EA007273B1 - Выделенный полипептид, связывающийся с каспазой -8, и способы его применения - Google Patents

Выделенный полипептид, связывающийся с каспазой -8, и способы его применения Download PDF

Info

Publication number
EA007273B1
EA007273B1 EA200401390A EA200401390A EA007273B1 EA 007273 B1 EA007273 B1 EA 007273B1 EA 200401390 A EA200401390 A EA 200401390A EA 200401390 A EA200401390 A EA 200401390A EA 007273 B1 EA007273 B1 EA 007273B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
caspase
protein
proteins
interacting
cells
Prior art date
Application number
EA200401390A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200401390A1 (ru
Inventor
Дэвид Уоллах
Маркус Шухманн
Таня Гончаров
Original Assignee
Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко.Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from IL12772198A external-priority patent/IL127721A0/xx
Application filed by Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко.Лтд. filed Critical Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко.Лтд.
Publication of EA200401390A1 publication Critical patent/EA200401390A1/ru
Publication of EA007273B1 publication Critical patent/EA007273B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12N9/6475—Interleukin 1-beta convertase-like enzymes (3.4.22.10; 3.4.22.36; 3.4.22.63)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01033—N-Acetylglucosamine deacetylase (3.5.1.33)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/06—Methods of screening libraries by measuring effects on living organisms, tissues or cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и раскрывает полипептиды, взаимодействующие с каспазой-8. В частности, изобретение относится к полипептиду или его вариантам, где полипептид имеет выведенную аминокислотную последовательность клона р74, и способен взаимодействовать с субъединицей 1 и/или субъединицей 2 каспазы-8. Изобретение также раскрывает последовательность ДНК, кодирующей полипептид по изобретению. Представлены вектор, содержащий указанную ДНК, и клетка-хозяин, которая может продуцировать указанный полипептид. Представлены специфический для указанной ДНК рибозим, а так же антисмысловой олигонуклеотид и антитело к заявленному полипептиду. Полипептид, рибозим, антитело используются для модуляции активности каспазы-8, апоптоза и, соответственно, для лечения ряда заболеваний, связанных с каспазой-8. Антитело против указанного полипептида может использоваться в иммуноанализе, а сам полипептид - для идентификации и выделения белков с подобной активностью.

Description

Настоящее изобретение относится в основном к области цистеин-протеаз. Конкретнее, изобретение относится к полипептидам или белкам, взаимодействующим с каспазой-8 (МАСН) и/или модулирующим ее функции на пути гибели клеток (или при апоптозе), опосредованном СЭ95 (Еа§/Аро-1) или СО 120а (рецептор для ΤΝΕ р55).
В частности, настоящее изобретение относится к полипептидам, взаимодействующим с каспазой8/МАСН прямо или косвенно. Изобретение также относится к получению и применению полипептидов или белков, взаимодействующих с каспазой-8/МАСН.
Предпосылки создания изобретения
Фактор некроза опухоли (ΤΝΕ-альфа) и лимфотоксин (ΤΝΕ-бета) (далее обозначение ΤΝΕ относится как к ΤΝΕ-альфа, так и к ΤΝΕ-бета) являются многофункциональными провоспалительными цитокинами, образованными, главным образом, мононуклеарными фагоцитами, и оказывают ряд воздействий на клетки (^айаей, Ό. (1986), в 1п1сгГсгоп 7 (1оп Сгс55сг. сб.). рр. 83-122, Асабепис Ргс55. Ьопбоп; и ВеиНет апб Сетата1 (1987). Как ΤΝΕ-альфа, так и ΤΝΕ-бета начинают свое воздействие через связывание со специфическими рецепторами на поверхности клетки. Некоторые такие воздействия, вероятно, благоприятны для организма: они разрушают, например, опухолевые клетки или клетки, зараженные вирусом, и повышают антибактериальную активность гранулоцитов. В этом отношении ΤΝΕ вносит вклад в защиту организма от опухолей и инфекционных агентов и вносит вклад в восстановление после повреждений. Таким образом, ΤΝΕ можно использовать в качестве противоопухолевого средства, которое при применении связывается со своими рецепторами на поверхности опухолевых клеток и посредством этого инициирует события, приводящие к гибели опухолевых клеток. ΤΝΕ также можно использовать в качестве противоинфекционного средства.
Однако, как ΤΝΕ-альфа, так и ΤΝΕ-бета, обладают также разрушительным действием. Очевидно, что сверхпродуцирование ΤΝΕ-альфа может играть роль главного патогена при некоторых заболеваниях. Например, известно, что воздействие ΤΝΕ-альфа, в первую очередь, на сосудистую сеть является основной причиной симптомов септического шока (Етасеу е! а1., 1986). При некоторых заболеваниях ΤΝΕ может вызвать чрезмерную потерю веса (кахексия), подавляя активность адипоцитов и вызывая анорексию, и поэтому ΤΝΕ-альфа назван кахектином. Он также описан как медиатор повреждения тканей при ревматоидных заболеваниях (ВеиЙет апб Сетат1, 1987) и как главный медиатор повреждения, наблюдаемого при реакциях трансплантат против хозяина (Р1С|ие( е! а1., 1987). Кроме того, известно, что ΤΝΕ вовлекается в процесс воспаления и во многие другие болезненные состояния.
Два разных, экспрессируемых независимо, рецептора ΤΝΕ-К р55 (СЭ120а) и р75 (СО120Ь), которые специфически связываются как с ΤΝΕ-альфа, так и с ΤΝΕ-бета, инициируют и/или опосредуют указанное выше биологическое действие ΤΝΕ. Эти два рецептора имеют различные по структуре внутриклеточные домены, причем предполагается, что они передают сигнал по-разному (см. Нойтапп е! а1., 1989; Епде1тапп е! а1., 1990; Вгоскйаик е! а1., 1990; БоеЕсйег е! а1., 1990; 8с11а11 е! а1., 1990; №р11аг е! а1., 1990; διηίΐΐι е! а1., 1990; и Но11ег е! а1., 1990). Однако клеточные механизмы, например, различные белки и другие факторы, вовлекаемые во внутриклеточную передачу сигналов СЭ120а и СЭ120Ь, еще не выяснены. Речь идет о внутриклеточной передаче сигнала, которая происходит, как правило, после связывания лиганда, т.е. ΤΝΕ (альфа или бета), с рецептором, что является ответственным за начало каскада реакций, конечным результатом которого является наблюдаемая реакция клетки на ΤΝΕ.
Что касается вышеуказанного действия ΤΝΕ, вызывающего гибель клетки, в большинстве клеток, изученных до настоящего времени, то это действие инициируется, главным образом, СЭ120а. Антитела против внеклеточного домена (домена связывания лиганда) СЭ120а сами могут инициировать действие, вызывающее гибель клеток (см. ЕР 412486), коррелирующее с эффективностью поперечного сшивания рецепторов антителами, что предположительно является первой стадией при генерации процесса внутриклеточной передачи сигнала. Далее, исследования мутаций (ВгакеЬшсй е! а1., 1992; Τа^ιад1^а е! а1., 1993) показали, что биологическая функция СЭ120а зависит от целостности его внутриклеточного домена, и, соответственно, предполагается, что инициация внутриклеточной передачи сигнала, приводящего к вызывающему гибель клетки действию ΤΝΕ, происходит в результате ассоциации двух или большего числа внутриклеточных доменов СЭ120а. Кроме того, ΤΝΕ (альфа и бета) встречается в виде гомотримера, и как таковой, предположительно, индуцирует внутриклеточную передачу сигнала через СО 120а за счет своей способности связываться с молекулами рецептора и образовывать поперечные сшивки, т.е. вызывать агрегацию рецепторов.
Еще одним членом суперсемейства рецепторов ΤΝΕ/Ν6Ε является рецептор ГА8/АРО1 (СО95), который также называют БАЗ-антигеном, белок поверхности клетки, экспрессируемый в различных тканях и гомологичный ряду рецепторов клеточной поверхности, включая ΤΝΕ-К и ΝΟΕ-К. СЭ95 опосредует гибель клетки в форме апоптоза (1!ой е! а1., 1991) и представляется служащим в качестве отрицательного селектора аутореактивных Τ-клеток, т.е. во время созревания Т-клеток СЭ95 опосредует гибель Т-клеток вследствие апоптоза, распознающих аутоантигены. Также обнаружено, что мутации в гене СЭ95 (1рг) вызывают нарушение лимфопролиферации у мышей, что имеет сходство с аутоиммунной болезнью человека системной красной волчанкой (8ЬЕ) (^а1апаЬе-Рикипа8а е! а1., 1992). Оказывается, что лиганд
- 1 007273
СЭ95 представляет собой молекулу, связанную с поверхностью клетки, содержащейся, среди прочих, в киллерных Т-клетках (или цитотоксичных Т-лимфоцитах СТЬ), и, следовательно, когда такие СТЬ контактируют с клетками, содержащими ί.Ό95. они способны индуцировать апоптозную гибель клеток, содержащих СЭ95. Далее, получены моноклональные антитела, специфичные для СЭ95, причем такие моноклональные антитела способны индуцировать апоптозную гибель клеток, содержащих СЭ95, включая мышиные клетки, трансформированные кДНК, кодирующей СЭ95 человека (Кой с1 а1., 1991).
Несмотря на то, что цитотоксическое действие лимфоцитов опосредуется через взаимодействие продуцированного лимфоцитами лиганда с встречающимся повсеместно рецептором поверхности клетки СО95, обладающим способностью инициировать гибель клетки, также обнаружено, что различные другие здоровые клетки, кроме Т-лимфоцитов, экспрессируют СЭ95 на своей поверхности и могут быть убиты через инициирование этого рецептора. Предполагается, что неуправляемая индукция такого киллинга вносит вклад в повреждение тканей при некоторых заболеваниях, например, разрушение клеток печени при остром гепатите. Соответственно, поиск способов сдерживания цитотоксической активности СЭ95 может иметь лечебное значение.
С другой стороны, так как также обнаружено, что некоторые злокачественные клетки и ВИЧинфицированные клетки содержат СЭ95 на своей поверхности, антитела против СЭ95 или лиганд для СЭ95 можно использовать для инициации опосредуемого СЭ95 цитотоксического действия в этих клетках и посредством этого создать способ борьбы со злокачественными клетками или ВИЧ-инфицированными клетками (см. Ной с1 а1., 1991). Поиск еще и других способов усиления цитотоксической активности поэтому также может иметь лечебный потенциал.
Уже длительное время существует потребность в способе модуляции клеточной реакции на ΤΝΕ (альфа или бета) и лиганд СЭ95. Например, в случаях указанной выше патологии, когда ΤΝΕ или лиганд СЭ95 экспрессируются в избытке, желательно подавлять вызываемое ΤΝΕ или СЭ95 действие, убивающее клетки, в то время как в других случаях, например, при применениях для заживления ран желательно усиливать действие ΤΝΕ, или, в случае СО95, усиливать опосредуемое СЭ95 действие в опухолевых клетках или в ВИЧ-инфицированных клетках.
Заявители предприняли попытки (см. заявки на европейский патент №№ ЕР 186833, ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 412486) регулировать губительное действие ΤΝΡ посредством ингибирования связывания ΤΝΡ с его рецепторами с использованием антител против ΤΝΡ или с использованием растворимых рецепторов для ΤΝΡ (являющихся, по существу, растворимыми внеклеточными доменами рецепторов), для того, чтобы создать конкуренцию связыванию ΤΝΕ с ΤΝΕ-К, связанным с поверхностью клетки. Кроме того, на том основании, что СЭ95 на поверхности клетки, хотя количественное повышение активности ΤΝΕ-К или СЭ95 может потребоваться, когда добиваются усиленного действия ΤΝΕ или СО95. С этой целью секвенированы и проанализированы промоторы как для СЭ120а, так и для СЭ120Й, и найден ряд ключевых мотивов последовательностей, специфичных для различных факторов регуляции транскрипции, и, по существу, экспрессию этих ΤΝΕ-К можно регулировать на уровне их промоторов, т.е. ингибировать транскрипцию от промоторов для снижения числа рецепторов и усиливать транскрипцию от промоторов для увеличения числа рецепторов (ЕР 606869 и \УО 9531206).
Несмотря на то, что известно, что рецепторы для фактора некроза опухоли (ΤΝΕ) и структурно родственный рецептор СО95 инициируют в клетках, после стимуляции лигандами, продуцированными лейкоцитами, деструктивную активность, приводящую к их собственной гибели, механизмы такого инициирования пока мало понятны. Исследования с мутациями показывают, что в передаче цитотоксического сигнала в СЭ95 и СО 120а участвуют разные участки в пределах их внутриклеточных доменов (Втакейшей с1 а1., 1992; Τ;·ΐΓΐ;·ΐβ1ί;·ι с1 а1., 1993; Ной апб Ыада1а, 1993). Эти области (домены гибели) имеют схожие последовательности. Домены гибели как СЭ95, так и СЭ120а, имеют тенденцию к самоагрегации. Их самоагрегация, по-видимому, промотирует агрегацию рецепторов, необходимую для инициации передачи сигнала (см. 8опд е1 а1., 1994; ^айаей е1 а1., 1994; Βοϊάίη е1 а1., 1995), и при высоком уровне экспрессии рецепторов может привести к инициации лиганд-независимой передачи сигнала (Во1бт е1 а1., 1995).
Некоторые из цитотоксических действий лимфоцитов опосредуются через взаимодействие продуцированного лимфоцитами лиганда с СЭ95 встречающимся повсеместно рецептором поверхности клетки, способным инициировать гибель клетки (см. также №ща1а апб Со1бЧет, 1995); и такая гибель клетки, опосредованная мононуклеарными фагоцитами, включает участие пары лиганд и рецептор - ΤΝΕ и его рецептора СЭ120а, родственной по строению паре СЭ95 и его лиганду (см. также Уапбепайее1е е1 а1., 1995). Как и в случае других индуцируемых рецепторами воздействий, индукция гибели клеток рецепторами ΤΝΕ и СЭ95 происходит через ряд белок-белковых взаимодействий, ведущих от связывания рецептора с лигандом к возможной активации эффекторных функций ферментов, которые при исследованиях разъяснили неферментные белок-белковые взаимодействия, инициирующие передачу сигналов гибели клеток: связывание тримерного ΤΝΕ или молекул лиганда СЭ95 с рецепторами, итоговые взаимодействия их внутриклеточных доменов (Втакейикй е1 а1., 1992; Τа^ιад1^а е1 а1., 1993; Ной апб ШдаЩ 1993), усиленные склонностью мотивов доменов гибели к самоагрегации (Во1бт е1 а1., 1995а), и индуцированное связывание двух цитоплазматических белков (которые также могут связываться друг с другом) с внутри
- 2 007273 клеточными доменами рецепторов - МОКТ-1 (или ΡΆΌΌ) с СИ95 (Βοϊάίη с1 а1., 1995Ь; СЫппагуап с1 а1., 1995; К18сйке1 е1 а1., 1995) и ΤΚΑΌΌ с СИ120а (Нки е1 а1., 1995; Нки е1 а1., 1996). Три белка, связывающиеся с внутриклеточным доменом ΟΌ95 и СЭ120а в области домена гибели, вовлеченные в индукцию гибели клетки рецепторами через гетероассоциацию гомологичных областей, и которые, независимо, способны также инициировать гибель клетки, идентифицированы с помощью метода скрининга с двумя гибридами дрожжей. Одним из них является белок МОКТ-1 (Βοϊάίη е1 а1., 1995Ь), известный также, как ΡΆΌΌ (СЫппагуап е1 а1., 1995), который специфически связывается с ΟΌ95. Второй белок ΤΚΑΌΌ (см. также Нки е1 а1., 1995, 1996) связывается с СЭ120а. и третий К1Р (см. также 81апдег е1 а1., 1995) связывается как с СИ95, так и с СЭ120а. Кроме связывания с СЭ95 и с СЭ120а, эти белки также способны связываться друг с другом, что обеспечивает функциональное кросс-общение между СЭ95 и СЭ120а. Такое связывание осуществляется через консервативный мотив последовательности - модуль домена гибели, обычный для рецепторов и ассоциированных с ними белков. Кроме того, хотя при испытании с двумя гибридами дрожжей показано, что МОРТ-1 в клетках млекопитающих спонтанно связывается с СИ95, такое связывание происходит только после стимуляции рецептора, причем предполагается, что МОРТ-1 участвует в инициации событий передачи сигнала СЭ95. МОРТ-1 не содержит какого-либо мотива последовательности, характеризующегося ферментативной активностью, и, следовательно, представляется, что его способность инициировать гибель клетки не вызывает истинной активности самого МОКТ-1, а скорее активирует какой-либо другой белок или белки, связывающиеся с МОКТ-1, и действует далее в каскаде передачи сигнала. Показано, что экспрессия в клетках мутантов МОКТ-1, лишенных Ν-концевой части молекулы, блокирует индукцию цитотоксичности СЭ95 или СЭ120а (Нки е1 а1., 1996; СЫппагуап е1 а1., 1996), что указывает на то, что эта Ν-концевая область передает сигнал вызывающего гибель клетки действия обоих рецепторов через белок-белковые взаимодействия.
Выполненные в последнее время исследования охватывают группу цитоплазматических тиолпротеаз, родственных по строению протеазе СаепогйаЬбШк е1едап§ СЕЭ3 и конвертирующему ферменту интерлейкина-1-бета млекопитающих (1СЕ), в начале различных физиологических процессов гибели клеток (обзор в работах Китаг, 1995, и Непкай, 1996). Имеется также ряд показаний, что протеаза(ы) этого семейства могут принимать участие в индуцированной СЭ95 и ΙΝΡ-К цитотоксичности в клетке. Обнаружено, что специфические пептидные ингибиторы протеаз и блокирующие их функции белки, кодированные двумя вирусами - белок вируса коровьей оспы сгтА и белок бакуловируса р35, обеспечивают защиту клеток от такой цитотоксичности в клетке (Епап е1 а1., 1995; Ьо§ е1 а1., 1995; Те\\'ап е1 а1., 1995; Хие е1 а1., 1995; Ве1б1ег е1 а1., 1995). Быстрое расщепление некоторых специфических клеточных белков, явно опосредованное протеазой(ами) семейства СЕИ3/1СЕ, можно показать в клетках вскоре после стимуляции СЭ95 или ΙΝΡ-К.
Одна из таких протеаз, и ее различные изоформы (включая ингибирующие формы), известная как МАСН (теперь каспаза-8), являющаяся белком, связывающим МОКТ-1, и служащая для модуляции активности МОКТ-1 и, следовательно, Τ.Ό95 и СИ120а, и которая также может действовать независимо от МОКТ-1, недавно выделена, клонирована, охарактеризована, и также описаны ее возможные применения, как подробно указано во включенных в настоящее описание в качестве ссылок находящихся в совместной собственности одновременно рассматриваемых заявках на патент Израиля №№ 1Ь 114615, 114986, 115319, 116588 и 117932, а также в соответствующем им аналоге РСТ № РСТ/И896/10521, и в последних публикациях авторов настоящего изобретения (Во1бш е1 а1., 1996). Авторами настоящего изобретения (неопубликованные данные) и другими (Регпапбе8-А1петп е1 а1., 1996; 8йшуа8и1а е1 а1., 1996) также недавно выделена и охарактеризована еще одна такая протеаза и ее различные изоформы (включая ингибирующие формы), названная Мс114 (также называемая каспазой-10). Каспаза-10 также является белком, связывающим МОКТ-1, служащим для модуляции активности МОКТ-1 и, следовательно, также, вероятно, Τ.Ό95 и СИ120а, и который также может действовать независимо от МОКТ-1. Итак, подробности относительно всех аспектов, особенностей, свойств и применения каспазы-10 приводятся в указанных выше публикациях, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Следует также отметить, что каспазы - каспаза-8 и каспаза-10, имеющие подобные продомены (см. Во1бш е1 а1., 1996; Ми/ίο е1 а1., 1996; Регпапбе8-Л1петп е1 а1., 1996; УшсеШ апб Όίχίΐ, 1997), взаимодействуют через свои продомены с МОКТ-1, причем такое взаимодействие осуществляется через мотив домена гибели или эффекторный домен гибели ИЕИ, присутствующий в Ν-концевой части МОКТ-1 и присутствующий в двух копиях в каспазе-8 и каспазе-10 (см. Во1бш е1 а1., 1995Ь; СЫппа1уап е1 а1., 1995).
Такие протеазы, известные в настоящее время как каспазы (цистеин-аспартатспецифические протеазы), относятся к семейству цистеинпротеаз, способствующих росту, имеющих общие признаки. Обнаружено, что большинство таких каспаз участвуют в инициации и осуществлении запрограммированной гибели клеток или апоптозе, в то время как оказывается, что другие участвуют в продуцировании провоспалительных цитокинов (Мсйокоп Ό. +. е1 а1., 1997; 8а1уе§еп 0.8. е1 а1., 1997; Сойеп О.М., 1997). Они синтезируются как каталитически неактивные предшественники и, как правило, активируются посредством расщепления после специфических внутренних аспартатовых остатков, присутствующих в междоменных линкерах. Сайты расщепления каспаз определяются тетрапептидной последовательностью (Х-ХХ-Э), и расщепление всегда происходит после аспарагиновой кислоты. В результате некоторые зрелые
- 3 007273 активные каспазы могут процессировать и активировать как свои собственные, так и другие, неактивные предшественники (Гсгпап4с5-Л1пстп Т. е! а1., 1996; 8тш1уа8и1а 8.М. е! а1., 1996).
Активация процесса запрограммированной гибели клеток, как правило, специфична и включает последовательный процессинг нижних каспаз, называемых исполняющими каспазами, верхними каспазами, называемых инициирующими каспазами. Функциональные характеристики двух классов каспаз также отражаются в их строении. Действительно, инициирующие каспазы содержат более длинную продоменную область, по сравнению с исполняющими каспазами (8а1уе5еп С.8. е! а1., 1997; Сойеп С.М., 1997). Длинный продомен позволяет инициирующим или апикальным каспазам активироваться путем инициации рецепторов гибели семейства рецепторов для ΤΝΓ. После индуцированной лигандом тримеризации рецепторов гибели, инициирующие каспазы набираются через их длинный Ν-концевой продомен для взаимодействия со специфическими адаптерными молекулами с образованием комплекса, передающего сигнал индуцирования гибели (Сойсп С.М., 1997; Кщсйке1 Р.С., е! а1., 1995). Например, каспаза-8/МАСН и, вероятно, каспаза-10, которые содержат два эффекторных домена гибели (ΌΕΌ) или ΡΑΌΌ-домена, включаются в рецепторный комплекс с помощью адаптерных молекул ΡΑΌΌ/ΜΘΚΤ-1, в то время как каспаза-2 включается при помощи ΟΚΑΌΌ/ΚΑΙΌΌ и ΚΙΡ (№ща1а 8. е! а1., 1997; МсРат1апе М. е! а1., 1997; Лйта4 М. е! а1., 1997; Эпап Н. е! а1., 1997). Вследствие тримерной природы активированного рецепторного комплекса полагают, что по меньшей мере две молекулы каспазы приходят в непосредственную близость друг с другом, приводящую, таким образом, их к активации путем аутокаталитического процессирования (Уапд е! а1., 1998; Михю е! а1., 1998).
Каспазы синтезируются как проферменты, состоящие из трех основных субъединиц - Ν-концевого продомена и двух субъединиц, иногда разделенных линкерным пептидом. Эти две субъединицы названы длинной или субъединицей 1, содержащей активный участок фермента, и короткой или субъединицей 2. Для полной активации фермента продомен и две субъединицы расщепляются. Две отщепленные субъединицы образуют гетеродимер, в соответствии с чем длинный домен образуется из Ν-конца, а короткая субъединица образуется из С-концевой области предшественника каспазы. Исходя из установленной трехмерной структуры каспазы-3, оказывается, что С-конец длинного домена так же, как и Νконец короткого субдомена, свободны, и С-конец короткой субъединицы приходит в непосредственную близость с Ν-концом длинной субъединицы для того, чтобы образовать правильно сложенный и активный фермент (Ко!оп4а е! а1., 1996; МЙ11 е! а1., 1997; 8тш1уа8и1а е! а1., 1998).
