JP2000511050A

JP2000511050A - 機能性分子表面の生成、スクリーニング、および展開のための新規の合成タンパク質の構造の鋳型

Info

Publication number: JP2000511050A
Application number: JP09541632A
Authority: JP
Inventors: シュタイペ，ボリス; ブルーン，ハインケ; フンク，マルティーン; ヘンケル，トーマス
Original assignee: メディジーン・アクチェンゲゼルシャフト; ボリス・シュタイペ
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 2000-08-29
Also published as: WO1997045538A1; EP0912728A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般に、新規な結合または触媒特性を有するタンパク質分子に関する。より詳しくは、本発明は、プレックストリン・ホモロジー（ＰＨ）ドメインに由来する構造的鋳型の骨格においてペプチド配列のライブラリを製造すること、および化学反応の遷移状態を含む高分子または小分子リガンドに結合する所望の特性を有するそのような配列を同定することに関する。本発明はまた、そのようにして得られたペプチド配列に由来する、構造的骨格の状況においてペプチドのリガンド結合特性に匹敵するリガンド結合特性を有する小分子を提供することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】機能性分子表面の生成、スクリーニング、および展開のための新規の合成タンパク質の構造の鋳型発明の分野本発明は一般に、新規の結合性または触媒性を有するタンパク質分子に関する。より明確には、本発明は、プレックストリン−ホモロジー（ＰＨ）ドメインから誘導される構造の鋳型の骨格（framework）におけるペプチド配列のライブラリの作成、および、化学反応の遷移状態を含む、巨大分子もしくは小分子リガンドとの所望の結合性を有する配列の同定に関する。本発明はまた、構造骨格に関して、そのように得られたペプチド配列から誘導される、ペプチドのリガンド結合性に匹敵するリガンド結合性を有する小分子の提供に関する。関連する分野の背景新規の表面エピトープの生成タンパク質は、アミノ酸の直線状ヘテロコポリマーとして細胞内で構築される複雑な巨大分子である。その正確な組成は、本質的に遺伝子配列にコードされており、タンパク質の配列によりタンパク質の特有かつ強固な三次元的屈曲（fold ing）が特定される。この屈曲、つまり、分子の形状、疎水性および親水性領域、そして静電場の空間的構成が、分子の相互作用の特異性の根拠であり、最終的にはタンパク質の機能を決定する。根本原理は、相互作用する表面の相補性による分子の認識の一つである。タンパク質表面の形状および特性は、タンパク質の三次元構造によって決定され、これはそのアミノ酸配列によって決定されるため、この配列における変更は構造の変更を引き起こすことができ、タンパク質、他の巨大分子、もしくは小分子に相補的な新規の表面を提供することができる。そのような表面が化学反応の遷移状態に相補的である場合、そのような表面への基質の結合により遷移状態の自由エネルギーは低下し、反応は表面により触媒される。可能な配列の変更の数はコンビナトリアル的に多数あり、また、それぞれ個々の変更の効果は状況に依存し、かつ正確に設計することのできないエンタルピーおよびエントロピー要素を有するので、そのような新規の表面の合理的な工学的操作は現在のところ不可能である。そのような表面の他の入手方法として、当該分野では、自然の選択法にならって、好結果の変化のためのスクリーニング技術と組み合わせてランダムな変異誘発の技術を使用してきた。特定の実施例では、免疫グロブリン中に自然の範例が存在し、そこでは、ランダムな体細胞の可変ドメインの変異が抗原親和性を向上し、これが次に、変異した抗体を発現するＢ細胞の増殖刺激物質に翻訳される。当該分野では、Ｒｏｐ［ Vispo NS,1993］もしくはチオレドキシン［McCoy J,1992］中に連続エピトープとしてクローン化されたペプチドライブラリ、繊維状ファージ［Hoess RH,1993 ］のような複製能をもつファージまたは細菌［Little M，1993］の表面に提示（ display）されたペプチドのようなインビボシステムが使用されてきた。また、当該分野では、ｌａｃ−レセプターのＣ−末端へのペプチドの融合［Cull MG,19 92］またはポリソームに付着したペプチドの提示［Mattheakis LC,1994］のようなＤＮＡの結合機能により、発現されたペプチド配列と遺伝情報を物理的に結合するインビトロシステムも使用されてきた。これらの方法はそれぞれ、特定の利点を有する一方、原則的に、そして実際問題としてその適用性を制限する欠点も有する。高親和性を有する新規の表面エピトープの効果的な生成のために、今なお懸命な努力がなされている。インビトロと同様インビボのスクリーニングシステムに使用してもよく、そのため機能性の発現のためのジスルフィド結合の酸化を必要とせず、連続および非連続ペプチドエピトープを提示し、環状ペプチドおよび同様のコンフォメーション上の制約を受けた小分子の合成のためのリード物質としてのそのようなペプチドの利用を促進するために逆平行ベータ鎖の二次構造にそのようなペプチドを固定し、独立して屈曲して高い安定性を有し、組換えに効率的に発現し、そして効率的に再屈曲する、多目的に使用できる構造鋳型が必要とされ続けている。しかしながら、当該分野で現在使用されている構造鋳型には、これら全ての特性を備えたものはない。従って、新規の分子のエフェクター表面（effector surfaces）を提供する分野において、上記の所望の特性を兼ね備える新規の構造鋳型が、いまだ必要とされている。この目的のために、発明者は、プレックストリン−ホモロジー（ＰＨ）ドメインの好適な誘導体の使用を研究した。天然存在型ＰＨドメインＰＨドメインは約１１０のアミノ酸配列長をもつタンパク質である。それらは初め、プレックストリンのＮ−末端およびＣ−末端の内部配列ホモロジーとして記載され［Haslam RJ,1993；Mayer BJ,1993］、その後、高感度の配列比較サーチにより９０より多くのそのようなドメインが、主に真核細胞のシグナル経路のタンパク質の成分として同定され［Gibson TJ,1994］、並列された。通常、配列の類似性が低いタンパク質ファミリーに見られることであるが、コア配列アライメントに関する挿入および欠失は二次構造の構成要素を結合する全てのループに見出すことができる。プレックストリンのＰＨドメイン［Yoon HS,1994］、ベータスペクトリン［Macias MJ,1994；Zhang P,1995］、ダイナミン（dynamin）［D owning AK,1994；Ferguson KM,1994；Timm D,1994］、およびホスホリパーゼＣ −デルタ１［Ferguson KM,1995］の構造が、精製を容易にするための、天然型のドメイン配列またはＮ−もしくはＣ−末端に非天然型の伸張鎖を有する天然型のドメイン配列の組換え発現後、Ｘ−線結晶学実験ならびに核磁気共鳴実験によって決定された。ＰＨドメインの全体構造は、一方の末端がＣ−末端ヘリックスでカバーされた７本鎖の屈曲した逆平行ベータシートである［図１］。ＰＨドメインの生理学的機能は正確には知られておらず、タンパク質によって実に多様でありうるが、多くのＰＨドメインはビス−およびトリス−イノシトールリン酸に高い親和性で結合すると考えられる。そのような結合は、リン脂質膜表面へのＰＨドメインの局在性に影響を与えるか、別のメッセンジャーの結合によりアロステリック効果を引き起こすか、またはその両方でありうる。ＰＨドメインのループＡＢ、ＣＤ、およびＦＧに隣接する表面エピトープ、またはループＣＤおよびＥＦに隣接するエピトープがそのような結合の原因でありうることが示唆された。特に、イノシトールリン酸／ＰＨ複合体の既知の二つの構造におトープのうちのどちらか一つにリガンドが結合すると考えられる。そして、構造が知られている三つのＰＨドメインについて、“三つのドメインの表面は、共通と思われる結合部位を提案させるような共通のパッチまたはポケットを示さない ”ことが観測された［Ferguson KM,1995］。天然存在型ＰＨドメインの配列の修飾プレックストリンのＰＨドメインのＮ−末端の骨格領域に突然変異を起こし、イノシトールリン酸の結合に重要な残基を明らかにした。ループＡＢに隣接する残基の突然変異により、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸への結合親和性が低下した［Harlan JE,1995］。ベータ・アドレナリン受容体キナーゼのＰＨドメインのループＦＧのＣ−末端のヘリックスを突然変異させ、Ｇ−ベータ−ガンマサブユニットおよびイノシトールリン酸への結合を検討した。これらの突然変異はＧ−ベータ−ガンマとの相互作用およびホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸の結合に有害であることが明らかになった。このことから著者は、更に別の構造の異なる機能性表面エピトープを暗示していると解釈した［Touhara K,1995］。事実、ＰＨドメインの側面にあるＣ−末端配列がＧ−ベータガンマの結合に重要であるという証明［Mahadevan D,1995；Touhara K,1994； Tsukada S,1994；Wang DS,1994］は、構造的理由により、上記のエピトープがドメインのタンパク質−タンパク質相互作用の主要な部位でありえないことを示唆している。ドメインの構造に関する出版物で、著者は、構造の類似性から明らかになりうる、可能な機能の観点−特にリガンド相互作用部位−について思索している。この場合、カリシンタンパク質ファミリー［Yoon HS,1994］、ＦＫ５０６結合タンパク質［Macias MJ,1994］、免疫グロブリンの抗原結合部位、ストレプタビジン、ウシ肝臓カタラーゼのドメイン、およびスペクトリンのＳＨ３ドメイン［Ferguson KM,1994］とＰＨドメインの間に構造の類似性があることが認められた。構造の類似性はＰＨドメインの種々の表面エピトープ上にある好適な相互作用部位を示唆する。しかし、上記のタンパク質はいずれもＰＨドメインと正確な屈曲のトポロジーを共有しないので、ホモロジーおよび保存されたリガンド結合構造があるとは考えられない。概して、特にドメイン間の配列のホモロジーの程度が低い場合、証明された、もしくは暗示されたリガンド結合部位もしくはタンパク質−タンパク質相互作用部位が一般化されるかどうかは明白ではない。精製を単純化するために、赤血球凝集素のエピトープをＲａｓ交換因子サン− オブ−セブンレス（Son-of-sevenless）のＰＨドメインのＣ−末端伸張鎖として使用し、組換えタンパク質の抗体親和性の調製を可能にした［McCollam L,1995 ］。ＰＨドメインそのものは未修飾のままであった。Ｈｉｓ−ｔａｇのエピトープをＤｂ１、Ｓｏｓ１、ＩＲＳ−１、およびベータ −ＡＲＫのＰＨドメインのＣ−末端伸張鎖として使用し、組換えタンパク質の固定化金属アフィニティークロマトグラフィーでの精製を可能にした［Mahadevan D,1995］。ＰＨドメインそのものは未修飾のままであった。ＰＨドメインのリガンドのスクリーニングインビボでのタンパク質−タンパク質相互作用のスクリーニングに特に有用かつ多目的に使用できるシステムでは、相互作用トラップ（interaction trap）［ Fields S,1989］および２−ハイブリッド［Estojak J,1995］システムに例証されるように、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインをそれぞれ含有する二つの融合タンパク質を使用する。可能なタンパク質性のリガンドを同定するために、天然型ＰＨドメインを相互作用トラップシステムに使用することが既に報告されている［Ferguson KM,1994］。著者は、詳細を明記せずに、リガンドは得られず、タンパク質性のリガンドへの結合が証明されなかったと述べており、また、これにより、ＰＨドメインがタンパク質に結合しない、またはこのスクリーニングシステムで機能しないと解釈できるとしている。発明の概要本発明は、連続的および非連続的表面エピトープを、機能性発現のためにジスルフィド架橋の酸化を必要とせず、独立的に屈曲しており、高度に安定であり、組換え的に効率よく発現されて効率よく再屈曲することができる、アンチパラレルベータ鎖二次構造の状況において提示（ｄｉｓｐｌａｙ）するための、構造的骨格を提供する。本発明の主要な態様においては、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリを、指向的クローニングまたはＰＣＲの方法により、ドメインの構造的状況中に効率的にクローニングするのに適した制限部位を含んでいてもよい、ＰＨドメインの修飾された配列の使用を記載する。