oder eine Mutation innerhalb der Sequenz, welche die Stabilität des Proteins verstärken würde, als cis-Mutation im Protein bezeichnet werden. Zum Vergleich würde ein transdominanter Effektor dieses Proteins ein Agens inkludieren, unabhängig von β-Lactamase, das auf solch eine Art und Weise an β-Lactamase band, dass es die Funktion der β-Lactamase durch seine Bindung an β-Lactamase verstäkte oder verringerte.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird, ist eine Zelle mit einem veränderten Phänotypen einmal detektiert, die Gegenwart des Fusionsproteins verifiziert, um sicherzustellen, dass das Peptid exprimiert wurde und dass daher der veränderte Phänotyp auf die Gegenwart des Peptids zurückgeführt werden kann. Wie der Fachmann zu schätzen weiß, kann diese Verifikation der Gegenwart des Peptids entweder vor, während oder nach dem Screening auf einen veränderten Phänotypen durchgeführt werden. Dies kann auf eine Vielzahl an Arten erfolgen, obwohl die bevorzugten Methoden die FACS-Verfahren umfassen.
Ist die Gegenwart des Fusionsproteins einmal verifiziert, so wird die Zelle mit dem veränderten Phänotypen im Allgemeinen aus der Vielzahl, die keine veränderten Phänotypen aufweist, isoliert. Dies kann auf beliebigen einer Anzahl an Wegen erfolgen, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, und hängt in einigen Fällen vom Test oder Screening ab. Geeignete Isolationsverfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, FACS, Lyse-Auswahl unter Verwendung von Komplement, Zellklonierung, Scannen durch Fluorimager, Expression eines „Überlebens"-Proteins, induzierte Expression eines Zelloberflächenproteins oder anderen Moleküls, das für die physikalische Isolation fluoreszierend oder markierbar gemacht werden kann; Expression eines Enzyms, das ein nicht fluoreszierendes Molekül zu einem fluoreszierenden macht; Überwachstum gegen einen Hintergrund mit keinem oder langsamem Wachstum; Zelltod und Isolation von DNA oder anderen Zellvitalitäts-Indikator-Farbstoffen etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Fusionsnucleinsäure und/oder das bioaktive Peptid (d.h. das Fusionsprotein) aus einer positiven Zelle isoliert. Dies kann auf eine Vielzahl an Arten erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Primer, die zu DNA-Regionen, die in retroviralen Konstrukten häufig vorkommen, komplementär sind oder zu spezifischen Komponenten der Bibliothek, wie z.B. einer Rettungssequenz, wie oben stehend definiert, verwendet, um die einzigartige Zufallssequenz „zu retten". Alternativ dazu wird das Fusionsprotein unter Verwendung einer Rettungssequenz isoliert. Daher können z.B. Rettungssequenzen, die Epitop-Markierungen oder Reinigungssequenzen umfassen, verwendet werden, um das Fusionsprotein unter Verwendung der Immunpräzipitation oder von Affinitätssäulen herauszuziehen. In einigen Fällen kann dadurch, wie unten stehend beschrieben, auch das primäre Zielmolekül herausgezogen werden, falls es eine ausreichend starke Bindungswechselwirkung zwischen dem bioaktiven Peptid und dem Zielmolekül gibt. Alternativ dazu kann das Peptid unter Verwendung von Massenspektroskopie detektiert werden.
Einmal gerettet, wird die Sequenz des bioaktiven Peptids und/oder der Fusionsnucleinsäure bestimmt. Diese Information kann anschließend auf eine Vielzahl an Arten verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das bioaktive Peptid erneut synthetisiert und erneut in die Zielzellen eingeführt, um die Wirkung zu verifizieren. Dies kann unter Verwendung von Retroviren oder, alternativ dazu, unter Verwendung von Fusio nen an das HIV-1-Tat-Protein und Analoga und verwandte Proteine erreicht werden, wodurch eine sehr hohe Aufnahme in die Zielzellen ermöglicht wird. Siehe z.B. Fawell et al., PNAS USA 91, 664 (1994); Frankel et al., Cell 55, 1189 (1988); Savion et al., J. Biol. Chem. 256, 1149 (1981); Derossi et al., J. Biol. Chem. 269, 10444 (1994); sowie Baldin et al., EMBO J. 9, 1511 (1990), von denen alle hierin durch Verweis aufgenommen wurden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sequenz des bioaktiven Peptids verwendet, um mehr Kandidatenpeptide zu erzeugen. Die Sequenz des bioaktiven Peptids kann z.B. die Basis einer zweiten Runde an (beeinflusster) Randomisierung sein, um bioaktive Peptide mit verstärkten oder veränderten Aktivitäten zu entwickeln. Alternativ dazu kann die zweite Runde der Randomisierung die Affinität des bioaktiven Peptids verändern. Weiters kann es wünschenswert sein, die identifizierte Zufallsregion des bioaktiven Peptids in andere Präsentationsstrukturen zu platzieren oder die Sequenz der konstanten Region der Präsentationsstruktur zu verändern, um die Konformation/Form des bioaktiven Peptids zu verändern. Es kann ebenfalls auch erwünscht sein, eine potentielle Bindungsstelle „zu umgehen", und zwar auf eine Art und Weise, die der Mutagenese einer Bindungstasche ähnelt, indem ein Ende der Ligandenregion konstant gehalten wird und das andere Ende randomisiert wird, um die Bindung des Peptids zu verschieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird entweder das bioaktive Peptid oder die bioaktive Nucleinsäure, die dafür kodiert, verwendet, um Zielmoleküle zu identifizieren, d.h. die Moleküle, mit denen das bioaktive Peptid wechselwirkt. Wie der Fachmann zu schätzen weiß, kann es primäre Zielmoleküle geben, an die das bioaktive Peptid bindet oder auf die es direkt wirkt, und es kann sekundäre Zielmoleküle geben, die Teil des Signalwegs sind, der durch das bioaktive Peptid beeinflusst wird; diese können „validierte Ziele" benannt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das bioaktive Peptid verwendet, um Zielmoleküle herauszuziehen. Wie hierin beschrieben, kann, wenn die Zielmoleküle Proteine sind, die Verwendung von Epitop-Markierungen oder Reinigungssequenzen z.B. die Reinigung von primären Zielmolekülen mit biochemischen Mitteln (Co-Immunpräzipitation, Affinitätssäulen etc.) ermöglichen. Alternativ dazu kann das Peptid, wenn es in Bakterien exprimiert wird und gereinigt wird, als Sonde gegen eine bakterielle cDNA-Expressionsbibliothek verwendet werden, die aus mRNA des Zielzell-Typs hergestellt ist. Oder aber es können Peptide als „Köder" in entweder Hefe- oder Säugetier-Zwei- oder -Drei-Hybrid-Systemen verwendet werden. Solche Wechselwirkungs-Klonierungsansätze waren sehr nützlich, um DNA-Bindungsproteine und andere wechselwirkende Proteinkomponenten zu isolieren. Das/die Peptid(e) kann/können mit anderen pharmakologischen Aktivatoren kombiniert werden, um die epistatischen Beziehungen der jeweiligen Signalübertragungswege zu untersuchen. Es ist auch möglich, auf synthetische Art und Weise markierte Peptide herzustellen und diese für das Screening einer cDNA-Bibliothek, die in Bakteriophagen exprimiert wird, für jene cDNAs zu verwenden, die das Peptid binden. Weiters ist es auch möglich, cDNA-Klonierung durch retrovirale Blibliotheken zu verwenden, um die durch das Peptid induzierte Wirkung zu „komplementieren". In solch einer Strategie wäre es erforderlich, dass das Peptid einen wichtigen Faktor für einen spezifischen Signalweg stöchiometrisch wegtitrieren würde. Falls dieses Molekül oder diese Aktivität durch Über-Expression einer cDNA aus einer cDNA-Bibliothek aufgefüllt wird, so kann das Ziel kloniert werden. Auf ähnliche Art und Weise können cDNAs, die durch ein beliebiges der oben genannten Hefe- oder Bakteriophagensysteme kloniert wurden, erneut auf diese Art und Weise in Säugetierzellen eingeführt werden, um zu bestätigen, dass sie die Funktion in jenem System, auf welches das Peptid wirkt, komplementieren.
Wurden primäre Zielmoleküle einmal identifiziert, so können sekundäre Zielmoleküle auf dieselbe Art und Weise identifiziert werden, und zwar unter Verwendung des primären Ziels als „Köder". Auf diese Art und Weise können Signalwege aufgeklärt werden. Auf ähnliche Art und Weise können auch bioaktive Peptide, die für sekundäre Zielmoleküle spezifisch sind, entdeckt werden, um es einer Anzahl an bioaktiven Peptiden zu ermöglichen, auf einen einzelnen Weg zu wirken, z.B. für Kombinationstherapien.
Die Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung können von Nutzen sein, um eine große Anzahl an Zelltypen unter einer großen Bandbreite an Bedingungen zu screenen. Im Allgemeinen sind die Wirtszellen Zellen, die in Erkrankungszustände involviert sind, und sie werden unter Bedingungen getestet oder gescreent, die normalerweise zu unerwünschten Folgen für die Zellen führen. Wird ein geeignetes bioaktives Peptid gefunden, so kann die unerwünschte Wirkung reduziert oder eliminiert werden. Alternativ dazu können normalerweise gewünschte Konsequenzen reduziert oder eliminiert werden, und zwar im Hinblick auf die Aufklärung der zellulären Mechanismen, die mit dem Erkrankungszustand oder dem Signalweg assoziiert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren in Anwendungen bei Krebs von Nutzen. Die Fähigkeit, Tumorzellen schnell und spezifisch abzutöten, ist ein Eckpfeiler der Krebs-Chemotherapie. Im Allgemeinen können Zufallsbibliotheken unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung in eine beliebige Tumorzelle (primär oder gezüchtet) eingeführt werden, und es können Peptide identifiziert werden, die von sich selbst aus Apoptose, Zelltod, reduzierte Zellteilung oder verringertes Zellwachstum induzieren. Dies kann de novo erfolgen oder durch beeinflusste Randomisierung hin zu bekannten Peptidagenzien, wie z.B. Angiostatin, das das Wachstum der Blutgefäßwände inhibiert. Alternativ dazu können die Verfahren der vorliegenden Erfindung mit anderen Krebstherapeutika (z.B. Arzneimittel oder Bestrahlung) kombiniert werden, um die Zellen zu sensibilisieren und daher nach dem Aussetzen gegenüber einem sekundären Agens schnell und spezifisch Apoptose, Zelltod, reduzierte Zellteilung oder verringertes Zellwachstum zu induzieren. Auf ähnliche Art und Weise können die vorliegenden Verfahren zusammen mit bekannten Krebstherapeutika verwendet werden, um auf Agonisten zu screenen, um das Therapeutikum wirksamer oder weniger toxisch zu machen. Dies wird besonders bevorzugt, wenn das Chemotherapeutikum sehr teuer in der Herstellung ist, wie z.B. Taxol.
Bekannte Onkogene, wie z.B. v-Abl, v-Src, v-Ras und andere, induzieren einen transformierten Phänotypen, der zu abnormalem Zellwachstum führt, wenn er in gewisse Zellen transfiziert wird. Dies ist auch ein Hauptproblem bei Mikro-Metastasen.
Daher können in einer bevorzugten Ausführungsform nicht transformierte Zellen mit diesen Onkogenen transfiziert werden und anschließend Zufallsbibliotheken in diese Zellen eingeführt werden, um bioaktive Peptide auszuwählen, die den transformierten Zustand umkehren oder korrigieren. Eines der Signalmerkmale der Onkogen-Transformation von Zellen ist der Verlust der Kontaktinhibierung und die Fähigkeit, in Weichagar zu wachsen. Werden transformierende Viren konstruiert, die v-Abl, v-Src oder v-Ras in retroviralen IRES-Puro-Vektoren enthalten, in 3T3-Zielzellen infiziert und einer Puromycin-Selektion unterzogen, so kommt es bei allen der 3T3-Zellen zu einer Hyper-Transformation und zu einer Ablösung von der Platte. Die Zellen können durch Waschen mit frischem Medium entfernt werden. Dies kann als Basis eines Screenings dienen, da Zellen, die ein bioaktives Peptid exprimieren, an die Platte gebunden bleiben und Kolonien bilden.
Auf ähnliche Art und Weise wird das Wachstum und/oder die Ausbreitung gewisser Tumortypen durch stimulatorische Reaktionen von Wachstumsfaktoren und Zytokinen (PDGF, EGF, Heregulin und andere) verstärkt, die an Rezeptoren auf den Oberflächen spezifischer Tumoren binden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, um das Tumorwachstum und/oder die Tumorausbreitung zu inhibieren oder zu stoppen, und zwar durch das Auffinden bioaktiver Peptide, die in der Lage sind, die Fähigkeit des Wachstumsfaktors oder des Zytokins, die Tumorzelle zu stimulieren, zu blockieren. Die Einführung von Zufallsbibliotheken in spezifische Tumorzellen mit der Addition des Wachstumsfaktors oder Zytokins, gefolgt von der Selektion bioaktiver Peptide, welche die Bindung, die Signalgebung, die phänotypischen und/oder funktionellen Reaktionen dieser Tumorzellen an den jeweiligen Wachstumsfaktor oder das jeweilige Zytokin blockieren.
Auf ähnliche Art und Weise ist die Ausbreitung von Krebszellen (Invasion und Metastase) ein signifikantes Problem, das den Erfolg von Krebstherapien einschränkt. Die Fähigkeit, die Invasion und/oder die Migration spezifischer Tumorzellen zu inhibieren, wäre ein signifikanter Fortschritt in der Krebstherapie. Tumorzellen, von denen bekannt ist, dass sie ein hohes Metastase-Potential besitzen (z.B. Melanom, Lungen zellenkarzinom, Brust- und Eierstock-Karzinom), können Zufallsbibliotheken eingeführt haben, und Peptide können ausgewählt werden, die in einem Migrations- oder Invasionstest die Migration und/oder die Invasion spezifischer Tumorzellen inhibieren. Bestimmte Applikationen zur Inhibierung des metastatischen Phänotypen, die eine spezifischere Inhibierung der Metastase ermöglichen könnten, umfassen das Metastase-Suppressor-Gen NM23, das für eine Dinucleosiddiphosphatkinase kodiert. Daher könnten intrazelluläre Peptidaktivatoren dieses Gens die Metastase blockieren, und ein Screening auf dessen Hinaufregulierung (durch dessen Fusion an ein Reportergen) könnte von Interesse sein. Viele Onkogene verstärken auch die Metastase. Peptide, die mutierte RAS-Onkogene, v-MOS, v-RAF, A-RAF, v-SRC, v-FES und v-FMS deaktivieren oder ihnen entgegenwirken, würden auch als Anti-Metastatika agieren. Peptide, die intrazellulär wirken, um die Freisetzung von Kombinationen von Proteasen zu blockieren, die für die Invasion erforderlich sind, wie z.B. die Matrix-Metalloproteasen und Urokinase, könnten ebenfalls wirksame Anti-Metastatika sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zufallsbibliotheken der vorliegenden Erfindung in Tumorzellen eingeführt, von denen bekannt ist, dass sie deaktivierte Tumorsuppressorgene aufweisen, und die erfolgreiche Umkehr entweder durch Reaktivierung oder Kompensation des Knockouts würde durch Wiederherstellung des normalen Phänotypen gescreent werden. Ein bedeutendes Beispiel ist die Umkehr von p53-deaktivierenden Mutationen, die in 50 % oder mehr aller Krebsarten vorhanden sind. Da die Wirkungen von p53 komplex sind und seine Wirkung als Transkriptionsfaktor involvieren, gibt es wahrscheinlich zahlreiche potentielle Wege, wie ein Peptid oder kleines Molekül, das von einem Peptid abstammt, die Mutation umkehren könnte. Ein Beispiel wäre die Hinaufregulierung der unmittelbar stromab befindlichen cyclinabhängigen Kinase p21CIP1/WAF1. Um von Nutzen zu sein, müsste eine solche Umkehr für viele der verschiedenen bekannten p53-Mutationen funktionieren. Dies wird im Moment durch den Ansatz der Gentherapie versucht; eines oder mehrere kleine Moleküle, die dies bewirken, könnten bevorzugt werden.
Ein weiteres Beispiel umfasst das Screening von bioaktiven Peptiden, welche die konstitutive Funktion von brca-1- oder brca-2-Genen wiederherstellen, sowie anderer Tumorsuppressorgene, die bei Brustkrebs von Bedeutung sind, wie z.B. das adenomatöse Polyposis-coli-Gen (APC) und das große Drosophila-Discs-Gen (Dlg), die Komponenten von Zell-Zell-Verbindungspunkten sind. Mutationen von brca-1 sind bei erblichen Eierstock- und Brustkrebsarten von Bedeutung und stellen eine zusätzliche Anwendung der vorliegenden Erfindung dar.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, um neue Zelllinien aus Krebsarten von Patienten zu züchten. Ein retroviral angeliefertes kurzes Peptid, das den gemeinsamen Endweg des programmierten Zelltods inhibiert, sollte die Etablierung von kurzlebigen und möglicherweise langlebigen Zelllinien ermöglichen. Die Bedingungen der In-vitro-Kultur und der Infektion menschlicher Leukämie-Zellen werden festgelegt. Es gibt einen realen Bedarf an Verfahren, welche den Erhalt gewisser Tumorzellen in Kultur lange genug ermöglichen, um physiologische und pharmakologische Studien zu ermöglichen. Im Moment wurden einige menschliche Zelllinien durch die Verwendung von transformierenden Agenzien, wie z.B. dem Epstein-Barr-Virus, etabliert, das die existierende Physiologie der Zelle bedeutend verändert. Gelegentlich wachsen Zellen von alleine in Kultur, dies ist jedoch ein zufällig auftretendes Vorkommnis. Der programmierte Zelltod (Apoptose) tritt über komplexe Signalwege innerhalb von Zellen auf, die schließlich einen gemeinsamen Endweg aktivieren, der charakteristische Veränderungen in der Zelle hervorruft, die zu einer nichtentzündlichen Zerstörung der Zelle führen. Es ist wohlbekannt, dass Tumorzellen einen hohen apoptotischen Index aufweisen oder eine Neigung, in vivo in die Apoptose einzutreten. Werden Zellen in einer Kultur platziert, so werden die In-vivo-Stimuli für malignes Zellwachstum entfernt, und die Zellen unterziehen sich leichter der Apoptose. Das Ziel wäre es, eine Technologie zu entwickeln, um Zelllinien aus einer beliebigen Anzahl an primären Tumorzellen zu etablieren, z.B. primäre menschliche Leukämie-Zellen, und zwar auf eine reproduzierbare Art und Weise, ohne die native Konfiguration der Signalwege in diesen Zellen zu verändern. Durch die Einführung von Nucleinsäuren, die für Peptide kodieren, welche die Apoptose inhibieren, kommt es in vitro zu einem erhöhten Zellüberleben und daher zu der Möglichkeit, die Signalübertragungswege in primären menschlichen Tumorzellen zu untersuchen. Zusätzlich dazu können diese Verfahren zur Kultivierung von Primärzellen, d.h. Nicht-Tumor-Zellen, verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren in kardiovaskulären Anwendungen von Nutzen. In einer bevorzugten Ausführungsform können Cardiomyozyten auf die Prävention von Zellschäden oder Zelltod bei Vorliegen von normalerweise schädlichen Zuständen, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, die Gegenwart von toxischen Arzneimitteln (besonders chemotherapeutischen Arzneimitteln), z.B. um Herzversagen nach Behandlung mit Adriamycin zu verhindern; Anoxie, z.B. im Rahmen einer Okklusion der Koronararterie; sowie zellulären Autoimmunschaden durch Angriff von aktivierten Lymphoidzellen (z.B. wie bei postviraler Myocarditis und Lupus der Fall) gescreent werden. Bioaktive Kandidatenpeptide werden in Cardiomyozyten insertiert, die Zellen werden dem Anfall ausgesetzt, und es werden bioaktive Peptide ausgesucht, die ein beliebiges oder alle der folgenden Phänomene verhindern: Apoptose, Membrandepolarisierung (d.h. Verringerung des arrythmogenen Potentials des Anfalls); Zellschwellung oder das Entweichen spezifischer intrazellulärer Ionen, zweiter Messenger und aktivierender Moleküle (z.B. Arachidonsäure und/oder Lysophosphatidsäure).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die vorliegenden Verfahren verwendet, um auf verringertes Arrhythmiepotential bei Cardiomyozyten zu screenen. Die Screenings umfassen das Einführen der Kandidaten-Nucleinsäuren, die für die bioaktiven Kandidatenpeptide kodieren, gefolgt von der Anwendung arrythmogener Anfälle mit einem Screening auf bioaktive Peptide, welche die spezifische Depolarisierung der Zellmembran blockieren. Dies kann unter Verwendung von Patch-Clamps oder durch Fluoreszenzverfahren detektiert werden. Auf ähnliche Art und Weise konnte die Kanalaktivität (z.B. Kalium- und Chlorid-Kanäle) in Cardiomyozyten unter Verwendung der vorliegenden Verfahren reguliert werden, um die Kontraktilität zu erhöhen und Arrhythmien zu verhindern oder zu verringern.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die vorliegenden Verfahren verwendet, um auf verstärkte kontraktile Eigenschaften von Cardiomyozyten zu screenen und das Potential für Herzversagen zu verringern. Die Einführung der Bibliotheken der Erfindung gefolgt von der Messung der Veränderungsrate der Myosin-Polymerisation/Depolymerisation unter Verwendung von Fluoreszenzverfahren kann durchgeführt werden. Bioaktive Peptide, welche die Veränderungsrate dieses Phänomens erhöhen, können zu einer erhöhten kontraktilen Reaktion des gesamten Myocards führen, ähnlich wie bei jener Wirkung, die bei Digitalis zu beobachten ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren von Nutzen, um Agenzien zu identifizieren, welche den intrazellulären und sarkolemmalen Calcium-Stoffkreislauf in Cardiomyozyten regulieren, um Arrhythmien zu verhindern. Bioaktive Peptide werden ausgewählt, die den Natrium-Calcium-Austausch und die Natrium-Protonenpumpen-Funktion regulieren, sowie für die Regulation der Calcium-ATPase-Aktivität.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren von Nutzen, um Agenzien zu identifizieren, die embolische Phänomene in Arterien und Arteriolen verringern, die zu Schlaganfällen führen (und anderen okklusiven Vorkommnissen, die zu Nierenversagen und Extremitätenischämie führen) sowie zu Angina, die einen Myocard-Infarkt herbeiführt, wobei diese ausgewählt werden. Z.B. bioaktive Peptide, welche die Adhäsion von Plättchen und Leukozyten verringern und daher die Okklusionsvorkommnisse verringern. Die Adhäsion in diesem Rahmen kann durch die Bibliotheken der Erfindung inhibiert werden, die in Endothel-Zellen insertiert werden (ruhende Zellen oder jene, die durch Zytokine, d.h. IL-1, und Wachstumsfaktoren, d.h. PDGF/EGF, aktiviert sind), gefolgt von anschließendem Screening auf Peptide, die entweder: 1) die Adhäsionsmolekül-Expression auf der Oberfläche der Endothel-Zellen hinunterregulieren (Bindungstest); 2) die Adhäsionsmolekülaktivierung auf der Oberfläche dieser Zellen blockieren (Signaltest); oder 3) auf autokrine Art und Weise Peptide freisetzen, welche die Rezeptorbindung an den verwandten Rezeptor auf der anhaftenden Zelle blockieren.