Ν-ацетилглюкозамин-б-фосфатдеацетилаза является внутриклеточным ферментом, участвующим, как известно, во внутриклеточном метаболизме глюкозамина. Фрагмент геномной ДНК, содержащий Νацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазу, клонирован из продуцирующей хитиназу бактерии УФтю сйо1егае (Уатапо е! а1., Вю8С1. Вю!есЬпо1. Вюсйет., 61, р. 1349-53, 1997).
Ген падЛ, кодирующий №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазу Ε. сой, также известен [см., например. Реп е! а1., 1апиату 1990, 68(1), рр. 123-137]. Θ клонировании и секвенировании Νацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека пока не сообщается.
Краткое изложение сущности изобретения
Изобретение относится к полипептиду, взаимодействующему с субъединицей 1 и/или субъединицей 2 каспазы-8.
Изобретение также относится к вариантам указанного полипептида.
Изобретение также относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 7.
Также в объем изобретения входит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, кодированную, в частности, клоном р74, как описано ниже.
Изобретение также относится к описанному выше полипептиду, который расщепляется каспазой-8 Ш У1!то или Ш У1Уо.
Изобретение также относится к выделенной последовательности ДНК, кодирующей полипептиду изобретения. В объем изобретения входит последовательность ДНК, представленная на фиг. 5а.
В объем изобретения также входит выделенная ДНК, способная гибридизироваться с указанной последовательностью ДНК в умеренно строгих условиях.
Изобретение также относится к вектору, содержащему последовательность ДНК, определение которой дано выше.
Изобретение также относится к эукариотной или прокариотной клетке-хозяину, содержащей вектор изобретения.
Изобретение также относится к способу получения полипептида, взаимодействующего с каспазой8, включающему выращивание клетки-хозяина по изобретению в условиях, допускающих продуцирование указанного полипептида, воздействие на посттрансляционные модификации, необходимое для получения указанного полипептида, и выделение указанного полипептида.
Изобретение также относится к указанному способу, где клеткой является прокариотическая клетка.
Изобретение также относится к указанному способу, где клеткой является эукариотическая клетка.
Изобретение также относится к указанному способу, где клеткой является клетка млекопитающего,
- 4 007273 насекомого или дрожжей.
Изобретение также относится к указанному способу, где клеткой является клетка НеЬа или 2 93 Т НЕК.
Изобретение также относится к указанному способу, где в качестве промотора используют промотор СМУ человека.
Изобретение также относится к рибозиму, специфическому для нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательности ДНК изобретения.
Изобретение также относится к антисмысловому олигонуклеотиду, содержащему по меньшей мере 9 нуклеотидов последовательности, соответствующей последовательности ДНК изобретения.
Изобретение также относится к антителу против эпитопа белка изобретения.
Изобретение также относится к набору для иммуноанализа, предназначенного для обнаружения белка, взаимодействующего с каспазой-8, с участием антитела изобретения.
Изобретение также относится к указанному полипептиду, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения при модуляции активности каспазы-8.
Изобретение также относится к указанному полипептиду, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения при модуляции действий, опосредованных рецептором для ΤΝΡ или Рак.
Изобретение также еще относится к указанному полипептиду, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения при модуляции апоптоза.
Изобретение также относится к указанному полипептиду, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения в качестве лечебного средства.
Изобретение также относится к указанному полипептиду, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения в качестве лечебного средства при лечении рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита, диабета, волчанки, аутоиммунного миокардита I, опосредованного НСУ хронического гепатита, хронического гастрита, например, гастрита типа А, смешанной болезни соединительной ткани (МСТИ), болезни Крона или неспецифического язвенного колита.
Изобретение также относится к полипептиду, который применяется для выделения, идентификации и клонировании другого белка или полипептида того же класса.
Термин взаимодействующий в контексте данного описания, относящийся к взаимодействию полипептида или белка по изобретению с каспазой-8, предназначен для обозначения форм прямого взаимодействия, таких как связывание и расщепление, и косвенного взаимодействия, например, через адаптерные белки. Взаимодействие может привести, необязательно, к модуляции сигнала, опосредуемого каспазой-8.
Термин связывание в контексте данной заявки, когда относится к связыванию белков, взаимодействующих с каспазой-8, предназначен для обозначения физической связи белка, взаимодействующего с каспазой-8, с каспазой-8. Эту физическую связь можно измерить при иммуноанализах, таких как анализы ЕЫ8А или РИА, при двухгибридном испытании, анализах с иммунопреципитацией или анализах на основе разделения по размеру, таких как электрофорез в неденатурирующем геле или гель-хроматография, смеси каспазы-8 или ее субъединицы и белка изобретения. При использовании двухгибридного испытания имеется в виду, что каспаза-8 или ее субъединица экспрессируются в виде гибрида домена активации ДНК, а белок, взаимодействующий с каспазой-8, зкспрессируестя в виде гибрида домена связывания ДНК, или наоборот.
Термин двухгибридное испытание относится к двухгибридному анализу, когда белок-белковые взаимодействия можно измерить посредством введения в дрожжевые клетки первого экспрессирующего вектора, кодирующего гибрид первого белка и домена связывания ДНК, и второго экспрессирующего вектора, кодирующего гибрид второго белка и домена активации ДНК. Дрожжевые клетки должны содержать по меньшей мере один репортерный ген, управляемый промотором, содержащим мотив последовательности ДНК, распознаваемый указанным доменом связывания ДНК. Как правило, используют два репортерных гена, например, гистидин-синтетазу и бета-галактозидазу. Это позволяет исследователям избежать ложных положительных результатов, которые могут появиться от мутации. Этот метод модифицирован и усовершенствован авторами настоящей заявки для применения при скрининге, выделении и испытании белков, опосредующих сигналы ΤΝΡ-Κ и Рак, см., например, ХУО 97/03998 и приведенные там ссылки. Двухгибридное испытание опирается на локализацию обоих слитых белков в ядре клетки.
Термин двухгибридное испытание, используемый здесь, также включает модификацию двухгибридного метода, когда используют белки, подающие сигнал роста клетки, такие как гак и кок (Вгобег е1 а1., Сигг. ΒίοΙ., 1998, 8, р. 1121-4; Лгопйепп е1 а1., ΝιιοΕίο АеИк Век., 1997, 25, р. 3373-4, и указанные в этих работах ссылки). Для того, чтобы быть функциональными, этим белкам требуется перемещение в
- 5 007273 клеточную мембрану. Это достигается посредством экспрессии белка, подающего сигнал роста клетки, в виде гибрида с первым белком, и экспрессии сигнала локализации в клеточной мембране, такого как сигнальная последовательность миристилирования, в виде гибрида со вторым белком. Взаимодействие между первым и вторым белком будет перемещать белок, подающий сигнал роста клетки, в клеточную мембрану, и таким образом инициировать рост клетки. Затем отбирают агрессивно растущие клетки для дальнейшего исследования. Эта система отличается от описанной выше двухгибридной системы, поскольку не основана на локализации обоих гибридов в ядре клетки.
Термин наживка относится к белку в вышеуказанном двухгибридном испытании, который экспрессируется в виде слитого белка с доменом связывания ДНК.
Термин добыча относится к белку в вышеуказанном двухгибридном испытании, который экспрессируется в виде слитого белка с доменом активации ДНК.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 показывает схематическое изображение одноцепочечной конструкции каспазы-8, используемой в качестве наживки при двухгибридном скрининге, описанном в примере 1В.
Фиг. 2 представляет предварительный неполный нуклеотид (8Еф ΙΌ N0: 1) и расшифрованную аминокислотную последовательность (8Еф ΙΌ N0: 2) клона 32, кодирующую белок, взаимодействующий с каспазой-8, полученный из клона кДНК.
Фиг. 3 показывает предполагаемую полноразмерную последовательность нуклеотида человека (8Еф ΙΌ N0: 3) и расшифрованную аминокислотную последовательность (8Еф ΙΌ N0: 4) Νацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы, составленную из наращивания по 5' клона 12 клона Е8Т АА460869 и клона ловушки экзона Ь48741.
Фиг. 4А показывает функциональную активность экспрессированного клона 12 в виде процента апоптозных клеток после трансфекции клеток НЕК-2 93Т или одним рецептором для Т№ р55 (обозначенным р55 Т№-К), или рецептором для Т№ р55 вместе с р35 - бакуловирусным ингибитором каспаз (р55+р35), или с клоном 12 (р55+12), или рецептором для Т№ р55 вместе с нерасщепляемым мутантом 12 (обозначенным 1*), содержащим замену Акр на С1и в позиции 346 на фиг. 3 (р55+12*). Этот мутант нельзя расщепить ни ίη νίΐτο, ни ίη νίνο.
Фиг. 4В показывает процент апоптозных клеток НеЕа, одних или после трансфекции р35, или 12, или 12*, обработанных Т№ и циклогексимидом.
Фиг. 5А показывает 172 5 кодирующих пар оснований в 5'-конце клона Р74 (8Еф ΙΌ N0: 5) .
Фиг. 5В показывает последовательность 574 аминокислот (8Еф ΙΌ N0: 6), расшифрованную из последовательности клона Р74 показанной на фиг. 5А.
Фиг. 6 показывает последовательность 1428 аминокислот (8Еф ΙΌ N0: 7) открытой рамки считывания, полученную из расшифрованной аминокислотной последовательности клона РАС, инвентарный номер ΡΡ0Ι5-1057Ι20.
Фиг. 7 показывает расположенные в ряд 574 аминокислоты открытой рамки считывания, полученной из расшифрованной аминокислотной последовательности клона р74 (обозначенной клонированная), в сравнении с 1428 аминокислотами открытой рамки считывания, полученной из расшифрованной аминокислотной последовательности клона РАС, ΗΡΟΙ5-1057Ι20 (обозначенной расшифрованная).
Фиг. 8 показывает расположенную в ряд открытую рамку считывания расшифрованной аминокислотной последовательности клона ΕΡΟΙ5-1057Ι20 (верхняя последовательность) с последовательностью гистондеацетилазы А (нижняя последовательность, инвентарный номер СепЬапк №-006028.1) (8Еф ΙΌ N0: 9).
Фиг. 9А показывает ауторадиографию Βίά-белка и белков, кодированных клонами кДНК 12, или Ρ16, или Р43, или Р70, или Р74, или Р79, полученных в лизате ретикулоцитов в присутствии 358метионина, разделенных методом δΌδ-РАСЕ.
Фиг. 9В показывает ауторадиографию Βίά-белка и белков, кодированных клонами кДНК 12, или Ρ16, или Р43, или Р70, или Р74, или Р79, полученных так же, как в случае фиг. 9А, при анализе на связывание с каспазой-8, экспрессированной в бактериях в виде слитого белка двух ее субъединиц, гибридизированных с С8Т. Положение маркеров молекулярной массы показано на геле слева.
Фиг. 10 показывает результаты расщепления белка, кодированного неполным клоном кДНК Р43, каспазой-8 или каспазой-10, или каспазой-3, или каспазой-9, или мутантами каспазы-3, или каспазы-9, или каспазы-10. Объемы всех использованных бактериальных лизатов рекомбинантных каспаз, экспрессированных в Е. сой, показаны в относительных единицах (КН). Положение маркеров молекулярной массы показано на геле слева. Представляющие интерес белки помечены звездочками: стрелки с заштрихованными остриями показывают полноразмерный белок Р43, а стрелки с незаштрихованными остриями показывают продукты расщепления.
Фиг. 11 показывает функциональную активность белков, кодированных клонами кДНК, идентифицированными посредством двухгибридного скрининга, выраженную в виде процента клеток, претерпевающих апоптоз, после котрансфекции клеток НЕК-293Т рецептором для Т№ р55 и белком зеленой флуоресценции (помеченным РС), без или с вставками кДНК клонов 12, или Ρ16, или Р27, или Р43, или Р79, или Р74, или Р70.
- 6 007273
Фиг. 12 показывает ингибирующую активность в отношении гибели клеток дикого типа и нерасщепляемого мутанта ΤίρΟΟ в клетках НЕК-293Т, котрансфицированных рецептором для ΤΝΕ р55 и белком зеленой флуоресценции, а также действие Δ32-Τίρ60, лишенного первых 32 Ν-концевых аминокислот. Контрольные клетки трансфицированы одним вектором ρί,ΌΝ.
Подробное описание изобретения
Многие методы молекулярной биологии здесь подробно не описываются, так как они хорошо известны специалистам в этой области техники. К таким методам относятся сайтнаправленный мутагенез, клонирование методом РСК, скрининг фаговой библиотеки с использованием олигонуклеотидных или кДНК-зондов, экспрессия кДНК, анализ рекомбинантных белков, трансформация бактериальных и дрожжевых клеток, трансфекция клеток млекопитающих и т.п. К литературе, где описываются такие методы, относятся, например, издания 8атЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд А БаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу; Ι8ΒΝ: 0879693096, 1989, Сиггеп! Рго1осо1§ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Ьу Е.М. Аи8иЬе1, Ι8ΒΝ: 047150338Х, 1988, и 8йоЦ Рго1осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Ьу Е.М. Аи8иЬе1 е1 а1. (еб§.), 3гб еб., 1о11п Абеу & 8оп5; Ι8ΒΝ: 0471137812, 1995. Эти публикации включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Для того, чтобы методом двухгибридного скрининга идентифицировать белки, взаимодействующие с каспазой-8, можно использовать систему с двумя гибридами или тремя гибридами.
Систему с двумя гибридами в способе изобретения используют, по существу, в том виде, в каком она описана Е1е1б§ апб 8опд (№11иге. 340, ρ. 245, 1989). Предпочтительно, отдельные векторы, дрожжевые штаммы и библиотеки можно получить от С1оп1ес11 (Пало-Альто, США), как компоненты двухгибридной системы Ма1сйтакег (#РТ1265-1).
Предпочтительный вариант системы с двумя дрожжевыми гибридами, используемой в способе изобретения, описан Во1б1п е1 а1., Се11, 85, р. 803-15, 1996. Система с двумя дрожжевыми гибридами также описана в патенте США 5580736, Вгеп1 е1 а1. Эти публикации включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Трехгибридная система используется, по существу, так, как описано Тйобе е1 а1., 1. Вю1. Сйет., 272, р. 22995-9, 1997.
Для обнаружения соответствующих изобретению белков, взаимодействующих с каспазой-8, необходимо, чтобы две субъединицы каспазы-8 экспрессировались независимо. С этой целью две субъединицы каспазы-8 экспрессируют, предпочтительно, по отдельности под контролем разных промоторов. В предпочтительном варианте воплощения изобретения субъединица каспазы-8 р10 (от серина 375 до аспарагиновой кислоты 479) экспрессируется под контролем слабого промотора, операбельного в дрожжах, в рамке с доменом связывания ДНК. Предпочтительно, слабый промотор представляет собой промотор дрожжей АЭН, а белком, связывающимся с ДНК, является домен связывания ДНК дрожжевого активатора транскрипции Са1-4 или бактериальный белок ЬехА. АЭН-промотор и домен связывания ДНК Са1-4 имеются, например, в доступном коммерчески рОВЭ, Пало-Альто, США. Однако для специалистов в этой области техники будет очевидно, что можно использовать другие промоторы, до тех пор, пока промотор эффективен в дрожжевых клетках. По этому же признаку можно использовать другие домены связывания ДНК, до тех пор, пока такие домены связывания ДНК не имеют функции активатора транскрипции.
Длинная активная субъединица каспазы-8 р20 (от серина 217 до аспарагиновой кислоты 374) экспрессируется в виде отдельного белка под контролем индуцибельного промотора, операбельного в дрожжевых клетках. Предпочтительно, можно использовать репрессируемый промотор метионин Ме125, как описано в указанной выше публикации Т1гобе е1 а1. Использование индуцибильного промотора упрощает обнаружение комплекса р10-р20 посредством иммунопреципитации и электрофореза в полиакриламидном геле. Индуцибельный промотор имеет также преимущество в том, что он делает возможной экспрессию в дрожжах белка, который может быть токсичным для дрожжевых клеток, вследствие возможности ограничения периода, в пределах которого экспрессируется потенциально токсичный белок.
Белки, скринируемые по способу изобретения, предпочтительно, представляют в форме библиотеки кДНК. Однако можно использовать также геномные библиотеки или комбинированные библиотеки. Библиотеку клонируют по С-концу домена активации транскрипции, операбельного в дрожжах. Предпочтительно используют дрожжевой домен активации транскрипции Оа1-4, однако можно использовать многие другие активаторы транскрипции. Предпочтительно для клонирования библиотеки используют вектор рОАЭ ОН, доступный от С.’1оп1ес11.
Штамм дрожжей, используемый для скрининга, должен содержать селективный маркер, такой как гистидинсинтетаза, под контролем промотора, содержащего последовательность ДНК, с которой специфически связывается вышеуказанный домен связывания ДНК. Предпочтительно дрожжевая клетка также содержит репортерный ген под контролем промотора, содержащего последовательность ДНК, с которой специфически связывается вышеуказанный домен связывания ДНК. Штамм дрожжей НЕ7с, доступный от С1оп1есй, можно использовать для скрининга с гибридами домена связывания Оа1-4; штамм Ь40 можно использовать, когда используют домен связывания ДНК 1ехА.
После трансформации дрожжевые клетки помещают в условия, селективные для активного высева
- 7 007273 ния в среды, лишенные некоторых аминокислот, что требуется для устойчивости введенных в них плазмид.
Среда является селективной для дрожжевых клеток, в которых активируется ген для вышеуказанного селективного маркера. Предпочтительно селективный маркер представляет собой ген гистидинсинтетазы. Клетки дрожжей, экспрессирующие этот ген, можно отобрать для культивирования в среде, лишенной гистидина. Преимуществом такой системы является возможность добавления в среду для роста ингибитора гистидинсинтетазы 3-аминотриазола. Таким образом, возможно подавлять рост дрожжевых клеток, в которых гистидинсинтетаза экспрессируется в небольшом количестве, что вызвано утечкой промотора, содержащего последовательность, с которой специфически связывается вышеуказанный домен связывания ДНК. В некоторых клонах слабое неспецифическое взаимодействие между субъединицей каспазы-8 р10 и/или р20 и указанным клоном может вызвать кажущуюся активацию указанного промотора. Таким образом, повышая концентрацию указанного ингибитора в среде, используемой для селекции взаимодействующих клонов, можно отобрать только такие клоны, которые взаимодействуют с определенной минимальной силой. Концентрация 3-аминотриазола составляет, предпочтительно, 7,5 мМ.
Клоны, идентифицированные по их способности расти в среде, лишенной гистидина, затем анализируют путем количественного определения активности их репортерного гена. Предпочтительно в качестве репортерного гена используют ген 1;·ιοΖ. Количественное определение активности 1;·ιοΖ осуществляют, предпочтительно, в жидкой культуре, как описано Βοϊάίη е1 а1., 1. Βίο1. СНет., 270, 7795-8, 1995.
Описанный выше способ скрининга можно осуществить подобным образом с использованием двухгибридного испытания. Существенное отличие состоит в том, что две субъединицы каспазы-8 экспрессируются в виде единой пептидной цепи и представляют собой слитый белок с указанным выше доменом связывания ДНК. Субъединицу р20 мутируют в ее активном сайте (цистеин 360-серин 360) так, как описано ниже.
Предпочтительно субъединицу р10 отделяют от субъединицы р20 с помощью линкера, который, предпочтительно, имеет длину от 10 до 50 аминокислот. Указанный линкер содержит, предпочтительно, небольшие незаряженные аминокислоты, такие как глицин, серин, треонин, аланин и валин. Предпочтительнее, линкер состоит из остатков серина и глицина. Наиболее предпочтительно, когда соотношение между остатками глицина и остатками серина в указанном линкере составляет примерно от 3:1 до 4:1.
Получение клонов с использованием двухгибридной системы с описанной выше наживкой каспазы8 подобно описанному выше применению трехгибридной системы, за исключением того, что клоны, связывающиеся только с одной из субъединиц, трудно отличить от клонов, связывающихся с обеими субъединицами или требующих для связывания комплекс из двух субъединиц. Однако любой клон, обнаруженный при двухгибридном способе, можно легко проверить на связывание с двумя субъединицами посредством оценки 1асΖ-активности двойных трансформантов, т.е. дрожжевых клеток, трансформированных вновь идентифицируемым клоном и субъединицей каспазы-8 - или р10 или р20, где указанная субъединица слита с доменом связывания ДНК. Связывание с комплексом субъединиц р10 и р20 также можно легко оценить посредством определения 1асΖ-активности тройных трансформантов, где одна из субъединиц каспазы-8 экспрессируется в виде слитого белка с доменом связывания ДНК, а другая является отдельным белком. Очевидно, что вышеуказанная трехгибридная система, следовательно, также полезна для определения характеристик связывания клонов, найденных с помощью двухгибридной системы, так как индуцибельный промотор, используемый в ней, дает возможность быстрой идентификации клонов, взаимодействующих только с субъединицей 10 или с комплексом субъединиц р10-р20.
Клоны, способные расти в среде, лишенной гистидина, и экспрессирующие 1асΖ-активность, затем отбирают для дальнейшего исследования. Сначала белки, кодированные указанными клонами, проверяют на их способность связываться с нерелевантными белками, такими как ламин. Как правило, клоны, связывающиеся с ламином, отбрасывают.
Клоны, найденные для специфического взаимодействия с каспазой-8, затем анализируют далее. Такой анализ проводят с неполными клонами, полученными непосредственно при описанных выше способах скрининга, а также с полноразмерными клонами, полученными на основе последовательности указанных неполных клонов. Для того, чтобы получить полноразмерные клоны, получают последовательность неполного клона посредством экстракции ДНК указанного клона из дрожжевых клеток способами, известными специалистам в этой области техники. Затем ДНК переносят в бактерии для того, чтобы получить большое количество очищенной ДНК, которое можно использовать для секвенирования. С другой стороны, для целей секвенирования вставку в векторе, представляющем собой, предпочтительно, вышеуказанный вектор ρΟΒΌ, можно вырезать с использованием рестриктаз и клонировать в другой вектор, такой как рВШекепрк доступный от 81га1адепе. Секвенирование осуществляют методом терминации цепи, предпочтительно, с использованием фермента секвеназы-2, доступной из набора для секвенирования от Ипйеб 81а1е8 В1осйеш1са1к.
Затем полученную таким образом последовательность можно ввести в базу данных программы поиска и посредством компьютерного поиска идентифицировать перекрывающиеся последовательности. Используемые программы хорошо известны специалистам в этой области техники и включают, напри
- 8 007273 мер, пакет ОСС (депеОск сотри!ег дгоир). Предпочтительно используют сервисную программу поиска, такую как Вакю Ьоса1 Айдшеп! 8еатсй Тоо1 (ВЬА8Т), доступную с сервера ЕМВЬ (например, ййр://боуе.етЬ1-йе1бе1Ьегд.бе/В1ак!2/). Команды В1ак1п можно использовать для поиска нуклеотидных последовательностей, перекрывающих или схожих с идентифицированными клонами.
Белок, идентифицированный по способу изобретения, представляют в виде слитого белка с доменом связывания ДНК. Следовательно, рамка, в которой должна транслироваться нуклеотидная последовательность, известна, так как она должна быть в рамке с кодирующей последовательностью домена связывания ДНК. Последовательность ДНК клона, идентифицированного по изобретению, можно, следовательно, однозначно транслировать в аминокислотную последовательность. Затем для идентификации перекрывающихся белковых последовательностей или подобных белков можно использовать программу В1ак!р, доступную на вышеуказанном сервере ЕМВЬ.