配列の変更は、例えば、ドメインの安定性を改良し、ドメインの屈曲特性を改良し、酸化または凝集に対するその耐性を改良し、そのプロテアーゼ耐性を改良し、タンパク質の精製を促進または改良し、その免疫原性の特性を変更し、または特定の細胞区画中に局在化されるタンパク質の能力を改変することによりドメインの操作性を容易にするアミノ酸の変更をコードすることができる。さらに、上述の機能は、タンパク質配列へのＮ−末端またはＣ−末端伸長の付加により達成することができる。そのようなタンパク質においては、３つの表面ループを、単一で、または組み合わせて改変して、新たな連続的または非連続的表面エピトープを与えることができる。ここでは、この構造的骨格を用いて配列のライブラリを機能性についてスクリーニングする方法、ならびに機能性配列の展開（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）およびさらなる改良のために、スクリーニングと改変のサイクルを使用する方法が記載される。このようにして得られる配列は、小分子量化合物のためのリード構造として用いることができ、ここでは、そのような配列に由来する、タンパク質構造の元の状況におけるそれらのコンフォーメーション的な制約に匹敵する仕方でコンフォーメーション的に制約される小分子量リガンドを製造するためのアプローチが記載される。発明の詳細な説明本発明は、核酸ベクター分子に関する。本発明の核酸ベクター分子は、ポリペプチドをコードする第１の非天然核酸配列を含み、ここで、前記ポリペプチドの三次元屈曲のトポロジーは、プレックストリン・ホモロジー（ＰＨ）ドメインのトポロジーと相同であり、前記非天然核酸配列は、対応する天然核酸配列と比較して、（ａ）ＰＨドメインのループをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つにおいて少なくとも１つの変更されたヌクレオチドを含み、ここで、前記少なくとも１つの変更されたヌクレオチドは、対応するアミノ酸中に変更を付与し、かつ前記対応するアミノ酸中の前記変更は機能の獲得を付与し；（ｂ）ＰＨ−ドメインのループまたはそれに直接隣接する領域をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つにおいて、１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を表す配列を含み；または／および（ｃ）コードされるポリペプチドに、改良された安定性、改良された屈曲特性、酸化および凝集に対する改良された耐性、または改良されたプロテアーゼ耐性、促進されたまたは改良された精製、変更された免疫原性の特性、および／または特定の細胞区画中に局在化される能力を付与する、ことを特徴とする。好ましい態様においては、本発明のベクター分子は、前記ループがループＡＢ、ＣＤまたはＦＧであることを特徴とする。さらに好ましい態様においては、本発明のベクター分子は、前記ＰＨドメインがサイトヘシン１またはサイトヘシン２ドメインであることを特徴とする。さらに好ましい態様においては、本発明のベクター分子は、さらに前記第１の非天然核酸配列の５’−末端または３’−末端に隣接して、対応するポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端の、前記ポリペプチドの精製または検出を促進または改良するか、または前記ポリペプチドの特定の位置への標的化を助ける伸長をコードする、少なくとも１つの別の核酸配列をさらに含むことを特徴とする。本発明はさらに、以下のものを含む組換え核酸ベクター分子に関する：（ａ）本発明に従うベクター分子、または前記第１の非天然核酸配列が対応する天然核酸配列により置き換えられている対応するベクター；および（ｂ）１つまたはそれ以上のアミノ酸配列をコードする少なくとも１つの第２の核酸配列、ここで前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列は、前記第１のまたは対応する天然核酸配列によりコードされる前記ポリペプチドの少なくとも１つのループ、好ましくはループＡＢ、ＣＤおよび／またはＦＧの少なくとも一部を形成し、前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列は、前記天然核酸配列中に天然に生ずるものではなく、前記第１のまたは対応する天然のおよび第２の核酸配列によりコードされるポリペプチドにより、前記第１のまたは対応する天然核酸配列によりコードされるポリペプチドの構造的一体性が維持される。好ましい態様においては、本発明の（組換え）ベクター分子は、前記核酸がＤＮＡであることを特徴とする。最も好ましい態様においては、本発明の組換えベクター分子は、前記少なくとも１つの第２の核酸配列によりコードされる前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、少なくとも１つのループ、好ましくはループＡＢ、ＣＤおよび／またはＦＧの少なくとも一部を置き換えることを特徴とする。さらに別の最も好ましい態様においては、本発明の組換えベクター分子は、前記少なくとも１つの第２の核酸配列によりコードされる前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、少なくとも１つのループ、好ましくはループＡＢ、ＣＤおよび／またはＦＧ中に挿入されていることを特徴とする。さらに別の最も好ましい態様においては、本発明の組換えベクター分子は、前記少なくとも１つの第２の核酸配列によりコードされる前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、連続的エピトープを形成するかまたはその形成に寄与することを特徴とする。さらに別の最も好ましい態様においては、本発明の組換えベクター分子は、前記少なくとも１つの第２の核酸配列によりコードされる前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、非連続的エピトープを形成するかまたはその形成に寄与することを特徴とする。さらに別の最も好ましい態様においては、本発明の組換えベクター分子は、前記少なくとも１つの第２の核酸配列によりコードされる前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、リード構造、リガンド結合能力を有する（ポリ）ペプチド、基質修飾能力を有する（ポリ）ペプチド、または触媒または反応体と相互作用しうる（ポリ）ペプチドを表示するか、またはその表示に寄与するアミノ酸配列を含むことを特徴とする。本発明はまた、本発明に従う複数の組換えベクター分子を含む、組換えベクター分子のライブラリに関する。本発明はさらに、本発明に従う組換えベクター分子によりトランスフォームされた宿主に関する。好ましい態様においては、本発明の宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母細胞、好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、昆虫細胞または哺乳動物細胞であることを特徴とする。さらに本発明は、本発明のライブラリによりトランスフォームされた、本発明に従う複数の宿主に関する。本発明はさらにまた、本発明に従うベクター分子によりコードされる、または本発明に従う宿主または本発明の複数の宿主により生成される（ポリ）ペプチドに関する。前記（ポリ）ペプチドはまた、化学的に合成され、本発明のベクター分子によりコードされる（ポリ）ペプチドと同じアミノ酸配列を有していてもよい。前記（ポリ）ペプチドはさらに、（ポリ）ペプチド鎖には天然に生じないがその他の点では上述のポリペプチドと同一の化合物、好ましくは立体異性体、Ｄ −アミノ酸、タンパク質性アミノ酸またはα−アミノ酸を含むアミノ酸配列を有していてもよい。さらに、本発明は、前記（ポリ）ペプチドを含むライブラリに関する。特に、前記ライブラリは、前記化学的に合成された（ポリ）ペプチドを含み、これは、その中に天然に生じない化合物を含有していても含有していなくてもよい。（ポリ）ペプチドの化学合成は、例えば、フラグメント縮合技術または全（ポリ）ペプチド鎖を得る一工程方法を用いて行うことができる。非天然ペプチド化合物は、ペプチド合成の技術を利用しうる分子であってもよい。上述のライブラリは、コンビナトリアルケミストリ法により行うことができる。構築は、スプリット合成により、または固定ペプチド配列と連続的配列エピトープの前記ライブラリからなる配列から構成される構築ブロックの利用により行うことができる。さらに別の態様においては、本発明に従う（ポリ）ペプチドから小分子量リガンドが誘導される。好ましい態様においては、本発明に従う小分子量リガンドは、コンフォーメーション的に制約されており、好ましくはシクロペプチドであることを特徴とする。本発明はさらに、本発明に従うライブラリを生成する方法に関し、該方法は、複数のアミノ酸配列をコードする前記第２の核酸配列を前記第１のまたは対応する天然核酸配列中に挿入することを含むことを特徴とする。好ましい態様においては、本発明に従う方法は、前記挿入が、制限酵素で消化した第１のまたは対応する天然核酸配列中に前記第２の核酸配列をライゲーションすることにより行われることを特徴とする。本発明はまた、本発明に従うライブラリをスクリーニングする方法に関し、該方法は、（ａ）本発明に従う組換えベクター分子によりコードされるポリペプチドを発現させ；そして（ｂ）前記（ポリ）ペプチドを、前記第２の核酸配列によりコードされる所望の特性についてスクリーニングすることを含む。本発明はまた、本発明に従うライブラリを展開またはスクリーニングする方法に関し、該方法は、（ａ）本発明に従う組換えベクター分子によりコードされるポリペプチドを発現させ、ここで、前記ポリペプチドの一部は、本発明に従うトランスフォームされた宿主に選択的利点を付与し；そして（ｂ）宿主集団を前記選択的利点についてスクリーニングすることを含む。好ましい態様においては、本発明の前記方法は、前記第２の核酸配列の遺伝的情報を、発現されスクリーニングされた（ポリ）ペプチドと物理的にカップリングする工程を用いることを特徴とする。好ましい態様においては、本発明に従う方法は、工程（ａ）における前記発現が、ファージディスプレイ技術により行われることを特徴とする。一般に、発現されたポリペプチドまたは第２の核酸配列と発現されたポリペプチドの遺伝的情報とのカップリングを、例えば外膜タンパク質、表面付属物のサブユニットまたは分泌されたタンパク質を用いて、宿主細胞の表面に提示することが好ましい。さらに別の好ましい態様においては、本発明に従う方法は、前記スクリーニングが、前記第２の核酸配列によりコードされる前記ポリペプチドに融合されたＤＮＡ結合ドメインによる、遺伝的情報と発現されたポリペプチドとのカップリングを媒介する技術により行われることを特徴とし、ここで、前記ＤＮＡ結合ドメインは、本発明の前記ベクター分子に結合するか、または前記スクリーニングは、ポリソームディスプレイ技術または相互作用トラップ技術により行われる。特に好ましいものは、前記ＤＮＡ結合ドメインがｔｅｔリプレッサー分子またはｌａｃリプレッサー分子である方法である。本発明はさらに、本発明に従うベクター分子および／または核酸ベクター分子を含むキットに関し、該キットは、ポリペプチドをコードする第１の非天然核酸配列を含み、ここで、前記ポリペプチドの三次元屈曲のトポロジーは、プレックストリン・ホモロジー（ＰＨ）ドメインのトポロジーと相同であり、前記非天然核酸配列は、対応する天然核酸配列と比較して、（ａ）ＰＨドメインのループをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つにおいて、少なくとも１つの変更されたヌクレオチドを含み；（ｂ）ＰＨ−ドメインのループをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つまたはそれに直接隣接する領域において、１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を表す配列を含み；または／および（ｃ）コードされるポリペプチドに、改良された安定性、改良された屈曲特性、酸化および凝集に対する改良された耐性、または改良されたプロテアーゼ耐性、促進されたまたは改良された精製、変更された免疫原性の特性、および／または特定の細胞区画に局在化される能力を付与することを特徴とする。本発明はまた、本発明に従う（ポリ）ペプチドまたはそれに由来するリガンドを含む医薬組成物またはワクチンに関する。本発明はまた、本発明に従うベクター分子または本発明に従う組換えベクター分子の、遺伝子治療における使用に関する。発明の詳細な説明以下の説明において、組換えＤＮＡおよびタンパク質工学技術の多く用語を利用する。明細書および請求の範囲を一貫して理解できるよう、以下のように定義する。ライブラリ。本明細書において使用する場合、ライブラリは複数の配列である。一般に、この多くの配列は、ライブラリの全てのもしくはほとんど全ての分子に存在する共通部分、およびライブラリの一つの分子のみに存在する、もしくは稀にしか存在しないユニーク部分から成る配列の一部である。