Auf embolische Phänomene kann auch durch Aktivierung proteolytischer Enzyme auf den Zelloberflächen von Endothel-Zellen reagiert werden, wodurch das aktive Enzym, das Blutgerinnsel verdauen kann, freigesetzt wird. Daher erfolgt die Anlieferung der Bibliotheken der Erfindung an Endothel-Zellen, gefolgt von fluorogenen Standard-Tests, die eine Beobachtung der proteolytischen Aktivität auf der Zelloberfläche hin zu einem bekannten Substrat ermöglichen. Anschließend können bioaktive Peptide ausgewählt werden, die spezifische Enzyme hin zu spezifischen Substraten aktivieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine arterielle Entzündung im Rahmen einer Vasculitis und Post-Infarktbildung durch Verringerung der chemotaktischen Reaktionen der Leukozyten und der mononuklearen Leukozyten reguliert werden. Dies kann durch Blockieren chemotaktischer Rezeptoren und ihrer reagierenden Wege auf diesen Zellen erreicht werden. Bioaktive Kandidatenbibliotheken können in diese Zellen insertiert werden, und die chemotaktische Reaktion auf diverse Chemokine (z.B. auf die IL-8-Familie von Chemokinen, RANTES) kann in Zellmigrationstests inhibiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine arterielle Restenose nach koronarer Angioplastie durch Regulation der Proliferation der intimalen vaskulären Zellen und der Kapillar- und/oder arteriellen Endothel-Zellen gesteuert werden. Bioaktive Kandidatenpeptidbibliotheken können in diese Zelltypen insertiert werden und ihre Proliferation als Reaktion auf spezifische Stimuli beobachtet werden. Eine Anwendung kann intrazelluläre Peptide umfassen, welche die Expression oder Funktion von c-myc und anderen Onkogenen in Glattmuskelzellen blockieren, um ihre Proliferation zu stoppen. Eine zweite Anwendung kann die Expression von Bibliotheken in vaskulären Glattmuskelzellen involvieren, um selektiv ihre Apoptose zu induzieren. Die Anwendung von kleinen Molekülen, die von diesen Peptiden abstammen, kann gezielte Arzneimittelanlieferung erfordern; dies ist mit Stents, Hydrogel-Überzügen und infusionsbasierten Kathetersystemen erhältlich. Peptide, die Endothelin-1A-Rezeptoren hinunterregulieren oder die Freisetzung des leistungsstarken Vasokonstriktors und vaskulären Mitogens von Glattmuskelzellen Endothelin-1 blockieren, können auch Kandidaten für Therapeutika sein. Peptide können aus diesen Bibliotheken isoliert werden, die das Wachstum dieser Zellen inhibieren oder welche die Adhäsion anderer Zellen in Zirkulation verhindern, von denen bekannt ist, dass sie autokrine Wachstumsfaktoren, wie z.B. Plättchen (PDGF) und mononukleare Leukozyten, freisetzen.
Die Kontrolle des Kapillar- und Blutgefäß-Wachstums ist ein wichtiges Ziel, um den erhöhten Blutfluss zu ischämischen Gebieten (Wachstum) zu fördern oder um die Blutzufuhr von Tumoren zu unterbrechen (Angiogenese-Inhibierung). Bioaktive Kandidatenpeptidbibliotheken können in Kapillarendothel-Zellen insertiert werden und ihr Wachstum beobachtet werden. Stimuli, wie z.B. niedriger Sauerstoffpartialdruck und variierende Ausmaße an angiogenen Faktoren, können die Reaktionen regulieren, und es können Peptide isoliert werden, welche den geeigneten Phänotypen produzieren. Ein Screening auf den Antagonismus des Gefäßendothel-Zellwachstumsfaktors, der bei der Angiogenese wichtig ist, wäre ebenfalls von Nutzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren beim Screening auf Verringerungen der atheroskleroseproduzierenden Mechanismen von Nutzen, um Peptide zu finden, welche den LDL- und den HDL-Metabolismus regulieren. Kandidatenbibliotheken können in die geeigneten Zellen insertiert werden (unter anderem Hepatozyten, mononukleare Leukozyten, Endothel-Zellen), und es können Peptide ausgewählt werden, die zu einer verringerten Freisetzung von LDL oder einer verringerten Synthese von LDL führen oder umgekehrt zu einer erhöhten Freisetzung von HDL oder einer verstärkten Synthese von HDL. Bioaktive Peptide können auch aus Kandidatenbibliotheken isoliert werden, welche die Produktion von oxidiertem LDL verringern, was mit Atherosklerose in Verbindung gebracht wurde, und von atherosklerotischen Verletzungen isoliert werden. Dies könnte durch Verringerung seiner Expression, durch Aktivierung reduzierender Systeme oder Enzyme oder durch Blockieren der Aktivität oder Produktion von Enzymen, die in die Produktion von oxidiertem LDL involviert sind, wie z.B. 15-Lipoxygenase in Makrophagen, erreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die vorliegenden Verfahren in Screenings verwendet, um Obesität durch die Kontrolle der Nahrungsaufnahmemechanismen zu regulieren oder durch die Verringerung der Reaktionen auf Rezeptor-Signalwege, die den Stoffwechsel regulieren. Bioaktive Peptide, welche die Reaktionen von Neuropeptid Y (NPY), Cholecystokinin und Galanin-Rezeptoren regulieren oder inhibieren, sind besonders erwünscht. Kandidatenbibliotheken können in Zellen insertiert werden, die diese Rezeptoren in sich hineinkloniert haben, und es können inhibitorische Peptide ausgewählt werden, die auf eine autokrine Art und Weise ausgewählt werden und die Signalreaktionen auf Galanin und NPY blockieren. Auf ähnliche Art und Weise können Peptide gefunden werden, die den Leptin-Rezeptor regulieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren in neurobiologischen Anwendungen von Nutzen. Kandidatenbibliotheken können für das Screening von Anti-Apoptotika für den Erhalt der neuronalen Funktion und der Verhinderung von neuronalem Tod verwendet werden. Anfängliche Screenings würden in Zellkultur durchgeführt werden. Eine Anwendung würde die Verhinderung von neuronalem Tod durch Apoptose bei zerebraler Ischämie aufgrund eines Schlaganfalls umfassen. Von Apoptose ist bekannt, dass sie durch das neuronale apoptoseinhibierende Protein (NAIP) blockiert wird; Screenings für dessen Hinaufregulierung oder die Durchführung eines beliebigen gekoppelten Schritts könnten zu Peptiden führen, welche die neuronale Apoptose selektiv blockieren. Andere Anwendungen umfassen neurodegenerative Erkrankungen, wie z.B. die Alzheimer-Erkrankung und die Huntington-Krankheit.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren bei Knochenbiologie-Anwendungen von Nutzen. Von Osteoklasten ist bekannt, dass sie eine Schlüsselrolle bei der Knochen-Neumodellierung durch das Abbauen von „alten" Knochen spielen, so dass die Osteoblasten „neue" Knochen aufbauen können. Bei Osteoporose liegt ein Ungleichgewicht dieses Prozesses vor. Die Osteoklasten-Überaktivität kann durch Insertieren von Kandidatenbibliotheken in diese Zellen und anschließendes Suchen nach bioaktiven Peptiden reguliert werden, die Folgendes produzieren: 1) eine verringerte Verarbeitung von Kollagen durch diese Zellen; 2) eine verringerte Narbenbildung auf Knochensplittern; sowie 3) eine verringerte Freisetzung von Calcium aus Knochenfragmenten.
Die vorliegenden Verfahren können auch verwendet werden, um auf Agonisten für morphogene Knochenproteine, Hormonmimetika zur Stimulation, Regulation oder Verbesserung der neuen Knochenbildung zu screenen (auf eine Art und Weise, die z.B. jener des Nebenschilddrüsenhormons und von Calcitonin ähnelt). Diese sind bei Osteoporose bei schlecht heilenden Frakturen von Nutzen sowie zur Beschleunigung der Heilungsgeschwindigkeit neuer Frakturen. Weiters können Zelllinien, die ursprünglich aus Bindegewebe stammen, mit Kandidatenbibliotheken behandelt werden und auf ihr Wachstum, ihre Proliferation, ihre kollagenstimulierende Aktivität und/oder ihre prolininkorporierende Fähigkeit auf die Ziel-Osteoblasten gescreent werden. Alternativ dazu können Kandidatenbibliotheken direkt in Osteoblasten oder Chondrozyten exprimiert werden und auf erhöhte Produktion von Kollagen oder Knochen gescreent werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren in Hautbiologie-Anwendungen von Nutzen. Die Keratinozyten-Reaktionen auf eine Reihe an Stimuli kann zu Psoriasis führen, einer proliferativen Veränderung in diesen Zellen. Kandidatenbibliotheken können in Zellen insertiert werden, die aus aktiven psoriatischen Plaques entfernt wurden, und bioaktive Peptide können isoliert werden, welche die Wachstumsgeschwindigkeit dieser Zellen verringern.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren bei der Regulation oder Inhibierung der Keloidbildung (d.h. übermäßige Narbenbildung) von Nutzen. Kandidatenbibliotheken, die in Haut-Bindegewebezellen insertiert sind, die aus Individuen mit diesem Zustand isoliert wurden, sowie bioaktive Peptide, die isoliert wurden und welche die Proliferation, Kollagenbildung oder die Prolininkorporation verringern. Resultate dieser Arbeit können auf die Behandlung der übermäßigen Narbenbildung, die auch bei Verbrennungspatienten auftritt, angewandt werden. Falls ein gemeinsames Peptid-Motiv im Kontext der Keloid-Arbeit gefunden wird, so kann es in großem Rahmen topisch verwendet werden, um die Vernarbung nach Verbrennungen zu verringern.
Auf ähnliche Art und Weise kann die Wundheilung bei diabetischen Geschwüren und anderen chronischen „nicht-heilenwollenden" Zuständen der Haut und der Extremitäten reguliert werden, und zwar durch das Bereitstellen zusätzlicher Wachstumssignale für Zellen, welche die Haut und die dermalen Schichten bevölkern. Wachstumsfaktor-Mimetika können tatsächlich für diesen Zustand sehr nützlich sein. Kandidatenbibliotheken können in Haut-Bindegewebezellen insertiert werden, und es können bioaktive Peptide isoliert werden, die das Wachstum dieser Zellen unter „rauen" Bedingungen, wie z.B. niedrigem Sauerstoffpartialdruck, niedrigem pH und der Gegenwart von entzündlichen Mediatoren, fördern.
Kosmetisch-pharmazeutische Anwendungen der vorliegenden Erfindung umfassen die Kontrolle der Melaninproduktion in Haut-Melanozyten. Ein natürlich vorkommendes Peptid, Arbutin, ist ein Tyrosinhydroxylase-Inhibitor, ein Schlüsselenzym bei der Melaninsynthese. Kandidatenbibliotheken können in Melanozyten insertiert werden, und bekannte Stimuli, welche die Synthese von Melanin erhöhen, können den Zellen zugeführt werden. Es können bioaktive Peptide isoliert werden, welche die Synthese von Melanin unter bestimmten Bedingungen inhibieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren in endokrinologischen Anwendungen von Nutzen. Das Verfahren der retroviralen Peptidbibliothek kann auf breiter Ebene auf ein beliebiges endokrines, Wachstumsfaktor-, Zytokin- oder Chemokin-Netzwerk angewandt werden, das ein Signalpeptid oder -protein involviert, das entweder auf eine endokrine, parakrine oder autokrine Art und Weise wirkt, die einen Rezeptor bindet oder dimerisiert und eine Signalkaskade aktiviert, die zu einem bekannten phänotypischen oder funktionellen Resultat führt. Die Verfahren werden so angewandt, dass ein Peptid isoliert wird, das entweder das gewünschte Hormon imitiert (d.h. Insulin, Leptin, Calcitonin, PDGF, EGF, EPO, GMCSF, IL1-17, Mimetika) oder seine Wirkung inhibiert, und zwar entweder durch Blockieren der Freisetzung des Hormons, Blockieren seiner Bindung an einen spezifischen Rezep tor oder ein spezifisches Trägerprotein (z.B. CRF-bindendes Protein) oder durch Inhibierung der intrazellulären Reaktionen auf die spezifischen Zielzellen auf dieses Hormon. Die Selektion von Peptiden, welche die Expression oder die Freisetzung von Hormonen aus den Zellen erhöhen, die sie normalerweise produzieren, könnte auf breiter Ebene Anwendung bei hormonalen Defizienz-Zuständen finden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren bei Anwendungen in Bezug auf Infektionskrankheiten von Nutzen. Virale Latenz (Herpes-Viren wie z.B. CMV, EBV, HBV und andere Viren wie etwa HIV) und ihre Reaktivierung sind ein signifikantes Problem, besonders bei Patienten mit unterdrückter Immunreaktion (AIDS-Patienten und Transplantations-Patienten). Die Fähigkeit, die Reaktivierung und Verbreitung dieser Viren zu blockieren, ist ein wichtiges Ziel. Zelllinien, die bekannterweise Viren in sich aufnehmen oder für latente virale Infektionen anfällig sind, können mit dem spezifischen Virus infiziert werden, und anschließend können diese Zellen gegenüber Stimuli ausgesetzt werden, von denen gezeigt wurde, dass sie zur Reaktivierung und viralen Replikation führen. Danach kann eine Messung der viralen Titer im Medium erfolgen sowie das Bewerten der Zellen auf phänotypische Veränderungen. Anschließend können Kandidatenbibliotheken unter den oben genannten Bedingungen in diese Zellen insertiert werden, und es können Peptide isoliert werden, die das Wachstum und/oder die Freisetzung des Virus blockieren oder verringern. Wie bei Chemotherapeutika können diese Experimente auch mit Arzneimitteln durchgeführt werden, die hinsichtlich dieses Resultats nur teilweise wirksam sind, und es können bioaktive Peptide isoliert werden, welche die viruzide Wirkung dieser Arzneimittel verstärken.
Ein Beispiel unter vielen ist die Fähigkeit, eine HIV-1-Infektion zu blockieren. HIV-1 benötigt CD4 und einen Co-Rezeptor, der einer von mehreren Sieben-Transmembran-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren sein kann. Im Fall der Infektion von Makrophagen ist CCR-5 der erforderliche Co-Rezeptor, und es gibt bedeutende Beweise dafür, dass eine Blockade von CCR-5 zu einer Resistenz gegen eine HIV-1-Infektion führt. Für diese Aussage gibt es zwei Beweislinien. Erstens ist es bekannt, dass die natürlichen Liganden für CCR-5, die CC-Chemokine RANTES, MIP1a und MIP1b, für die CD8+-vermittelte Resistenz gegen HIV verantwortlich sind. Zweitens sind Individuen, die für ein Mutantenallel von CCR-5 homozygot sind, vollständig gegen eine HIV-Infektion resistent. Daher wäre ein inhibitor der CCR-5/HIV-Wechselwirkung sowohl für Biologen als auch für Kliniker von enormem Interesse. Die extrazellulären verankerten Konstrukte bieten vorzügliche Werkzeuge für eine solche Entdeckung. In die Transmembran, epitopmarkierte, glycin-serin-gebundene Konstrukte (ssTM V G20 E TM), kann eine zyklisierte Zufallspeptidbibliothek der allgemeinen Sequenz CNNNNNNNNNNC oder C-(X)_n-C platziert werden. Anschließend wird eine Zelllinie, die CCR-5 exprimiert, mit Retroviren infiziert, die diese Bibliothek enthalten. Unter Verwendung eines Antikörpers für CCR-5 kann durch FACS eine Sortierung der gewünschten Zellen erreicht werden, und zwar basierend auf der Bindung dieses Antikörpers an den Rezeptor. Von allen Zellen, die nicht an den Antikörper binden, wird angenommen, dass sie Inhibitoren dieser Antikörper-Bindungsstelle enthalten. Diese Inhibitoren im retroviralen Konstrukt können weiter auf ihre Fähigkeit, das Eindringen von HIV-1 zu inhibieren, getestet werden.
Von Viren ist bekannt, dass sie unter Verwendung spezifischer Rezeptoren in Zellen eindringen, um an Zellen zu binden (z.B. verwendet HIV CD4, Coronavirus verwendet CD13, das murine Leukämie-Virus verwendet das Transportprotein, und das Masernvirus verwendet CD44) und um mit Zellen zu fusionieren (HIV verwendet den Chemokin-Rezeptor). Kandidatenbibliotheken können in Zielzellen insertiert werden, von denen bekannt ist, dass sie diesen Viren gegenüber permissiv sind, und es können bioaktive Peptide isoliert werden, welche die Fähigkeit dieser Viren blockieren, spezifische Zielzellen zu binden und mit diesen zu fusionieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung bei infektiösen Organismen verwendet. Intrazelluläre Organismen, wie z.B. Mycobacteria, Listeria, Salmonella, Pneumocystis, Yersinia, Leishmania, T. cruzi, können in Zellen bestehen und sich replizieren und bei Patienten mit unterdrückter Immunantwort aktiv werden. Derzeit sind Arzneimittel auf dem Markt und in Entwicklung, die gegen diese Organismen entweder nur teilweise wirksam oder unwirksam sind. Kandidatenbibliotheken können in spezifische Zellen insertiert werden, die mit diesen Organismen infi ziert sind (vor oder nach der Infektion), und es können bioaktive Peptide ausgewählt werden, welche die intrazelluläre Zerstörung dieser Organismen auf eine Art und Weise fördern, die analog zu den intrazellulären „Antibiotika-Peptiden" ähnlich zu Magaininen zu sehen ist. Zusätzlich dazu können Peptide ausgewählt werden, welche die ziden Eigenschaften von Arzneimitteln, die bereits untersucht werden, verstärken, die selbst nicht ausreichend stark sind, jedoch in Kombination mit einem spezifischen Peptid aus einer Kandidatenbibliothek durch einen Synergiemechanismus um Vieles wirksamer sind. Schließlich können bioaktive Peptide isoliert werden, die den Metabolismus dieser intrazellulären Organismen verändern, und zwar auf solch eine Art und Weise, dass ihr intrazellulärer Lebenszyklus durch Inhibierung eines bedeutenden Organismusvorkommnisses beendet wird.