С другой стороны, или кроме вышеуказанных способов поиска в базе данных, для того, чтобы идентифицировать полные клоны, можно скринировать библиотеку, такую как геномная библиотека или библиотека кДНК. Такие способы скрининга описаны в указанных выше изданиях 8ашЬтоок е! а1. и АикиЬе1 е! а1. С другой стороны, или кроме того, можно использовать методы клонирования на основе РСК, такие как быстрая амплификация концов кДНК (5' апб 3' КАСЕ, Сгайат е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Кек. Соттип., 177, р. 8-16, 1991, и указанные в этой работе ссылки).
Неполные клоны, идентифицированные при скрининг-анализе по изобретению, или полноразмерные клоны, полученные любым из описанных выше способов, затем исследуют далее. Это осуществляют, например, путем испытания чувствительности этих клонов к протеолитическому расщеплению активной каспазой-8. Этот анализ можно проводить ίη у1уо. Для этой цели линию клеток млекопитающего трансфицируют экспрессирующим вектором, который продуцирует белок, кодированный испытываемым клоном, и экспрессирующим вектором, кодирующим второй белок, экспрессия которого будет индуцировать активность каспазы-8.
Экспрессирующие векторы, предпочтительно, содержат сильный промотор для экспрессии клона и второго белка, такой как вирус саркомы Рауса (К8У, Уашашо!о е! а1., Се11, 22, р. 787-97, 1980), вирус миелопролиферативной саркомы (МР8У, АйеЙ Р. е! а1., Сепе, 68, р. 213-9, 1988), цитомегаловирус (СМУ, ТНоткеп е! а1., ΡΝΛ8. 81, р. 659-63, 1984), или подобные промоторы вирусного или клеточного происхождения.
Второй белок, экспрессия которого индуцирует активность каспазы-8, выбирают среди внутриклеточного домена Рак, внутриклеточного домена СЭ120а, Мог!-1, каспазы-8, или эквивалента белка, способного индуцировать активность каспазы-8. С другой стороны, активность каспазы-8 можно индуцировать в клетках посредством обработки ΤΝΡ или лигандом СЭ95. Подробности эксперимента, возможный механизм и другие технические подробности анализа такого типа описаны в указанной выше работе Во1бш е! а1., Се11, 1996.
После введения в клетку млекопитающего указанного выше экспрессирующего вектора, кодирующего второй белок, и испытываемого белка, выращивают культуру клеток в течение времени, достаточного для осуществления экспрессии белков, активации или экспрессии каспазы-8 и расщепления испытываемого белка. Указанный период времени обычно составляет от 4 до 72 ч, предпочтительно - от 16 до 30 ч, и наиболее предпочтительно - от 20 до 24 ч. Для того, чтобы определить степень расщепления, получают лизат целых клеток. С другой стороны, можно очистить меченый белок с использованием антител против метки или хроматографии с никелем и нитрилоуксусной кислотой, реагенты и подробные протоколы которых доступны от 01адеп СтЬН, Хилден, Германия. Метод иммунопреципитации описан в указанной выше работе Во1бт е! а1., Се11, 1996. Реагенты и указания по иммунопреципитации также доступны в форме набора от Воейппдет Маппйе1т, Маннгейм, Германия.
Затем лизат целых клеток очищенного белка разделяют по размеру посредством электрофореза в полиакриламидном геле с добавлением 8Ό8.
Испытываемый белок или его меченые фрагменты теперь можно визуализировать методом вестернблоттинга с использованием антител против метки. Предпочтительной меткой является гистидиновая метка в сочетании с антителом против полигистидина. Однако можно использовать другие сочетания последовательности-метки и антитела, специфического к ней, до тех пор, пока антитело остается специфическим к последовательности-метке, т.е. не узнает другие белки в лизате целых клеток. Специфичность расщепления можно проверить путем проведения контрольных реакций, при которых к культуре клеток млекопитающего в указанный выше период времени добавляют специфический ингибитор каспазы. Предпочтительный ингибитор представляет собой ингибитор, выбранный среди /УАП-Ртк, ζΌΕνΌГтк, ζΙΕΤΩ-Гтк (см. Керр1ег-На1кетеуег е! а1., ВюсйетПйу, 37, р. 16934-42, 1998). Более предпочтительным ингибитором является ζVΛ^-Гтк. Другие ингибиторы, которые можно использовать, представляют собой белки, такие как Вс1х или белок р35, действующие как клеточные ингибиторы каспаз. Подавление расщепления, когда в ходе анализа коэкспрессируются такие белки, показывает, что расщепление специфично для каспаз.
Другим анализом с целью испытания, может ли испытываемый белок расщепляться каспазой-8, является анализ ш уйто, при котором рекомбинантно продуцированная каспаза-8 используется в фермента
- 9 007273 тивной реакции вместе с меченым испытываемым белком. Испытываемый белок можно получить, как описано выше, посредством клонирования его кодирующей последовательности в экспрессирующий вектор, содержащий сильный промотор, и трансфекции в клетку млекопитающего. Выгодно метить испытываемый белок, как описано выше, с тем, чтобы его можно было выделить в чистом виде из экстракта клеток млекопитающего с помощью антител против метки или других агентов, способных специфически связываться с последовательностью-меткой. С другой стороны, испытываемый белок можно получить ίη νίίτο с использованием системы трансляции ίη νίίτο. Метод трансляции ίη νίίτο хорошо известен специалистам в этой области техники, и все реагенты для него и подробные протоколы доступны, например, от 81га1адспс. Ьа ίοΐΐα. И8Л.
С другой стороны, испытываемый белок можно пометить, например, с использованием радиоизотопа. Выгодно, при мечении изотопами, экспрессировать испытываемый белок ίη νίίτο, и во время реакции трансляции ίη νίίτο меченную изотопами аминокислоту добавлять вместе с немеченой кислотой. Предпочтительно изотоп представляет собой 835. Также предпочтительно, чтобы меченая аминокислота представляла собой 835-метионин, и соотношение между меченой и немеченой аминокислотой составляло от 1:1 до примерно 1:1000.
Затем полученный рекомбинантно испытываемый белок и полученный рекомбинантно активный белок каспазу-8 соединяют в подходящем буфере и дают проходить реакции расщепления в течение достаточного для этого времени. Предпочтительный буфер и другие предпочтительные параметры анализа описаны в указанной выше работе Βοϊάίη с1 а1., Се11, 1996. Предпочтительный период времени, как правило, составляет от 10 мин до нескольких часов, предпочтительно - от 30 мин до 1 ч.
После осуществления расщепления реакционную смесь разделяют по размеру молекул методом электорофореза в полиакриламидном геле в присутствии 8Ό8. Если использовано мечение изотопами, гель можно высушить, и обнаружить изотоп с помощью фотопленки или люминофоров (Ецр). Испытываемый белок метят, и обнаружить его можно с использованием специфических к метке антител при вестерн-блоттинге.
Появление дополнительных низкомолекулярных полос в реакционных смесях, в которые добавлен белок каспаза-8, по сравнению с контрольными реакционными смесями без каспазы-8, указывает на расщепление испытываемого белка каспазой-8. Кроме того, размер низкомолекулярных полос указывает приблизительное расположение сайта расщепления.
Настоящее изобретение относится к последовательности ДНК, кодирующей белки, взаимодействующие с каспазой-8.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к последовательностям ДНК, кодирующим биологически активные изоформу, аллельный вариант, функциональный аналог, мутант или производное белка, взаимодействующего с каспазой-8, и к кодированным ими белку, изоформе, аллельному варианту, функциональному аналогу, мутанту или производному. Получение таких аналогов, фрагментов, мутантов и производных является стандартной процедурой (см., например, δαιηόΐΌοΚ еί а1., 1989), при которой в последовательностях ДНК, кодирующих белок, взаимодействующий с каспазой-8, один или несколько кодонов можно делетировать, добавить или заменить другими и получить аналоги, имеющие по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка относительно нативного белка.
Среди последовательностей ДНК по изобретению, кодирующих белок, взаимодействующий с каспазой-8, изоформу, аллельный вариант, функциональный аналог, мутант или производное, также имеются, как вариант воплощения изобретения, последовательности ДНК, способные к гибридизации с последовательностью кДНК, полученной из кодирующей области нативного белка, взаимодействующего с каспазой-8, и такая гибридизация осуществляется в умеренно строгих условиях, и способные к гибридизации последовательности ДНК кодируют биологически активный белок, взаимодействующий с каспазой-8. Следовательно, к таким способным к гибридизации последовательностям ДНК относятся последовательности ДНК, имеющие относительно высокую гомологию с последовательностью кДНК нативного белка, взаимодействующего с каспазой-8, и, как таковые, представляют последовательности, похожие на белок, взаимодействующий с каспазой-8, которые могут представлять собой, например, последовательности природного происхождения, кодирующие различные изоформы белка, взаимодействующего с каспазой-8, или встречающиеся в природе последовательности, кодирующие белки, принадлежащие к группе последовательностей, похожих на белок, взаимодействующий с каспазой-8, кодирующих белок, обладающий активностью белка, взаимодействующего с каспазой-8. Кроме того, к таким последовательностям также могут относиться, например, последовательности, не встречающиеся в природе, полученные синтетически, подобные последовательности кДНК нативного белка, взаимодействующего с каспазой-8, но включающие ряд требуемых модификаций. Следовательно, такие синтетические последовательности включают все возможные последовательности, кодирующие аналоги, фрагменты и производные белка, взаимодействующего с каспазой-8, которые все обладают активностью белка, взаимодействующего с каспазой-8.
Используемые здесь строгие условия являются функцией температуры, используемой при экспериментах по гибридизации, молярности одновалентных катионов и процентного содержания формамида в растворе для гибридизации. Для того, чтобы определить степень строгости для любого данного набора
- 10 007273 условий, используют, в первую очередь, уравнение Мейнкота (Меткой) е1 а1. (1984) для определения устойчивости гибридов 100% идентичности, выраженное в виде температуры плавления Тт гибрида ДНК-ДНК: Тт = 81,5°С + 16,6(ЬодМ) + 0,41(%бС) - 0,61(%£огт) - 500/Ь, где М представляет собой молярность одновалентных катионов, %СС представляет собой % нуклеотидов С и С в ДНК, %£огт представляет собой процентное содержание формамида в растворе для гибридизации, и Ь представляет собой длину гибрида в парах оснований. На каждый 1°С, когда Тт снижается, исходя из величины, вычисленной для 100% идентичного гибрида, количество допускаемых ошибочных спариваний возрастает примерно на 1%. Таким образом, если Тт, используемая для любого данного эксперимента по гибридизации с определенной солью и концентрациями формамида, на 10оС ниже Тт, вычисленной для 100% гибрида в соответствии с уравнением Мейнкота, гибридизация будет происходить, даже если имеются примерно до 10% ошибочных спариваний.
Умеренно строгими условиями являются условия, обеспечивающие Тт, которая не более, чем на 20оС ниже Тт, которая должна быть для совершенного дуплекса с намеченной последовательностью, вычислена ли она по указанной выше формуле или измерена фактически. Без ограничений, в умеренно строгих (на 15-20оС ниже вычисленной или измеренной Тт, гибрида) условиях используют раствор для промывки 2x880 (стандартный солевой раствор цитрата) и 0,5% 8Ό8 (натрийдодецилсульфат) при соответствующей температуре ниже вычисленной Тт гибрида. Окончательная строгость условий обусловлена в первую очередь условиями промывки, особенно, если используемые условия гибридизации таковы, при которых наряду с устойчивыми гибридами образуются менее устойчивые гибриды. В таком случае более строгие условия промывки позволяют удалить менее устойчивые гибриды. Обычным условием гибридизации, которое можно использовать с умеренно строгими условиями промывки, описанными выше, является гибридизация в растворе 6х88С (или 6х88РЕ (стандартный солевой фосфат-ЭДТК раствор)), 5х раствор Денхардта, 0,5% 8Ό8 и 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при температуре приблизительно на 20-25оС ниже Тт. Если используют смешанные зонды, предпочтительно использовать тетраметиламмонийхлорид (ТМАС) вместо 88С (АикиЬе1, 1987, 1999).
Для того, чтобы получить указанные выше встречающиеся в природе последовательности, подобные белку, взаимодействующему с каспазой-8, можно использовать стандартные процедуры скрининга и выделения образцов ДНК или РНК природного происхождения из различных тканей с использованием в качестве зонда кДНК природного белка, взаимодействующего с каспазой-8, или ее части (см., например, стандартные процедуры, описанные в 8атЬгоок е1 а1., 1989).
Изобретение относится к белку, взаимодействующему с каспазой-8, который можно идентифицировать с помощью описанного выше скрининг-анализа. Изобретение также относится к полипептиду или белку, по существу, соответствующему белку, взаимодействующему с каспазой-8. Термин по существу, соответствующий включает не только белок, взаимодействующий с каспазой-8, но также полипептиды или белки, являющиеся его аналогами.
Аналоги, по существу, соответствующие белку, взаимодействующему с каспазой-8, представляют собой полипептиды, в которых одна или несколько аминокислот аминокислотной последовательности белка, взаимодействующего с каспазой-8, заменены другими аминокислотами, делетированы и/или встроены, при условии, что полученный белок обнаруживает, по существу, такую же или более высокую биологическую активность, чем белок, взаимодействующий с каспазой-8, которому он соответствует.
Для соответствия, по существу, белку, взаимодействующему с каспазой-8, изменения в последовательности белков, взаимодействующих с каспазой-8, такие как изоформы, являются, как правило, незначительными. Хотя число изменений может превышать 10, предпочтительно, чтобы изменений было не более 10, предпочтительнее - не более 5, и наиболее предпочтительно - не более 3 таких изменений. Можно использовать многие методы для поиска потенциально биологически активных белков, которые, по существу, соответствуют белкам, взаимодействующим с каспазой-8, и одним из таких методов является применение обычного метода мутагенеза для ДНК, кодирующей белок, приводящего к нескольким модификациям. Затем белки, экспрессированные клонами, можно скринировать на их способность связываться с каспазой-8 и модулировать активность каспазы-8 при модуляции/посредничестве в указанных выше внутриклеточных каскадах реакций.
Консервативными изменениями являются изменения, в результате которых не ожидают изменения активности белка, и, как правило, сначала скринируются как изменения, в результате которых не ожидают изменений размера, заряда или конфигурации белка, и не ожидают изменения его биологических свойств. К консервативным заменам белков, взаимодействующих с каспазой-8, относится аналог, где по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде консервативно заменен другой аминокислотой. Такие замены, предпочтительно, осуществляют в соответствии со списком, представленным в таблице ТА, и такие замены можно определить путем обычного эксперимента и обеспечить модификацию структурных и функциональных свойств молекулы синтезированного полипептида при сохранении свойств биологической активности белка, взаимодействующего с каспазой-8.
- 11 007273
Таблица ΙΑ
Исходный остаток Пример замены
А1а С1у; Зег
Агд Ьуз
Азп С1п; Η13
Азр С1и
Суз Зег
С1п Азп
С1и Азр
С1у А1а; Рго
Н1з Азп; С1п
Не Ьеи; Уа1
Ьеи 11е; Уа1
Ьуз Агд; С1п; С1и
МеЕ Ьеи; Туг; 11е
РЬе МеЕ; Ьеи; Туг
Зег ТЬг
ТЬг Зег
Тгр Туг
Туг Тгр; РЬе
Уа1 11е; Ьеи
С другой стороны, другую группу замен белка, взаимодействующего с каспазой-8, составляют замены, при которых по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде удаляют и на его место встраивают другой остаток в соответствии с приведенной далее таблицей ΙΒ. Типы замен, которые можно сделать в полипептиде, могут основываться на анализе частоты встречаемости аминокислотных замен в гомологичных белках разного вида, таких как замены, представленные в таблице 1-2 в работе Зсйик е! а1., О.Е., Ρπηοΐρίβδ о£Рго!ет 81шс1иге, 8рппдег-Уег1а§, Νε\ν Уогк, ΝΥ, 1978, и на фиг. 3-9 в работе СгещМоп, Т.Е. Рго1етз: 81шс1иге апс! Мо1еси1аг Ргорегйез, АН. Егеетап & Со., 8ап Ргапсшсо, СА, 1983. На основании такого анализа альтернативные консервативные замены определены здесь как замены в пределах одной из указанных далее групп.
Таблица ΙΒ
1. Небольшие алифатические неполярные или слабополярные остатки: А1а, Зег, ТЕг, (Рго, С1у)
2. Полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Азр, Азп, С1и, С1п
3. Полярные положительно заряженные остатки: ΗΪ3, Агд, Ьуз
4. Большие алифатические неполярные остатки: Мек, Ьеи, 11е,
Уа1, (Суз)
5. Большие ароматические остатки: РИе, Туг, Тгр
Три аминокислотных остатка, указанные выше в скобках, играют особую роль в строении белка. О1у является единственным остатком, лишенным какой-либо боковой цепи, и, таким образом, придает цепи гибкость. Однако это обстоятельство вызывает тенденцию промотирования образования вторичной структуры иного типа, чем а-спираль. Рго, в силу своей необычной геометрии, жестко сдерживает цепь и,
- 12007273 как правило, имеет склонность промотировать структуры, подобные бета-повороту, хотя в некоторых случаях Сук может быть способен принимать участие в образовании дисульфидной связи, которая важна для структуры белка. Бс1ш1х с( а1., цитировано выше, смогли соединить указанные выше группы 1 и 2. Следует также отметить, что Туг, в силу его возможности образования водородной связи, имеет существенное сходство с Бег и Тйг, и т.п.
Консервативные замены аминокислот в соответствии с настоящим изобретением, например, такие, какие указаны выше, известны в технике, и можно ожидать, что после замены аминокислот биологические и структурные свойства полипептида сохраняются. Большинство делеций и замен в соответствии с настоящим изобретением являются такими, которые не вызывают радикальных изменений в характеристиках белковой или пептидной молекулы. Характеристики не являются исключительным определением как замен во вторичной структуре, например, а-спирали на бета-складку, а также изменений биологической активности, например, связывания с каспазой-8, так и/или опосредования действия каспазы-8 на гибель клеток.
Примеры получения замен аминокислот в белках, которые можно использовать для получения аналогов белков, взаимодействующих с каспазой-8, для использования в настоящем изобретении включают стадии любых известных способов, например, представленные в патентах США КБ 33653, 4959314, 4588585 и 4737462, Магк е1 а1.; 5116943, КоЛк е1 а1.; 4965195, Матеи е1 а1.; 4879111, Сйоид е1 а1.; и 5017691, Бее е( а1.; а в патенте США № 4904584 (Бйоте е( а1.) представлены лизинзамещенные белки.
Подразумевается, что в объем изобретения, кроме описанных выше консервативных замен, которые, по существу, не изменяют активность белка, взаимодействующего с каспазой-8, входят или консервативные изменения или менее консервативные и более случайные замены, приводящие к возрастанию биологической активности аналогов белков, взаимодействующих с каспазой-8.
Когда специалист в данной области техники подтверждает точное воздействие замены или делеций, следует иметь в виду, что действие замены(замен), делеции(ий) и т.п. будет оцениваться с помощью обычных анализов связывания и гибели клеток. Скрининг с использованием такого стандартного испытания не включает уникальных экспериментов.
Приемлемыми аналогами, взаимодействующими с каспазой-8, являются аналоги, сохраняющие по меньшей мере способность взаимодействовать с каспазой-8 и, в силу этого, опосредовать активность каспазы-8 во внутриклеточном метаболизме, или модулировать активность самой каспазы-8. При этом можно получить аналоги, которые имеют так называемое доминантотрицательное действие, а именно, аналог, который дефектен в отношении связывания с каспазой-8 или последующей передачи сигнала, или в отношении другой активности после такого связывания. Такие аналоги можно использовать, например, для ингибирования цитотоксического действия каспазы-8 или для его усиления, в зависимости от того, требуется усилить гибель клеток или их выживаемость, и в зависимости от того, какая из этих активностей является главной, модулируемой взаимодействием белка, взаимодействующего с каспазой8, и каспазой-8 (см. выше), и это с помощью таких аналогов, конкурирующих с природным белком, взаимодействующим с каспазой-8, за связывание или взаимодействие с каспазой-8.
На генетическом уровне такие аналоги получают, как правило, посредством сайтнаправленного мутагенеза нуклеотидов в ДНК, кодирующей белок, взаимодействующий с каспазой-8, причем посредством этого продуцируется ДНК, кодирующая аналог, и затем в рекомбинантной клеточной культуре синтезируется ДНК и экспрессируется полипептид. Аналоги, как правило, обнаруживают такую же или качественно повышенную биологическую активность по сравнению с встречающимся в природе белком, АикиЬе1 е( а1., Сиггеп! РгоЮсо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Сгееие РиЬйсайоик аиб Уйеу 1и1ег8с1еисе, №\ν Уогк, ΝΥ, 1987-1995; БатЬгоок е( а1., Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога1огу Маииа1, Со1б Брпид НагЬог БаЬогаЮгу. Со1б Брпид НагЬог, ΝΥ, 1989.
Получение таким образом белка, взаимодействующего с каспазой-8, или альтернативной нуклеотидной последовательности, кодирующей тот же полипептид, но отличающейся от природной последовательности вследствие замен, дозволенных известным вырождением генетического кода, можно достичь с помощью сайтнаправленного мутагенеза ДНК, кодирующей полученный ранее аналог или нативный вариант белка, взаимодействующего с каспазой-8. Сайтспецифический мутагенез позволяет получить аналоги посредством применения специфических олигонуклеотидных последовательностей, кодирующих последовательность ДНК нужной мутации, а также достаточное число соседних нуклеотидов, чтобы получить последовательность-затравку достаточного размера и сложности последовательности для образования устойчивого дуплекса по обеим сторонам пересекающейся области делеции. Как правило, предпочтителен праймер длиной примерно в 20-25 нуклеотидов, примерно с 5-10 комплементирующими нуклеотидами с каждой стороны изменяемой последовательности. Вообще, метод сайтспецифического мутагенеза хорошо известен в технике, например, из таких публикаций, как Абе1таи е( а1., ΌΝΑ, 2:183 (1983), включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
Как будет понятно, в методе сайтспецифического мутагенеза, как правило, используется фаговый вектор, существующий как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной форме. Типичные векторы, полезные при сайтнаправленном мутагенезе, включают такие векторы, как фаг М13, например, как описано в работе Меккищ е( а1., ТЫгб С1еуе1аиб Бутрокшт ои Масгото1еси1ек аиб КесотЬтагИ ΌΝΑ, ЕбПог А.
- 13 007273 ^а1!оп, Е1§еу1ег, Атйегбат (1981), включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Такие фаги доступны коммерчески, и их применение хорошо известно специалистам в этой области техники. С другой стороны, для получения одноцепочечной ДНК можно использовать плазмидные векторы, содержащие одноцепочечный фаговый ориджин репликации (Уепа е! а1., Ме!й. Епгуток, 153:3, 1987).
Вообще, сайтнаправленный мутагенез в соответствии с описанным выше осуществляют посредством получения сначала одноцепочечного вектора, включающего в свою последовательность последовательность ДНК, кодирующую релевантный полипептид. Олигонуклеотидный праймер, содержащий нужную мутированную последовательность, получают синтетически посредством автоматизированного синтеза ДНК/олигонуклеотидов. Затем этот праймер отжигают с одноцепочечным вектором, содержащим последовательность белка, и подвергают воздействию ферментов, полимеризующих ДНК, таких как фрагмент Кленова полимеразы I Е. сой, для завершения синтеза цепи, содержащей мутацию. Таким образом, мутированная последовательность и вторая цепь содержат нужную мутацию. Затем этот гетеродуплексный вектор используют для трансформации соответствующих клеток, таких как клетки Е. сой 1М101, и отбирают клоны, которые включают рекомбинантные векторы, содержащие порядок мутированной последовательности.