ホモロジー。本明細書において使用する場合、二つの配列が共通の原型配列から誘導されたと認識できる場合、それらはホモロジーがあるとみなされる。ループ。本明細書において使用する場合、ループは、二次構造の二個の要素を架橋するアミノ酸配列である。プレックストリン−ホモロジードメインのループは図−１および２に定義する。骨格。本明細書において使用する場合、タンパク質の骨格は、ループ配列部分ではない残基から成る。機能性。本明細書において使用する場合、機能性という用語は、本発明の方法の結果として得られた、もしくは有意に向上したタンパク質の機能を指して使用する。一般にこの機能はリガンドの（向上した）結合である。本明細書において使用するタンパク質もしくはタンパク質ドメインの機能とは、タンパク質もしくはタンパク質ドメインの別の分子との相互作用の検出可能な効果を示す。典型的には、機能はリガンドの結合を意味することを意図する。本明細書において使用する機能の獲得とは、リン酸化部位の損失のような機能の損失と対照的に、タンパク質もしくはタンパク質ドメインの新規の相互作用、もしくは既存の相互作用の向上された効果の獲得である。ドメイン。ドメインは、構造的に定義されたサブユニットであり、通常は自然に屈曲するポリペプチドである。しばしばドメインは、より大きなタンパク質において機能性モジュールとして観測される。制限部位。本明細書において使用する場合、制限部位は制限エンドヌクレアーゼにより切断部位として認識されるヌクレオチド配列である。融合タンパク質。融合タンパク質は、少なくとも二つの異なるタンパク質もしくはペプチドに由来する配列を含有するように構築されたハイブリッドタンパク質である。表面エピトープ。本明細書において使用する場合、表面エピトープとは、タンパク質のサブセットであり、そのタンパク質の溶媒が接近できる表面の隣接部分に寄与するアミノ酸もしくは一連のアミノ酸である。連続エピトープ。本明細書において使用する場合、連続エピトープとは、タンパク質の一次構造において連続的に配置されたアミノ酸によって形成される表面ェピトープである。非連続エピトープ。本明細書において使用する場合、非連続エピトープとは、２あるいはそれ以上の（連続的でない）連続エピトープによって形成される表面エピトープである。レポーター遺伝子。本明細書において使用する場合、レポーター遺伝子は、宿主内にある条件が存在する場合、該宿主に検出可能な表現型を授与する遺伝子である。一般にレポーター遺伝子は、リガンドへの強い結合のような、エピトープライブラリの標本に存在する機能の結果として、活発に発現されることができる。提示される(displaved)。本明細書において使用する場合、分子もしくは分子の一部が、他の分子との相互作用が可能なように、分子の接近可能な表面に寄与する場合、その分子もしくは分子の一部は提示されている。機能性エピトープライブラリの展開（evolution）。ここで使用されるところによれば、機能性エピトープライブラリを、ライブラリの構成要素もしくはそのコピーにおいて配列変化が起こるような条件にし、向上した機能を有する該ライブラリの標本を選択する場合、そのようなライブラリは展開される。表現型。本明細書において使用する場合、表現型とは、宿主細胞の外観、機能、または性質における検出可能な変化である。表現型はコロニーの色、細胞の増殖の特性、細胞の化学反応触媒能、または、物理的もしくは他の方法により検出することができ、高い親和性を有し、そのため細胞内もしくはそのすぐ近傍に濃縮される化合物への結合能であることが可能である。これらおよび他の検出可能な表現型の例は当業者によく知られている。本発明の方法および組成物により、タンパク質中の連続および非連続表面エピトープの提示のために、新規の構造原理を利用することができる。このタンパク質の構造骨格は、機能性の発現にジスルフィド架橋の酸化を必要としない。新規の表面エピトープは、修飾型ＰＨドメインの機能性配列に基づく小分子化合物の構築に特に好適な逆平行ベータ鎖二次構造に提示される。ベクター配列への修飾遺伝子工学の方法を用いてそのようなタンパク質を生成するように修飾した核酸ベクター分子について記載する。これらの修飾は、鋳型タンパク質の所望の特性を保持しつつ本発明により提供される新規の構造骨格を有するタンパク質の生成を促進するヌクレオチド配列の変化から成るものでもよい。特に、そのような修飾は、新規の表面エピトープに寄与すべき配列部分に隣接する特有の制限部位を提供するために、タンパク質のヌクレオチド配列において新規の制限部位を生成するか、または既存の制限部位を削除するものであってもよい。本発明の実施態様では、ランダム化したヌクレオチドおよび３’末端と５’末端の近傍に制限部位を有するオリゴヌクレオチドプライマーを、相補的なプライマーとアニールさせて、二本鎖オリゴヌクレオチドに変換する。その後このオリゴヌクレオチドを適当な制限エンドヌクレアーゼで切断して調製したベクター分子とライゲートするが、ここでランダム化したヌクレオチドは構造鋳型分子にインフレームで挿入された複数のアミノ酸配列をコードする。アミノ酸配列への修飾構造骨格のヌクレオチド配列への修飾により、技術的および他の理由に好適なように、タンパク質のアミノ酸配列の変更および性質の導入を行ってもよい。修飾型ＰＨドメイン骨格の安定性を、天然に存在するドメインに見られるものより向上させることは有利でありうる。修飾型ＰＨドメイン骨格の構造的に新しい表面エピトープを形成することを意図したペプチド配列の中には不安定化するものがあることを証明してもよく、また、これは骨格の安定性のレベルを向上することにより補われてもよい。更に、新規のドメインの使用には、変性剤および／または高温に対する安定性が必要とされるものがありうる。また、そのような使用は屈曲の安定性の向上により促進されてもよい。この目的を達成するための方法は当業者に知られており、天然変異体に深く関係するアラインメント由来の共通配列の導入［Steipe B,1994］、好適な帯電性残基の結合によるヘリックス双極子の安定性［Nicholson H,1988］、Ｎ−キャップもしくはＣ−キャップヘリックス構造残基の提供［Serrano L,1989］、骨格の好適な位置へのプロリン残基の結合［Nicholson H,1992］、構造骨格の好適な位置への、αヘリックスもしくはベータ鎖の形成傾向の高いアミノ酸の結合［Blaber M,1993；Smith CK,1994］、および、構造的理由によりＰＨドメイン配列中に保存されたアミノ酸配列の、それぞれの構造においてより好適でありうるアミノ酸配列による置換−リゾチームの安定化に適用することに成功した方法［Shoichet BK,1995］。修飾型ＰＨドメイン骨格の熱力学的安定性を向上する技術により、ドメインの屈曲性も同時に向上されうる。そのような向上された屈曲性はまた、他の突然変異によって達成されてもよく、技術的な理由に好適なものであってもよい。特に、凝集傾向のある屈曲中間体の蓄積を誘引しうる緩慢な屈曲段階を除去することにより、ドメインが再び屈曲する際に凝集する傾向を低下させてもよい。緩慢な屈曲段階は、おそらくは構造的な理由によりペプチド−プロリン結合がエネルギー学的に好適なトランスコンフォメーションからシスコンフォメーションへ異性化することを必要とするタンパク質について報告されている。そのような配列を他の残基で置換することによりドメインの屈曲は有意に促進される−リボヌクレアーゼＡに適用することに成功した方法［Schultz DA,1992］。技術的もしくは他の理由により、修飾型ＰＨドメイン骨格の不可逆な修飾に対する耐性の向上が望まれてもよく、これは酸化的損傷を受けやすい高い硫黄含有アミノ酸であるシステインおよびメチオニン、または、脱アミド化およびイソアスパラギン酸への変換を受けやすいアスパラギン残基を、他の好適なアミノ酸で部分的に、もしくは完全に置換することにより達成してもよい。技術的もしくは他の理由により、修飾型ＰＨドメイン内もしくはドメイン間のジスルフィド結合の酸化に対する耐性の向上が望まれてもよく、これはシステイン残基をセリン、アラニン、またはバリンのような他の好適なアミノ酸で置換することにより達成してもよい。技術的もしくは他の理由により、修飾型ＰＨドメインの凝集に対する耐性の向上および溶解度の増大が望まれてもよい。例えば、これにより、修飾型ＰＨドメインを含有する組成物の保存性が向上し、修飾型ＰＨドメインを含有する生成過程およびドメインそのものの生成が向上し、そして薬剤組成物への修飾型ＰＨドメインの有用性が向上しうる。これは、修飾型ＰＨドメインの骨格配列の変更（例えば他のアミノ酸による疎水性残基の置換）により達成してもよい−呼吸性シンシチウムウイルス（respiratory syncitial virus）の主要な糖タンパク質フラグメントに適用することに成功した方法［Murby M,1995］。別の実施例では、修飾型ＰＨドメインの再屈曲の際またはその後の凝集に対する耐性の向上および溶解度の増大は、好適な表面残基の突然変異誘発によりグリコシル化部位、リン酸化部位、および／または帯電した残基を提供することにより達成してもよい。技術的理由により、修飾型ＰＨドメインのタンパク質分解による切断および分解に対する耐性の向上が望まれ、これによりインビボおよびインビトロにおけるドメインの有用性を向上してもよい。多くのプロテアーゼについて、特異的認識部位が知られており、そのようなプロテアーゼに対する感受性を低下するために、修飾型ＰＨドメインの配列を変更してもよい。発現したドメインからペプチドを得るために、特定のプロテアーゼによる限定されたタンパク質分解による切断、または化学的切断に対する感受性の低下が望まれてもよい。例えば、活性化されたＸ因子のプロテアーゼ認識部位Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、もしくはトロンビンのプロテアーゼ認識部位Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒのようなプロテアーゼ認識部位、、またはアミノ酸であるメチオニンを、ループ領域に隣接する両側のアミノ酸配列に存在させるように操作してもよい。従って、好適なプロテアーゼを用いた修飾型ＰＨドメインの切断、または当業者によく知られる条件下における臭化シアン処理のうち、選択された修飾に好適な方によって、これらの残基間に配列を含有するペプチドを得てもよい。技術的な理由により、アフィニティークロマトグラフィー技術を使用して修飾型ＰＨドメインの精製を促進することが望まれてもよい。例えば、これは、ヒスチジン残基を含有する表面エピトープを導入して、後に好適な親和性マトリックスと複合体を形成できるような二価の金属カチオンを配位させることにより達成してもよい。そのような方法をレチノール結合タンパク質に適用することが成功修飾型ＰＨドメインが使用されるべき種に外来の配列エピトープを、種に在来の配列エピトープ、または、他の理由により抗原性のより低い残基で置換することにより、インビボへの使用または薬剤組成物への含有を目的とする修飾型ＰＨドメインの抗原性を低下させてもよい。この目的のために、新規の配列の設計、または、少なくとも一個の他の天然存在型タンパク質の配列を含有するハイブリッドＰＨドメインの構築を使用してもよい。そのような方法を抗体可変ドメインに適用することが成功している［Roguska MA,1994］。多くのタンパク質が特定の細胞の区画（compartment）内に輸送され、修飾型ＰＨドメインの使用はそのような特異的な輸送を必要としてもよい。これは好適なシグナル配列の導入により達成してもよい。例えば、アデノウィルスの配列、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏのような核内保留シグナル、またはＣ −末端配列、Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕのような小胞体保留シグナルがある。Ｎ−およびＣ−末端の融合上記および他の技術的利点の多くは、Ｎ−もしくはＣ−末端に、修飾型ＰＨドメイン骨格に所望の特性を与える配列を融合することにより認識されてもよい。骨格に安定化相互作用をもたらす残基を含有する配列をＮ−もしくはＣ−末端に融合させることにより、修飾型ＰＨドメイン骨格の安定性を天然に存在するドメインのそれより向上させてもよい。修飾型ＰＨドメイン骨格配列に対するＮ− もしくはＣ−末端配列のそのような融合は、同時に、または独立して、ドメインの屈曲性を向上させてもよい。例えば、帯電した残基、リン酸化部位、および／またはグリコシル化部位を含有する配列の伸長部分をＮ−もしくはＣ−末端に融合させて、修飾型ＰＨドメインの再屈曲の際もしくはその後の凝集に対する耐性および安定性を向上させてもよい。プロテアーゼを阻害する配列またはプロテアーゼ阻害剤とＮ−もしくはＣ−末端の融合により、修飾型ＰＨドメインのタンパク質分解による切断および分解に対する耐性を向上させてもよい。