Antibiotika, die auf breiter Ebene verwendet werden, weisen gewisse, dosisabhängige gewebespezifische Toxizitäten auf. Nierentoxizität ist z.B. bei der Verwendung von Gentamycin, Tobramycin und Amphotericin beobachtet worden; Hepatotoxizität ist bei der Verwendung von INH und Rifampin beobachtet worden; Knochenmarkstoxizität ist bei Chloramphenicol beobachtet worden, und Plättchentoxizität ist bei Ticarcillin etc. beobachtet worden. Diese Toxizitäten schränken ihre Verwendung ein. Kandidatenbibliotheken können in die spezifischen Zelltypen eingeführt werden, wo spezifische Veränderungen, die zu Zellschaden oder Apoptose durch die Antibiotika führen, herbeigeführt werden, und bioaktive Peptide können isoliert werden, die Schutz verleihen, wenn diese Zellen mit diesen spezifischen Antibiotika behandelt werden.
Weiters ist die vorliegende Erfindung beim Screening auf bioaktive Peptide von Nutzen, welche die antibiotischen Transportmechanismen blockieren. Die schnelle Sekretion gewisser Antibiotika aus dem Blutstrom schränkt ihren Nutzen ein. Penicilline werden z.B. durch gewisse Transportmechanismen in der Niere und dem Adergeflecht im Gehirn schnell sekretiert. Von Probenicid ist bekannt, dass es diesen Transport blockiert und die Serum- und Gewebespiegel erhöht. Kandidatenagenzien können in spezifische Zellen insertiert werden, die von Nierenzellen abstammen, und von Zellen des Adergeflechts ist bekannt, dass sie aktive Transportmechanismen für Antibiotika besitzen. Anschließend können bioaktive Peptide isoliert werden, die den aktiven Transport spezifischer Antibiotika blockieren und daher die Serumhalbwertszeit dieser Arzneimittel verlängern.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren bei Arzneimitteltoxizitäten und Arzneimittelresistenzanwendungen von Nutzen. Arzneimitteltoxizität ist ein signifikantes klinisches Problem. Dies kann sich als spezifischer Gewebe- oder Zellschaden zeigen, und zwar mit dem Resultat einer limitierten Wirksamkeit des Arzneimittels. Beispiele umfassen die Myeloablation bei hochdosierter Krebs-Chemotherapie, Schaden der Epithelzellen, die den Luftkanal und den Darm auskleiden, sowie Haarverlust. Spezifische Beispiele umfassen adriamycininduzierten Cardiomyocyten-Tod, cisplatinininduzierte Nierentoxizität, vincristininduzierte Darmmotilitätsstörungen sowie cyclosporininduzierten Nierenschaden. Kandidatenbibliotheken können in spezifische Zelltypen mit charakteristischen arzneimittelinduzierten phänotypischen oder funktionellen Reaktionen eingeführt werden, und zwar in Gegenwart der Arzneimittel, und es können Agenzien isoliert werden, die den spezifischen Zelltyp umkehren oder gegen die toxischen Veränderungen bei Aussetzen gegenüber dem Arzneimittel schützen. Diese Wirkungen können sich als Blockieren der arzneimittelinduzierten Apoptose der Zelle von Interesse zeigen, daher beschäftigen sich anfängliche Screenings mit dem Überleben der Zellen in Gegenwart hoher Arzneimittelmengen oder von Kombinationen von Arzneimitteln, die bei der Kombinations-Chemotherapie verwendet werden.
Arzneimitteltoxizität kann auf einen spezifischen Metaboliten zurückgeführt werden, der in der Leber oder in der Niere produziert wird, der für spezifische Zellen hochgradig toxisch ist, oder auf Arzneimittel-Wechselwirkungen in der Leber, die den Metabolismus eines verabreichten Arzneimittels blockieren oder verbessern. Kandidatenbibliotheken können nach dem Aussetzen dieser Zellen gegenüber dem Arzneimittel, von dem bekannt ist, dass es den toxischen Metaboliten produziert, in Leber- oder Nierenzellen eingeführt werden. Es können bioaktive Peptide isoliert werden, welche die Art und Weise verändern, in der die Leber- oder Nierenzellen das Arzneimittel metabolisieren, sowie auch spezifische Agenzien identifiziert werden können, welche die Erzeugung eines spezifischen toxischen Metaboliten verhindern. Die Erzeugung des Metaboliten kann von einer Massenspektrometrie gefolgt werden, und phänotypische Veränderungen können durch Mikroskopie untersucht werden. Solch ein Screening kann auch in gezüchteten Hepatozyten durchgeführt werden, die mit Readout-Zellen co-gezüchtet wurden, die besonders empfindlich auf den toxischen Metaboliten sind. Anwendungen umfassen reversible Inhibitoren (um die Toxizität einzuschränken) von Enzymen, die in den Arzneimittelmetabolismus involviert sind.
Mehrfache Arzneimittelresistenz und daher Tumorzellenselektion, -auswuchs und -rückfall führen zu Morbidität und Mortalität bei Krebspatienten. Kandidatenbibliotheken können in Tumorzelllinien (primär und gezüchtet) eingeführt werden, die eine spezifische oder mehrfache Arzneimittelresistenz gezeigt haben. Anschließend können bioaktive Peptide identifiziert werden, die eine Arzneimittelempfindlichkeit verleihen, wenn die Zellen gegenüber dem Arzneimittel von Interesse oder den Arzneimitteln, die in der Kombinations-Chemotherapie eingesetzt werden, ausgesetzt werden. Das Readout kann der Beginn der Apoptose in diesen Zellen sein, die Membranpermeabilitätsveränderungen, die Freisetzung von intrazellulären Ionen und fluoreszierenden Markern. Die Zellen, in denen eine Resistenz gegen mehrere Arzneimittel Membrantransporter umfasst, können mit fluoreszierenden Transportersubstraten vorbeladen werden, und es kann die Selektion für Peptide durchgeführt werden, welche den normalen Abfluss an fluoreszierendem Arzneimittel aus diesen Zellen blockieren. Kandidatenbibliotheken sind besonders für das Screening von Peptiden geeignet, die schlecht charakterisierte oder erst vor kurzem entdeckte intrazelluläre Resistenzmechanismen oder Mechanismen umkehren, für die es im Moment wenige oder keine Chemosensibilisatoren gibt, wie z.B. die Mechanismen, die LRP (Lungenresistenzprotein) involvieren. Dieses Protein wurde mit der Resistenz gegen mehrere Arzneimittel bei Eierstock-Karzinom, metastatischem malignem Melanom und akuter Myeloid-Leukämie in Verbindung gebracht. Besonders interessante Beispiele umfassen das Screening auf Agenzien, die mehr als einen wichtigen Resistenzmechanismus in einer einzigen Zelle umkehren, wobei dieser in einer Untergruppe der meisten arzneimittelresistenten Zellen auftritt, die auch bedeutende Ziele sind. Anwendungen würden das Screening auf Peptidinhibitoren von sowohl MRP (Multidrug-Resistance related Protein) als auch LRP für die Behandlung von resistenten Zellen bei metastatischem Melanom umfassen, auf Inhibitoren von sowohl p-Glycoprotein und LRP bei akuter Myeloid-Leukämie sowie auf die Inhibierung aller drei Proteine (durch einen beliebigen Mechanismus) zur Behandlung von pan-resistenten Zellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren bei der Verbesserung der Leistung existierender oder sich in Entwicklung befindlicher Arzneimittel von Nutzen. Der First-Pass-Metabolismus von oral verabreichten Arzneimitteln limitiert ihre orale Bioverfügbarkeit und kann zu einer verringerten Wirksamkeit sowie zur Notwendigkeit führen, mehr des Arzneimittels zu verabreichen, um eine gewünschte Wirkung zu erreichen. Reversible Inhibitoren von Enzymen, die in den First-Pass-Metabolismus involviert sind, können daher ein nützlicher Zusatz für Verbesserung der Wirksamkeit dieser Arzneimittel sein. Der First-Pass-Metabolismus tritt in der Leber auf, daher können Inhibitoren der korrespondierenden katabolischen Enzyme die Wirkung der verwandten Arzneimittel verbessern. Reversible Inhibitoren würden zur selben Zeit wie das Arzneimittel von Interesse angeliefert werden oder etwas davor. Das Screening von Kandidatenbibliotheken in Hepatozyten für Inhibitoren (durch einen beliebigen Mechanismus, wie z.B. die Protein-Herabregulierung sowie eine direkte Inhibierung der Aktivität) von besonders problematischen Isozymen wäre von Interesse. Diese umfassen die CYP3A4-Isozyme von Cytochrom P450, die in den First-Pass-Metabolismus der Anti-HIV-Arzneimittel Saquinavir und Indinavir involviert sind. Andere Anwendungen könnten reversible Inhibitoren von UDP-Glucuronyltransferasen, Sulfotransferasen, N-Acetyltransferasen, Epoxidhydrolasen und Glutathion-S-Transferasen inkludieren, in Abhängigkeit vom Arzneimittel. Screenings würden in gezüchteten Hepatozyten oder Leber-Mikrosomen durchgeführt werden und könnten Antikörper umfassen, welche die spezifische Modifikation erkennen, die in der Leber durchgeführt wird, oder aber co-gezüchtete Readout-Zellen, wenn der Metabolit eine andere Bioaktivität als das nicht transformierte Arzneimittel aufweisen würde. Die Enzyme, die das Arzneimittel modifizieren, müssten nicht notwendigerweise bekannt sein, wenn das Screening auf das Fehlen der Veränderung des Arzneimittels durchgeführt würde.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren in Immunbiologie-, Entzündungs- und allergischen-Reaktions-Anwendungen von Nutzen. Die selektive Regulation von T-Lymphozyten-Reaktionen ist ein gewünschtes Ziel, um immunvermittelte Erkrankungen auf eine spezifische Art und Weise zu modulieren. Kandidatenbibliotheken können in spezifische T-Zellen-Untergruppen eingeführt werden (TH1, TH2, CD4+, CD8+ und andere), und die Reaktionen, die diese Untergruppen charakterisieren (Zytokin-Erzeugung, Zytotoxizität, Proliferation in Reaktion auf ein Antigen, das von einem mononuklearen Leukozyt präsentiert wird, und andere), können durch Mitglieder der Bibliothek modifiziert werden. Es können Agenzien ausgewählt werden, welche die bekannte physiologische Reaktion der T-Zellen-Untergruppe steigern oder verringern. Dieser Ansatz ist bei einer beliebigen Anzahl an Bedingungen von Nutzen, unter anderem: 1) Autoimmunerkrankungen, wo man einen Toleranzzustand induzieren möchte (Auswahl eines Peptids, das die T-Zellen-Untereinheit an der Erkennung einer selbst-antigentragenden Zelle hemmt); 2) allergische Erkrankungen, bei denen man die Stimulierung von IgE-produzierenden Zellen verringern möchte (Auswahl eines Peptids, das die Freisetzung spezifischer B-Zellen-stimulierender Zytokine von T-Zellen-Subsets blockiert, die eine Umschaltung auf die IgE-Produktion induzieren); 3) bei Transplantationspatienten, bei denen eine selektive Immunsuppression induziert werden soll (Auswahl eines Peptids, das die proliferativen Reaktionen von Wirts-T-Zellen gegenüber fremden Antigenen verringert); 4) bei lymphoproliferativen Zuständen, bei denen man das Wachstum eines spezifischen T-Zellen-Tumors inhibieren möchte oder diesen für die Chemotherapie und/oder Bestrahlung empfindlich machen möchte; 5) bei der Tumorüberwachung, wo das Abtöten von zytotoxischen T-Zellen durch Fas-Ligand-tragende Tumorzellen inhibiert werden soll; und 5) bei T-Zellen-vermittelten Entzündungserkrankungen, wie z.B. rheumatoider Arthritis, Bindegewebserkrankungen (SLE), Multipler Sklerose und Reizdarm-Erkrankungen, bei denen die Proliferation von krankheitsauslösenden T-Zellen inhibiert werden soll (Förderung ihrer selektiven Apoptose) und die resultierende selektive Zerstörung von Zielgeweben (Knorpel, Bindegewebe, Oligodendrozyten bzw. Darm-Endothelzellen).
Die Regulierung von B-Zellen-Reaktionen erlaubt eine stärker selektive Modulierung des Typs und der Menge von Immunglobulin, die von spezifischen B-Zellen-Untereinheiten hergestellt und sekretiert wird. Kandidatenbibliotheken können in B-Zellen insertiert werden, und bioaktive Peptide können ausgewählt werden, welche die Freisetzung und die Synthese eines spezifischen Immunglobulins inhibieren. Dies kann bei Autoimmunerkrankungen von Nutzen sein, die durch die Überproduktion von Auto-Antikörpern und die Produktion von allergiehervorrufenden Antikörpern, wie z.B. IgE, charakterisiert sind. Es können auch Agenzien identifiziert werden, welche die Bindung einer spezifischen Immunglobulin-Unterklasse an ein spezifisches Antigen (entweder fremd oder Selbst-Antigen) inhibieren oder verstärken. Schließlich können Agenzien ausgewählt werden, welche die Bindung einer spezifischen Immunglobulin-Unterklasse an ihren Rezeptor auf spezifischen Zelltypen inhibieren.
Auf ähnliche Art und Weise können Agenzien ausgewählt werden, welche die Zytokin-Produktion beeinflussen, und zwar im Allgemeinen unter Verwendung von Zwei-Zellsystemen. Es kann z.B. die Zytokinproduktion von Makrophagen, Monozyten etc. evaluiert werden. Auf ähnliche Art und Weise können Agenzien ausgewählt werden, die Zytokine imitieren, z.B. Erythropoietin und IL1-17, oder aber Agenzien, die Zytokine binden, wie z.B. TNF-α, bevor sie ihren Rezeptor binden.
Die Antigenverarbeitung durch mononukleare Leukozyten (ML) ist ein wichtiger früher Schritt in der Fähigkeit des Immunsystems, fremde Proteine zu erkennen und zu eliminieren. Kandidatenagenzien können in ML-Zelllinien insertiert werden, und es können Agenzien ausgewählt werden, welche die intrazelluläre Verarbeitung fremder Peptide und die Sequenz des fremden Peptids verändern, das den T-Zellen durch MLs auf ihrer Zelloberfläche im Kontext der Klasse-II-MHC präsentiert wird. Man kann nach Mitgliedern der Bibliothek suchen, welche die Immunreaktionen einer spezifischen T-Zellen-Subgruppe verbessern (das Peptid würde z.B. tatsächlich als eine Vakzine funktionieren), oder man kann nach einem Mitglied der Bibliothek suchen, das enger an MHC bindet und dadurch natürlich auftretende Peptide verdrängt, trotzdem wäre das Agens jedoch weniger immunogen (weniger stimulierend für einen spezifischen T-Zellen-Klon). Dieses Agens würde tatsächlich eine Immunto leranz induzieren und/oder Immunreaktionen gegenüber fremden Proteinen verringern. Dieser Ansatz könnte bei Transplantationen, Autoimmunerkrankungen und allergischen Erkrankungen verwendet werden.
Die Freisetzung von Entzündungsmediatoren (Zytokinen, Leukotrienen, Prostaglandinen, plättchenaktivierendem Faktor, Histamin, Neuropeptiden und anderen Peptid- und Lipidmediatoren) ist ein wichtiges Element beim Erhalt und der Amplifikation von abnormalen Immunreaktionen. Kandidatenbibliotheken können in MLs, Mastzellen, Eosinophile und andere Zellen, die an einer spezifischen Entzündungsreaktion beteiligt sind, insertiert werden, und es können bioaktive Peptide ausgewählt werden, welche die Synthese, Freisetzung und Bindung an den verwandten Rezeptor eines jeden dieser Typen von Mediatoren inhibieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorliegenden Verfahren bei biotechnologischen Anwendungen von Nutzen. Die Kandidatenbibliotheksexpression in Säugetierzellen kann auch für andere pharmazeutisch verwandte Anwendungen in Betracht gezogen werden, z.B. für die Modifikation der Proteinexpression, die Proteinfaltung oder die Proteinsekretion. Ein solches Beispiel wäre bei der kommerziellen Produktion von Protein-Pharmazeutika in CHO- und anderen Zellen. Kandidatenbibliotheken, die zu bioaktiven Peptiden führen, die für eine erhöhte Zellwachstumsrate (vielleicht Peptide, die Wachstumsfaktoren imitieren oder als Agonisten von Wachstumsfaktor-Signalübertragungswegen agieren), für Pathogen-Resistenz (siehe vorherigen Abschnitt), für das Fehlen der Sialylierung oder Glykosylierung (durch Blockieren der Glycotransferasen oder das Umleiten des Handels mit dem Protein in der Zelle), für das Ermöglichen des Wachstums auf Autoklav-Medien oder für das Wachstum in serumfreien Medien selektieren, würden alle die Produktivität erhöhen und die Kosten der Produktion von Protein-Pharmazeutika verringern.
Zufallspeptide, die auf der Oberfläche von zirkulierenden Zellen dargestellt werden, können als Werkzeuge verwendet werden, um organ-, gewebe- und zellspezifische Peptid-Targetingsequenzen zu identifizieren. Jede beliebige Zelle, die in den Blutstrom eines Tiers eingeführt wird, das eine Bibliothek exprimiert, die auf die Zellober fläche abzielt, kann für das spezifische Abzielen auf spezifische Organe und Gewebe ausgewählt werden. Die identifizierte bioaktive Peptidsequenz kann dann an einen Antikörper, ein Enzym, ein Arzneimittel, ein bildgebendes Agens oder eine Substanz gekoppelt werden, für die ein Organ-Abzielen gewünscht wird.
Andere Agenzien, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden können, umfassen: 1) Agenzien, welche die Aktivität von Transkriptionsfaktoren blockieren, unter Verwendung von Zelllinien mit Reportergenen; 2) Agenzien, welche die Wechselwirkung von zwei bekannten Proteinen in Zellen blockieren, unter Verwendung des Fehlens normaler zellulärer Funktionen, der Säugetier-Zwei-Hybrid-System- oder der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Mechanismen zur Detektion; und 3) es können Agenzien durch Bindung eines Zufallspeptids an eine Proteinbindungsregion identifiziert werden, um Wechselwirkungen mit Molekülen zu ermöglichen, die sterisch nahe sind, d.h. innerhalb eines Signalwegs, um die Wirkungen auf ein funktionelles Gebiet von Interesse zu lokalisieren.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Art und Weise der Verwendung der oben beschriebenen Erfindung ausführlicher zu beschreiben, sowie dazu, die besten in Betracht gezogenen Modi zur Durchführung verschiedener Aspekte der Erfindung darzulegen. Es ist anzumerken, dass diese Beispiele auf keine Art und Weise dazu dienen, den tatsächlichen Umfang dieser Erfindung einzuschränken, sondern stattdessen zum Zweck der Veranschaulichung dargestellt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Auswahl der Schleifen-Insertionsstellen
Ein Beispiel betrifft die Insertion von Sequenzen mit der Zusammensetzung Linker-Testsequenz-Linker in definierte Stellen innerhalb gentechnisch veränderter GFP-Schleifen, die mit der größten Wahrscheinlichkeit Insertionen tolerieren. Diese Schleifen wurden basierend auf ihrer Mobilität in der Schleife oder der Spitze der Schleife ausgewählt, die weit über jener der starrsten Abschnitte der β-Fass-Struktur liegt (Yang et al., Nature Biotechnology 14, 1246-9 (1996); Ormo et al., Science 273, 1392-5 (1996)). Die Schleifen, die das meiste Interesse erwecken, sind jene, die nicht starr an die β-Fass-Struktur des Rests von GFP gekoppelt sind; dieses Fehlen einer starren Kopplung kann die meiste Toleranz für Sequenzadditionen innerhalb der Schleifen in einem Bibliothekskonstrukt ermöglichen. Schleifen können als jene ausgewählt werden, welche die höchsten Temperaturfaktoren in den Kristallstrukturen aufweisen, und umfassen die Schleifen 130-135, 154-159, 172-175, 188-193 und 208-216 in einem GFP-Monomer. Der Temperaturfaktor der Schleife kann durch das Inkludieren flexibler Aminosäuren, wie z.B. Glycin, in die Linker (siehe unten) künstlich erhöht werden.