После того, как такой клон отобрали, последовательность белка, взаимодействующего с каспазой-8, можно извлечь и поместить в соответствующий вектор, как правило, вектор переноса или экспрессирующий вектор типа, который можно использовать для трансфекции соответствующего хозяина.
Соответственно, ген или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, взаимодействующий с каспазой-8, также можно обнаружить, получен он и/или модифицирован ίπ уйго, ίπ кйи и/или ίπ у1уо, путем использования известных методов амплификации ДНК или РНК, таких как РСК и химический синтез олигонуклеотидов. РСК дает возможность амплификации последовательностей ДНК посредством повторяющихся полимеразных реакций ДНК. Такую реакцию можно использовать как замену клонирования; все, что требуется, - это знание нуклеотидной последовательности. Для того, чтобы осуществить РСК, создают праймеры, комплементарные к последовательности, представляющей интерес. Затем праймеры получают посредством автоматизированного синтеза ДНК. Поскольку можно создать праймеры для гибридизации любой части гена, условия можно создать такие, что можно допустить ошибки при спаривании комплементарных оснований. Амплификация таких ошибочных областей может привести к синтезу мутагенного продукта, и причем результатом является генерация пептида с новыми свойствами (т.е. сайтнаправленный мутагенез). См. также Аи8иЬе1, цитировано выше, глава 16. Кроме того, посредством сочетания синтеза комплементарных ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы с РСК можно использовать РНК в качестве исходного вещества для синтеза внеклеточного домена рецептора пролактина без клонирования.
Кроме того, можно создать праймеры РСК для внесения новых сайтов рестрикции или других признаков, таких как кодоны терминации, в концы амплифицируемого сегмента гена. Такое размещение сайтов рестрикции по 5'- и 3'-концам амплифицированной последовательности гена позволяет создать сегменты гена, кодирующие белок, взаимодействующий с каспазой-8, или его фрагмент, для лигирования других последовательностей и/или сайтов клонирования с векторами.
РСК и другие способы амплификации РНК и/или ДНК хорошо известны в технике и могут применяться в соответствии с настоящим изобретением без излишнего экспериментирования на основе положений и указаний, приведенных здесь. К известным способам амплификации ДНК или РНК относятся, но не ограничиваются перечисленным, полимеразная цепная реакция (РСК) и родственные способы амплификации (см., например, патенты США №№ 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, МиШ§ е! а1.; 4795699 и 4921794, ТаЬог е! а1.; 5142033, 1ппЕ; 5122464, \\чЬоп е! а1.; 5091310, 1ппЕ; 5066584, 6у11еп§!еп е! а1.; 4889818, Се1Гапб е! а1.; 4994370, Зйуег е! а1.; 4766067, Вщетак; 4656134, К1пдо1б; и йтк е! а1., еб§., РСК Рго!осо1§: А Сшбе !о Ме!йоб апб Аррйсайопк), и амплификация, опосредуемая РНК, при которой в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК используется антисмысловая РНК к последовательности-мишени (патент США № 5130238, Ма1ек е! а1., торговое название ЫА8ВА); и иммуно-РСК, соединяющая применение амплификации ДНК с мечением антител (Ки/юка е! а1., Заепсе, 260:487 (1993); Запо е! а1., 8с1епсе, 258:120 (1992); Запо е! а1., Вю!есйшдие8, 9:1378 (1991)), которые включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Аналогичным образом, биологически активные фрагменты белков, взаимодействующих с каспазой8 (т.е. фрагменты любых белков, взаимодействующих с каспазой-8, или их изоформ), можно получить так, как указано выше в отношении аналогов белка, взаимодействующего с каспазой-8. Подходящими фрагментами белка, взаимодействующего с каспазой-8, являются фрагменты, которые сохраняют способность белка, взаимодействующего с каспазой-8, и могут опосредовать биологическую активность каспазы-8 или других белков, непосредственно или косвенно связанных с каспазой-8. Соответственно, можно получить фрагменты белка, взаимодействующего с каспазой-8, которые обладают доминантотрицательным или доминантположительным действием, как указывалось выше в отношении аналогов. Следует отметить, что такие фрагменты представляют особый класс аналогов по изобретению, а именно, они определяются как части белков, взаимодействующих с каспазой-8, образованные от полной последовательности белка, взаимодействующего с каспазой-8 (например, от последовательности любого из белков,
- 14 007273 взаимодействующих с каспазой-8, или их изоформ), причем каждая такая часть или фрагмент обладает любой из указанных выше активностей. Такой фрагмент может представлять собой, например, пептид.
Подобным образом, производные можно получить путем стандартных модификаций боковых групп одного или нескольких аминокислотных остатков белка, взаимодействующего с каспазой-8, его аналогов или фрагментов, или посредством конъюгации белка, взаимодействующего с каспазой-8, его аналогов или фрагментов, с другой молекулой, например, антителом, ферментом, рецептором и т.п., что хорошо известно в технике. Соответственно, используемый здесь термин производные охватывает производные, которые можно получить из функциональных групп, встречающихся в боковых цепях остатков, или Ν- или С-концевых групп, способами, известными в технике, и все они входят в объем изобретения. Производные могут иметь химические группы, такие как углеводные или фосфатные остатки, при условии, что такая фракция обладает такой же или более высокой биологической активностью, как белки, взаимодействующие с каспазой-8.
Например, производными могут являться алифатические эфиры, полученные по карбоксильным группам, амиды, полученные по карбоксильным группам посредством взаимодействия с аммиаком или первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с помощью ацильных групп (например, алканоильных или карбоциклических ароильных групп), или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, серильных или треонильных остатков), образованные с помощью ацильных групп.
Термин производные предназначен для обозначения только таких производных, в которых нет замены одной аминокислоты на другую из числа двадцати обычно встречающихся в природе аминокислот.
Как описано выше, анализы с расщеплением можно использовать для определения того, расщепляется ли белок, взаимодействующий с каспазой-8, каспазой-8. Разделение по размеру расщепленных фрагментов приблизительно указывает местоположение сайта расщепления.
Сайт расщепления также можно определить посредством получения делеционных мутантов испытываемого белка и испытанием каждого делеционного мутанта на его подверженность расщеплению каспазой-8, как описано выше. Делеционные мутанты можно сконструировать посредством РСКклонирования нужных фрагментов испытываемого белка с использованием в качестве матрицы последовательности ДНК клона, кодирующего указанный испытываемый белок. Фрагменты, амплифицированные методом РСК, затем можно клонировать в экспрессирующие векторы, за счет чего должны обеспечиваться стартовый кодон АТС и, предпочтительно, последовательность Козак (Ко/ак, М., №с1ею Ас1бк Кек., 12, р. 857-72, 1984). Другие подробности экспрессирования белков можно найти в указанных выше сведениях от Р1адеп, относящихся к меченным гистидином белкам, а также вообще к экспрессии белков. Другой ссылкой, содержащей сведения об экспрессии белков, являются указанные выше Сиггеп! Рго!осо1к, и особенно глава 16 в них.
Таким образом, сайт расщепления испытываемого белка можно определить посредством получения его делеционных мутантов и определения наименьшего такого делеционного мутанта, отщепляемого каспазой-8.
При другом способе идентификации сайта расщепления используют пептиды, которые образуются в соответствии с предсказанной белковой последовательностью испытываемого клона. Пептиды можно синтезировать химическим способом, например, так, как подробно описано в Вобапкхку апб Вобапкхку, Т11е ргасбсе о£ рерббе куп!йек1к, 8ргшдег, №\ν Уогк, I8ΒN 0-387-13471-9, и в Вобапкхку, ТНе рг1пс1р1ек о£ рерббе куп!йек1к. 8ргшдег, №\ν Уогк, I8ΒN 0-387-12359-4. Синтез нужного пептида также доступен от некоторых коммерческих компаний, например, 8упРер Согр., ОиЬ1т, СА, И8А, и Са11£огша Рерббе Кекеагсй, 1пс., №ра, СА, И8А. Пептиды также можно получить или в виде гибридов с другими белками, или отдельно посредством экспрессии рекомбинантной ДНК, кодирующей их, что подробно описано в цитированной выше главе 16 Сиггеп! Рго!осо1к.
Для того, чтобы использовать пептиды для картирования сайта расщепления испытываемого белка, предсказанную аминокислотную последовательность указанного белка разделяют на зоны, и синтезируют пептид, соответствующий каждой зоне. Кроме того, синтезируют пептиды, содержащие примерно половину аминокислот одной из зон и содержащие в соприкосновении также примерно половину аминокислот непосредственно прилегающей области для того, чтобы перекрыть границу между двумя зонами. Зоны содержат от 5 до 100 аминокислот, предпочтительно от 9 до 40 аминокислот, и наиболее предпочтительно от 20 до 30 аминокислот. Затем полный набор пептидов испытывают так, как описано выше, на подверженность расщеплению каспазой-8. Полученные пептиды можно очистить и получить в большом количестве. После реакции расщепления их можно затем проанализировать непосредственно методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 8Ό8 и УФ-детекции или визуализации посредством окрашивания, например, с использованием кумасси синего. С другой стороны, для более легкого обнаружения пептиды можно пометить, например, путем изотопного мечения концов (см., например, 811еус11епко А. е! а1., Кар1б Соттип. Макк 8рес!гит, 11, р. 1015-24, 1997).
После завершения скрининга пептидов, описанного выше, пептид, который, как теперь известно, содержит сайт расщепления каспазой-8, затем можно исследовать, повторив те же приемы, но отбирая
- 15 007273 более мелкие зоны, выбранные из последовательности идентифицированного пептида.
Фактический сайт расщепления пептидов должен соответствовать последовательности расщепления каспазой ΧΧΧΌ (см. Во1бт е1 а1., Се11, 1996, и №сйо1коп е1 а1., КШег сакракек, Τιόπ65 ш Вюсйет. 8ск, 22, 299-306, 1997). Вклад каждой аминокислоты в пептид можно оценить посредством получения пептидов, мутированных по одной из аминокислот, и испытанием таких мутированных пептидов на подверженность расщеплению каспазой-8. Мутированную аминокислоту, предпочтительно, заменяют аминокислотой, выбранной из группы заряженных неполярных аминокислот (см. Ьейшпдег, Вюсйет1кЕгу, ^огЕй, ΝΥ, 1979, сйарЕег 4), и наиболее предпочтительно, выбранных среди глицина или аланина.
Путем мутации критических аминокислот можно получить пептиды, связывающиеся с каспазой-8, но невосприимчивые к расщеплению ею. Связывание можно проверить посредством разделения по размеру комплексов пептида и каспазы-8 в условиях без денатурации с использованием электрофореза в акриламидном геле.
Также можно сконструировать модифицированные пептиды, способные к взаимодействию с активным цистеином каспазы-8, при этом они ковалентно связываются с указанным цистеином. Для этой цели можно использовать реагенты, взаимодействующие с тиольными группами, известные специалистам в области химии. Например, с 8Н-группой активного цистеина каспазы-8 могут реагировать реагенты, содержащие тиольную группу. Образовавшуюся ковалентную связь 8-8 можно расщепить посредством восстановления, например, в физиологических условиях в цитозоле или с использованием реагента, восстанавливающего 8-8-группы, такого как дитиотреитол (ΌΤΤ). Реагенты, взаимодействующие с тиольными группами, можно также необратимо присоединить к каспазе-8. Такие реагенты можно легко найти среди кросс-линкеров, способных взаимодействовать с тиольными группами, известных в технике, таких как описанные на с. О-90 и далее в каталоге Р1ЕКСЕ Ь1Ее 8с1епсек (Р1ЕКСЕ, КоскЕогб, 1Ь, И8Л).
Подходящими группами, реагирующими с тиольными группами, являются, например, пиридилдитио-, иодацетамидо- или малеимидогруппы. Эти группы можно присоединить к пептиду через линкеры, содержащие цепи необязательно ненасыщенных алифатических углеводородов, -О-, -8-, -ΝΗ- или ароматические группы. Линкеры, необязательно, могут содержать заместители.
Тиолреактивные группы можно присоединить к пептиду путем химического синтеза, как известно в технике; функциональные группы пептида можно ввести во взаимодействие с подходящими функциональными группами молекул линкера с тиолреагирующей группой. Например, остаток лизина, присутствующий в пептидной последовательности или введенный в нее с целью создания подходящей функциональной группы, которой, в случае лизина, является эпсилон-аминогруппа, можно ввести во взаимодействие с гетеробифункциональным кросс-линкером, таким как М-гамма-малеимидобутирилоксисукцинимидэфир, и создать пептид, где указанная эпсилон-аминогруппа реагирует с Ν- гидроксисукцинимидной группой кросс-линкера, в то время как малеимидогруппа кросс-линкера не вступает в реакцию и может, после контакта с цистеином каспазы-8, который встречается, когда указанный пептид специфически связывается с указанной каспазой-8, реагировать с тиольной группой указанного цистеина и посредством этого инактивировать указанную каспазу-8.
Позицию в пептиде, используемую для взаимодействия с ним тиолреактивного реагента, можно выбрать так, чтобы она была вблизи аминокислоты (как правило, аспарагиновой кислоты), где происходит расщепление каспазой-8. Линкер, с помощью которого тиолреактивная группа связывается с пептидом, может изменяться по своей длине, наличию полярных групп, таких как гидрокси, заряженных групп, таких как нитро- и сульфогруппы, и ароматических групп, таких как фениленовый или фенильный остаток. Такие вариации в строении линкера позволят получить реагент, содержащий пептид и связанную с ним ковалентно тиолреактивную группу, которая специфически связывается с каспазой-8 и эффективно реагирует с тиольной группой ее активного цистеина.
Испытываемый белок или его пептидный фрагмент можно также охарактеризовать посредством введения указанного белка или пептида в клетку млекопитающего и измерения его действия на реагенты, вызывающие апоптоз в указанной клетке.
Экспрессию белка или пептида в клетке млекопитающего можно осуществить путем встраивания ДНК, кодирующей испытываемый белок, в вектор, содержащий промотор, необязательно, интронную последовательность и донорные/акцепторные сигналы сплайсинга, и также, необязательно, содержащий последовательность терминации. Эти методы в целом описаны в указанных выше СиггеШ РгоЕосо1к, глава 16.
Вышеуказанные промоторная, интронная и терминационная последовательности операбельны в клетках млекопитающего. Промотор, предпочтительно, является сильным промотором, таким как указанные выше промоторы К8У, СМУ или МР8У. Промотор также может представлять собой ранний промотор 8У40 (Еуегей е1 а1., ШсЕю Ас1бк Кек., 11, р. 2447-64, 1983, и указанные там ссылки) или клеточный промотор, такой как промотор бета-актин или промотор ЕЬР-1 (^кикШ^е е1 а1., Е У1го1. МеЕйобк, 64, р. 73-80, 1997). Можно также использовать гибридный промотор, такой как гибрид 1ас-оператора и ЕЬР-1 альфа-промотора человека, описанный ЕбатаЕки е1 а1. (Оепе, 187, р. 289-94, 1997), гибридный промотор СМУ-бета-актин, описанный Акад| е1 а1., К1бпеу 1пЕ., 51, р. 1265-9, 1997, или гибрид ЕеЕ-операторных последовательностей и промотора СМУ (РигЕй е1 а1., РЫА8, 91, 9302-6, 1994, и указанные там ссылки).
- 16 007273
Интронные последовательности, которые можно встраивать в виде полных последовательностей, т.е. включающие сайты донора и акцептора сплайсирования, можно встраивать в кодирующую последовательность белка, который нужно экспрессировать. Встраивание таких интронных последовательностей может усилить устойчивость РНК и, таким образом, увеличить продуцирование нужного белка. Несмотря на то, что, в принципе, подходящие интронные последовательности можно выбрать среди любых интронов, содержащих ген, предпочтительными интронными последовательностями являются интрон бетаактина, интрон 8У40 и интрон рецептора к ΤΝΡ р55.
Интронная последовательность может содержать энхансерные элементы, которые могут усилить транскрипцию от вышеуказанных промоторов.
Часто интронные последовательности также содержат транскрипционные или транскрипционные контрольные последовательности, которые придают экспрессии тканеспецифичность. Следовательно, когда белок изобретения нужно экспрессировать ткакеспецифически, может быть выгодным использование таких интронных последовательностей. Примером интрона, содержащего тканеспецифические энхансерные элементы, является эритроидспецифический энхансер, расположенный в интроне 8 гена 5аминолевулинатсинтазы 2 человека (8иппуа е! а1., 1. Вю1. СНет., 273, р. 16798-809, 1998), а обсуждение принципов усиления продуцирования белков с использованием интронных последовательностей, наряду с примерами интронных последовательностей, описаны Ниапд е! а1., М.1с1е1с АсИк Век., 18, р. 937-47, 1990).
Транскрипционные терминационные последовательности и сигналы полиаденилирования можно добавить к 3'-концу ДНК, кодирующей белок, который нужно экспрессировать. Такие последовательности можно найти во многих или даже в большинстве генов. Выгодно использовать сигнал полиаденилирования 8У40 (8сйек е! а1., Мо1. Се11. Вю1., р. 5386-93, и приведенные там ссылки).
Предпочтительным вектором экспрессии белка в клетке млекопитающего является вектор ρс^NАН^к (1пуйгодеп), содержащий промотор СМУ для управления экспрессией гена, кодирующего нужный белок. Другими векторами, которые можно использовать, являются векторы ρС^NА3 или рМР8УЕН. Эти векторы содержат промоторы СМУ и МР8У, соответственно.
Используя рекомбинантную экспрессию испытываемого белка, указанный белок теперь можно оценить по его действию на сигнал апоптоза, опосредуемый каспазой-8. С этой целью можно индуцировать апоптоз или путем сверхэкспрессии индуцирующего апоптоз белка, такого как внутриклеточный домен СО120а, внутриклеточный домен СЭ95, белок Мой-1, каспаза-8 или их эквиваленты, или путем активации сигнала апоптоза посредством инициации СО 120а, СЭ95, ТВАМР/ОВ3 или эквивалентного рецептора. Активации рецептора можно добиться или посредством приведения рецепторов в контакт с лигандом, или посредством поперечного сшивания рецепторов с антителами, предпочтительно поликлональными антителами (см. Епде1тапп е! а1., 1. Вю1. СНет., 265, р. 14497-504, 1990).
Несмотря на то, что, вообще, инициация рецептора, подобного СО 120а, требует добавления ингибитора синтеза белка, подобного циклогексимиду, для того, чтобы добиться сильного сигнала для апоптоза, сверхэкспрессии рецепторных внутриклеточных доменов или белков, вовлеченных в трансдукцию сигнала апоптоза, не происходит (см. Во14ш е! а1., Се11, 85, р. 803, 1996) . Детекция апоптоза, время инкубации и другие подробности и параметры этого анализа описаны в цитированной выше работе Во14т е! а1.
Гибель клеток, экспрессирующих испытываемый белок, по сравнению с клетками, белок не экспрессирующими, можно оценить любым из многих способов, таким как способ на основе фрагментации ДНК или обнаружении апоптозспецифических антигенов и эпитопов, а реагенты и протоколы для обнаружения апоптоза в форме набора доступны от вышеуказанной компании Воеклпдег Маппкеш и от других компаний.
Гибель клеток можно также определить путем оценки морфологического состояния клеток. Гибель клеток вследствие апоптоза характеризуется волнистой мембраной у клеток и сморщиванием клеток при отсутствии лизиса.
Выгодно экспрессировать в клетке млекопитающего репортерный ген для того, чтобы обеспечить маркер для успешной трансфекции. Так как сама процедура трансфекции приводит к гибели некоторых клеток, в том числе клеток, которые не трансфицированы, выгодно оценивать только те клетки, которые трансфицированы. Предпочтительным репортерным геном для этой цели является ген 1;κΖ, который легко обнаруживается путем инкубации трансфицированных клеток с Хда1 или подобным реагентом, указывающим на активную бета-галактозидазу. Однако можно использовать любой другой репортерный ген, предпочтительно ген, продукты которого легко обнаруживаются с использованием простой реакции окрашивания, результаты которой можно оценить с использованием микроскопа. Например, для непосредственной детекции без реакции окрашивания можно использовать белок зеленой флуоресценции. Этот репортерный ген требует применения флуоресцентного микроскопа.
Таким образом, рассматривая только клетки, которые трнсфицированы, т. е. которые экспрессируют репортерный ген, и подсчитывая процент клеток, демонстрирующих морфологию, характерную для апоптоза, можно оценить действие определенного трансфицированного клона и экспрессированного им белка на апоптоз.
- 17 007273
Клетки млекопитающего представляют собой, предпочтительно, НеЬа или эмбриональные клетки почки человека (НЕК) 2 93-Т. Трансфекцию, предпочтительно, осуществляют кальцийфосфатным способом, как описано в цитированных выше Сштеи! Рго!осок. Морфологию клеток оценивают через 1-150 часов после трансфекции, предпочтительно - через 4-35 часов, и наиболее предпочтительно - через 20 часов после трансфекции.
Получение антител
Поликлональные антитела можно получить в кроликах, курах, мышах, крысах, овцах или подобных млекопитающих. Для получения антител против белка или пептида изобретения в клетках млекопитающего получают белок или пептид, как описано выше, с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Белок также можно получить в клетках бактерий или насекомых, как подробно описано в цитированных выше Сиггеи! Рго!осок, глава 16.
Белок или пептид очищают от клеток, в которых он продуцирован. Способы очистки белков известны специалистам в этой области техники и описаны подробно, например, в цитированных выше Сиггеи! Рго!осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, глава 16, и в Сиггеи! Рго!осок ίη Рго!еш 8с1еисе, \Убеу аиб 8оиз 1пс., главы 5 и б. Белок можно выгодно получить в виде гибрида с другим белком, таким как глутатион3-трансфераза, или подобным белком, или последовательностью-меткой, такой как последовательность гистидиновой метки. Использование гибридных или меченых белков упрощает процедуру очистки, что подробно описано в цитированных выше Сштеи! Рго!осо1§ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, глава 16, и в инструкциях для указанного выше набора для экспрессии и очистки белков с гистидиновой меткой от О|ас.|еп.
Если белок или пептид экспрессирован в виде слитого белка, желательно отщепить партнера по гибридизации перед применением белка для получения антител против партнера по гибридизации. Расщепление партнеров по гибридизации и выделение нужного белка описано в цитированных выше Сштеи! Рго!осо1§ ш Мо1еси1аг Вю1оду, глава 16. Векторы, протоколы и реагенты для экспрессии и очистки рекомбинантных белков, слитых с белком связывания мальтозы, также доступны коммерчески.
При получении пептида изобретения может быть желательно не удалять партнера по гибридизации, так как слитый белок может стимулировать продуцирование антител против пептида. Как правило, это соображение будет уместно, когда получают антитела из пептидов, длина которых менее 50 аминокислот.
Как отмечено также выше, пептид также можно синтезировать химическими способами, известными в химии.
Получение поликлональных антител против белков описано в главе 2 Сштеи! Рго!осок ш 1ттиио1оду, ^МПеу аиб 8ои§ 1ис. При получении антител против пептидов могут потребоваться некоторые изменения в протоколе, как правило, вследствие более низкой антигенности пептидов по сравнению с белками. Получение поликлональных антител против пептидов описано в цитированных выше Сштеи! Рго!осо1§ ш 1ттиио1оду, глава 9.
Моноклональные антитела можно получить из В-клеток, взятых из селезенки или лимфоузлов иммунизированных животных, в частности, крыс или мышей, путем слияния с иммортализованными Вклетками в условиях, благоприятных для роста гибридных клеток. Для слияния с В-клетками мышей предпочтительна клеточная линия Ад-8.