ヒスチジン残基を含有するＮ−もしくはＣ−末端配列［Lindner P,1992］、特定の抗体で認識されるエピトープ［Evan GI,1985 ］、エピトープ結合ストレプタビジン（streptavidine）［Schmidt TGM,1994］、リボヌクレアーゼのＳペプチド［Kim JS,1993］、帯電した残基、または、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼのような融合タンパク質［Smith DB,1 988］と融合させた後、あるいは当業者に知られる他の技術を使用した後、アフィニティークロマトグラフィー技術を実施して、修飾型ＰＨドメインの精製を促進してもよい。修飾型ＰＨドメインの特定の細胞区画への輸送は、Ｎ−もしくはＣ−末端に、アデノウィルスの核内保留配列Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＰｒｏもしくはＣ−末端小胞体保留シグナル配列Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕのような好適なシグナル配列を融合させることによって行われてもよい。修飾型ＰＨドメインの他の適用は、特定の標的へのドメインの結合を必要としてもよい。これは、Ｎ−もしくはＣ−末端に、抗体もしくはＤＮＡ結合ドメインのような標的と特異的に結合するペプチドもしくはタンパク質を融合させることにより達成することができる。修飾型ＰＨドメインの他の適用は、酵素もしくは阻害剤のような機能性ペプチドもしくはタンパク質の、修飾型ＰＨドメインそのものによって提供される親和性を介する特定の標的への結合を必要としてもよく、これは、適当に構築もしくは選択された修飾型ＰＨドメインへの、機能性ペプチドもしくはタンパク質のＮ−もしくはＣ−末端融合により達成してもよい。機能性修飾型ＰＨドメインを誘導する修飾本発明の好ましい態様では、エピトープの修飾を好適な修飾型ドメインの表面ループＡＢ、ＣＤ、およびＦＧにおいて、単一もしくはいずれかの組み合わせで実施してもよく、そのようなエピトープの修飾は、独立した屈曲、高度な安定性、効果的な組換えの発現への好適性、および効果的な再屈曲のような、元のドメインの好ましい特性を保持する。そのようなエピトープの修飾は、コンフォメーション的に不自然な連続配列エピトープを提供してもよい。連続配列エピトープにより、マイクロモルもしくはそれより低い解離定数をもつリガンドを提供することができ、それらの好適なコンフォメーション的制約により、解離定数を大幅に向上させてもよい。修飾型ＰＨドメイン骨格の逆平行ベータ鎖の表面ループＡＢ、ＣＤ、ＥＦ、およびＦＧの安定な固定により、そのようなコンフォメーション的制約を提供してもよい。非連続エピトープにより、連続配列エピトープよりはるかに大きな結合親和性を提供してもよい。これにより、修飾型ＰＨドメインの表面エピトープとそのリガンドの間の相互作用の数が有意に増加しうる。非連続エピトープによりナノモルもしくはそれより低い解離定数が提供されてもよく、リガンドに高い親和性をもつ大きな非連続表面エピトープを構築もしくは他の方法で得られる可能性は、本発明の重要な観点である。そのような非連続エピトープは、修飾型ＰＨドメインの１個以上の表面ループＡＢ、ＣＤ、ＥＦ、およびＦＧをいずれの組み合わせで含有してもよく、表面ループＡＢ、ＣＤ、およびＦＧの３個全てを含有するのが好ましい。ライブラリの構築修飾型ＰＨドメインにおける連続配列エピトープのライブラリを以下のように構築してもよい。当業者に知られる部位特異的変異誘発の技術を利用して、表面ループＡＢ、ＣＤ、もしくはＦＧをコードする配列の両側にある好適な、好ましくは単一の制限部位を導入して、ＰＨドメインの天然の、もしくは修飾されたヌクレオチド配列を変更してもよい。あるいはまた、天然の配列において１度以上発生する制限部位を単一にするために、ベクターまたはコードする配列における制限部位を該変異誘発法を用いて削除してもよい。あるいはまた、該表面ループ配列のすぐ隣に位置する、またはその中にある一つの制限酵素部位を導入または単一化してもよい。修飾型ドメインをコードするヌクレオチド配列に好適なエンドヌクレアーゼ制限部位を導入した後、その配列を切断して、次のランダム化したオリゴヌクレオチドのライゲーションに適合性のある末端を生成させてもよい。あるいはまた、好ましくは（しかし必ずしも必要ではない）既存の天然型単一制限部位もしくはあらかじめ導入された単一制限部位を削除して、変異体の遺伝子型の制限酵素による選択をすると同時に、部位特異的変異誘発によりランダム化したオリゴヌクレオチドそのものの配列を導入してもよい。該オリゴヌクレオチドは同一の、もしくは適合性のあるエンドヌクレアーゼの制限部位を含有し、更に同義配列（すなわち、それぞれの部位は特定のヌクレオチドによる特徴はないが、正確な合成条件により決定されうる多くの選択枝のいずれであることもできるような配列）を提供するように合成されたヌクレオチドを含有するように設計される。例えば、配列ＮＮＢの同義コドンは異なる４８個のコドンであるが、全てがＡで終わるわけではない。そのようなランダム化したコドンの使用により、停止コドンの導入の確率は０．０４７（または２１コドン中１個）から０．０２１（または４８コドン中１個）に低下し、従って、停止コドンの導入の確率は０．５より高くはならないが、生成されうるランダムな部位の数は〜１４から〜３３に上昇する。適当に調製したドメインのヌクレオチド配列にライゲートするための該ランダム化オリゴヌクレオチドを調製するために、該ランダム化オリゴヌクレオチドの５’末端に相補的な配列をもつ別のヌクレオチドを該オリゴヌクレオチドにアニールさせ、好適なポリメラーゼの作用により相補鎖を生成する。その後、当業者によく知られる方法でドメインのベクター配列へのランダム化したオリゴヌクレオチド配列の効果的なライゲーションを行い、最終的に修飾型ＰＨドメインのライブラリを作成する。あるいはまた、ランダム化したセグメントを好適なポリメラーゼの作用によって相補鎖を生成して、ドメイン全体もしくはその一部の遺伝子合成によりライブラリを構築してもよい。その後、そのような配列ライブラリを使用して好適な宿主を形質転換するか、または配列ライブラリを、直接、もしくはポリメラーゼ連鎖反応による増幅の後、ヌクレオチド配列の更なる操作に使用することができる。一つより多いランダム化したオリゴヌクレオチド配列を適当に調製したベクター配列に、一つより多い部位で、マルチ−フラグメントライゲーションすると同時に、上記の方法に従って非連続エピトープの配列のライブラリを作成してもよい。しかしながら好ましくは、当業者によく知られるクローニング技術を使用して、ランダム化した連続エピトープのライブラリの組み合わせを介して非連続エピトープ配列のライブラリを作成する。化学合成によって生成される合成ＰＨドメイン修飾型ＰＨドメインにおける連続もしくは非連続配列エピトープのライブラリの構築のための、全く異なる別のアプローチは、タンパク質の完全な化学合成を利用するものである。当業者に知られる技術を利用して、修飾型ＰＨドメインの連続配列部分を含有するるペプチドを化学合成しうる。これらのペプチドを好適な化学的方法で縮合して、断続していないポリペプチド鎖の全長を生成してもよい（例えば［Nyfeler R,1994］。あるいはまた、既知の技術に従った一段階のペプチド合成で、全ポリペプチド配列を合成しうる。上記の方法のどちらにも、約１１０のアミノ酸を有するＰＨドメインの配列の短さが、効率のための特別な利点、または必要条件でさえある。該化学合成ポリペプチド鎖は屈曲して、天然存在型の三次元構造になる必要がある。ポリペプチド鎖が生理学的条件下で自然に屈曲するために好ましい特性は、ジスルフィド結合が存在しないことであり、これは、遊離型のシステイン残基の不正確な結合により、しばしば非屈曲型の凝集タンパク質が生成されるためである。天然存在型ＰＨドメインは、その逆平行ベータ鎖の強固な構造はジスルフィド架橋による安定化を必要としないので、ジスルフィド結合を有しない。この状況において、天然に存在する遊離型のシステイン残基が上記のように置換された修飾型ＰＨドメインの特別な技術的重要性に言及するべきである。非天然存在型の連続もしくは非連続配列エピトープの大きなライブラリを作成するために、これらの上記のタンパク質の完全な化学合成法を、ペプチド結合化学技術により補足するのが好ましい。固定配列の合成ユニット、および連続配列エピトープのライブラリを含有するユニットを組み合わせてもよい。そのようなライブラリは、例えば当業者に知られるアミノ酸カップリング段階の後、固相ビーズの結合と分離を繰り返す、スプリット合成を介して得られてもよい。関連する方法は、スプリット合成のアプローチを介して調製したコンビナトリアルライブラリは一つの型の化合物だけを表示する単一ビーズを含有するという事実に基づく、Lamらによって認識された１ビーズ１化合物の概念［Lam KS,1991］であってもよい。この方法により、空間的に分離でき、そのため同時に、しかし独立してスクリーニングできる大きなライブラリを迅速に合成することができる。ペプチド結合化学に関する別の方法により、分子の位置によりその組成が同定される、空間的に取り扱うことができるコンビナトリアルライブラリを作成する。精巧な化学、例えばフォトリトグラフ技術［Fodor SPA,1991］の利用により、小さな表面領域上で多くの異なる配列を合成することができる。迅速に発展するコンビナトリアル化学の分野は、まもなく、該組み合わせたライブラリの構築のための更に適用性および実用性のある技術を提示するであろう。高度な複雑さに加え、合成されたライブラリは、例えばＤ−アミノ酸、天然アミノ酸の立体異性体、またはカップリング化学の作用を受けやすい他の化合物のような非天然型アミノ酸のペプチド鎖への組込みの利点を提供する。リガンドへの向上した親和性のスクリーニング修飾型ＰＨドメイン配列について適切な多様性をもって構築された表面エピトープのコンビナトリアルライブラリには、これらの配列のうち、所望のリガンドに対する親和性が向上されたものが含有される。そのような配列を同定するために、特定のリガンドに結合する配列としない配列とを識別できる方法について記載する。一般に、そのような方法および手順は、例えば発現されたタンパク質配列とそのベクターとの非共有結合による、ベクター配列を保有する好適な宿主細胞内の機能性配列の同定による、またはコードする核酸配列を保有する好適な宿主細胞もしくはウィルスの表面上の発現されたタンパク質の提示による、核酸ベクター分子と発現されたタンパク質との物理的カップリングに依存する。ライブラリ由来の発現されたタンパク質配列の、その配列をコードする核酸ベクター分子への非共有結合の一例として、例えばｌａｃ−リプレッサーのような、高い親和性および緩慢な速度（a slow kinetic off-rate）で特定のＤＮＡ配列に結合できるペプチドもしくはタンパク質のＮ−もしくはＣ−末端に融合された修飾型ＰＨドメイン配列を含有するベクター分子を使用してライブラリを作成する。好適な宿主細胞においてコードするベクター配列を有する修飾型ＰＨドメインの表面エピトープライブラリ由来の分子を結合する戦略の一例として、そのような修飾型ドメインの相互作用トラップシステムへの使用について記載する。転写の活性化は、細胞におけるＤＮＡ結合および転写活性化ドメインの分離可能な機能によって行うことができる。タンパク質−タンパク質相互作用を検出する方法は、これらの機能の可分性を利用し、相互作用するタンパク質の一つが好適なＤＮＡ結合ドメインに融合し、第二のタンパク質は好適な転写活性化ドメインに融合する。これら二つの融合タンパク質が相互作用する場合、転写活性化剤が核酸配列上にあるＤＮＡ結合部位の近傍に誘導され、転写の活性化により宿主細胞の検出可能な表現型が生じる。その主要な態様では、この方法は、修飾型ＰＨドメインの配列ライブラリのスクリーニングに適用されるが、修飾型ＰＨドメインのライブラリをコードする核酸配列が転写活性化ドメイン（例えば酵母ＧＡＬ４タンパク質の７６８−８８１のアミノ酸）をコードする別の核酸配列の５’末端に融合するように、ベクター分子のライブラリを構築する必要がありうる。好適な宿主を、その染色体ＤＮＡ内、または別のプラスミド上に、構成的に発現される融合タンパク質を含有するように、遺伝学的に修飾する。該融合タンパク質は、ライブラリから該タンパク質と結合する修飾型ＰＨドメイン配列を見つけることが望まれる標的タンパク質をコードする配列と融合させた、酵母ＧＡＬ４の１−１４７のアミノ酸のようなＤＮＡ結合ドメイン、または、細菌のタンパク質Ｌｅｘ４のＤＮＡ結合ドメインからなる。宿主細胞の染色体上、または別のベクター分子上にレポーター遺伝子が存在し、上記の融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、次いでＲＮＡに転写される際には、酵素、他のタンパク質、ペプチド、もしくは機能性配列が、その遺伝子に高い親和性で結合することができ、その遺伝子の発現によりある種の表現型が宿主細胞に与えられる。そのような表現型は、例えばベータ−ガラクトシダーゼの酵素作用による色の変化のような一見して明らかな宿主細胞の特性であってもよく、または、酵母細胞のＬＥＵもしくはＵｒａの遺伝子座のような、ある限定された栄養条件下での増殖の利点を宿主細胞に与えるもの、または、ゲンタマイシンから誘導した抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を与える酵素アミノグリコシド−ホスホトランスフェラーゼのような、通常は細胞に毒性を示す化合物に対する細胞の耐性を与えるであってもよい。