Die vielversprechendsten Insert-Stellen wurden durch Entfernen von Resten an den Termini der Schleifen ausgewählt, deren Seitenketten sich in die Lösung erstreckten und weder das GFP-β-Fass noch andere Teile der Schleife kontaktierten. Schleifenreste, deren Seitenketten an andere Teile von GFP banden, wurden nicht ersetzt, um die Wahrscheinlichkeit einer starken Konformationskopplung zwischen den Zufallssequenzen und GFP zu minimieren, die zu fehlgefalteten Proteinen führen könnte und/oder die Anzahl an fluoreszierenden GFP-fusionierten Zufallspeptiden durch Verzerrung des unteren Teils der Schleife und Ermöglichen des Zugangs von Kollisions-Quenchern zum Fluorophor verringern könnte.

Schleife	Insert-Position
1	Ersetzen von asp133 mit Insert; glu132 kann nicht entfernt werden, da Carboxylat an andere Rest-Seitenketten bindet; dies ist eine sehr kurze Kette
2	Ersetzen von gln157 und lys156 mit dem gesamten Insert: lys156- und gln157-Seitenketten stehen in die Lösung hinein; lys158 ionenpaart mit asp155, um zu helfen, die Schleife zu schließen, so dass diese im Allgemeinen beibehalten werden; Vermeiden der Entfernung von asn159, da es den Hauptproteinkörper an einer Reihe an Stellen kontaktiert
3	Ersetzen von asp173 mit dem Insert, da es sich am äußeren Ende der Schleife befindet; Vermeiden der Entfernung von glu172, da die Seitenkette andere Seitenketten in der gefalteten Struktur kontaktiert; könnte auch gly174 ersetzen
4	Ersetzen der Reste 189-192 (gly-asp-gly-pro) mit dem Insert; dabei handelt es sich nicht so sehr um eine Schleife als um einen Strang, der zwei getrennte Ketten verbindet; P192, G191, D190 und G189 stehen alle in die Lösung hinein und scheinen keine engen Kontakte mit dem Hauptproteinkörper zu bilden; so erscheinen sie ersetzbar zu sein
5	Ersetzen von asn212, glu213 und lys214 mit dem Insert; lys214-Seitenketten stehen in die Lösung hinaus; glu213 hilft dabei, die Schleife zu bilden, da seine Seitenketten andere Seitenketten in der Schleife binden, daher kann sein Ersatz zu Problemen bei der Beibehaltung einer nativen Schleifenkonformation führen; asn212-Seitenkette steht in die Lösung vor