Методы получения моноклональных антител описаны во многих статьях и книгах, таких как цитированные выше Сштеи! Рго!осок ш 1ттиио1оду. В главе 9 этого издания описывается иммунизация животных с помощью пептидов. Клетки селезенки или лимфоузлов этих животных можно использовать для получения моноклональных антител так же, как клетки селезенки или лимфоузлов животных, иммунизированных белками, как это описано в этом издании в главе 2.
Методы, используемые при получении моноклональных антител, также описаны в КоЫег аиб Мййеш, Иа!иге, 256, 495-497, и в И8Р 4376110.
Для получения антител из банка генов антител человека гипервариабельные области генов заменяют почти случайными последовательностями, как описано в И8Р 5840479. Такие антитела предпочтительны, если иммунизация животного данным пептидом или белком затруднительна. Некоторые структуры являются слабоиммуногенными и могут оставаться такими, несмотря на добавление адъювантов и связь с другими белками в гибридные конструкции. Антитела, описанные в И8Р 5840479, также предпочтительны, если требуется использование антител со структурой, подобной антителам человека, например, когда нужны антитела с низкой иммуногенностью у людей.
Как только подходящие антитела идентифицированы, может потребоваться изменение их свойств. Например, при получении можно достичь более высоких выходов с химерными антителами. Химерные антитела, где константные области заменены на константные области антител человека, также могут потребоваться, когда желательно, чтобы антитела имели низкую иммуногенность у людей. Получение химерных антител описано во многих публикациях, например, в СаЬ111у е! а1., РИА8, 81, р. 3273, 1984; Моггкои е! а1., РИА8, 81, р.6851, 1984; Воийаиие е! а1., Иа!иге, 312, р.643, 1984; ЕР 125023, ЕР 171496, ЕР 173494, ЕР 184187, \УО 86/01533, \УО 87/02671 и в Наг1оте аиб Ьаие, Аи!1Ьоб1е8: А ЬаЬога!огу Маииа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу, 1988.
Другим типом антител являются антиидиотипические антитела. Антиидиотипические (анти-1б) ан
- 18 007273 титела являются антителами, распознающими уникальные детерминанты, как правило, ассоциированные с антигенсвязывающим сайтом антитела. Антитела против Ιά можно получить посредством иммунизации животного того же вида и генетического типа (например, штамма мышей), что и источник тАЬ, к которому получают анти-Ιά. Иммунизированное животное будет узнавать и реагировать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела путем продуцирования антител к этим идиотипическим детерминантам (анти-Ιά антитела). См., например, патент США № 4699880, включенный в настоящее описание в качестве ссылки.
Анти-Ιά антитела также можно использовать в качестве иммуногена для индукции иммунной реакции еще и у другого животного, продуцируя так называемые анти-анти-Ιά антитела. Анти-анти-Ιά могут быть эпитопно идентичны исходным тАЬ, которые индуцировали анти-Ιά. Таким образом, используя антитела к идиотипическим детерминантам тАЬ, возможно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности.
Соответственно, тАЬ, полученные против белка, взаимодействующего с каспазой-8, его аналогов, фрагментов или производных настоящего изобретения можно использовать для индукции анти-Ιά антител у подходящих животных, таких как мыши ВАЬВ/с. Клетки селезенки таких иммунизированных мышей используют для получения анти-Ιά гибридом, секретирующих анти-Ιά тАЬ. Далее, анти-Ιά тАЬ можно сочетать с носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (КЬН) и использовать для иммунизации других мышей ВАЬВ/с. Сыворотка этих мышей будет содержать анти-анти-Ιά антитела, обладающие свойством связываться с исходными тАЬ, специфичными для эпитопа вышеуказанного белка, взаимодействующего с каспазой-8, или его аналогов, фрагментов или производных.
Таким образом, анти-Ιά тАЬ имеют свои собственные идиотипические эпитопы или идиотопы, схожие по строению с оцениваемым эпитопом.
Термин антитело также обозначает как интактные молекулы, и их фрагменты, такие, как, например, РаЬ и Р(аЬ')2, способные связываться с антигеном. Фрагменты РаЬ и Р(аЬ')2, лишенные Рсфрагмента интактного антитела, быстро выводятся из кровообращения и могут иметь меньше нетканеспецифического связывания, чем интактное антитело (+аЫ е! а1., 1. №с1. Меά., 24:316-325 (1983)).
Следует иметь в виду, что РаЬ и Р(аЬ')2 и другие фрагменты антител, полезные в настоящем изобретении, можно использовать для детекции и количественного определения белка, взаимодействующего с каспазой-8, в соответствии со способами, описанными здесь для молекул интактных антител. Такие фрагменты, как правило, получают посредством протеолитического расщепления с использованием ферментов, таких как папаин (для получения РаЬ-фрагментов) или пепсин (для получения Р(аЬ')2фрагментов).
Об антителе говорят, что оно способно к связыванию с молекулой, если оно способно специфически взаимодействовать с молекулой, и посредством этого молекула связывается с антителом. Термин эпитоп относится к той части любой молекулы, способной связываться антителом, которую это антитело может узнать. Эпитопы или антигенные детерминанты, как правило, состоят из химически активных групп молекул на поверхности, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и имеют специфические трехмерные структурные характеристики, так же, как и специфические характеристики по заряду.
Антиген представляет собой молекулу или часть молекулы, способную связываться антителом, которое также способно индуцировать животное к продуцированию антител, способных к связыванию с эпитопом этого антигена. Антиген может иметь один или несколько эпитопов. Специфическое взаимодействие, упомянутое выше, означает, что антиген будет взаимодействовать с высокой селективностью со своим соответствующим антителом, а не со многими другими антителами, которые могут вызываться другими антигенами.
Антитела, в том числе, фрагменты антител, полезные в настоящем изобретении, можно использовать для качественной и количественной детекции белка настоящего изобретения, взаимодействующего с каспазой-8. Это можно осуществить иммунофлуоресцентными методами с использованием флуоресцентно помеченных антител (см. ниже) вместе с детекцией оптическими методами, методом поточной цитометрии или флуорометрическими методами.
Антитела (или их фрагменты), полезные в настоящем изобретении, можно использовать для гистологии с методами иммунофлуоресценции или иммуноэлектронной микроскопии для детекции ш δίΐιι белка настоящего изобретения, взаимодействующего с каспазой-8. Детекцию ш δίΐιι можно выполнить посредством взятия гистологического образца у пациента и предоставления меченого антитела настоящего изобретения к такому образцу. Антитела (или их фрагменты), предпочтительно, предоставляют посредством нанесения или наслоения меченых антител (или фрагментов) на биологический образец. Применяя такую процедуру, можно определить не только наличие белка, взаимодействующего с каспазой-8, но также его распределение в проверяемой ткани. Применяя настоящее изобретение, специалисты легко представят, что любой из многочисленных гистологических методов (таких как процедуры окрашивания) можно модифицировать для того, чтобы добиться такой детекции ш δίΐιι.
Такие анализы на белок настоящего изобретения, взаимодействующий с каспазой-8, как правило, включают инкубацию биологического образца, такого как биологическая жидкость, тканевый экстракт,
- 19 007273 свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, инкубированные в культуре ткани, в присутствии обнаруживаемых меченых антител, способных идентифицировать белок, взаимодействующий с каспазой-8, и детекцию антител любым из многих способов, известных в технике.
Биологический образец можно обработать с помощью твердофазной подложки или носителя, таких как нитроцеллюлоза, или других твердой подложки или носителя, способных иммобилизовать клетки, частицы клеток или растворимые белки. Затем подложку или носитель можно промыть подходящими буферами с последующей обработкой детектируемыми мечеными антителами в соответствии с настоящим изобретением, как указано выше. Затем твердофазную подложку или носитель можно промыть буфером во второй раз и удалить несвязанные антитела. Затем обычными способами можно определить количество связанной метки на указанной подложке или носителе.
Под твердофазной подложкой, твердофазным носителем, твердой подложкой, твердым носителем, подложкой или носителем подразумеваются любые подложки или носители, способные связывать антиген или антитела. Хорошо известными подложками или носителями являются стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, найлонамилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит. Носитель для целей настоящего изобретения по природе может быть или растворимым до некоторой степени, или нерастворимым. Материал подложки фактически может иметь любую возможную структурную конфигурацию до тех пор, пока присоединенная молекула способна связываться с антигеном или антителом. Так, конфигурация подложки или носителя может быть сферической, как у гранул, цилиндрической, как внутренняя поверхность пробирки или как наружная поверхность стержня. С другой стороны, поверхность может быть плоской, такой как лист, тестпластина и т. п. Предпочтительными подложками или носителями являются полистирольные гранулы. Специалистам в этой области техники известны многие другие подходящие носители для связывания антител или антигенов, или в этом можно удостовериться с помощью простых экспериментов.
Связывающую активность полученных антител, по изобретению, как указано выше, можно определить с соответствии с хорошо известными способами. Специалисты в этой области техники смогут определить рабочие и оптимальные условия анализа в случае каждого определения, используя обычные эксперименты.
Другие стадии, такие как промывка, перемешивание, встряхивание, фильтрация и т.п., можно включить в анализы как обычные или необходимые в данной ситуации.
Одним из способов, которым антитела в соответствии с настоящим изобретением можно пометить для обнаружения, является связывание их с ферментом и применение иммуноферментного анализа (ΕΙΑ). Фермент, в свою очередь, при дальнейшем воздействии соответствующего субстрата будет реагировать с субстратом таким образом, что получится химическая группа, которую можно обнаружить, например, спектрофотометрическим, флуорометрическим или визуальным способом. Ферменты, которые можно использовать для детектируемого мечения антител, включают, но не ограничиваются перечисленным, малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, дельта-5-стероидизомеразу, дрожжевую алкогольдегидрогеназу, альфа-глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу.
Детекцию можно осуществить колориметрическими методами, при которых используют хромогенный субстрат для фермента. Детекцию также можно осуществить посредством визуального сравнения с полученными таким же способом стандартами.
Детекцию можно осуществить с использованием многих других иммуноанализов. Например, с помощью мечения антител или фрагментов антител радиоизотопами можно обнаружить К-РТРазу, применяя радиоиммуноанализ (ΚΙΑ). Хорошее описание ΚΙΑ можно найти в ΎιόοηΙοίΎ Тесйтциек ;·ιηά Вюсйеш18ру ίη Мс1еси1аг Βίοϊο^γ, \νοιΈ Т.8., еί а1., ΝοΠίι Ηοϊϊαηά РиЬНкйтд ^тра^, ΝΥ (1978), особенно в главе под названием Αη ΙηίΓοάικΙίοη ίο Каά^ο^ттиηе Аккау ηηά Ке1а1е4 Тесйтдиек, СБагб, Т., включенных в настоящее описание в качестве ссылок. Радиоактивные изотопы можно обнаружить с помощью таких средств, как счетчик гамма-квантов или сцинтилляционный счетчик, или методом ауторадиографии.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением также можно пометить флуоресцентным соединением. Когда на антитела с флуоресцентными метками действует свет с подходящей длиной волны, их присутствие можно обнаружить вследствие флуоресценции. Среди наиболее часто используемых соединений для флуоресцентного мечения находятся изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, пикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальдегид и флуорескамин.
Антитела также можно пометить для детекции с использованием флуресциирующих металлов, таких как 152Ε, или других металлов ряда лантанидов. Эти металлы можно присоединить к антителам с использованием таких образующих комплексы с металлами групп, как остаток диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ΕΊΕΑ).
Антитела также можно пометить для детекции посредством сочетания их с хемилюминесцентным соединением. Присутствие меченных хемилюминесцентным соединением антител затем определяют путем детекции наличия люминесценции, которая появляется в ходе химической реакции. Примерами
- 20 007273 соединений, особенно полезных для хемилюминесцентного мечения, являются люминол, изолюминол, Шеготайс эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и эфир щавелевой кислоты.
Подобным образом, для мечения антител настоящего изобретения можно использовать биолюминесцентное соединение. Биолюминесценция является видом хемилюминесценции, обнаруженной в биологических системах, в которых каталитический белок повышает эффективность хемилюминесцентной реакции. Наличие биолюминесцентного белка определяют посредством детекции наличия люминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями для целей мечения являются люциферин, люцифераза и аэкорин.
Молекулу антитела настоящего изобретения можно адаптировать для применения в иммунометрическом анализе, известном также, как двухслойный или сэндвич-анализ. При типичном иммунометрическом анализе некоторое количество помеченных антител (или фрагментов антител) связывается с твердой подложкой или носителем, и добавляют некоторое количество меченных для детекции растворимых антител, чтобы создать возможность детекции и/или количественного определения тройного комплекса, образуемого антителами твердой фазы, антигеном и мечеными антителами.
Типичными, и предпочтительными, иммунометрическими анализами являются прямые анализы, при которых антитела, связанные с твердой фазой, сначала вводят в контакт с бинарным твердофазным комплексом антитело-антиген. После соответствующего периода инкубации твердую подложку или носитель промывают для удаления остатков жидкого образца, включая не прореагировавший антиген, если таковой есть, и затем вводят в контакт с раствором, содержащим неизвестное количество меченого антитела (которое функционирует как репортерная молекула). После второго периода инкубации для создания комплекса меченого антитела с антигеном, связанным с твердой подложкой или носителем с помощью немеченого антитела, твердую подложку или носитель промывают во второй раз для удаления не прореагировавших меченых антител.
В другом типе сэндвич-анализа, который также можно применять с антигенами настоящего изобретения, используют так называемые одновременные и обратные анализы. Одновременный анализ включает одну стадию инкубации, так как антитела, связанные с твердой подложкой или носителем, и меченые антитела добавляют к испытываемому образцу одновременно. После завершения инкубации твердую подложку или носитель промывают для удаления остатков жидкого образца и не вступивших в комплекс меченых антител. Затем определяют наличие меченых антител, связанных с твердой подложкой или носителем, так, как это обычно делают при прямом сэндвич-анализе.
При обратном анализе используют постадийное добавление к жидкому образцу сначала раствора меченых антител, а затем немеченых антител, связанных с твердой подложкой или носителем, после соответствующего периода инкубации. После второй инкубации твердую фазу промывают обычным способом для освобождения ее от остатков испытываемого образца и раствора не прореагировавших меченых антител. Затем осуществляют определение меченых антител, связанных с твердой подложкой или носителем, как при одновременном и прямом анализах.
Иммуноанализы
Осуществление иммуноанализов, таких как К1А или ЕЫ8А, описано во многих статьях, книгах и других публикациях. Дается ссылка на \¥0 97/03998, со с. 48, строка 4, по с. 52, строка 27. Иммуноанализы изобретения могут быть двух общих типов: во-первых, можно использовать иммуноанализы с использованием иммобилизованного белка, взаимодействующего с каспазой-8, или его эквивалента для количественного определения каспазы-8; во-вторых, можно использовать иммуноанализы с использованием иммобилизованных антител, направленных против эпитопа белка, взаимодействующего с каспазой8, для количественного определения белков, взаимодействующих с каспазой-8.
Такие анализы могут найти применение в диагностике, когда нужно оценить содержание каспазы-8 и других белков, вовлеченных в апоптозный каскад реакций, при многих нарушениях или синдромах, где возможно участие таких каскадов.
Нуклеиновые кислоты
Ожидается, что клоны, полученные при скрининге по изобретению, будут неполными клонами. Получение полных клонов, когда это необходимо, также описано выше. Последовательность ДНК полного клона и неполного клона, найденная сначала при скрининге по изобретению, может найти разные применения.
Например, для того, чтобы управлять экспрессией белка, взаимодействующего с каспазой-8, может потребоваться получение в клетке антисмысловой РНК. Для этой цели полную или неполную кДНК, кодирующую белок, взаимодействующий с каспазой-8, встраивают в экспрессирующий вектор, содержащий промотор, что также указано выше. Посредством этого 3'-конец кДНК встраивают по соседству с 3'концом промотора, причем 5'-конец кДНК отделяется от 3'-конца промотора указанной кДНК. Поэтому после экспрессии кДНК в клетке продуцируется антисмысловая РНК, неспособная кодировать белок. Наличие антисмысловой РНК в клетке снижает экспрессию клеточной (геномной) копии гена, взаимодействующего с каспазой-8.
Для получения антисмысловой РНК можно использовать полную кДНК. С другой стороны, можно использовать ее фрагмент, который, предпочтительно, имеет длину от 9 до 2000 нуклеотидов, предпоч
- 21 007273 тительнее - от 15 до 500 нуклеотидов, и наиболее предпочтительно от 30 до 150 нуклеотидов.
Фрагмент, предпочтительно, соответствует области в пределах 5'-половины кДНК, предпочтительнее - 5'-области, содержащей 5'-нетранслируемую область и/или первую экзонную область, и наиболее предпочтительно - содержащей сайт начала трансляции АТС. С другой стороны, фрагмент может соответствовать последовательности ДНК только 5'- нетранслируемой области.
В качестве антисмыслового олигонуклеотида можно использовать синтетический олигонуклеотид. Олигонуклеотид, предпочтительно, представляет собой олигонуклеотид ДНК. Длина антисмыслового олигонуклеотида составляет, предпочтительно, от 9 до 150, предпочтительнее - от 12 до 60, и наиболее предпочтительно - от 15 до 50 нуклеотидов. Область, перекрываемая антисмысловым олигонуклеотидом, содержит, предпочтительно З'-нетранслируемую область кДНК, предпочтительнее она содержит сигнал полиаденилирования или стоп-кодон трансляции, или то и другое.
Обзор механизма действия антисмысловой РНК и сегодняшнее состояние техники использования антисмысловых инструментов приведен в Китаг е1 а1., М1егоЫо1. Μοί. ΒίοΙ. Рсу.. 62, р. 1415-1434, 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов при ингибировании синтеза рецептора ΒΜΡ описано Уеи е1 а1., 1. Вопе Мтег. Век., 13, р. 1870-9, 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов для ингибирования синтеза гена вольтзависимого калиевого канала Куц.4 описано Меш е1 а1., ΡΝΑ8, 95, р. 150371042, 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов для ингибирования синтеза Вс1-х описано Копбо е1 а1., Опсодепе, 17, р. 2585-91, 1998.
Лечебное применение антисмысловых лекарственных средств описывают δΐίχ. 8сг Ат., 279, р. 46, 50, 1998; Нападав. Сапсег Ме1ак1ак1к Веу., 17, р. 169-76, 1998; Сшпо1 апб Теткаташ, Ра11ю1. Вюг (Рапк), 46, р. 347-54, 1998; и в приведенных в этих работах ссылках.
Когда создают антисмысловые олигонуклеотиды, как правило, используют модификации олигонуклеотидов, усиливающие нужные свойства. Например, вместо фосфоэфирных связей, встречающихся в природных ДНК, используют фосфоротиоатные связи, главным образом, вследствие того, что такие фосфоротиоатсодержащие олигонуклеотиды менее расположены к разрушению клеточными ферментами. Репд е1 а1. сообщают, что нежелательные ш у1уо побочные действия фосфоротиоатсодержащих олигонуклеотидов можно ослабить при использовании смешанного фосфодиэфирфосфоротиоатного скелета. Предпочтительно, 2'-метоксирибонуклеотидные модификации используют в 60% нуклеотида. Такие модифицированные олигонуклеотиды способны выявлять антисмысловое действие, сравнимое с действием, наблюдаемым в случае фосфоротиоатсодержащих олигонуклеотидов. Репд е1 а1. также сообщают, что аналоги олигонуклеотидов, неспособные к поддержанию активности рибонуклеазы Н, являются неактивными.
Следовательно, предпочтительный антисмысловой олигонуклеотид изобретения имеет смешанный фосфодиэфирфосфоротиоатный скелет. Наиболее предпочтительно 2'-метоксирибонуклеотидные модификации используют примерно в 30-80%, наиболее предпочтительно примерно в 60% олигонуклеотида.
В антисмысловой олигонуклеотид можно ввести другие модификации. Например, молекулу олигонуклеотида можно соединить с группой, содержащей необязательно частично ненасыщенную углеводородную цепь и одну или несколько полярных или заряженных групп, таких как карбоксильная кислотная группа, сложноэфирные группы и спиртовые группы. С другой стороны олигонуклеотиды можно соединить с пептидными структурами, которые, предпочтительно, являются мембранотропными пептидами. Такие модифицированные олигонуклеотиды проникают через мембраны легче, что является критическим для их функционирования, и, следовательно, можно существенно усилить их активность. Проникновение сквозь мембраны особенно желательно для антисмысловых лекарственных средств, которым нужно достичь головного мозга. Олигонуклеотиды, соединенные с пальмитилом, описаны Сегк1ег е1 а1., Апа1. Вюсйет., 262, р. 177-84, 1998. Олигонуклеотиды, соединенные с гераниолом, описаны 8По_|1 е1 а1., 1. Огид Тагде1, 5, р. 261-73, 1998. Олигонуклеотиды, соединенные с пептидами, например, мембранотропными пептидами, и их получение описаны Зоиксйагеип е1 а1., Вюсопщд. СНет.. 9, р. 466-75, 1998. Модификации антисмысловых молекул или других лекарственных средств, которые направляют молекулу в определенные клетки и усиливают поглощение олигонуклеотида указанными клетками, описаны \Уапд. 1. Соп1го11еб Веа1еаке, 53, р. 39-48, 1998.
Рибозимы
Получив известную последовательность мРНК гена, можно создать рибозимы, представляющие собой молекулы РНК, которые специфически связываются и расщепляются указанной последовательностью мРНК (см., например, СНеп е1 а1., Апп. ΝΥ Асаб. 8сг, 660, 211-3, 1992; 2Нао апб Р1ск, №11иге. 365, р.448, 1993; 8йоге е1 а1., Опсодепе, 8, 3183, 1993; 1окерН апб Вигке, 1. Вю1. СНет., 24515, 1993; ЗЫтауата е1 а1., №.1с1е1с Ас1бк 8утр., 8ег. 29 р. 177, 1993; Сап1ог е1 а1., ΡΝΑ8, 90, р.10932, 1993).
Соответственно, можно создать последовательность РНК, кодирующую рибозим, которая расщепляет мРНК белка изобретения, взаимодействующего с каспазой-8. Место расщепления располагается, предпочтительно, в кодирующей области или в 5'-нетранслируемой области, предпочтительнее - в 5'части кодирующей области, примыкающей к стартовому кодону трансляции АИС.
ДНК, кодирующую рибозим по изобретению, можно ввести в клетки путем поглощения ДНК, поглощения модифицированной ДНК (см. модификации олигонуклеотидов и белков, приводящие к уси
- 22 007273 ленной мембранной проницаемости, как описано ниже) или переносу гена, опосредованному вирусным вектором, что подробно описано ниже.
Введение в клетки белков, взаимодействующих с каспазой-8, пептидов и ДНК
Настоящее изобретение относится к белкам, взаимодействующим с каспазой-8, полученным из них пептидам, антисмысловым молекулам ДНК и олигонуклеотидам. Применение для лечения или исследований таких инструментов требует введения их в клетки живого организма. Для этой цели нужно усилить мембранную проницаемость для пептидов, белков и олигонуклеотидов. Способы улучшения мембранной проницаемости для олигонуклеотидов описаны выше. Те же принципы, а именно, дериватизацию лиофильными структурами, можно также использовать при создании белков и пептидов с усиленной способностью проходить через мембрану. Например, к последовательности пептида или белка можно добавить последовательность известного мембранотропного пептида, как указано выше. Кроме того, пептид или белок можно дериватизировать с помощью частично лиофильных структур, таких как вышеуказанные углеводородные цепи, которые замещены по меньшей мере одной полярной или заряженной группой. Например, лауроилпроизводные пептидов описаны МигашкЫ е! а1., Рйагт. Кекеагсй., 8, 649, 1991. Другие модификации пептидов и белков включают окисление метиониновых остатков, посредством чего создаются сульфоксидные группы, как описано Еасйапа е! а1., Еиг. 1. Рйагтасок. 203, р.353, 1991. Еасйапа с сотрудниками также описывают пептид или производные, где относительно гидрофобная пептидная связь заменяется ее кетометиленовым изоэфиром (СОСН2). Такие и другие модификации, известные специалистам в области химии белков и пептидов, усиливают способность проникать через мембрану.