多くの宿主細胞を修飾型ＰＨドメインの配列のライブラリ由来のベクターで形質転換した後、高い親和性で所望の標的分子と相互作用する発現されたタンパク質配列が存在してもよい。それらの細胞において、機能性表面エピトープを有する修飾型ＰＨドメインは、融合したＤＮＡ結合ドメインを介してレポーター遺伝子の上流のＤＮＡ配列に結合する所望のリガンド分子に非共有結合し；従って、修飾型ＰＨドメインに融合した転写活性化ドメインがレポーター遺伝子の転写を活性化し、検出可能な表現型が発現する。スクリーニングすべき配列のライブラリの特異性の高さを保証するため、実際のスクリーニング段階は精製段階と共に実施し、その精製段階においては、スクリーニングに使用した宿主と全く同様の方法で遺伝学的に調製した宿主を使用したが、親和性をスクリーニングすべきものに対しては実際のタンパク質−リガンドは存在させず、検出可能な表現型を、増殖を阻害するもので置き換えた。そのようにして、非特異的相互作用を介して転写を活性化するライブラリの構成要素、または、細胞の機能に干渉し、従ってそれら自身によって増殖を阻害するものを、ライブラリから除去した。形質転換した宿主細胞から残存するベクターを回収した後、この精製されたライブラリを上記のように使用してもよい。修飾型ＰＨドメインのスクリーニングの第三の実施例では、ファージディスプレイ技術を使用する。この方法の目的は、Ｍ１３、Ｆ１、もしくは同様の繊維状一本鎖ＤＮＡファージの遺伝子IIIもしくは遺伝子VIIIに融合したＮ−末端修飾型ＰＨドメインを含有する融合タンパク質を提供することである。この融合タンパク質はファージ−ゲノムまたはファージミドベクターのいずれにもコードされる。第一の事例では、ファージは所望のタンパク質のコピーを多く含有しており、後者の事例では宿主細胞がヘルパーファージに感染した後、わずかの、またはただ一つの融合タンパク質のコピーが、ファージミド一本鎖ベクターを充填する外殻粒子に表示されるのが見出される。両事例において、修飾型ＰＨドメインをコードする遺伝情報はファージ粒子に含有され、融合タンパク質は該ファージの表面に提示される。両者の方法は以下のように実施してもよい。ランダム化したＰＨドメイン表面エピトープを有するベクター配列のライブラリを構築し、ＰＨドメインを好適な制限エンドヌクレアーゼを使用して該ベクターから切断する。ファージゲノムまたはファージミドベクターを変異誘発して、遺伝子IIIタンパク質をコードするＤＮＡ配列の３’末端に、適合性のある制限部位を含有させる。ファージまたはファージミドによる増幅で二本鎖ＲＦ−ＤＮＡを調製し、その後の修飾型ＰＨドメイン配列フラグメントのライブラリのライゲーションのために、ＤＮＡを好適な制限エンドヌクレアーゼで切断して適合性のある末端を提供する。生成したRF −ＤＮＡベクターまたはファージミドを好適な宿主大腸菌に形質転換し、ファージゲノムを使用した場合は宿主が増殖して組換えファージを生成する；またはヘルパーファージに感染する。どちらの場合も、修飾型ＰＨドメインをコードする一本鎖ＤＮＡ分子は、遺伝子IIIおよび遺伝子VIIIの生成物を合わせたもの、および修飾型ＰＨドメインそのものを含有する融合タンパク質を、結果として生じるファージ粒子に内包する。この培養液を遠心分離した後、ファージ粒子を含有する上清を直接使用するか、または限外濾過もしくは沈殿により粒子を濃縮することができる。好ましくはカラムのマトリックスに共有結合した、所望のリガンド分子と共に、これらの粒子をインキュベートする。マトリックスを洗浄した後、リガンドに強く結合していないファージ粒子を除去するために、リガンドに親和性のある残存粒子を、所望のリガンドと共に可溶性にして選択的に溶出してもよい。この溶出液を、所望の標的分子に特異的に結合する融合分子を含有するファージ中で濃縮する。次いで大腸菌細胞に感染（または、ファージミドの場合は形質転換）させ、増幅後、修飾型ＰＨドメインをコードする大量のＤＮＡを回収することができ、機能性ドメインの核酸配列を演繹（deducing）するか、または更に一回以上のサイクルで機能性配列のプールを濃縮するためのいずれに使用してもよい。機能性配列ライブラリの展開修飾型ＰＨドメインのライブラリから選択されたドメインの親和性を非常に高度にするための方法として、極端に大きなライブラリをサーチしようと試みるのは効率的ではなく、むしろ低〜中程度の親和性をもつ結合ドメインの大多数を分離し、修飾およびスクリーニングのサイクルを繰り返して、段階的にそれらを展開させるのが好ましい。この場合、結合ドメインを通して宿主に与えられた表現型を選択できるシステムを利用するのが特に有利である。所望のリガンドとの親和性を更に高める目的で、修飾型ＰＨドメインの構造におけるアミノ酸の新規の組み合わせを、上記の３つの実施例に記載したようにして得ることができ、これは、機能性の向上のために既存の結合ドメインの更なる修飾への効果的なアプローチの例証となる。この展開および既存の機能性配列の最適化のアプローチにより、コンビナトリアル的に複雑かつ大きな配列空間において好適な標本を検出する問題を、処理しやすい程度に低減することができる。ある実施例では、一より多くのエピトープに修飾を含有する複数の配列を好適な制限エンドヌクレアーゼで切断し、それぞれ独立して何らかの方法でリガンドへの結合に関与すると考えられる生成フラグメントを混合し、確率論的に再度ライゲートして、エピトープ配列の組み合わせから新しい、そして更に機能性の高いエピトープを得る。別の実施例では、それぞれリガンド結合能が証明された修飾型ＰＨドメインの複数の配列を、増幅された配列に高率のエラーを起こすような条件下でポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅することができ、従って所望の配列領域全体にランダムに近い点突然変異が起き、これは単一のエピトープ、エピトープの組み合わせ、またはドメイン全体に及びうる。第三の実施例では、リガンド結合能が証明された多くの修飾型ＰＨドメインの配列から独立したループ領域を削除し、次いでランダム化した配列を含有するオリゴヌクレオチドのライブラリで置換する。機能性タンパク質の生成本発明はまた、スクリーニングアッセイで特定の機能を有することをあらかじめ確認した連続もしくは非連続エピトープを含有する大量のタンパク質を生成するためにも有用である。この目的のために、ドメインをコードする核酸配列の、例えばベクターｐＰＨＣＹ１Ｌ１中のＴ７プロモーターのような強力なプロモーターの下流を好適な細菌発現ベクターでクローン化し、当業者によく知られる標準的な技術を使用して誘発した後、発現した物質を宿主細胞から回収する。該修飾型ＰＨドメインの生成に続いて、タンパク質そのものが特定の機能をするように使用するか、または、上に明記したような特異的なプロテアーゼの切断部位を利用して、連続ペプチドエピトープをタンパク質から切断することができる。切断の後、例えばＨＰＬＣのような当業者によく知られる技術を利用して、プロテアーゼおよび構造鋳型の残存物からペプチドを精製してもよい。機能エピトープのリード構造としての使用スクリーニングまたは展開した機能性修飾型ＰＨドメインを小分子リガンドの生成のためのリード構造の設計に利用してもよい。この目的のために、単一の連続エピトープを化学的に合成するか、または上記のように調製して、標的化されたもしくはコンビナトリアルの化学修飾を行って、例えば、細胞質への向上した透過性、または特定の生物もしくは細胞のサブ区画への好適な局在化、向上された生物学的利用能、化合物の経口摂取後の向上された安定性、体液からの向上もしくは低減された除去、毒素との組み合わせによりそのような毒素の運搬を標的化すること、放射性物質もしくはスピン標識物質との組み合わせにより診断の際にこれらのマーカーを標的にできるようにすることのような、更に改善された機能／向上した機能性、または所望の特性を提供してもよい。構造的に制約された小分子の生成のための戦略非常に高度な親和性及び特異性のために、機能性を有することが見出されている構造鋳型の制約と同様に構造的に制約されたペプチドを使用するのが有利でありうる。そのような構造的制約は該ペプチドの構造学的エントロピーを低下させ、結合状態に比例して非結合状態を不安定化することにより結合の自由エネルギーを増加させる。機能性ペプチドの固定点はＰＨドメイン骨格の構造状態によく統合されたままであると考えられるので、本発明は構造的に制約された機能性ペプチドの設計に特に有用である。固定点は水素結合した二本の逆平行ベータ鎖にあるので、疑似βターンを介したペプチドの環化により、該ペプチドがスクリーニングもしくは展開された元の構造のものと非常に類似した構造的制約が保証される。そのような環化は当業者によく知られるものである。薬剤組成物および遺伝子治療上記の組成物は全て、薬剤組成物の一部および／または活性原理である。それらはまた、ワクチンの調製の一部および／または活性原理でもある。本発明の組成物は、主に遺伝子工学によって誘導されるという性質上、遺伝子治療への適用に適している。つまり、修飾型ＰＨドメインは遺伝子治療のために好適なベクター上に発現可能な形態でコードされていてもよく、機能性修飾型ＰＨドメインが活性化される標的細胞に発現されてもよい。図面の説明図１は、ＰＨドメインを規定する屈曲トポロジーを示す。二次構造要素は矢印（ベータ鎖）またはヘリックス（アルファ・ヘリックス）として示されており、ベータ鎖ＡとＢを連結するループＡＢ、ベータ鎖ＣとＤを連結するループＣＤ、およびベータ鎖ＦとＧを連結するループＦＧが表示されている。ドメインのＮおよびＣ−末端も表示されている。図２は、ラットダイナミン（Ｄｙｎ１Ｒａｔ）およびヒトスペクトリン（ＳｐｃｎｍｒＨｕｍ）の、構造的に特徴づけられたＰＨドメインの配列アライメント、ならびにヒトベータ・アドレナリン作用性レセプターキナーゼ（Ａｒｋｌ＿Ｈｕｍａｎ）、ヒトＶａｖタンパク質（Ｐｈ−Ｈｖａｖ）、ヒトサイトヘシン１（Ｃｙｔｈ１Ｈｕｍａ）、ヒトサイトヘシン２（Ｃｙｔｈ２Ｈｕｍａ）およびヒトＲａｓタンパク質（Ｐｈ−Ｒａｓａ−Ｈｕ）のＰＨドメインを示す。アライメントに対する二次構造要素の正確な位置および広がりは、残基を記号「＝」で強調することにより示され、ストランドおよびヘリックスは、それぞれ「ストランド」（略号「Ｓ」）および「ヘリックス」と表示されている。ループＡＢ、ＣＤ、ＥＦおよびＦＧの、アライメントに対する位置および広がりは、残基を記号「＊」で強調することにより示され、ループは、「ループ」と表示されている。図３は、プラスミドｐＰＨＣＹ１上の遺伝的要素の位置およびおおよその相対的サイズを示す。図４は、実施例１に記載される修飾ＰＨドメイン配列ＰＨＣＹ１Ｌ１の発現のための発現プラスミドｐＰＨＣＹ１Ｌ１のＤＮＡ配列（配列番号１１）、およびこの中に含まれる修飾ＰＨドメイン配列ＰＨＣＹ１Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。図５は、実施例１に記載される、ＰＨＣＹ１Ｌ１ドメイン中に挿入されたペプチドのライブラリを生成するために用いられたランダムオリゴヌクレオチドプライマーのＤＮＡ配列（配列番号１３）を示す。図６は、実施例１に記載されるように、安定性の測定を行ったインフレーム変異体のＤＮＡ配列（配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９）を示す。ここに挙げられる配列は、プラスミド配列（配列番号１１）のヌクレオチド１３９、ＰＨドメイン配列のコドン１２に対応するヌクレオチドで始まる。図７は、先祖および変異体ＰＨドメインについての安定性の測定値をまとめたものである。デルタＧは、ＰＢＳ中、２５℃でのドメインの屈曲の自由エネルギーであり、ｋＪ／ｍｏｌで与えられる。図８は、実施例４に記載される、システイン残基の置換のためのオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す。オリゴヌクレオチドは、発現されるドメインのコーディング鎖に相補的であり、したがって、「リバース」と称される。突然変異体は、Ｃ３２Ａ（配列番号１７）、Ｃ６６（配列番号１８）、Ｃ８２Ａ（配列番号１９）およびＣ１１４Ａ（配列番号２０）であり、ここで第１の文宇は野生型アミノ酸を１文字コードで示し、番号は配列中の位置を示し、最後の文字は置換の選択を示す。図９は、プラスミドｐＴＬＰ２上の遺伝的要素の位置およびおおよその相対的サイズを示す。図１０は、細菌細胞の懸濁液中における緑色蛍光タンパク質（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ）の相対的蛍光を、培地中のアンヒドロテトラサイクリンの濃度に対してプロットしたものを示す。野生型ｔｅｔ−リプレッサー（黒丸）およびｔｅｔ−リプレッサー−ＰＨ−ドメイン融合タンパク質の両方の、アンヒドロテトラサイクリンによる滴定から、同等のレベルの蛍光の誘導が得られた。