Beispiel 2
Auswahl einer Test-Insert-Sequenz
Um es einer Maximalanzahl verschiedener Schleifen-Inserts oder Ersetzungen in GFP zu ermöglichen, sich korrekt in ein fluoreszierendes GFP-Konstrukt zu falten, kann es von Bedeutung sein, die Linker-Sequenzen zwischen der nativen GFP-Struktur und den insertierten Sequenzen, aus denen die tatsächliche Bibliothek besteht, die in die Schleife insertiert ist, vorsichtig auszuwählen. Eine Art und Weise, Probleme bei der GFP-Faltung zu verhindern, besteht darin, jegliche Insert-Sequenz von der GFP-Struktur selbst konformationell zu entkoppeln, um lokale Verzerrungen in der GFP-Struktur zu minimieren, die entweder Faltungs-Zwischenprodukte destabilisieren könnten oder exogenen Kollisions-Fluoreszenz-Quenchern Zugang zu dem verborgenen GFP-Tripeptid-Fluorophor ermöglichen könnte (Phillips, s.o.). Dies kann durch Insertieren mehrerer hochgradig flexibler Aminosäurereste zwischen GFP und der Bibliothek erreicht werden, die GFP minimale Konformationseinschränkungen auferlegen. Ein oder mehrere Glycine sind für diesen Zweck ideal, da Glycin zu signifikant mehr phi-psi-Raum Zugang hat als dies sogar bei Alanin der Fall ist und viel weniger eingeschränkt ist als Reste mit längeren Seitenketten (H.A. Scheraga, Predicting three-dimensional structures of Oligopeptides, in: Reviews in Computational Chemistry III, 73-142 (1992)). Um daher die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass die Schleifen-Inserts die GFP-Struktur nicht beeinflussen, wird -(gly)_n- zwischen diese beiden Sequenzen an jeder Schleife, die eine Bibliothek enthält, insertiert. Im Minimalfall ist n = 1, optimaler wäre jedoch n ≥ 2.
Die anfänglichen zwei Test-Inserts waren: 1: -GGGGYPYDVPDYASLGGGG- und 2: -GGGG-YPYD-GGGG-. Die erste Sequenz war ein 19mer-Insert (etwa die angestrebte Bibliotheksgröße), wobei die Influenza-Hämagglutinin-(HA-)Epitopmarkierung eingebettet ist, weiters wurden Glycine an jedes Ende hinzugefügt, um mit dem in das Dimerisierer-gefaltete Gerüst insertierte Epitop übereinzustimmen und um dem Epitop Flexibilität zu geben, um eine Konformation zu ermöglichen, die an polyklonale Antisera bindet. Dies ermöglichte eine Schätzung des Expressionsausmaßes der verschiedenen Konstrukte durch Western-Blotting. Das zweite Insert ist trunkiert, um die Wirkung eines kürzeren Peptids auf die GFP-Fluoreszenz zu untersuchen.
Beispiel 3
Durchschnittliche Fluoreszenz von GFP mit Test-Inserts 1 und 2 in den Schleifen 1-5, exprimiert in E. coli