Другим способом усиления мембранной проницаемости является использование рецепторов, таких как вирусные рецепторы, на поверхности клетки для индукции поглощения клеткой пептида или белка. Этот механизм часто используется вирусами, специфически связывающимися с некоторыми молекулами поверхности клетки. После связывания клетка пропускает вирус вовнутрь. Такая молекула поверхности клетки называется вирусным рецептором. Например, молекулы интегрина СЛК и Л4У описаны как вирусные рецепторы для аденовируса, см. Нетпй е! а1., Нит. Сепе Тйег., 9, р. 2363-73, 1998, и приведенные там ссылки. Молекулы СЭ4, СРК1, СРК15 и 8ТКБ33 идентифицированы как рецепторы/корецепторы для ВИЧ, см. Е4тдег е! а1., УпЫоду, 249, р. 367-78, 1998, и приведенные там ссылки.
Таким образом, конъюгирование пептидов, белков и олигонуклеотидов с молекулами, известными как рецепторы для связывания с поверхностью клетки, будет усиливать мембранную проницаемость для указанных пептидов, белков или олигонуклеотидов. Примерами подходящих групп для образования конъюгатов являются сахара, витамины, гормоны, цитокины, трансферрин, азиалогликопротеин и подобные молекулы. В патенте США 5108921, Ьоте е! а1., описывается применение таких молекул для целей усиления мембранной проницаемости для пептидов, белков и олигонуклеотидов, и получение указанных конъюгатов.
Ьоте с сотрудниками также указывают, что молекулы, такие как фолат или биотин, можно использовать для направленной доставки конъюгата ко многим клеткам организма, в силу обильной и неспецифической экспрессии рецепторов для этих молекул.
Описанное выше применение белков поверхности клетки для усиления мембранной проницаемости для пептида, белка или олигонуклеотида изобретения можно также использовать при направленной доставке указанного пептида, белка или олигонуклеотида изобретения к клеткам или тканям определенного типа. Например, если необходимо попасть в раковые клетки, предпочтительно использовать белок поверхности клетки, который экспрессируется обильнее на поверхности таких клеток. Примерами являются фолатные рецепторы, антигены к муцину МИС1, МИС2, МИС3, МИС4, МИС5ЛС, МИС5В и МИС7, гликопротеиновые антигены Κ8Α, карциномо-эмбриональный антиген, специфический для предстательной железы мембранный антиген (Ρ8МΑ) НЕК-2/пеи и хорионный гонадотропин-бета человека. В цитированной выше работе \Уапд е! а1., 1998, описывается применение фолата для направленной доставки в раковые клетки, а в 2йапд е! а1., С1т. Сапсег Кек., 4, р. 2669-76, 1998, указывается на относительное обилие каждого из других антигенов, указанных выше, в раковых и здоровых клетках разного типа.
Следовательно, белок, пептид или олигонуклеотид изобретения можно, с использованием описанного выше метода конъюгации, направленно доставить в определенный, какой требуется, тип клеток. Например, если нужно усилить апоптоз в клетках лимфоцитарной линии, в эти клетки можно направить белок или пептид изобретения, положительно модулирующие каспазу-8, например, используя молекулы КГС класса ΙΙ, которые экспрессируются на этих клетках. Этого можно достичь посредством сочетания антитела, или его антигенсвязывающего сайта, направленного против константной области указанной молекулы КГС класса ΙΙ, с белком или пептидом изобретения. Далее, описаны многие рецепторы клеточной поверхности для разных цитокинов и других молекул клеточной коммуникации, и многие из этих молекул экспрессируются более или менее ткане-или клеточноспецифически. Так, когда нужна направленная доставка подгруппы Т-клеток, для получения конъюгата изобретения можно использовать молекулу поверхности клетки СЭ4. Молекулы, связывающие СЭ4, предоставляются вирусом ВИЧ, чей поверхностный антиген др42 способен связываться с молекулой СЭ4. Белок изобретения, взаимодействующий с каспазой-8, или пептид изобретения, усиливающие апоптоз, можно направленно доставить
- 23 007273 преимущественно в Т-клетки при лечении пациента, страдающего от аутоиммунных реакций на основе Т-клеток, таких как пациенты с красной волчанкой.
Направленная доставка в клетки, опосредованная вирусами
Белки, пептиды и антисмысловые последовательности изобретения можно ввести в клетки, используя вирусный вектор. Применение вакцинного вектора для таких целей подробно описано в цитированной выше главе 16 Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду. Применение аденовирусного вектора описано, например, ТеоН е! а1., В1ооб, 92, р. 4591-4601, 1998; №гиш1 е! а1., Ат. 1. Кекр1г. Се11. Мо1. Вю1., 19, р. 936941, 1998; Ребегкоп е! а1., 1. Сак!гот!ек!. 8игд., 2, р. 283-91, 1998; Сиапд-Ьт е! а1., Тгапкр1ап!. Ргос, 30, р. 2923-4, 1998, и в цитированных в этой работе ссылках; №кЫба е! а1., 8рше, 23, р. 2437-42, 1998; 8с11\\'а1УепЬегдег е! а1., 1. 1ттипо1., 161, р. 6383-9, 1998; и Сао е! а1., 1. 1ттипо1., 161, р. 6238-44, 1998. Ретровирусный перенос антисмысловых последовательностей описан Оаше1 е! а1., 1. Вютеб. 8ск, 5, 38394, 1998.
Когда в качестве векторов используют вирусы, для направленной доставки вируса обычно используют белки вирусной поверхности. Так как многие вирусы, такие как вышеуказанный аденовирус, скорее неспецифичны в своем клеточном тропизме, может потребоваться придание большей специфичности посредством использования промотора клеточного типа или тканеспецифического промотора. СпксеШ е! а1., Нит. Сепе Тйег., 9, р. 1919-28, 1998, описывают применение промотора легкой цепи 2 кардиального миозина, специфического для желудочка, для специфической направленной доставки в сердце гена, перенос которого опосредуется аденовирусом.
С другой стороны, можно создать методами генной инженерии вирусный вектор для экспрессии другого белка на его поверхности, или белок поверхности вирусного вектора можно заменить для введения нужной пептидной последовательности. Таким образом, можно создать вирусный вектор для экспрессии одного или нескольких дополнительных эпитопов, пептидов, связывающихся с КГС класса ΙΙ или можно использовать эпитопы, образованные от хоминг-молекул, для направления вирусного вектора в соответствии с указаниями изобретения.
Применения описанных выше инструментов
Белки изобретения, взаимодействующие с каспазой-8, взаимодействуют специфически с субъединицами каспазы-8, вовлеченными в протеолитическую активность каспазы-8. Не углубляясь в теорию, авторы изобретения полагают, что белки изобретения, взаимодействующие с каспазой-8, являются последующими элементами в каскаде передачи сигнала с участием каспазы-8. Оказывается, что предыдущие агенты связываются через продомен каспазы-8, опосредующий домен взаимодействия белокбелок. Оказывается, что экстенсивное кросс-общение со многими средствами, организующими апоптозную реакцию, может быть опосредовано взаимодействиями белок-белок с участием эффекторного домена гибели (ΌΕΌ) и родственных доменов, таких как домены, локализованные в продомене каспазы8. В противоположность таким белкам, белки настоящего изобретения, взаимодействующие с каспазой8, могут находиться среди непосредственных исполнителей процесса гибели клеток. Например, один из белков изобретения, взаимодействующих с каспазой-8, Т1р-60 является ферментом гистондеацетилазои. Следовательно, указанный белок может непосредственно участвовать в изменениях структуры хроматина.
Взаимодействие белков изобретения с каспазой-8 имеет ряд смежных последствий. Во-первых, происходит модуляция активности каспазы-8. Это показано здесь при анализе ш у1уо, где клон 12 изобретения ингибирует апоптоз, опосредуемый каспазой-8.
Во-вторых, белок, взаимодействующий с каспазой-8, может повысить активность каспазы-8 посредством предупреждения разрушения каспазы-8, или снизить ее активность, действуя как ингибитор.
В-третьих, активность белка, взаимодействующего с каспазой-8, можно модулировать. Это показано здесь через способность каспазы-8 расщеплять белки, взаимодействующие с каспазой-8. Возможно, что некоторые из таких белков инактивируются путем расщепления. Однако также возможно, что активность белков изменяется, индуцируются новые активности, или что белок, взаимодействующий с каспазой-8, активируется путем расщепления, именно как сами каспазы.
Следовательно, белки, взаимодействующие с каспазой-8, пептиды, олигонуклеотиды и антитела изобретения полезны при модуляции активности каспазы-8. Модуляция каспазы-8 по нисходящей желательна в ситуациях, где происходит избыточная гибель клеток вследствие апоптоза. Например, предполагается, что при рассеянном склерозе с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунном увеоретините, диабете, волчанке, аутоиммунном миокардите Ι, печеночной недостаточности, независимо от этиологии, опосредованном НСУ хроническом гепатите, гастрите, например, гастрите типа А, смешанной болезни соединительной ткани (МСТО), болезни Крона и неспецифическом язвенном колите разрушение тканей организма вызывается сигналами апоптоза. Следовательно, для пациентов, страдающих от таких болезней, может быть благоприятной модуляция активности каспазы-8 по нисходящей в тех клетках, которые разрушаются путем апоптоза.
Например, при указанной выше олигодендропатии нужно ингибировать активность каспазы-8 в олигодендроцитах. Рецептор фосфолипидлизофосфатидной кислоты в сочетании с С-протеином клеточной поверхности экспрессируется в олигодендроцитах и в различных других клетках головного мозга, но
- 24 007273 не в других тканях организма. Следовательно, пептид или белок изобретения направляют в эти клетки. Этого можно достичь или посредством сочетания указанного пептида или белка с фосфолипидлизофосфатидной кислотой или посредством введения последовательности антитела, специфически узнающего указанный рецептор фосфолипидлизофосфатидной кислоты, в вирусный вектор, так что указанный вирусный вектор специфически связывается с указанным рецептором фосфолипидлизофосфатидной кислоты.
Подобным образом пептиды или белки изобретения можно направить в клетки другого типа, затрагиваемые при других заболеваниях, перечисленных выше, и других заболеваниях, при которых, как показано, избыток апоптозных клеток опосредует повреждение в наблюдаемой ткани организма.
Подобным образом антисмысловую ДНК, антисмысловой олигонуклеотид и рибозим изобретения также можно направить в вышеуказанные олигодендроциты или в соответствующие клетки при других заболеваниях. В таком случае подавляется экспрессия белков, взаимодействующих с каспазой-8, а не экспрессия самой каспазы-8. Путем ингибирования экспрессии ряда белков, взаимодействующих с каспазой-8, можно снизить апоптозное действие каспазы-8. Однако снижение экспрессии определенных белков, взаимодействующих с каспазой-8, может фактически повысить действие каспазы-8, так как некоторые белки, взаимодействующие с каспазой-8, способны действовать как отрицательные регуляторы активности каспазы-8. Следовательно, сначала следует проверить эффект использования антисмысловых олигонуклеотидов и антисмысловой РНК и рибозимов, например, в описанном выше анализе ш у1уо, прежде чем обсуждать применение таких средств для лечения.
С другой стороны, существуют определенные ситуации, когда может потребоваться повышение активности каспазы-8. Это может произойти в случае тех же заболеваний, указанных выше, например, при системной красной волчанке. Однако типы клеток, которые должны стать мишенями, другие. Например, при волчанке популяция Т-клеток может содержать аутореактивные клетки, которые не разрушаются в тимусе. Следовательно, к Т-клеткам следует направить средство изобретения, модулирующее активность каспазы-8 по восходящей. Предполагается, что при некоторых заболеваниях, таких как рассеянный склероз, некоторые клоны Т-клеток играют критическую роль в развитии заболевания. Следовательно, в такие клетки можно направить средство по изобретению, модулирующее активность каспазы-8 по восходящей, используя одно или несколько антител, специфически направленных на вариабельную область Тклеточного рецептора клонов аутореактивных Т-клеток, для направления средства изобретения, модулирующего активность каспазы-8 по восходящей, которое может представлять собой белок, взаимодействующий с каспазой-8, или пептид, соответствующие изобретению.
Ввиду вышеуказанного, настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаратам, содержащим активное вещество, состоящее из одного или нескольких белков, взаимодействующих с каспазой8, пептидов, антител, рибозимов, антисмысловых РНК или антисмысловых олигонуклеотидов, соответствующих изобретению.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей вирусный вектор, способный инфицировать клетки млекопитающего, где указанный вектор содержит операбельно связанный промотор и последовательность ДНК изобретения, кодирующую белок, взаимодействующий с каспазой8, или пептид, рибозим, антисмысловую РНК, антисмысловой олигонуклеотид или антитело, соответствующие изобретению. Вирусный вектор может содержать, необязательно, кодирующую последовательность, операбельно связанную с промотором, кодирующую пептид или белок, расположенные на поверхности вируса, которая способна к связыванию с белком поверхности клетки млекопитающего. Белок поверхности, предпочтительно, представляет собой белок, который может поглощать вирусный вектор, и, предпочтительно, экспрессируется тканеспецифически или специфически для типа клеток, так что создается возможность направленной доставки вирусного вектора.
Белок, взаимодействующий с каспазой-8, его аналоги, фрагменты или производные также можно использовать для выделения, идентификации и клонирования других белков того же класса, т. е. белков, связывающихся с каспазой-8, или функционально родственных протеаз или белков, вовлеченных в процесс внутриклеточной передачи сигнала. При таком применении можно использовать указанную выше систему с двумя гибридами дрожжей, или можно использовать недавно разработанную систему с использованием гибридизации по Саузерну в нестрогих условиях с последующим клонированием методом РСВ (^йкк е! а1., 1989). В публикации \УПкк е! а1. описаны идентификация и клонирование двух предполагаемых протеинтирозинкиназ посредством применения гибридизации по Саузерну в нестрогих условиях с последующим клонированием методом РСВ на основе известной последовательности мотива киназы задуманной последовательности киназы. Такой подход можно применить, в соответствии с настоящим изобретением, с использованием последовательности белка, взаимодействующего с каспазой-8, для идентификации и клонирования белков, родственных белкам, взаимодействующим с каспазой-8.
Другой подход к применению белка, взаимодействующего с каспазой-3, или его аналогов, фрагментов или производных по изобретению состоит в использовании их в методах аффинной хроматографии для выделения и идентификации других белков или факторов, вовлеченных в процесс внутриклеточной передачи сигнала. При таком применении белок, взаимодействующий с каспазой-8, его аналоги, фрагменты или производные настоящего изобретения можно по отдельности присоединить к матрицам для
- 25 007273 аффинной хроматографии и затем привести в контакт с клеточными экстрактами или выделенными белками или факторами, которые, как предполагаются, вовлечены в процесс внутриклеточной передачи сигнала. Следуя процедуре аффинной хроматографии, можно элюировать, выделить и охарактеризовать другие белки или факторы, связывающиеся с белком, взаимодействующим с каспазой-8, или его аналогами, фрагментами или производными изобретения.
Как указывалось выше, белок, взаимодействующий с каспазой-8, или его аналоги, фрагменты или производные изобретения можно также использовать в качестве иммуногенов (антигенов) для получения специфических антител к ним. Такие антитела также можно использовать для целей очистки белка, взаимодействующего с каспазой-8 (например, №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека или ее любых изоформ), или от клеточных экстрактов или от трансформированных клеточных линий, продуцирующих белок, взаимодействующий с каспазой-8, или его аналоги или фрагменты. Далее эти антитела можно использовать для целей диагностики для идентификации нарушений, связанных с аномальным функционированием опосредованных каспазой-8 лиганда РА8-К или системы ΊΝΕ. Таким образом, если такие нарушения связаны с нарушениями в системе внутриклеточной передачи сигнала с участием белка каспазы-8 или белка, взаимодействующего с каспазой-8, такие антитела могли бы служить в качестве важного диагностического инструмента.
Следует также отметить, что выделение, идентификацию и характеризацию белка изобретения, взаимодействующего с каспазой-8, можно осуществить с использованием любой из хорошо известных стандартных процедур скрининга. Например, одну из таких процедур скрининга - процедуру с двумя гибридами дрожжей, как указано ниже, использовали для идентификации белка, взаимодействующего с каспазой-8 (см. 8!апдег е! а1., 1995), и затем различных белков изобретения, взаимодействующих с каспазой-8 (кроме различных других новых белков, указанных выше и ниже, в совместных находящихся на рассмотрении заявках). Подобным образом, как указывается выше и ниже, для выделения, идентификации и характеризации белка изобретения, взаимодействующего с каспазой-8, или для выделения, идентификации и характеризации других белков, факторов, рецепторов и т. п., способных связываться с белками изобретения, взаимодействующими с каспазой-8, можно использовать другие процедуры, такие как аффинная хроматография, методы гибридизации ДНК и т.п., хорошо известные в технике.
Пример Двухгибридный скрининг для идентификации белков, взаимодействующих с каспазой-8.
Для скрининга белков, взаимодействующих с каспазой-8, и их потенциальных субстратов использовали модифицированную систему с двумя гибридами дрожжей, описанную как Уеай-Йпее Ηνόπά 5у51ет (Τ^^οάе Р. е! а1., 1997). Отдельные использованные векторы, штаммы дрожжей и библиотеки получали от С1оп!ес11 (Ра1о А1!о, И8А) в виде компонентов двухгибридной системы Ма!с1ипакег (#РТ12651).
Две субъединицы каспазы-8 экспрессировали по отдельности под контролем разных промоторов. Короткую субъедининцу р10 (от серина 375 до аспарагиновой кислоты 479) клонировали в вектор рСВТ9 (С1оп!ес11) в рамке с доменом связывания ДНК дрожжевого белка Са14 (аминокислоты 1-147, числа в последовательностях в соответствии с Ьаидйоп е! а1., Мо1еси1аг ηπά Се11и1аг Вю1оду, 4, 260-267, 1984). Длинную активную субъединицу р20 (от серина 217 до аспарагиновой кислоты 374) мутировали в позиции 360, т.е. цистеин, находящийся в этой позиции, заменяли на серин (С3608), придавая протеазную активность неактивному ферменту.
Мутированную субъединицу С3608 р20 экспрессировали в виде неслитого белка под контролем промотора Ме!25, который положительно регулируется в среде, лишенной метионина (8аηд8οάа, Мо1. Сеп. Сепе!., 200, р. 407-14, 1985). Возможность регулирования активности промотора, управляющего экспрессией субъединицы р20, посредством подбора концентрации метионина в среде для роста дрожжевых клеток делает возможным (1) использование субъединиц токсичного белка в качестве наживки и (2) регулирование зависимости взаимодействия белок-белок от третьего партнера, т. е. субъединицы р20. Экспрессирующие единицы р10 и р20 можно локализовать в разных векторах. Их можно локализовать также в одном и том же векторе. В описываемом примере использовали модифицированный рСВТ9вектор рСВТ9-3Н (см. выше Τ^^οάе е! а1.). Субъединицу р20, предпочтительно, экспрессируют в виде гибрида с сигналом ядерной локализации.
После экспрессии в отсутствие метионина две субъединицы ассоциируют друг с другом в дрожжевой клетке. Ассоциация двух субъединиц показана с помощью экспериментов по коиммунопреципитации и вестерн-блоттинга.
Библиотеку кДНК В-клетки, клонированную в вектор рСАО СН (ЭигГее е! а1., Сепе5 Эеу., 7, 555569), получили в дар от д-ра 8. ε1Εά^. Вектор содержит домен активации Са14 (аминокислоты 768-881). Этого домена активации САЬ4 достаточно, когда слит с доменом связывания ДНК САЬ4, для индукции существенной транскрипционной активности гена 6АЬ4, см. Ма ηπά Р!а8Йпе, Се11, 48, 847-853 (1987).
Вышерасположенный сайт активации САЬ (иА8.5иЬ.6), как описано Кеедап е! а1., (1986), цитировано выше, присутствует в вышерасположенной области репортерного гена (1ас2) и гена, допускающего селекцию (Нй) в штамме дрожжей НР7с, полученном от С1оп!ес11.
Культуру НР7с трансформировали вышеуказанной каспазой-8, содержащей плазмиды, и трансформанты дрожжевых клеток отбирали посредством выращивания в среде для селекции, как описано в про
- 26 007273 токолах С1оп!есй для дрожжей, т.е. лишенной триптофана, лейцина, метионина, тирозина. Необязательно добавляли гомосерин в количестве 80 мг/л.
Затем культуру указанных трансформантов трансформировали далее библиотекой В-клеток, содержащей вектор, с последующим высеванием на вышеуказанную среду, лишенную гистидина (среда для селекции).
Необязательно, к среде для селекции добавляли 3-аминотриазол, который является ингибитором фермента гистаминсинтетазы. Добавление ингибитора служит для регуляции утечки из промотора, управляющего Ык-геном в дрожжевых клетках, не содержащих белков, взаимодействующих с каспазой8. В некоторых случаях слабое неспецифическое взаимодействие может привести к ложной транскрипции от промотора Са14-иАС-Ык, что ведет к дрожжевым клонам, растущим в среде для селекции.
Трансформанты, растущие в среде для селекции, отбирали и экстрагировали ДНК-плазмиды. Затем ДНК трансформировали в бактерии НВ101, которые допускают селекцию в среде, лишенной лейцина.
После выращивания бактерий и экстракции и очистки от них плазмидной ДНК затем трансформировали плазмидную ДНК в дрожжевые клетки 8ЕУ526. Затем проводили испытания 1ас2-активности трансформантов 8ЕУ526 посредством высевания на среду для селекции, включающую гистидин и содержащую Хда1. Затем колонии дрожжей снимали с использованием фильтровальной бумаги №50, А11а1тапп 3ММ (описание съема колоний см. в цитированной выше, 8атЬгоок е! а1.), затем помещали примерно на 20 с на алюминиевую фольгу, переносили примерно на 25 с в жидкий азот для того, чтобы заморозить дрожжевые клетки, выдерживали примерно 1 мин при комнатной температуре для того, чтобы дрожжевые клетки оттаяли, помещали в чашку Петри на фильтровальную бумагу №1, Айа!тапп 3ММ, которую предварительно смачивали в Ζ-буфере (буфер для реакции с бета-галактозидазой, см., например, протоколы С1оп!есй, цитировано выше, 8атЬгоок е! а1. или цитированной выше Сиггеп! Рго!осо1к 1п Мо1еси1аг Вю1оду), содержащем Хда1 и бета-меркаптоэтанол. Появление синего окрашивания в колониях указывает на активную бета-галактозидазу. Белки, взаимодействующие с каспазой-8, как правило, дают синюю окраску при этом анализе в интервале от минут до нескольких часов, предпочтительно - от 5 мин до 3 часов, и наиболее предпочтительно - в интервале от 5 мин до одного часа. С другой стороны, проводили количественную оценку бета-галактозидазной активности путем выращивания жидкой культуры в среде, содержащей Хда1, удаления клеток посредством центрифугирования и измерения поглощения среды с использованием спектрофотометра.
Клоны кДНК, идентифицированные в описанной выше процедуре скрининга, затем испытывали далее на взаимодействие с другими белками. Это испытание осуществляли посредством трансформации испытываемых клонов вместе с нерелевантным белком, экспрессированным в виде гибрида с доменом активации ДНК в векторе рСАЭ ОН.
Двойные трансформанты, способные расти в среде, лишенной гистидина, или показывающие ΕκΖактивность, указывали, что библиотечный клон связывался неспецифически.