このことは、野生型リプレッサーおよび融合タンパク質が、誘導剤への結合についてならびにオペレーター部位への結合について同じ親和性を有することを示す。図１１は、実施例６に記載されるランダム化実験において用いられた、コーディング鎖に相補的な固定リバースプライマーの配列を示す。同じ実施例において用いられたランダム化オリゴヌクレオチドのための配列および標的塩基組成も示される。Ｌｏｏｐ１ｒｍ−ｓは、ループＡＢをランダム化するために設計され、Ｌｏｏｐ２ｒｍ−ｓは、ループＣＤをランダム化するために設計された。図１２は、実施例６に記載されるランダム化ライブラリからのループ配列の比較を示す。ヌクレオチドの位置は、配列番号２１を参照し、対応するアミノ酸の位置は配列番号２２を参照のこと。変異したヌクレオチドは下線が施されており、対応するアミノ酸はイタリック体で示されている。図１３は、ＰＨＣＹ１合成ＰＨドメインの３つのループ配列中に挿入されたＣＲ６ペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。制限酵素部位は太字で示されている。下線を施した配列は、ＰＣＲ反応に用いられたオリゴヌクレオチドを表す。下線を施したアミノ酸配列は、ＣＲ６ペプチドを表す。図１４は、合成ＰＨドメイン／Ｂ４２トランスアクチベータドメイン融合タンパク質の酵母細胞における発現パターンを示す。合成ＰＨドメインを有しＣＲ６タンパク質を有しない２つの独立したクローン（ｐＪＧＰＨｗｔ、レーン１、２および５、６）、および合成ＰＨドメインのループＡＢ中に挿入されたＣＲ６ペプチドを有する２つの独立したクローン（ｐＪＧＰＨＣＲ６、レーン３、４および７、８）の全タンパク質を、抑制条件下（レーン１−４）および誘導条件下（レーン５−８）で、融合タンパク質の発現について分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットの後、Ｂ４２ドメインに融合させたＨＡ−エピトープに対するモノクローナル抗体でタンパク質を検出した。矢印は、それぞれの融合タンパク質についての予測分子量として移動した顕著なバンドを示す。図１５は、野生型およびループ配列中にＣＲ６ペプチドが挿入された変異体合成ＰＨドメインからのベータ・ガラクトシダーゼ活性の比較を示す。ベータ・ガラクトシダーゼ活性は、各構築物から独立して単離された４つのクローンから決定された。５−１５％の標準偏差を示した平均値が与えられている。以下の実施例により本発明を例証する。実施例１：合成ＰＨドメインの高レベル発現および屈曲安定性の測定ヒト・ナチュラルキラーＴリンパ球から得たヒトサイトヘシン１タンパク質（以前はｓｅｃ７ホモロジータンパク質として知られていた、ＧｅｎｂａｎｋＩＤ：Ｈｕｍｓｅｃ７ｈｏｍ）のｃＤＮＡクローンは、標準的方法により得た。このｃＤＮＡからのＰＨドメインを、開始コドンおよびＮｃｏＩ制限部位を生ずるための非天然Ｎ−末端アミノ酸、Ｃ−末端にＢｓｔＥＩＩ制限部位を形成する非天然グリシンおよびヘキサヒスチジンタグ、終止コドンおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含む合成ＰＨドメインを生成するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応で増幅し、得た。得られた合成ＰＨドメインを、Ｔ７プロモーターの制御下の発現ベクターｐＲＳｅｔ５ｄ（ＧｅｎＢａｎｋＸ５４２０５）中にクローニングして、プラスミドｐＰＨＣＹ１（図３、４）（配列番号１３）を得た。調製用スケールの発現および精製のプロトコルは、以下のようにして用いた：２Ｌの培地に、適当な変異体プラスミドでトランスフォームしたＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）の一夜培養物を植菌した。ＯＤ（６００ｎｍ）が約０．６の時に１ｍＭＩＰＴＧを加えて細胞を誘導し、さらに３時間培養し、次に遠心分離により細胞をペレット化した。細胞ペレットをＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）で１回洗浄し、約２ｍＬ／ｇ細胞（湿重量）の緩衝液Ａ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ＭＮａＣｌ）に再懸濁し、ここに０．０１ｍｇ／ｍＬのリゾチウムおよびＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅの１０ｍｇ／ｍＬ保存液０．００５ｍＬを加えた。冷室で細胞を２０分間インキュベートし、次に超音波処理により溶解させた。懸濁液を約４７０００のＲＣＦで２０分間遠心分離した。タンパク質は、緩衝液Ａで予め平衡化した２ｍＬのキレーティングセファロースベッド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより、この抽出物から一工程で精製した。遠心分離からの上清を重力流により適用し、緩衝液Ａ中２０ｍＭイミダゾール１０ｍＬで洗浄し、緩衝液Ａ中３００ｍＭイミダゾール８ｍＬでタンパク質を溶出した。溶出されたタンパク質を１ｍＭＤＴＴを含むＰＢＳで透析し、５ｍＭＤＴＴ、０．０２％アジ化ナトリウムとした後、４℃で保存した。単離された合成ＰＨドメインの収量は、細菌培養物１Ｌあたり２５ｍｇの精製産物であり、全可溶性細胞タンパク質の２０％と等しい。屈曲安定性を決定するために、１．１５μＭのタンパク質試料を、変化させた量のＧｄｍＨＣｌ（塩化グアニジン）を含む最終容量０．６ｍＬのＰＢＳ中で少なくとも一夜平衡化した。屈曲していないタンパク質および屈曲しているタンパク質の画分を、変性剤ＧｄｍＨＣｌの濃度の関数として、おそらくはタンパク質の単一のトリプトファン残基への溶媒のアクセス可能性の変化による、屈曲の開放（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）による大きな蛍光変化の観察により決定した。屈曲の自由エネルギー値は、屈曲の自由エネルギーが変性剤の濃度に対して直線関係にあると仮定し、屈曲の２状態モデルを仮定して、観察された蛍光の変性剤濃度に対する非直線最小自乗法により、屈曲の開放の前および後のベースライン補正を適用して計算した。安定性は−３９±１．６ｋＪ／ｍｏｌであることがわかり、これは単離されたタンパク質ドメインとしては驚くほど高い。このことから、このタンパク質は、ランダム突然変異実験、および適切な剛性骨格についておよびバイオテクノロジー的操作のための特性についてのさらなる最適化のよい出発点である。まとめると、この実験では、ヒトタンパク質サイトヘシン１の配列に基づく合成ＰＨドメインが、細菌宿主中において高いレベルで発現され、安定に屈曲し、Ｃ−末端に遺伝子工学的に融合させたアフィニティータグを用いて細菌抽出物から一工程で精製しうることを示した。実施例２サイトヘシン１配列に基づく合成ＰＨドメインのループＡＢ中の配列のライブラリこの合成ＰＨドメインの骨格の、ランダム突然変異への適合性を確かめ、本発明の第１の態様を製造するために、オリゴヌクレオチドＣｙ１１１ＲＭａｓ（配列番号１５）（図５）を用いる部位特異的突然変異誘発を用いてドメイン配列のライブラリを生成した。オリゴヌクレオチドは、ループＡＢ中にランダム化配列を、およびコーディング配列の５’および３’に２つの新たな制限部位を生成し、ＢｓｍＢＩのユニーク制限部位を排除するように設計された。当業者によく知られる方法に従って、ｄｕｔ^-、ｕｎｇ^-株ＣＪ２３６［ＫｕｎｋｅｌＴＡ、１９８５］（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中のｐＰＨＣＹ１からファージミドの一本鎖ＤＮＡを調製した。１００ｆｍｏｌの一本鎖ＤＮＡおよび２ｐｍｏｌのホスホリル化オリゴヌクレオチドを用いた。Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−ｂｌｕｅ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中にトランスフォーメーションした後、２０００個のクローンを得た。これらを合わせ、ＬＢ培地中で増殖させ、プラスミドＤＮＡを調製した。ＤＮＡのアリコートを制限エンドヌクレアーゼＢｓｍＢＩで消化して、野生型ＤＮＡを排除し、コンピテントＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮｏｖａｇｅｎＩｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）をトランスフォームした。再び２０００個のクローンを得た。これらのクローンのうち、無作為に３０個を取り出し、これらの３０個のクローンからプラスミドＤＮＡを調製した。制限酵素消化により、これらの３０個のクローン中２２個に変異体遺伝子型が存在うることが示された。これらの２２個のクローンのうち１８個を、蛍光ダイデオキシシークエンシング装置で標準的なプロトコルを用いて配列決定した後、８個のインフレーム変異配列を同定した。１つの配列は変更された制限部位を含んでいたが、野生型ループ配列を含み、他の９個の配列はプライマー領域に、おそらくは商業的に入手したプライマーの合成の問題によるフレームシフトエラーを含んでいた。すべてのクローンを２ｍＬのＬＢ培地で増殖させ、細胞が約０．６のＯＤ（６００ｎｍ）に達したときに、培地に１ｍＭＩＰＴＧを添加して発現を誘導した。３時間後、遠心分離により細胞をペレット化し、１００μｌのリン酸緩衝化食塩水に再懸濁し、超音波処理により破壊した。遠心分離により不溶性画分をペレット化した。ペレットおよび可溶性上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで別々に分析した。変異体配列をインフレームで含むクローンからの可溶性タンパク質画分のすべてのレーンにおいて、合成の変異体ＰＨドメインの予測された分子量として移動した顕著なバンドが見られた。いずれのフレームシフト配列においてもこのようなバンドは見られなかった。このバンドが観察されたすべての場合において、バンドは可溶性細胞タンパク質の約２０％に対応した。不溶性画分の試料のいずれにおいても、対応するバンドは見られなかった。すべてのクローンからの全細胞を、モノクローナル抗−Ｈｉｓタグ抗体（ＤｉａｎｏｖａＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより分析した。アルカリホスファターゼとコンジュゲートした抗マウス抗体で検出したところ、既に可溶性細胞抽出物において顕著なバンドが見られているクローンに対応するすべてのレーンにおいて、合成ＰＨドメインに対応する予測されたバンドが見られた。他のレーンのいずれにおいてもバンドは見られなかった。これらの実験は、ループＡＢ中にインフレームのランダム配列突然変異を有するこれらのすべてのクローンが、野生型先祖配列のレベルと対応するレベルで発現されていることを示す。さらに、Ｔ７ポリメラーゼ系により推進される高い発現レベルにもかかわらず、封入体は認められなかった。これとともに、発現可能性および可溶性は、ランダム化変異配列を有するＰＨドメインの構造的一体性を示す。インフレーム変異配列を含むクローンからの５個のクローンをさらなる分析のために選択した［図６］。これらの変異体の精製および安定性の測定は、実施例１に記載されるプロトコルに従って行った。安定性測定の結果は、図７にまとめられている。ランダム化が予測しうるほど完全であったことが明らかである。１つの配列のみが、野生型と１つの位置が共通であり、１つの配列のみが他の変異体と１つの位置が共通であった。さらに、すべての変異体は、野生型配列と僅かに離れているにすぎない匹敵する安定性を有する。屈曲の平均自由エネルギーは −３２．４（±３．３）ｋＪ／ｍｏｌであり、最も大きい屈曲の自由エネルギーを失った配列（配列番号４）においてさえも、十分に、安定に屈曲しているタンパク質について報告されている値の範囲内（＞２０ｋＪ／ｍｏｌ）であった。まとめると、この実施例では、ＰＨドメインのループ配列をランダム化することに成功し、そのようなランダム化が実際に先祖ドメインの構造的一体性と屈曲安定性を害しないことを示した。これらの変異体配列は何らかの機能的特性に基づいて選択されたものではないが、今やそのような突然変異が原理的に実施可能であることが確立され、上述のまたは当業者に知られる他の方法に従って製造される配列の大きなライブラリから機能的配列を導きうることが明らかである。実施例３：システイン残基を有しない安定化された合成ＰＨ−ドメインの作成本発明の修飾ＰＨドメイン中の、ドメイン内またはドメイン間ジスルフィド結合の望ましくない形成を防止するために、および酸化的損傷に対する耐性をさらに改良するために、天然の先祖配列中に存在する４個のシステインすべてを他のアミノ酸で置き換えた。突然変異のために用いたオリゴヌクレオチドは図８に示される。すべての突然変異は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発の標準的なプロトコルに従って実施し、ダイデオキシシークエンシングにより確認した。