Das verwendete GFP ist EGFP (Clontech Inc., Palo Alto, CA), und die beiden Testsequenzen wurden an den in Beispiel 1 angegebenen Stellen insertiert. Eine gleiche Anzahl an Bakterien (20000), die Klone einer einzigen Kolonie darstellten, wurden mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung auf einem Mo-Flo-Zellsortierer analysiert (Cytomation Inc., Ft. Collins, CO). Die Intensität von FL1 wurde der gemittelt. Die re lative Fluoreszenz-Intensität wurde als (WT-Fluoreszenz – Fluoreszenz des Schleifen-Inserts)/(WT-Fluoreszenz – bkd) × 100 % berechnet. Konstrukte mit Insert 1 in den Schleifen 1 und 5 wurden aufgrund von Klonierungsschwierigkeiten nicht exprimiert. Gleiche Mengen an Zelllysat von jedem Schleifen-Insert wurden auf einem 10-SDS-Gel laufen gelassen und an PVDF geblottet. GFP wurde mit Anti-GFP-Antikörper detektiert, und die Banden wurden unter Verwendung von chemilumineszierender Detektion beobachtet. Die Intensität der einzelnen Banden wurde unter Verwendung eines Sharp-JX-330-Scanning-Densitomers und Biolmage-Software gemessen. Die spezifische Fluoreszenz wurde als das Verhältnis der relativen Fluoreszenz zu der relativen Intensität der Western-Blot-Bande berechnet. Tabelle 1: Mittlere Fluoreszenz von GFP mit verschiedenen Insertionssequenzen in den Schleifen 1-5