В качестве нерелевантных белков использовали белки, известные как прилипающие, т.е. взаимодействующие неспецифически с другими белками, так же, как другие нерелевантные белки. Например, белки испытывали на связывание с ламином, К1Р, КАГОО, ТКАЕ2 и МОКТ1. Вообще, ламинсвязывающие белки отбрасывали.
Указанное выше трехгибридное испытание также осуществляли с субъединицей каспазы-8 р10, слитой с доменом связывания ДНК 1ехА. Предпочтительным вектором является вектор рЬехА, доступный от С1оп!есй. Когда в качестве домена связывания ДНК используют 1ехА, следует использовать штамм дрожжей Ь40 или эквивалентный штамм.
Белки, взаимодействующие с каспазой-8, идентифицировали с помощью описанного выше метода скрининга и затем анализировали с использованием анализов на расщепление 1п у1уо и 1п νίΙΐΌ и анализов на трансдукцию сигналов, как описано далее.
Пример 1В. Модифицированная наживка для двухгибридного скрининга для идентификации белков, взаимодействующих с каспазой-8.
Модифицированную каспазу-8 использовали для другого скрининга белков, взаимодействующих с каспазой-8, с системой с двумя гибридами дрожжей (Е1е1бк апб 8опд, 1989). Каспазу-8 экспрессировали из вектора-наживки рОВТ9 (С1оп!есй) в виде одноцепочечного белка. Для того, чтобы создать белокнаживку, который имел бы сходство с конформацией активной каспазы, удаляли предомен, и малую субъединицу 2 (начинающуюся от серина 375 и заканчивающуюся аспарагиновой кислотой 479) гибридизировали с доменом связывания ДНК Оа14. С-конец малой субъединицы отделяли от Ν-конца большой субъединицы 1 (начинающейся от серина 217 и заканчивающейся аспарагиновой кислотой 374) 16аминокислотным глицин-сериновым линкером (СССС8СССС8СССС8С). Таким образом, две субъединицы активной каспазы образуются при спонтанном образовании складчатой структуры одной молекулы. Цистеин активного сайта в субъединице 1 мутировали на серии (киЬ 1 С3608). Показано, что сверхэкспрессия такой одноцепочечной каспазы-8 функционально схожа со сверхэкспрессией каспазы-8 дикого типа, что определяется по ее способности индуцировать апоптоз в клетках НЕК 293Т при сверхэкспрессии из вектора рсВКАМ^, подобно каспазе-8. Активность одно-цепочечной каспазы-8 можно блокировать посредством коэкспрессии р35, являющегося ингибитором каспаз.
- 27 007273
Двухгибридный скрининг осуществляли так, как описано выше, за исключением того, что одноцепочечную каспазу-8, как описано выше, экспрессировали из вектора рСВΤ9 (С1оп!есй).
Пример 2. Идентификация белков, взаимодействующих с каспазой-8.
Используя модифицированную двухгибридную систему скрининга, описанную в примере 1А, идентифицировали несколько клонов, кодирующих белки, связывающиеся с каспазой-8. Специфичность связывания клонов подтверждали при двухгибридном испытании с дрожжами, в то время как обнаруживалось отсутствие связывания с контрольными белками. Отобранные клоны кДНК выделяли и секвенировали, и нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями, найденными в СепЬапк, как описано ниже.
Пример 2.1. Обнаружено, что клон Ь1 содержит неполную последовательность кДНК, идентичную аминокислотам 690-7 50 8!а! 1. 8!а! 1 идентифицировали как фактор транскрипции, который связывается с интерферон-стимулированным восприимчивым элементом (18КЕ) и с элементом гамма-активированной последовательности (6А8) (обзор см. в 1ГПс 8.Ν., 1998). Недавно показано, что 8!а! 1 вовлекается в регуляцию содержания конститутивной каспазы (Кшпег е! а1., 1997) и служит субстратом ш У1!го для каспазы-3 (Кшд Р. е! а1., 1998), Сделано предположение, что 8!а! 1 может играть некую роль в регуляции самой апоптозной реакции.
Пример 2.2. Обнаружено, что клон Ь7 кодирует неполную кДНК, которая почти полностью соответствует С-концевой части клона Е8Е найденного в СепЬапк, которому функционирование не приписывается (инвентарный номер АА6087 33).
Пример 2.3. Обнаружено, что клон Ь20 идентичен аминокислотам 104-420 ΝΈΤΑ (инвентарный номер 462693). ΝΈΤΑ является новым белком, содержащим домен связывания основных аминокислот предполагаемой ДНК с потенциальным ядерным сигналом направления доставки, две области мотива спираль-петля-спираль (НЬН), действующие совместно мотивы ΗΕ-ΙππΗ, кислотную богатую аминокислотами область между ЕΕ-йаηб. и лейциновый мотив-молнию (Вагшко1-\Уа1апаЬе е! а1., 1994). Также обнаружено, что ΝΈΤΑ является кальцийсвязывающим белком, и обнаружено, что он локализуется как в цитоплазме, так и на поверхности клетки, и его также можно обнаружить в культуральной среде. ИЕРЛ принадлежит к субсемейству нуклеобиндина. Однако биологическая роль NЕΕА пока не выяснена. Клон Ь20 расщепляется каспазой-8 как 1п уйго, так и ш у1уо.
Пример 2.4. Обнаружено, что клон Ь12 кодирует кДНК, которая почти полностью соответствует клону Е8Τ человека, найденному в базе данных (инвентарный номер М62097). Клон Ь12 расщепляется каспазой-8 1п уйго, как показано при анализе т уйго с протеазами. Коротко, синтезированный ш уйго меченный 358 белок инкубировали в течение 30-60 мин в протеазном буфере в присутствии каспазы-8, продуцированной бактериями. Белки и их фрагменты разделяли методом 8П8-РАСЕ, и результаты визуализировали с помощью ауторадиографии или люминофоров. Активность белка можно было блокировать специфическим ингибитором панкаспазы ζ-УАП-фторметилкетоном.
Пример 2.5.
Обнаружено, что клон Ь5 кодирует кДНК, идентичную белку ИрГЮ (инвентарный номер 3024755). Цр60 (взаимодействующий с Τа! белок в 60 кД) впервые описан как белок, взаимодействующий с клеточным трансактиватором НГУ-’Га! (Катше е! а1., У1го1оду, 216, 357-366, 1996) , а позднее показано, что он обладает гистон-ацетил-трансферазной активностью (Уатато!о апб НопкокЫ, 1997). Биологическую роль ИрГ)!), кроме его способности усиливать Τа!-опосредуемую активацию промотора НГУ, остается определить.
При двухгибридном испытании в дрожжах обнаружено, что клон Ь5 связывается с одной субъедининцей 2 каспазы-8, а также с комплексом р10-р20. Клон Ь5 расщеплялся каспазой-8 ш уйго при анализе 1п уйго с протеазами, описанном в примере 2.4. ^360 также расщеплялся зависимо от каспазы после коверхэкспрессии вместе с рецептором для ΤΝΕ р55 в клетках НеЬа и НЕК 293-Т. Он также расщеплялся в клетках НеЬа после обработки ΤΝΕ даже в отсутствие ингибиторов синтеза белка. Коротко, белок клонировали в вектор рсОНАНк (Гпуйгодеп) и экспрессировали в клетках НЕК 293-Т или НеЬа вместе с белком, индуцирующим апоптоз (например, р55ΤNΕ-К или каспазой-8). Через 20 ч после трансфекции клетки собирали и к лизатам 0,5-1х106 целых клеток применяли 8П8-РАСЕ и затем вестерн-блоттинг с антителами против поли-Нк (81дта). Результаты визуализировали с помощью ЕСЬ. Выделили несколько клонов кДНК, кодирующих вставки, соответствующие белку Цр60. Обнаружено, все клоны, включая полноразмерный, дикого типа клон ^360, лишены сегмента на протяжении от аминокислоты 94 (пролин) до 145 (треонин). Эта часть белка не является частью ацетилазактивного сайта и не считается существенной для функционирования белка. Обнаружено, что мутант ^360, где остатки аспарагиновой кислоты в позициях 200 и 203 заменены остатками аланина, не поддается расщеплению.
Пример 2.6. Обнаружено, что клон М2 6 кодирует неполную кДНК, которая почти полностью соответствует клону Е8Τ человека, найденному в СепЬапк (инвентарный номер С18037). При испытании с 2 гибридами в дрожжах обнаружено, что клон М26 связывается с одной субъединицей 2 каспазы-8.
Пример 3. Выделение белков, взаимодействующих с каспазой-8.
С использованием двухгибридного скрининга, описанного в примере 1В, идентифицировали несколько других клонов, кодирующих специфические белки, связывающиеся с каспазой-8. Отобранные
- 28 007273 клоны кДНК выделяли и секвенировали, и нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями, найденными в ОепЬапк, как описано ниже.
Скринировали библиотеку В-клеток (ЭигГее Т. е1 а1., 1993) и библиотеку Т-клеток Юрката. В табл. 2 приводится начальная характеризация первой группы клонов.
Таблица 2
Клон(ы) Часть/ гомолог к Источник 1асг (5ΓΥ) Длина вставки Расщепле ние
Несколь ΝΕΕΑ АЪЬ-клетки + 650- ίη νίνο/
ко 1100 ίη νίΐΤΟ
ВЗЗ Нуклеобиндин 1рг-клетки + 2000 ίη νίνο/ ίη νίΐτο
В4.2 ΚΙΑΑ0615 мозг самца +++ 3000 ίη νίΐτο
В8.1 Е5Т00156 +++ 1500 ίη νίνο/ ίη νίΐτο
В 11 Фосфоэтаноламинцитидилил трансфераза +++ 1500 ίη νίΐτο
В 17.1 Н23509 мозг младенца ++ 1200
В 13.1 Рибонуклео зиддифосфат редуктаза ЕВУ +++ 700 ίη νίΐτο
В22 ТТт/гк ппгЬт/г πτ/гм А + 700
В27 дЬАА936350 + 2700 ίη νίνο/ ίη νίΐτο
В37.1 ЕВУ ЕВУ ++++ 1400
Л2 АА746639 человек ++++ 600 ίη νίΐτο/ ίη νίνο
Д4 0 ΚΙΑΑ0419 мозг самца + + 2300 ίη νίΐτο
ίη νί\Ό: клетки 293-Т и/или НеЬа
Неполные клоны, кодирующие части NЕΕА, так же, как и клон В 8.1, выделяли также методом с двумя гибридами дрожжей, описанным в примере 1А.
Пример 3.1. Клоны В4 (инвентарный номер 3327044), В17 (инвентарный номер Н23509), В27 (инвентарный номер АА936350) и 140 (инвентарный номер 2887413), кодируют вставки кДНК, гомологичные терминальному концу соответствующих Е8Т.
Пример 3.2. Клон В11 кодирует кДНК-вставку, гомологичную С-концу СТР-фосфоэтаноламинцитидилилтрансферазы (ЕТ, инвентарный номер Э84307). ЕТ является ферментом, вовлеченным в метаболизм фосфолипидов, и катализирует конверсию фосфоэтаноламина в С'ЭР-этано.замин (№казЫша е! а1., 1997). Клон В11 расщеплялся ίη νίΐΐΌ каспазой-8, что показано при анализе, описанном выше в примере 2.4.
Пример 3.3. Клоны В13 и В37 кодируют кДНК-вставку, гомологичную С-концу клона, кодирующего часть генома ЕВУ (инвентарный номер У01555).
Пример 3.4. Клон В22 кодирует кДНК-вставку, гомологичную С-концу Т-клеточного циклофилина (инвентарный номер Υ00052). Т-клеточный циклофилин идентифицирован как внутриклеточный рецептор для циклоспорина А и ЕК506 и обладает активностью подлинной пептидилпролил-цис-трансизомеразы (НаенсПег В. е! а1., 1987).
Пример 3.5. Клон В33 кодирует кДНК-вставку, гомологичную С-концу нуклеобиндина (инвентарный номер 2506255). Нуклеобиндин является секретируемым белком со свойствами связывания ДНК и Са2+, который весьма схож с белком NЕΕА, описанным в примере 3.3. Нуклеобиндин первоначально описан как белок в 55 кД, усиливающий продуцирование антител против ДНК в культурах аутоиммунных клеток 1рг селезенки мыши (М1ига К. е! а1., 1992). Клон В33 расщеплялся каспазой-8 как ίη νίΐΐΌ, так и ίη νί\Ό, как показали анализы, указанные выше в примерах 2.4 и 2.5.
Пример 3.6. Клон 12 содержит вставку в 600 п.о., кодирующую неполную белковую последовательность, которая вырастает в полипептид в ~20 кД, когда экспрессируется ίη \Дго в бесклеточной системе,
- 29 007273 а также в клетках. Полипептид, кодированный клоном 12, расщепляется 1и νίΙΐΌ каспазой-8 и ш у1уо в клетках НЕК 293-Т и клетках НеЬа после коэкспрессии с ρ55ΤΝΕ-Κ или каспазой-8 при анализах, указанных выше в примерах 2.4 и 2.5.
Нуклеотидная последовательность и расшифрованная аминокислотная последовательность клона 12 приводятся на фиг. 2.
Сравнение и выстраивание в ряд 5'-наращивания клона 12 с помощью РСК с последовательностями, опубликованными в базе данных, показали гомологию клона 12 с ЕБТ человека (инвентарный номер АА4 608 69) , что соответствует предполагаемой М-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазе человека, а также другому клону (Б48741), и дало состав предполагаемой полноразмерной М-ацетилглюкозамин-6фосфатдеацетилазы человека, приведенный на фиг. 3.
Пример 4. Функциональная характеризация клона 12.
Первоначальная функциональная характеризация клона 12 показала, что клон обладает ингибирующей активностью в отношении каспазы-8 и апоптоза, индуцируемого ρ55ΤΝΕ-Η человека в клетках НЕК 293-Т и НеЬа. Экспрессия 12 подавляла/замедляла апоптоз клеток НЕК 2 93-Т, котрансфицированных рецептором для ΤΝΕ р55, или клеток НеЬа, обработанных ΤΝΕ и циклогексимидом, на 25-50%, что иллюстрируется фиг. 3. Количественное определение гибели вследствие апоптоза осуществляли путем определения части экспрессирующих бета-галактозидазу клеток, показывающих апоптозную морфологию через 2 0 часов после трансфекции указанных конструкций. Результаты выражены в виде среднего процента синих клеток, показывающих признаки апоптоза, как части общего числа подсчитанных синих клеток (примерно 500 клеток на образец). С другой стороны, использовали белок зеленой флуоресценции в качестве маркера, и проводили определение с помощью флуоресцентного конфокального микроскопа.
Пример 5. Клонирование белков, взаимодействующих с каспазой-8.
Библиотеку кДНК плаценты человека, экспрессированную из вектора рАСТ2 (доступного от С1ои1есБ, Ра1о А11о, ИБА), скринировали методом двухгибридного скрининга с использованием наживки, описанной выше в примере 1В. Используя такую процедуру скрининга, идентифицировали несколько клонов, кодирующих специфические белки, взаимодействующие с каспазой-8. Также исследовали клоны Р16, Р27, Р43, Р70, Р74 и Р79.
Секвенирование кДНК-вставок клонов кДНК Р43, Р16 и Р74 показало, что они участвуют в некоторых гомологичных последовательностях. Клон Р7 4 имел самую длинную кДНК-вставку примерно в 3000 п.о. и, как оказалось, кодирует белок с расшифрованной открытой рамкой считывания из 57 4 аминокислот и с ожидаемой молекулярной массой примерно 68-70 кД. Последовательности трех вышеуказанных кДНК-вставок сравнивали с последовательностями, найденными в опубликованных базах данных. Обнаружено, что кДНК-вставки клонов Р43, Р16 и Р74 имеют некоторую гомологию с последовательностью двух клонов ЕБТ, найденных в СеиЬаик (\УО4418 и N64095). Оказалось, что последовательность всех трех кДНК-вставок составляет 3'-концы различных сплайсинг-изоформ того же белка. Выстраивание в ряд последовательностей трех кДНК-вставок подтвердило открытую рамку считывания из 574 аминокислот в последовательности Р7 4 (показана на фиг. 5). Подобную последовательность также нашли в геномном клоне, идентифицированном в другой опубликованной базе данных (КРС15-1057120; библиотека Ко8\уе11 Рагк Саисег 1и8Й1и1е Нитаи РАС), которая локализуется на хромосоме человека 12с.|31. Открытая рамка считывания, расшифрованная из последовательности этого клона РАС, имела 1428 аминокислот (показана на фиг. 6), и она содержит указанную выше открытую рамку считывания, имеющую 57 4 аминокислоты. Фиг. 7 показывает выстроенную в ряд последовательность открытой рамки считывания расшифрованной аминокислотной последовательности кДНК-вставки клона Р74 (обозначенной клонированная) с открытой рамкой считывания, расшифрованной из последовательности клона РАС (обозначенной расшифрованная).
При сравнении расшифрованной аминокислотной последовательности клона Р74 и последовательности, расшифрованной из полноразмерного клона РАС, оказалось, что полноразмерный белок, соответствующий Р74, длиннее в 5'-конце и может, вероятно, начинаться с первого или одного из первых метионинов последовательности РАС, показанной на фиг. 6.
Также обнаружено, что последовательность клона Р74 показывает существенную гомологию с высокогомологичной областью гистондеацетилаз мыши и человека, областью, которая могла являться доменом, содержащим сайт ферментной активности гистондеацетилазы, причем предполагается, что белок, кодированный Р74, может разделять функцию этих белков. Последовательность в области 163-1716 п.о. неполной кДНК клона Р74 показывает примерно 80% гомологию с гистондеацетилазой А (инвентарный номер №_006028). Последовательность в области 385-1707 п. о. неполной кДНК клона Р74 показывает гомологию с последовательностью гистондеацетилазы 5 (инвентарный номер №_005465). Последовательность в области 418-1629 п.о. неполной кДНК клона Р74 показывает гомологию с последовательностью гистондеацетилазы шНЭА1 (инвентарный номер ААЭ09834), и последовательность в области 4241551 п.о. неполной кДНК клона Р74 показывает гомологию с последовательностью гистондеацетилазы 6 (инвентарный номер №_006035). Выстраивание в ряд аминокислотной последовательности полноразмерного белка, расшифрованной из последовательности РАС, с последовательностью гистондеацетилазы А (СеиЬаик, инвентарный номер №_006028.1) показано на фиг. 8.
- 30 007273
Пример 6. Функциональная характеризация белков, взаимодействующих с каспазой-8.
A) Белки, кодированные клонами кДНК 12, или Р16, или Р43, или Р70, или Р74, или Р79, идентифицированные методом двухгибридного скрининга, экспрессировали в лизатах ретикулоцитов в присутствии 358 метионина в системе лизатов сочетания ретикулоцитов ΤπΤ Т7 (доступной от Рготеда, кат. № Б4610) и разделяли в геле методом 8Э8-РАСЕ (см. фиг. 9А). Такие же количества белков, экспрессированных в лизатах ретикулоцитов, анализировали на связывание с гибридным белком двух субъединиц каспазы-8 Ο8Τ-82-81 (С3608) из вышеописанного примера 1В, слитого с Ο8Τ и экспрессированного в бактериях. После предварительной очистки посредством 1-часовой инкубации при 4оС только с гранулами Ο8Τ, продуцированные ΤπΤ белки осаждали гибридным белком Ο8Τ-82-81 каспазы-8, соединенного с гранулами Ο8Τ посредством 1-часовой инкубации при 4оС с гранулами Ο8Τ, С8Τ-преципитаты промывали, и белки, связывающиеся с каспазой-8, отделяли от гранул посредством кипячения в содержащем 8Ό8 буфере для образцов и разделяли методом 8Э8-РАСЕ. Белки, способные к связыванию с конструкцией каспазы-8, можно затем визуализировать методом ауторадиографии. Оказалось, что белок, кодированный клоном Р74, специфически связывается ш νίΙΐΌ с каспазой-8 (см. фиг. 9В), если сравнивать со связыванием Ο8Τ-82-81 (С3608) с В1б- известным проксимальным субстратом каспазы-8 в каскаде передачи сигнала апоптоза Рак. Полноразмерные белки, полученные в лизате ретикулоцитов, помечены на фигуре звездочками.
При испытаниях с двумя гибридами, описанных выше в примере 1А, обнаружено, что белок, кодированный Р74, связывается с гибридным белком, кодированным двумя субъединицами каспазы-8, а не с малой субъединицей каспазы-8, экспрессированной отдельно. Для сравнения, другие белки, указанные в приведенных выше примерах, такие как Пр60, связываются с малой субъединицей 82 каспазы-8, когда она экспрессируется одна (данные не приводятся).
B) Белок, кодированный кДНК Р43, экспрессировали ш νίίΐΌ в лизатах ретикулоцитов в присутствии 358 метионина с использова нием системы лизатов сочетания ретикулоцитов ΤιιΤ Т7 и подвергали расщеплению рекомбинантом дикого типа или мутированной каспазой-3, или каспазой-9, или каспазой10, экспрессированными в Е. сой в виде помеченных гистидином гибридных белков субъединицы 2 субъединицы 1 (82-81). Каспазу-8 экспрессировали в виде помеченного гистидином гибридного белка субъединицы 1 - субъединицы 2 (81-82). В анализе с протеазами использовали 1 и 4 объема полного бактериального лизата, определенных как 1 и 4 относительных единицы (КИ) (фиг. 10). Коротко, синтезированные ш \'йго меченые 358 белки инкубировали в протеазном буфере в течение 30 мин при 37оС в присутствии каспазы-8, продуцированной бактериями. Белки и их фрагменты разделяли методом 8Э8-РАСЕ и результаты визуализировали методом ауторадиографии или с помощью люминофоров. Результаты показали, что белок, кодированный кДНК Р43, используемый в качестве субстрата, эффективно расщеплялся каспазой-8, слабо расщеплялся каспазой-10 и не расщеплялся ни каспазой-3, ни каспазой-9 (фиг. 10). Таким образом, оказалось, что белок является специфическим субстратом каспазы-8.
C) Для анализа действия вновь клонированных белков на апоптозную гибель клеток, индуцированную каскадом передачи сигнала рецептором для ΤΝΕ, отобранные кДНК клонировали в экспрессирующие векторы рсЭНА 3.1/Н1к С (доступные от 1п\'йгодеп) и неустойчиво котрансфицировали рецептором для ΤΝΕ р55 в векторе рсПЫА 3 (1птйгодеп) и белком зеленой флуоресценции (СЕР), экспрессированным из экспрессирующего вектора рЕСЕРС1 (С1оп1есй), в клетки НЕК 293-Т. Клонировали кДНК Пр60 и Δ32^360, лишенный первых 32 Ν-концевых аминокислот, в векторе рССЫ (описан М. Τаηака апб ^. Негг, Се11, 60, 375-386, 1990), в котором гемагглутининовая (НА) метка слита с Ν-концом кДНК, и использовали в таком же эксперименте.
Через 24 часа трансфицированные клетки проверяли под флюоресцентным микроскопом, и гибель клеток учитывали путем определения числа клеток из всей популяции флуоресцирующих клеток, показывающих апоптозную морфологию. Обнаружили, что белок Р74, экспрессированный в избытке из неполной кДНК, клонированной в вектор рсПНА-Н1к, защищает клетки НЕК 293-Т и НеЬа от гибели, вызванной сверхэкспрессией рецептора для ΤΝΕ р55 (фиг. 11) или сверхэкспрессией слитых двух субъединиц каспазы-8 (не показано). Обнаружено, что Пр60 дикого типа и неспособный к расщеплению мутант Пр60, где остатки аспарагиновой кислоты в позициях 200 и 203 заменены на остатки аланина, защищают клетки НЕК 293-Т от гибели, вызванной сверхэкспрессией рецептора для ΤΝΕ р55 (фиг. 12), в то время как Δ32-Τ^р60, лишенный первых 32 Ν-концевых аминокислот, не оказывал такого защитного действия.