得られたタンパク質配列番号２２は、もはやドメイン内またはドメイン間ジスルフィド結合を形成することができない。置換の賢明な選択により、新たな配列は、実施例１に記載されるプロトコルに従って測定して、−４１．６±１．８ＫＪ／ｍｏｌという、さらに増加した熱力学的安定性を示した。まとめると、この実施例において、合成ＰＨドメインの配列中にさらなる突然変異を導入することに成功し、そのような突然変異がタンパク質の不安定化をもたらさなくてもよいことを示した。得られたタンパク質は、タンパク質を不活性化させるかまたは凝集をもたらすかもしれないジスルフィド結合を形成することができず、したがって、バイオテクノロジー的方法の要件について、またはそのようなドメインを含む組成物の安定性について、先祖ドメインの特性より望ましい特性を有する。さらに、これは先祖タンパク質より安定である。実施例４：ｔｅｔ−リプレッサーと合成ＰＨドメインの融合タンパク質の機能的一体性合成ＰＨドメインとＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質の、屈曲安定性および機能性、ならびにバイオテクノロジー的操作の容易性を示すために、実施例３の合成ＰＨドメインを、ｔｅｔ−リプレッサークラスＤ配列のＣ−末端に遺伝子工学的に融合させた。この融合タンパク質は、合成ＰＨドメインを含むタンパク質を、高い親和性で、部位特異的にＤＮＡ配列に結合させることができる。プラスミドｐＡＳＫ７５（ＳｋｅｒｒａＡ、１９９４］によりコードされるｔｅｔ−リプレッサーの配列および実施例３に記載される合成ＰＨドメインの配列を、ＰＣＲ反応により増幅した。用いたプライマーは、ペプチドＡＰＡＡＡＫＱＥＡＡＰＡＡをコードする重複リンカー配列ＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＴＧＣＡを生成した。このリンカーは、ｔｅｔ−リプレッサーの最後のアミノ酸をＰＨドメインの最初のアミノ酸に直接連結する。標準的な部位特異的突然変異誘発法により、ｐＡＳＫ７５中にＮｓｐＶ部位を導入し、ｔｅｔ−リプレッサー中のＮｓｉＩ部位およびＰＨドメインの３’側のＮｓｐＶ部位を用いてｔｅｔ−リプレッサー配列の３’側および増幅生成物をｐＡＳＫ７５中にクローニングした。得られたプラスミドｐＴＬＰ２［図９］においては、融合タンパク質は、ベータ・ラクタマーゼプロモーター遺伝子から構成的に転写されるポリシストロン性メッセージからから発現される。ｔｅｔ−リプレッサーの機能をモニターするために、リボソーム結合部位を含む緑色蛍光タンパク質の遺伝子を、ｔｅｔ−オペレータ／ｔｅｔ−プロモーター領域の下流に、ｐＡＳＫ７５のｏｍｐＡ配列およびストレップ（ｓｔｒｅｐ）タグを置き換えてＸｂａｌ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした。このプラスミド（配列番号２３）を用いて、コンピテントＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９細胞（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をトランスフォームした。融合タンパク質の機能性およびＤＮＡ配列特異的結合を示すために、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９細胞をＯＤ（６００ｎｍ）０．６まで増殖させ、異なる濃度のアンヒドロテトラサイクリンで誘導化した。発現の３時間後、細胞の１ｍＬのアリコートを遠心分離により回収し、リン酸緩衝化食塩水で１回洗浄し、２ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。細胞懸濁液をＯＤ（６００ｎｍ）０．５に調節し、３９５± ２．５ｎｍの励起波長および５１０±２．５ｎｍの放出波長を用いて２２℃で蛍光分析した。図１０は、野生型ｔｅｔ−リプレッサーを発現するＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９の培養物と、融合タンパク質を発現する培養物との相対的蛍光の比較を、誘導剤であるアンヒドロテトラサイクリンの培地中の濃度の関数として示す。細胞培地中のアンヒドロテトラサイクリンの存在は、ｔｅｔ−リプレッサーＤＮＡ結合部位からのｔｅｔ−リプレッサー−ＰＨ−ドメインの複合体の解離をもたらす。これは、レポーター遺伝子である緑色蛍光タンパク質の発現を誘導し、次にこれを蛍光測定により定量化することができる。２つの滴定曲線はほぼ同一であり、このことは、ＰＨドメインの存在にもかかわらず、融合タンパク質が機能的に一体性を有することを示す。まとめると、この実施例においては、融合タンパク質が、プラスミドＤＮＡ上のｔｅｔ−リプレッサーおよびｔｅｔ−オペレーター結合部位への遺伝子工学的融合により、合成ＰＨドメインをこれらの遺伝的情報をコードするプラスミドに直接結合させるのに有用であることを示すことに成功した。このようにして、新規な分子表面のスクリーニングのための方法において用いるために、配列のライブラリからの遺伝的情報およびそのそれぞれに発現された表現型を、物理的にカップリングさせることができる。このスクリーニング戦略は、ｌａｃ−リプレッサータンパク質およびｌａｃ−オペレーターＤＮＡ配列［ＣｕｌｌＭＧ、１９９２］に基づいて他の者が用いて成功したスクリーニングの系に類似するものであるが、本発明にかかる合成ＰＨドメインは、これらがはるかに大きい分子相互作用表面を提供し、スクリーニングのために非連続的エピトープを用いる可能性を有する点において、上述の参考文献に記載される系を越える独特の可能性を有する。実施例５：ランダム化非連続的表面エピトープを有する合成ＰＨドメインの大きな複雑なライブラリの合成非連続的表面エピトープのランダム化ライブラリを提示するＰＨドメインの有用性を示すために、第１の実験においては、ループＡＢおよびＣＤを同時にランダム化した。オリゴヌクレオチドは、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＥｃｏｓｙｎＤ３００合成機で、ループアミノ酸をコードする領域においてランダム化部分に隣接するコーディングＰＨドメイン配列の一部を含むように合成した。ランダム化配列をコードするオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、ＰＨ−ドメイン配列の３’−末端に相補的な固定リバースプライマーと組み合わせて用いるＰＣＲ反応を実施することにより、各ループを別々にランダム化した。得られた生成物は、１カ所切断制限エンドヌクレアーゼであるＡｆＩＩＩおよびＡｃｃＩ（ループＡＢ）、およびＡｃｃＩおよびＸｈｏＩ（ループＣＤ）によりそれぞれ制限して、互換性の結合末端を生成した。予測されたサイズのフラグメントをゲル精製し、ライゲーションして、配列番号２１のｂｐ３１５３−３４８２に対応する中断のないＰＨ−ドメイン配列を得た。ライゲーション生成物は、ループＡＢのランダム化フォワードプライマーおよび固定リバースプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。合成したオリゴヌクレオチドの配列および標的組成を図１１に示す。得られたＰＣＲ生成物（５００ｎｇ）を酵素ＡｆｌＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、ゲル精製し、互換性のあるように切断され精製されたベクター（３．５μｇ）にライゲーションした。ライゲーション生成物を透析し、コンピテントＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）のエレクトロポレーションに用いた。得られたライブラリは、２×１０⁶個の個別のクローンからなり、これは独立したものであると想定される。図１２は、９個の任意に選択されたクローンのループの配列を示す。ランダム化位置において観察されたアミノ酸組成は、オリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド組成から予測されたものとよく一致した。まとめると、この実施例においては、同時に２つのループにおいて同時にランダム化されているＰＨドメイン配列の大きな複雑なライブラリを構築することに成功し、そのようなランダム化が実際に、先祖ドメインの構造的一体性および屈曲安定性を害さなくてもよいことが示された。これらの変異体配列は何らかの機能的特性に基づいて選択されたものではないが、今やそのような突然変異が原理的に実施可能であることが確立され、上述のまたは当業者に知られる他の方法に従って製造される配列の大きなライブラリから機能的配列を導きうることが明らかである。実施例６：酵母相互作用トラップにおいて他のタンパク質と相互作用しうる合成ＰＨドメインの生成標的タンパク質との相互作用能力等の新たな機能的特性を、合成ＰＨドメインの状況において実際に生成することが可能であることを示すため、エプスタインバー核抗原２（ＥＢＮＡ−２）からのウイルス性転写因子の部分を有する合成ＰＨドメインを構築した。ＥＢＮＡ−２は、Ｃ−プロモーター結合因子ＣＢＦと相互作用することが示されており［ＨｅｎｋｅｌＴ、１９９４；ＬｉｎｇＰ、１９９５］、この相互作用はＥＢＮＡの、配列ＧＡＰＳＧＰＰＷＷＰＰＩＧＡＧを有するＣＲ６ペプチドに決定的に依存する。合成ＰＨドメインの構造的状況においてＣＲ６ペプチドを表示するために、プラスミドｐＰＨＣＹＣ１からの合成ＰＨドメインを、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩ制限部位および開始コドン、終止コドンおよびＳａｌＩ制限部位［プライマーＰＨＴおよびＰＨＢ、図１３］を含む合成ＰＨドメインを生成するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応において増幅した。前記ドメインを、ＧＡＬ１プロモーターの制御下の酵母発現ベクターｐＪＧ４−５（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．）の互換部位中に、Ｂ４２トランスアクティベーションドメインおよびヘマグルチニンエピトープへのＣ末端融合としてクローニングして、プラスミドｐＪＧＰＨｗｔを得た。前記ドメインのループＡＢのアミノ酸１５と１８の間にＣＲ６ペプチド［ＬｉｎｇＰ、１９９５］を挿入するために、２つの独立したＰＣＲ反応を実施した。１つは、ＥｃｏＲＩ制限部位および開始コドンを有する前記ドメイン用の５’−プライマー、および追加のセリンをコードするＢａｍＨＩ制限部位、ＣＲ６ペプチドの最初のアミノ酸のコーディングおよびＮｃｏＩ制限部位を生成するように設計された内部プライマーを用いた［図１３］。他方は、終止コドンおよびＳａｌＩ制限部位を有する、前記ドメイン用の３’プライマーおよびＮｃｏＩ制限部位、ＣＲ６ペプチドの最後のアミノ酸のコーディングおよび追加のトリプトファンのために設計された内部プライマー［プライマーＬＩＴＷおよびＬＩＢＷ、図１３］を用いた。単離したＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩ、またはＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化した後、得られたフラグメントの両方を同時にＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ切断ベクターｐＪＧ４−５にライゲーションして、プラスミドｐＪＧ−ＰＨＣＲ６（図１３）を得た。プラスミドｐＪＧ−ＰＨｗｔおよびｐＪＧ−ＰＨＣＲ６を酵母ＥＧＹ４８株（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．）にトランスフォームし、グルコースの存在下で抑制条件下で増殖させるか、またはガラクトースの存在下で誘導条件下で増殖させた、各構築物の２つの独立したクローンからの全細胞を、抗−ＨＡタグ抗体（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＳＤＳ −ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより分析した。すべての方法は、標準的なプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．）を用いて実施した。アルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウス抗体で検出したところ、細胞を非誘導条件下で増殖させた場合には、ＰＨｗｔ／Ｂ４２またはＰＨＣＲ６／Ｂ４２融合タンパク質の発現は検出できなかった（図１４）。誘導条件下では、それぞれの融合タンパク質について予測された分子量とし移動した顕著なバンドが見られた（図１４）。クローンは、ＰＨＣＲ６融合タンパク質をＰＨｗｔ融合タンパク質と非常に類似する量で発現していた。上述のようにＰＣＲ法を用いて［図１３において、プライマーＰＨＴ、ＰＨＢ、ＣＲ６ＴＬ１、ＣＲ６ＢＬ１、ＣＲ６ＴＬ２、ＣＲ６ＢＬ２、ＣＲ６ＴＬ３、ＣＲ６ＢＬ３］、追加のアミノ酸を有しないＣＲ６ペプチドを、ループＡＢのアミノ酸１６と１７との間、ループＣＤのアミノ酸４１と４２との間、またはループＥＦのアミノ酸８８と８９との間に導入して、ベクターｐＪＧＰＨＣＲ６．