	Relative Fluoreszenz		Relative Intensität: Western		Spezifische Fluoreszenz
Schleife	Insert 2	Insert 1	Insert 2	Insert 1	Insert 2	Insert 1
	12mer	19mer
Wildtyp (kein Insert)	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00
Hintergrund	0	0
1	0	–	0,179	–	0	–
2	0,198	0,10	0,165	0,189	1,20	0,53
3	0,612	0,399	0,467	0,68	1,3	0,59
4	0,119	0,034	0,135	0,0196	0,88	1,73
5	0	–	0,159	–	0	–

Insert 1: -GGGG-YPYDVPDYASL-GGGG- 2: -GGGG-YPYD-GGGG-

Die Resultate in Tabelle 1 zeigen, dass in E. coli die definierten Schleife-2-, -3- und -4-Insertionsstellen die GFP-Faltung und die Fluoreszenz sowohl für die 12mer- als auch die 19mer-Inserts unterstützen, während die Inserts an den Stellen 1 und 5 die Expression von GFP ohne Fluoreszenz für das 12mer-Insert ermöglichen. Bibliotheken an diesen Stellen können daher für das Screening unter Verwendung anderer Verfahren zur Auswahl von Positiven als die GFP-Fluoreszenz von Nutzen sein. Für die Insertionsstellen 2, 3 und 4 beträgt die Fluoreszenz für ein 12mer-Insert mit mehrfachen Glycinen an jedem Ende zumindest 10 % jener des Wildtyp-GFP. Die höchste Fluoreszenz für das 12mer-Insert wurde mit der Insertion in die Schleife-3-Stelle erhalten, während die niedrigste aus Schleife 4 erhalten wurde. Dies schien auf unterschiedliche Expressionsausmaße für jedes Konstrukt zurückzuführen zu sein. Für das größere 19mer-Insert wurde die höchste Fluoreszenz erneut mit der Insertion an der Schleife-3-Stelle erhalten, während die geringste durch die Insertion in die Schleife-2-Stelle erhalten wurde, wiederum aufgrund höherer sichtbarer Expressionsausmaße für das Schleife-3-Insert-GFP. Die höchste spezifische Fluoreszenz wurde wiederum mit Schleife 4 erhalten. Dies deutet darauf hin, dass Bibliotheken, die in Schleife 4 insertiert wurden, zusammen mit starken Promotoren, um die exprimierten Mengen der GFP-Bibliotheksmitglieder zu erhöhen, ein Screening dieser Bibliotheken sowie Schleife-2- und -3-Bibliotheken ermöglichen. Für die 19mer-Insert-Sequenz ergeben die Schleife-2-, -3- und -4-Inserts alle eine Fluoreszenz von zumindest 1 % des Wildtyps und sollten daher das Screening der Bibliotheken in allen drei Schleifen ermöglichen.
Die Western-Blot-Resultate zeigen, dass kürzere Inserts in den Schleifen 1 und 5 eine GFP-Expression in Ausmaßen ermöglichen, die genauso hoch sind oder höher als jene von Schleife 2 und 4 sind, wenn auch ohne Fluoreszenz. Daher können Zufallspeptid-Bibliotheken, die in diese Schleifen insertiert sind, verwendet werden, um Zellen auf phänotypische Veränderungen zu screenen, das Screening auf die Gegenwart des Bibliotheksmitglieds muss jedoch auf einer anderen beliebigen Eigenschaft als die GFP-Fluoreszenz basieren, wie z.B. ein Readout, das eine Phänotyp-Veränderung in der Zelle selbst reflektiert.
Beispiel 4
Mittlere Fluoreszenz von GFP mit den Test-Inserts 1 und 2 in den Schleifen 2-4 bei Expression in Jurkat-E-Zellen
Insertsequenzen, die mit den in Beispiel 3 oben gezeigten identisch sind, wurden mit GFP bei Expression in Jurkat-E-Zellen verwendet. GFP wurde unter Verwendung des LTR des retroviralen Expressionsvektors exprimiert, und die Jurkats wurden unter Verwendung von Phoenix-293-Helferzellen infiziert. 48 Stunden nach der Infekti on wurden die Jurkats einer FACS-Analyse unterzogen, und zwar unter Verwendung eines Becton-Dickinson-FACSCAN-Zellsortierers. Für jedes Insert wurden 10⁴ Zellen unter Verwendung von Forward- vs. Side-Scatter-Selektion gegatet, um lebende Zellen zu isolieren. Lebende Zellen wurden in einer zweiten Runde unter Verwendung von Propidiumiodid-Fluoreszenz ausgewählt und anschließend in FL1 auf die Intensität ihrer GFP-Fluoreszenz hin sortiert. Die Infektionsausmaße der Jurkat-Zellen mit den unterschiedlichen Konstrukten lagen im Bereich von 30,1%-44,9 %, was durchschnittlich ein Peptidkonstrukt ergab, das pro Zelle insertiert wurde. Tabelle 2: Mittlere geometrische Fluoreszenz von GFP mit unterschiedlichen Insertionssequenzen in den Schleifen 2-4: Jurkat-Zellen.