Ｌ１、ｐＪＧＰＨＣＲ６．Ｌ２またはｐＪＧＰＨＣＲ６．Ｌ３（図１３）を得た。ＣＢＦの５００アミノ酸のオープンリーディングフレーム［ＡｍａｋａｗａＲ、１９９３；ＨｅｎｋｅｌＴ、１９９４］を、発現ベクターｐＳＨ１（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．）中にクローニングし、ここで、これがｌｅｘ−ＡのＤＮＡ結合ドメインに遺伝子工学的に融合されて、ベクターｐＳＨ−ＣＢＦが得られた。ベクターｐＳＨ−ＣＢＦを、ベクターｐＪＧ４−５（陰性対照）または対応するｐＪＧ−ＰＨベクターとともに、酵母ＥＧＹ４８株にコトランスフォームした。各ｐＪＧ−ＰＨ構築物の４つの独立したクローンを、ガラクトースの存在下で誘導化条件下で増殖させ、標準的な方法に従ってベータ・ガラクトシダーゼ活性を決定した。ＰＨ−ドメインのループの１つにＣＲ６ペプチドを有する融合タンパク質のみが、相互作用トラップアッセイにおいてＣＢＦタンパク質との相互作用を示した（図１５）。ＣＲ６ペプチドをループＥＦに挿入すると、最も高いベータ・ガラクトシダーゼ活性から演繹して、最も強いタンパク質／タンパク質相互作用が得られた。まとめると、この実施例においては、元のドメイン配列中に外来ペプチド配列が挿入されている場合においても、ＰＨドメインを、Ｂ４２トランスアクティベーションドメインとの融合タンパク質として、酵母細胞において高レベルで発現させうることが示された。さらに、そのような外来配列がその先祖タンパク質の特性（これらの実施例においては、これはＣＢＦタンパク質と相互作用する能力である）を保持しうること、および今やそのような特性が前記外来配列を含む合成ＰＨドメインに付与されることが示された。最後に、合成ＰＨドメインと標的タンパク質との相互作用を、酵母相互作用トラップ系において検出しうることが示された。すなわち、合成ＰＨドメインは、相互作用トラップに基づくペプチド／タンパク質およびタンパク質／タンパク質相互作用のスクリーニングに実際に適している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ブルーン，ハインケドイツ連邦共和国デー―81245 ミュンヘン，ザインスハイマーシュトラーセ 29 (72)発明者フンク，マルティーンドイツ連邦共和国デー―86949 ヴィンダッハ，フォルストシュトラーセ１ (72)発明者ヘンケル，トーマスドイツ連邦共和国デー―81479 ミュンヘン，ベルテレ・シュトラーセ 53／１

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリペプチドをコードする第１の非天然核酸配列を含む核酸ベクター分子であって、前記ポリペプチドの三次元屈曲のトポロジーは、プレックストリン・ホモロジー（ＰＨ）ドメインのトポロジーと相同であり、前記非天然核酸配列は、対応する天然核酸配列と比較して、（ａ）ＰＨドメインのループをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つにおいて、少なくとも１つの変更されたヌクレオチドを含み、ここで、前記少なくとも１つの変更されたヌクレオチドは対応するアミノ酸において変更を付与し、かつ前記対応するアミノ酸中の前記変更は機能の獲得を付与し；（ｂ）ＰＨ−ドメインのループまたはそれに直接隣接する領域をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つにおいて、１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を表す配列を含み；または／および（ｃ）コードされるポリペプチドに、改良された安定性、改良された屈曲特性、酸化および凝集に対する改良された耐性、または改良されたプロテアーゼ耐性、促進されたまたは改良された精製、変更された免疫原性の特性、および／または特定の細胞区画中に局在化される能力を与える、ことを特徴とする核酸ベクター分子。２．前記ループがループＡＢ、ＣＤまたはＦＧである、請求項１記載のベクター分子。３．前記ＰＨドメインが、サイトヘシン１またはサイトヘシン２ドメインである、請求項１または２に記載のベクター分子。４．前記第１の非天然核酸配列の５’−末端または３’−末端に隣接して、対応するポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端の、前記ポリペプチドの精製または検出を促進または改良するか、または前記ポリペプチドの特定の位置への標的化を助ける伸長をコードする、少なくとも１つの別の核酸配列をさらに含む、請求項１−３のいずれかに記載のベクター分子。５．（ａ）請求項１−４のいずれかに記載のベクター分子、または前記第１の非天然核酸配列が対応する天然核酸配列により置き換えられている対応するベクター；および／または（ｂ）１つまたはそれ以上のアミノ酸配列をコードする少なくとも１つの第２の核酸配列、ここで前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列は、前記第１のまたは対応する天然核酸配列によりコードされる前記ポリペプチドの少なくとも１つのループ、好ましくはループＡＢ、ＣＤおよび／またはＦＧの少なくとも一部を形成し、前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列は、前記天然核酸配列中に天然に生ずるものではない、を含み、ここで、前記第１のまたは対応する天然核酸配列によりコードされるポリペプチドの構造的一体性は、前記第１のまたは対応する天然のおよび第２の核酸配列によりコードされるポリペプチドにより維持されることを特徴とする、組換え核酸ベクター分子。６．前記核酸がＤＮＡである、請求項１−５のいずれかに記載の（組換え）ベクター分子。７．前記少なくとも１つの第２の核酸配列によりコードされる前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、少なくとも１つのループ、好ましくはループＡＢ、ＣＤおよび／またはＦＧの少なくとも一部を置き換える、請求項５または６に記載の組換えベクター分子。８．前記少なくとも１つの第２の核酸配列によりコードされる前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、少なくとも１つのループ、好ましくはループＡＢ、ＣＤおよび／またはＦＧ中に挿入されている、請求項５または６に記載の組換えベクター分子。９．前記少なくとも１つの第２の核酸配列によりコードされる前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、連続的エピトープを形成するかまたはその形成に寄与する、請求項５−８のいずれかに記載の組換えベクター分子。１０．前記少なくとも１つの第２の核酸配列によりコードされる前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、非連続的エピトープを形成するかまたはその形成に寄与する、請求項５−８のいずれかに記載の組換えベクター分子。１１．前記少なくとも１つの第２の核酸配列によりコードされる前記１つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、リード構造、リガンド結合能力を有する（ポリ）ペプチド、基質修飾能力を有する（ポリ）ペプチド、または触媒または反応体と相互作用しうる（ポリ）ペプチドを表示するかまたはその表示に寄与するアミノ酸配列を含む、請求項５−１０のいずれかに記載の組換えベクター分子。１２．請求項５−１１のいずれかに記載の複数の組換えベクター分子を含む、組換えベクター分子のライブラリ。１３．請求項５−１１のいずれかに記載の組換えベクター分子によりトランスフォームされた宿主。１４．Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母細胞、好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、請求項１３記載の宿主。１５．請求項１２記載のライブラリによりトランスフォームされた、請求項１３または１４に記載の複数の宿主。１６．請求項１−１１のいずれかに記載のベクター分子によりコードされる、または請求項１３または１４に記載の宿主または請求項１５記載の複数の宿主により産生される、または化学的に合成されかつ請求項１−１１のいずれかに記載のベクター分子によりコードされる（ポリ）ペプチドと同じアミノ酸配列、または（ポリ）ペプチド鎖中に天然に生じない化合物、好ましくは立体異性体、Ｄ− アミノ酸、タンパク質性アミノ酸またはα−アミノ酸を含むが、その他の点においては上述の（ポリ）ペプチドと同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。１７．請求項１６記載の（ポリ）ペプチドを含むライブラリ。１８．請求項１６記載の（ポリ）ペプチドに由来する小分子量リガンド。１９．コンフォメーション的に制約された、かつ好ましくはシクロペプチドである、請求項１８記載の小分子量リガンド。２０．請求項１２記載のライブラリを生成する方法であって、複数のアミノ酸配列をコードする前記第２の核酸配列を、前記第１のまたは対応する天然核酸配列中に挿入することを含む方法。２１．前記挿入が、前記第２の核酸配列を、制限酵素で消化した第１のまたは対応する天然核酸配列中にライゲーションすることにより実施される、請求項２０記載の方法。２２．請求項１２記載のライブラリをスクリーニングする方法であって、（ａ）請求項５−１１のいずれかに記載の組換えベクター分子によりコードされる（ポリ）ペプチドを発現させ；そして（ｂ）前記第２の核酸配列によりコードされる所望の特性について前記（ポリ）ペプチドをスクリーニングすることを含む方法。２３．請求項１２記載のライブラリを開発（展開？）またはスクリーニングする方法であって、（ａ）請求項５−１１のいずれかに記載の組換えベクター分子によりコードされる（ポリ）ペプチドを発現させ、ここで前記（ポリ）ペプチドの一部は請求項１３または１４に記載のトランスフォームされた宿主に選択的利点を付与し；そして（ｂ）宿主集団を前記選択的利点についてスクリーニングすることを含む方法。２４．前記第２の核酸配列の遺伝的情報を、発現されスクリーニングされた（ポリ）ペプチドと物理的にカップリングさせる工程を用いる、請求項２２または２３に記載の方法。２５．工程（ａ）における前記発現が、ファージディスプレイ技術により実施される、請求項２２−２４のいずれかに記載の方法。２６．前記スクリーニングが、遺伝的情報と、前記第２の核酸配列によりコードされる前記ポリペプチドに融合されたＤＮＡ結合ドメインにより発現されるポリペプチドとのカップリングを媒介する技術により実施され、ここで前記ＤＮＡ結合ドメインは請求項５−１１のいずれかに記載の前記ベクター分子に結合するか、または前記スクリーニングがポリソームディスプレイ技術または相互作用トラップ技術により実施される、請求項２２−２５記載の方法。２７．前記ＤＮＡ結合ドメインが、ｔｅｔまたはｌａｃリプレッサー分子である、請求項２６記載の方法。２８．請求項１７記載のライブラリをスクリーニングする方法であって、前記ライブラリに含まれる（ポリ）ペプチドを、前記第２の核酸配列に対応するアミノ酸により反映される所望の特性についてスクリーニングすることを含む方法。２９．請求項１−４のいずれかに記載のベクター分子および／または核酸ベクター分子を含むキットであって、該キットは、ポリペプチドをコードする第１の非天然核酸配列を含み、ここで、前記ポリペプチドの三次元屈曲のトポロジーは、プレックストリン・ホモロジー（ＰＨ）ドメインのトポロジーと相同であり、前記非天然核酸配列は、対応する天然核酸配列と比較して、（ａ）ＰＨドメインのループをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つの中に、少なくとも１つの変更されたヌクレオチドを含み；（ｂ）ＰＨ−ドメインのループまたはこれに直接隣接する領域をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つにおいて、１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を表す配列を含み；または／および（ｃ）コードされるポリペプチドに、改良された安定性、改良された屈曲特性、酸化および凝集に対する改良された耐性、または改良されたプロテアーゼ耐性、促進されたまたは改良された精製、変更された免疫原性の特性、および／または特定の細胞区画中に局在化される能力を付与する、ことを特徴とするキット。３０．請求項１６記載の（ポリ）ペプチド、または請求項１７または１８に記載のリガンドを含む、医薬組成物またはワクチン。３１．請求項１−４のいずれかに記載のベクター分子または請求項５−１１のいずれかに記載の組換えベクター分子の、遺伝子治療における使用。