Relative Fluoreszenz

Schleife Insert 2 Insert 1

12mer 19mer

Wildtyp (kein Insert) 1,00 1,00

Hintergrund 0,000625 0,00625

2 0,324 0,088

3 1,01 0,254

4 0,188 0,0625

Insert 1: -GGGG-YPYDVPDYASL-GGGG-
Insert 2: -GGGG-YPYD-GGGG-

Diese Resultate zeigen, dass die kreierten Insertionsstellen in den Schleifen 2-4 ein hohes Ausmaß an GFP-Fluoreszenz beibehalten, wenn die Inserts von multiplen Glycinen in den Tetrapeptid-Linkern flankiert werden. Daher scheint ein Insert von 19 Resten hohe Ausmaße an Fluoreszenz beizubehalten, was darauf hindeutet, dass alle drei Schleifen eine Insertion von Zufallspeptidbibliotheken und ihr Screening ermöglichen. Solch ein Screening sollte nur ein Ausmaß an Fluoreszenz erfordern, das vom Hintergrund unterscheidbar ist, oder eine Größenordnung höher in FL1.
Die erfolgreiche Beobachtung der Fluoreszenz von beinahe 10 % oder mehr des Wildtyps in GFP mit beiden Sequenzen in der Schleife-2-Insertionsstelle wurde von Abedi et al. (1998) nicht festgestellt, was darauf hindeutet, dass die Inklusion der Glycinlinker auf jeder Seite der Insertsequenz zusammen mit der Ausschneidung von Resten an der Spitze der Schleife diese Schleife zu einer einzigartigen und nützlichen Stelle zur Insertion von Zufallsbibliothekssequenzen machen kann. Das hohe Ausmaß an relativer Fluoreszenz für Inserts 1 und 2 in den Schleifen 2-4 deutet darauf hin, dass die Tetraglycin-Linker eine erfolgreiche Insertion von Zufallspeptid-Bibliotheken in diese besonderen Stellen ermöglichen; kürzere Bibliotheken können bevorzugt werden.
Beispiel 5
Mittlere Fluoreszenz von GFP mit Test-Inserts 1 und 2 in Schleifen 2-4 bei Expression in Phoenix-293-Zellen

Insertsequenzen, die mit den in Beispiel 3 oben gezeigten identisch sind, wurden mit GFP bei der Expression in Phoenix-293-Zellen verwendet. GFP wurde unter Verwendung des 96.7-CMV-promotorgesteuerten retroviralen CRU-5-Expressionsvektors in transfizierten Phoenix-293-Zellen exprimiert. Die Transfektionswirksamkeit lag bei 40-45 %. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Phoenix-293-Zellen einer FACS-Analyse unterzogen, und zwar unter Verwendung eines Becton-Dickinson-FACSCAN-Zellsortierers. Für jedes Insert wurden etwa 10⁴ Zellen unter Verwendung von Forward- vs. Side-Scatter-Selektion gegatet, um lebende Zellen zu isolieren. Lebende Zellen wurden in einer zweiten Runde unter Verwendung von Propidiumiodid-Fluoreszenz ausgewählt und anschließend in FL1 auf die Intensität ihrer GFP-Fluoreszenz hin sortiert. Die Transfektionswirksamkeit für alle Konstrukte, über die berichtet wurde, lag im Bereich von 24-42 %, was durchschnittlich ein Plasmid/Zelle ergab, welche das GFP-Konstrukt exprimiert. Tabelle 3: Mittlere Geometrische Fluoreszenz von GFP mit unterschiedlichen Insertionssequenzen in Schleifen 2-4: Phoenix-293-Zellen

	Relative Fluoreszenz		Relative Intensität: Western		Spezifische	Fluoreszenz
Schleife	Insert 2	Insert 1	Insert 2	Insert 1	Insert 2	Insert 1
	12mer	19mer
Wildtyp (kein Insert)	1,00 ± 0,078	1,00 ± 0,078	1,00	1,00	1,00	1,00
Hintergrund	0,00	0,00	0	0
2	1,07 ± 0,18*	0,676 ± 0,078	0,44	0,40	2,43	1,69
3	1,32 ± 0,12*	0,471 ± 0,055	0,69	0,99	1,91	0,48
4	0,51 ± 0,08	0,422 ± 0,071	0,36	0,19	1,42	2,22

Insert 1: -GGGG-YPYDVPDYASL-GGGG- 2: -GGGG-YPYD-GGGG-

Die Zahlen für die relative Fluoreszenz der Schleife-2-, -3- und -4-Inserts stammen vom Mittelwert ± 1 Standardabweichung für 1-2 unabhängige Klone mit dem spezifischen Insert. Die spezifische Fluoreszenz ist das Verhältnis der relativen Fluoreszenz zu der relativen Western-Blot-Intensität. Die Standardabweichung der relativen Fluoreszenz wurde als [Fluoreszenz des Inserts/Fluoreszenz von WT {(Std.-Abweichung der Insert-Fluoreszenz/Insert-Fluoreszenz)² + (Std.-Abweichung der WT-Fluoreszenz/WT-Fluoreszenz)²}]^0,5 berechnet (P. Bevington, Data reduction and error analysis for the physical sciences, McGraw Hill, 61-2, New York (1969)). Daten mit einem Sternchen* stammten von Zellen mit einer Transfektionswirksamkeit von 60-70 % ab und können daher nur qualitativ mit dem Rest der Daten verglichen werden.
Diese Resultate für 293-Zellen zeigen, dass in diesen Zellen die kreierten Insertionsstellen in den Schleifen 2-4 ein sehr hohes Ausmaß an GFP-Fluoreszenz beibehalten, wenn die Inserts von mehrfachen Glycinen in den Tetrapeptid-Linkern flankiert werden, in einigen Fällen höher als die Wildtyp-GFP-Fluoreszenz. Daher behalten sowohl Inserts mit 19 als auch 12 Resten hohe Ausmaße an Fluoreszenz bei, was darauf hindeutet, dass alle drei Schleifen die Insertion von Zufallspeptid-Bibliotheken und ihr Screening ermöglichen und dass Bibliotheken in allen drei Schleifen im Gro ßen und Ganzen äquivalent sind. Das hohe Ausmaß an relativer Fluoreszenz von Schleife 3 scheint hauptsächlich auf ein höheres Expressionsausmaß als das GFP-Konstrukt mit Inserts in den Schleifen 1 und 2 zurückzuführen sein, obwohl die Expressionsmengen von allen 3 Schleifen-Inserts zumindest 19 % der Wildtyp-GFP-Mengen ausmachen. Da die spezifische Fluoreszenz von beiden Inserts in den Schleifen 2 und 4 größer ist als das Insert in Schleife 3 könnte ein höheres Expressionsausmaß für das allgemein geringere Ausmaß der Fluoreszenz dieser Schleife-2- und -4-Inserts kompensieren. Da die Expression dieser Konstrukte mit einem stärkeren Promotor als die Expression in E.-coli- oder Jurkat-Zellen erfolgt, deutet dies auch darauf hin, dass die Verwendung von stärkeren Promotoren als die retrovirale LTR oder der Promotor in E. coli mehr Schleifeninsertionsstellen für Screenings nutzbar macht.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Bibliothek von Fusionsproteinen, wobei jedes Fusionsprotein Folgendes umfasst: (a) ein autofluoreszierendes Protein, das ein Renilla-GFP, ein Aequorea-GFP oder eine fluoreszierende Variante eines Aequorea-GFP ist; (b) ein Peptid; sowie (c) zumindest einen flexiblen Linker, der -(gly)n- umfasst, worin n ≥ 2 ist, und zwar zwischen dem Peptid und zumindest einem Abschnitt des autofluoreszierenden Proteins; worin der flexible Linker an einen N-Terminus oder einen C-Terminus des autofluoreszierenden Proteins fusioniert ist oder das Peptid und der zumindest eine flexible Linker in eine Schleifenstruktur des autofluoreszierenden Proteins insertiert ist; und worin das autofluoreszierende Protein seine Fähigkeit, zu fluoreszieren, beibehält.
Bibliothek von Fusionsproteinen nach Anspruch 1, worin der zumindest eine flexible Linker Folgendes umfasst: GQGGG, GQAGGGG, GGGG, (GSGGS)n, oder (GGGS)n, worin n ≥ 1 ist.
Bibliothek von Fusionsproteinen nach Anspruch 1, worin es sich beim autofluoreszierenden Protein um ein grünfluoreszierendes (GFP) Aequorea-Protein, ein verstärktes GFP (EGFP), ein blaufluoreszierendes Protein (BFP), ein verstärktes gelbfluoreszierendes Protein (EYFP) oder ein Renilla-GFP handelt.
Bibliothek von Fusionsproteinen nach Anspruch 1, umfassend einen zweiten Linker, wobei sich jeder der flexiblen Linker zwischen dem Peptid und dem autofluoreszierenden Protein befindet.
Bibliothek von Fusionsproteinen nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, worin das Peptid ein zufällig ausgewähltes Peptid umfasst.
Bibliothek von Fusionsproteinen nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, worin das Peptid eine Präsentationsstruktur umfasst.
Bibliothek von Fusionsproteinen nach Anspruch 6, worin die Präsentationsstruktur aus einer Dimerisationssequenz, einer Minikörperstruktur, einer Schleife auf einer β-Schleifen-Struktur oder einem Doppelwendel-Stammbereich, einer Zink-Finger-Domäne, einer cysteingebundenen (Disulfid-)Struktur, einer transglutaminasegebundenen Struktur, einem zyklischen Peptid, einer β-Schleifen-Struktur, einer/einem Helix-Tonne oder -Bündel und einem Leucin-Zipper-Motiv ausgewählt ist.
Bibliothek von Fusionsproteinen nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, worin das autofluoreszierende Protein ein grünfluoreszierendes Protein (GFP) ist.
Bibliothek von Fusionsproteinen nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, worin das GFP aus Aequorea stammt und worin das Peptid in die die Aminosäuren 130 bis 135 des GFP umfassende Schleife insertiert ist.
Bibliothek von Fusionsproteinen nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, worin das GFP aus Aequorea stammt und worin das Peptid in die die Aminosäuren 154 bis 159 des GFP umfassende Schleife insertiert ist.
Bibliothek von Fusionsproteinen nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, worin das GFP aus Aequorea stammt und worin das Peptid in die die Aminosäuren 172 bis 175 des GFP umfassende Schleife insertiert ist.
Bibliothek von Fusionsproteinen nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, worin das GFP aus Aequorea stammt und worin das Peptid in die die Aminosäuren 188 bis 193 des GFP umfassende Schleife insertiert ist.
Bibliothek von Fusionsproteinen nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, worin das GFP aus Aequorea stammt und worin das Peptid in die die Aminosäuren 208 bis 216 des GFP umfassende Schleife insertiert ist.
Bibliothek von Fusionsproteinen nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, worin das GFP von einer Renilla-Spezies stammt.
Bibliothek von Fusionsnucleinsäuren, die für die Bibliothek von Fusionsproteinen nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche kodiert.
Bibliothek von Expressionsvektoren, umfassend die Fusionsnucleinsäuren nach Anspruch 15.
Bibliothek von Expressionsvektoren nach Anspruch 16, worin es sich bei den Vektoren um retrovirale Vektoren handelt.
Bibliothek von Wirtszellen, umfassend die Fusionsnucleinsäuren nach Anspruch 15.
Verfahren zum Screenen auf ein bioaktives Peptid, das einen bestimmten zellulären Phänotyp verleiht, umfassend: a) das Bereitstellen von Zellen, wobei jede Zelle eine Nucleinsäure der Bibliothek von Fusionsnucleinsäuren nach Anspruch 15 enthält, und zwar unter Bedingungen, unter denen die Nucleinsäuren exprimiert werden; sowie b) das Screening dieser Zellen auf eine Zelle mit einem identifizierbaren Phänotyp, worin der Phänotyp das Resultat der Expression der Nucleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin das Bereitstellen durch die Transfektion der Zellen mit der Expressionsvektor-Bibliothek nach Anspruch 16 oder Anspruch 17 erreicht wird.