Имея теперь полное описание данного изобретения, специалистам в этой области техники следует иметь в виду, что такие же операции можно выполнить с широким рядом эквивалентных параметров, концентраций и условий без отхода от сущности и объема изобретения и без излишнего экспериментирования.
Несмотря на то, что данное изобретение описано в связи с конкретными вариантами его воплощения, следует иметь в виду, что возможны другие модификации. Подразумевается, что данная заявка перекрывает любые вариации, применения или адаптации изобретения, вытекающие, вообще, из основных положений изобретения и включающие такие отклонения от настоящего описания, которые возникают в известной или обычной практике в области техники, к которой относится изобретение, и которые можно применить к существенным признакам, изложенным выше, как следует из объема прилагаемой формулы
- 31 007273 изобретения.
Все ссылки, цитированные здесь, включая журнальные статьи или рефераты, опубликованные или соответствующие заявкам на патент США или других стран, или любые другие ссылки, включены в настоящее описание в качестве ссылок во всей полноте, включая все данные, таблицы, фигуры и тексты, представленные в цитированных ссылках. Кроме того, все содержание цитированных здесь работ также во всей полноте включено в качестве ссылки.
Ссылки на известные стадии способов, стадии традиционных способов, известные способы или традиционные способы никоим образом не являются признанием факта, что какой-либо аспект, описание или вариант воплощения настоящего изобретения раскрываются, поясняются или предполагаются в родственных технических решениях.
Вышеизложенное описание конкретных вариантов воплощения изобретения будет настолько полно раскрывать общий характер изобретения, что другие могут, используя знания в данной области техники (включая содержание цитированных здесь ссылок), легко модифицировать и/или адаптировать для разных применений такие конкретные варианты воплощения изобретения без излишнего экспериментирования, без отхода от общей концепции настоящего изобретения. Следовательно, подразумевается, что такие адаптации и модификации находятся в пределах целей и круга эквивалентов описанных вариантов воплощения изобретения, основанных на пояснениях и указаниях, изложенных здесь.
Следует иметь в виду, что фразеология или терминология использованы здесь для целей описания, а не для ограничения, так что терминология или фразеология в описании настоящего изобретения должны интерпретироваться специалистами в свете пояснений и указаний, представленных здесь, в сочетании со знаниями рядового специалиста в этой области техники.
Ссылки
ΑΙιπίΗά М. еί а1. Саг1сег Кек. 1997; 57(4): 615-9
Βат^кο1-VаίаηаЬе 8. еί а1. Βίοϊ. С1ют. ^рре 8еу1ег 1994; 375(8): 497-512
ΟοΗοη О.М. Вюсйет., 1. 1997; 326 (Ρί 1): 1-16
Оиам Η е1 а1. Νοίπιβ, 1997; 385(6611): 86-9
ЭшТее Т. еί а1. Сенек. Эеу. 1993; 7(4): 888-69
Тетаηάек-Α1ηетπ Т. еί а1. Ргос №111 Αсаά 8α υ8Α 1996; 93 (15) : 7464-9
НеИк 8., 8οημ О. Νοίπιβ 1989; 340(6230): 245-6
Нае^к!· В. е1 а1., ЕМВО 1 1987; 6(4): 947-50
1Ь1е ΙΝ. Се11 1996; 84(3): 331-4
Катте 1. е1 а1. У1то1@ 1996; 216(2): 357-66
Кшд Р. е1 а1. 1 Βίοϊ СЬет 1998; 273(15): 8699-704
К1ксйке1 Т.С. е1 а1. ΕМΒО 1 1995; 14(22): 5579-88
Китаг Α. е1 а1. 8с1еисе 1997; 278(5343): 1630-2
Оие11е Τ.ν. е1 а1. 1. Βίοϊ. СЬет. 1995; 270(35): 20775-80
МасЕаНаме М. е1 а1. 1. Βίοϊ. СЬет. 1997; 272(41): 25417-20
М1й1 Р.К. е1 а1 1. Βίοϊ. СЬет. 1997; 272(10): 6539-47
Мшга К. еί а1. Β^οсЬет. Βϊορ^κ. Кек. Сеттла 1992; 187(1):
375-80
Ми/ίο М. е1 а1 1. Βίοϊ. СЬет. 1998; 273(5): 2926-30 №ща1а 8 е1 а1. Се11. 1997; 88(3): 355-65
МакакКнна Α. е1 а1. 1. Βίοϊ. СЬет. 1997; 272(14): 9567-72
ΝίοΗοϊδοη Ό.ν. еί а1. Тгемй Β^οсЬет. 8а. 1997; 22(8): 299-306
Κοΐοηά3 1. еί а1. 81гис1. 8ίοϊ. 1996; 3(7): 619-25
8ι^^η С.8. е1 а1. Се11 1997; 91(4): 443-6
8пшуаки1а 8.М. еί а1. Ргос. №-И1. Αсаά. 8α. υ8Α 1996; 93(25):
14486-91
8п1н\аки1а 8.М. е1 а1. 1. Βίοί. СЬет. 1998; 273(17): 10107-11
ТЬстЬепу Ν.Α. е1 а1. 1. Βίοϊ. СЬет. 1997; 272(29): 17907-11
Т1гобе Т. е1 а1. 1. Βίοϊ. СЬет. 1997; 272(37): 22995-9
Υататοίο Т. е1 а1. 1. Βίοϊ. СЬет. 1997; 272(49): 30595-8
Υι^ X е1 а1. Мс1. Се11. 1998; 1(2): 319-25
- 32 007273
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
- 33 007273 <110> ИАЬЬАСН, Баутс!
ЗСНиСКМАШ, Магсиз εΟΝΟΗΑΒΟν, Тапуа Уейа Резеагсй апй БеуеЬортепб Со. ΙΛά.
<120> Ν-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилаза человека, взаимодействующая с каспазой-8, и способы ее применения
<130> Каспаза-8
<140>
<14 1>
<150> <151> 132105 1999-09-28
<150> <151> 127721 1998-12-24
<160> 9
<170> РабепЫп Уег. 2.0
<210> 1 <211> 447 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 1 сддсасдадд дссбдддсаа сддссддсас асдсбдддас адсаддаадД ддаадбддас60 ддЕсДдасдд ссЬасдЬддс аддЬдадсдс ссбдасссас 'ЬдддЬсссад дбсссадссс120 дсабдссадд Ьддсссасда сссссссада дссбдсссЕс ЬсЬдсбсЬса аддсассаад180 асдсЬдадбд дсадсабадс сссаабдаас дЬсЬдЬдбсс дддсасббсс Ьдсаддссас240 аддЬЬсадса Ьдаадбсддс сЬЬдааддсб дсаЬссЬЬдс ассссдссса дЬ'Ьдсбдддд300 сбддадаада дЬааддддас сЬЬдасбЬЬд дЕдсбдасдс адасббсдСд дЬдсбсдасд360 асбсссЬЬса сдбссаддсс ассбасабсЬ сдддЬдадсЬ ддЬдбддсад дсддасдсад420 сОаддсадДд асааддассб сддсОда447 <210> 2 <211> 148 <212> Белок <213> Ното зарДепз <400> 2
Агд 1 Н1з 61и С1у Ьеи С1у 5 Азп С51у Агд НЬз 10 ТНг Ьеи С1у С1п С1п 15 С1и
Уа1 С1и Уа1 Азр С1у Ьеи ТЬг А1а Туг Уа1 А1а С1у 61и Агд Рго Азр
20 25 30
Рго Ьеи С1у Рго Агд Зег С1п Рго А1а Суз С1п Уа1 А1а НФз Азр Рго
35 40 45
Рго Агд А1а Суз Рго Ьеи Суз Зег О1п С1у ТНг Ьуз ТЬг Ьеи Зег С1у
50 55 60
Зег Не А1а Рго Меб Азп Уа1 Суз Уа1 Агд А1а Ьеи Рго А1а С1у Нтз
65 70 75 80
Агд РЬе Зег Меб Ьуз Зег А1а Ьеи Ьуз А1а А1а Зег Ьеи НЬз Рго А1а
90 95
- 34 007273
С1п Ьеи Ьеи С1у 100 Ьеи С1и Ьуз Зег Ьуз 105 <31 у ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи 110 Уа1 Ьеи
ТЬг С1п ТЬг Зег Тгр Суз Зег ТЬг ТЬг Рго РЬе ТЬг Зег Агд Рго Рго
115 120 125
ТЬг Зег Агд Уа1 Зег Тгр Суз С1у Агд Агд ТЬг Θΐη Ьеи С1у Зег Азр
130 135 140
Ьуз Азр Ьеи С1у
145 <210>
<211>
<212>
<213>
1513 ДНК Ното зарЬепз <400> ддсдсддсЬс сЬссддадсс сссдЬдсЬсс сЬдЬдддЬдс дрддссдасд садаЬсаасс дЬЬдсссЬсд дЬсасЬЬссс ддЬссссаЬд аадсддддсд ЬЬдсЬддсса ддссдЬадсс сасЬсадЬдд асссассЬсЬ сЬдассадсд асдсасасса сЬддЬсассд саддаадЬдд дд-ЬсссаддЬ ЬдсРсЬсаад сасЬЬсссдс сссдсссадЬ дасЬЬсдЬдд дЬд-Ьддсадд дсадсдддаЬ адсссЕдсЕд сдсЬсЬсддс дсксдсЬссс адЬЬсасЬаа дсддаддссд адсддсддда дЬддаЬЬЬдд Ьддсссддад сассддаддс дддсаддддЬ сдсассссда сскасдддсс асдаадЬдаЬ скдассЪдсд ЬсаасдссаЬ ассддсЬдсс ассссдссдс аЬдссаЬссс аадЬддасдд сссадсссдс дсассаадас аддссасадд ЬдсЬддддсО ЬдсЬсдасда сддасдсадс дссаЬсаддд даЬ
ЬддддЬЬсдЬ дасасддсЬс сЬдссддаЪс саЬсЬЬддас сЬдсдддддс ЬдЬЪдасЬЬс даЬссЬдЬсд ЬЬаЬсасаад ссЬсдддсЬд ддсссассЬс ссЬддасааЬ ссдддсдсЬд ддсддсадад дсЬдссЬЬЬс сдсаддссдс ссЬдсддаЬс ЬдссЬЬдддс ЬсЬдасддсс аЬдссаддЬд дсЬдадсддс сЬдсадсаЬд ддадаададЬ сЬсссЬЬсас ЬаддсадЬда ссдддЬддЬЬ сасЬдддсдс асдакдсдсд сЬдсдсддад ссададаадс сдсаЬсЬЬдд ЬсЬсаадсса сасддсдЬса дЪЬдЬЬссЬс сасскддадд сдсЬссЬЬсд дЬссдсаЬсд асддсссдрд даЬдсЬдЬдЬ сассассдсд ЬдсаЬсЬЬсЬ дсссассдЬд сЬдддсаасд РасдЕддсад дсссасдасс адсаЬадссс дадЬсддссс ааддддассс дЬссаддсса сааддассЪс ддддадсЬдд дддаЬЬЬддс дсдасадддс ддаааскдсЬ ЬдЬЬсЬЬЬда сЬсссддаЬЬ сддаддасдЬ ссЬссЬЬсЬд ада-ЬсссТдЪ дсссс’ЬЬсаЬ аддссдаЬдс 5дасдсЪддс дсаЬсЬдсдЬ ддадсддадс асссаддсаЬ аЬдддаЬдаЬ сссаЪсссса дссддсасас дрдадсдссс сссссададс сааЬдаасдЬ ЬддаддсЬдс Ьддас'Ь'Ь'Ьдд сскасаРсЬс ддсЬдададд ЬсЬссаддда сдссдсдддд сддсдддддс садддаддаЬ ддадсддсдс саЬсдасдЬд дддЬЬсдддд ссссасссЬд даададЬддЬ садссдддад сЬЬссаддас сссададЬЬд дЬсссЬаддд сассЬЬсаЬс сдЬддддсЬс ЬдсадаЬддс ддддсЬддЬд дсЬдддасад ЬдасссасЬд скдсссТскс сЬдЬдЬссдд аЬсссЬдсас ЬдсЬдасдса дддкдадсЬд асассЪддсс дЬдадЬсддд
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1513 <210>
<211>
<212>
<213>
502
Белок
Ното зарЬепз <400>
С1у Ί X А1а А1а Рго Ьеи к Зег А1а С1у Уа1 Агд Ί П х о Н13 Тгр А1а Агд Азр 1 с; X и Ьеи
А1а А1а А1а С1у Ьеи Агд Зег Агд Зег Ьеи Рго ТЬг Агд Ьеи ТЬг Мер
20 25 30
Агд С1у Азр Агд А1а 61у С1у С1у Рго Уа1 Ьеи С1п РЬе ТЬг Азп Суз
35 40 45
Агд Не Ьеи Агд С1у С1у Ьуз Ьеи Ьеи Агд С1и Азр Ьеи Тгр Уа1 Агд
- 35 007273
С1у 65 С1у Агд 11е Ьеи Азр 70 Рго (Ии Ьуз Ьеи Рйе 75 Рйе (Ии (Ии Агд Агд 80
Уа1 А1а Азр С1и Агд Агд Азр Суз С1у С1у Агд Не Ьеи А1а Рго СИу
85 90 95
Рйе 11е Азр Уа1 С1п 11е Аз η Агд (Иу Рйе С1у Уа1 Азр Рйе Зег С1п
100 105 110
А1а Тйг (Ии Азр Уа1 С1у Зег С1у Уа1 А1а Ьеи Уа1 А1а Агд Агд Не
115 120 125
Ев и Зег ΗΪ8 т χζ — _ζ Уа1 Тйг Зег Рйе Ρν.ς — — Рго Тйг Ьеи Уа1 Тйг Зег Рго
130 135 140
Рго С1и А1а Туг Низ Ьуз Уа1 Уа1 Рго С1п 11е Рго Уа1 Ьуз Зег С1у
145 150 155 160
С1у Рго Н13 С1у А1а С1у Уа1 Ьеи (Ну Ьеи Н13 Ьеи (Ии С1у Рго Рйе
165 170 175
Не Зег Агд (Ии Ьуз Агд (Иу А1а Н13 Рго (Ии А1а Н13 Ьеи Агд Зег
180 185 190
Рйе Ни А1а Азр А1а Рйе С1п Азр Ьеи Ьеи А1а Тйг Туг С1у Рго Ьеи
195 200 205
Азр Аз η Уа1 Агд Не Уа1 Тйг Ьеи А1а Рго (Ии Ьеи С1у Агд Зег ΗΪ3
210 215 220
С1и Уа1 11е Агд А1а Ьеи Тйг А1а Агд С1у Не Суз Уа1 Зег Ьеи С1у
225 230 235 240
ΗΪ3 Зег Уа1 А1а Азр Ьеи Агд А1а А1а С1и Азр А1а Уа1 Тгр Зег СИу
245 250 255
А1а Тйг Рйе 11е ТЬг Нгз Ьеи Рйе Азп А1а МеЬ Ьеи Рго Рйе ΗΪ3 ΗΪ3
260 265 270
Агд Азр Рго 61у Не Уа1 (Ну Ьеи Ьеи Тйг Зег Азр Агд Ьеи Рго А1а
275 280 285
С1у Агд Суз 11е Рйе Туг С1у МеЬ Не А1а Азр СИу Тйг ΗΪ3 Тйг Азп
290 295 300
Рго А1а А1а Ьеи Агд Не А1а Н13 Агд А1а Юз Рго СИп СИу Ьеи Уа1
305 310 315 320
Ьеи Уа1 Тйг Азр А1а 11е Рго А1а Ьеи С1у Ьеи (Ну Азп С1у Агд Нгз
325 330 335
Тйг Ьеи (Ну С1п С1п (Ии Уа1 СИи Уа1 Азр С1у Ьеи Тйг А1а Туг Уа1
340 345 350
А1а (Иу (Ии Агд Рго Азр Рго Ьеи С1у Рго Агд Зег (Ип Рго А1а Суз
355 360 365
С1п Уа1 А1а Н1з Азр Рго Рго Агд А1а Суз Рго Ьеи Суз Зег С1п (Иу
370 375 380
Тйг Ьуз Тйг Ьеи Зег СИу Зег Не А1а Рго Мек Азп Уа1 Суз Уа1 Агд
385 390 395 400
Н13 Рйе Ьеи С1п А1а Тйг СИу Суз Зег Мей С1и Зег А1а Ьеи С1и А1а
- 36 007273
405 410 415
А1а Зег Ьеи Низ Рго А1а 61п Ьеи Ьеи 61у Ьеи С1и Ьуз Зег Ьуз С1у
420 425 430
ТЬг Ьеи Азр РНе С1у А1а Азр А1а Азр РНе Уа1 Уа1 Ьеи Азр Азр Зег
435 440 445
Ьеи Низ Уа1 61п А1а ТЬг Туг 11е Зег С1у С1и Ьеи Уа1 Тгр 61п А1а
450 455 460
Азр А1а А1а Агд <31п С1п С1у Рго Агд Ьеи Агд С1у Н13 Ьеи А1а А1а
465 470 475 480
А1а С1у Суз Нтз С1п С1у Агд Уа1 Уа1 С1у С1и Ьеи Уа1 Зег Агд С1и
485 490 4 95
Уа1 О1у Зег Рго А1а 31у
500 <210> 5 <211> 1725 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 5 дадсадсЬса ааасЬсасд! ссаддЬдаЬс аададдЪсад ссаадссдад Ьдадаадссс60 сддсЬдсддс адаЬасссЬс ддсЬдаадас сЬддадасад аЬддсддддд ассдддссад120 дЬддЬддасд аЬддссйдда дсасадддад сЬдддссаЬд ддсадссйда ддссададдс180 сссдсЬссЬс Ьссадсадса сссЬсаддЬд ЬЬдсЬскддд аасадсадсд асЬддсЬддд240 сддсЬссссс ддддсадсас сддддасасО дЬдсЬдсЬЬс сЬсЬддссса дддЬдддсас300 сддссЬсОд! сссдддсЬса д-ЬсЬЬсссса дссдсассЬд ссЬсасОдЬс адссссадад360 ссЬдссадсс аддсссдад! ссЬсЬссадс Ьсададассс сЬдссаддас сскдсссООс420 ассасадддс Ьда-ЬсОаОда сЬсддЬсаЬд сЬдаадсасс адЬдсЬссЬд сддОдасаас480 адсаддсасс сддадсасдс сддссдсаЬс сададсаЬс! ддЬсссддс! дсаддадсдд540 дддскссдда дссадЬдЬда дЬдЬсЬссда ддссддаадд ссЬсссЬдда ададсОдсад600
ЬсддЬссас’Ь сЬдадсддса сдйдсЬссЬс Ьасддсасса асссдсЬсад ссдссЬсааа660 сЬддасаасд ддаадсЬддс адддс'ЬссОд дсасадсдда ЬдЬ'ЬЬдЬдаЬ дсЬдсссЬд-Ь720 ддЬддддЬЬд дддЬддасас ЬдасассаЬс ЬддааЬдадс ОЬсаЬОссЬс сааОдсадсс780 сдсЬдддссд сОддсад-ЬдЪ сасЬдассйс дссЪксааад ЬддсЬЬсЬсд ЪдадсОааад840 ааЬддЬЬЬсд сЬдЬддЬдсд дсссссадда сассаЬдсад аЬсаЬЬсаас адссаЪдддс900
Ыс'Ьдс’Ь’ЬсЬ ЬсаасЬсад! ддссаЬсдсс Одссддсадс Ьдсаасадса дадсааддсс960 адсаадаЬсс ОсаЬЬдЬада с'ЬдддасдЬд сассаОддса асддсассса дсааассЬЬс1020
Ьассаадасс ссадЬдЬдсО сЬасаЬсЬсс сЬдсаЬсдсс аЬдасдасдд саасЬЬсЬЬс1080 ссадддадЬд дддсйдЬдда ЬдаддЬаддд дсОддсадсд дЬдадддсЬЬ сааОдЬсаа!1140 дЬддссЬддд сЬддаддЬс! ддассссссс аОдддддаОс сЬдадЬасс! ддсЬдсЬЬЬс1200 аддаЬадЬсд ЬдаЬдссса! сдсссдадад ЬЬсЬсЬссад ассЬадЬсс! ддЬдЬсЬдс!1260 ддаЬЬЬдаЬд сЬдсЬдаддд Ьсасссддсс ссасОдддОд дсОассаОд! !!с!дссааа1320 !д!!!!дда! асаЬдасдса дсаасЬдаЬд аассЬддсад даддсдсад! ддЬдсЬддсс1380
ЬЬддадддЬд дссаЬдасс! сасадссаЬс ЬдЬдасдсс! сЬдаддссЬд ЬдЬддсЬдс!1440 сЬЬсЬдддЬа асадддЬдда ЬссссЬЬЬса даадааддсЬ ддааасадаа асссаассЬс1500 аасЬссаЬсс дсЬсЬсЬдда ддссдЬдаЬс сдддЬдсаса дЬаааЬасЬд дддсЬдсаЬд1560 садсдссЬдд ссЬссОдЬсс адасЬссЬдд дЬдссЬадад Ьдссаддддс Ьдасааадаа1620 даадЬддадд садЬаассдс ассддсдЬсс сЬсЬсЬдЬдд дсаЬссЬддс ЬдаадаЬадд1680 сссЬсддадс адсЬддЬдда ддаддаадаа ссЬаЬдааЬс ЬсЬаа1725 <210> 6 <211> 574 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 6
С1и С1п Ьеи Ьуз Тйг Низ Уа1 <31п Уа1 Не Ьуз Агд Зег А1а Ьуз Рго
10 15
- 37 007273
Зег С1и Ьуз Рго 20 Агд Ьеи Агд С1п 11е 25 Рго Зег А1а С1и Азр 30 Ьеи С1и
ТЬг Азр С1у С1у С1у Рго С1у С1п Уа1 Уа1 Азр Азр С1у Ьеи С1и Низ
35 40 45
Агд С1и Ьеи С1у Н1з 61у С1п Рго С1и А1а Агд С1у Рго А1а Рго Ьеи
50 55 60
С1п С1п Низ Рго С1п Уа1 Ьеи Ьеи Тгр С1и С1п С1п Агд Ьеи А1а С1у
65 70 75 80
Агд Ьеи Рго Агд С1у Зег ТЬг С1у Азр ТЬг Уа1 Ьеи Ьеи Рго Ьеи А1а
85 90 95
С1п С1у С1у Низ Агд Рго Ьеи Зег Агд А1а 61п Зег Зег Рго А1а А1а
100 105 110
Рго А1а Зег Ьеи Зег А1а Рго С1и Рго А1а Зег С1п А1а Агд Уа1 Ьеи
115 120 125
Зег Зег Зег С1и ТЬг Рго А1а Агд ТЬг Ьеи Рго РЬе ТЬг ТЬг С1у Ьеи
130 135 140
Не Туг Азр Зег Уа1 Мер Ьеи Ьуз Низ С1п Суз Зег Суз С1у Азр Азп
145 150 155 160
Зег Агд Н13 Рго С1и Низ А1а С1у Агд 11е С1п Зег 11е Тгр Зег Агд
165 170 175
Ьеи С1п С1и Агд С1у Ьеи Агд Зег С1п Суз С1и Суз Ьеи Агд С1у Агд
180 185 190
Ьуз А1а Зег Ьеи С1и С1и Ьеи С1п Зег Уа1 Низ Зег С1и Агд Низ Уа1
195 200 205
Ьеи Ьеи Туг <31у ТЬг Азп Рго Ьеи Зег Агд Ьеи Ьуз Ьеи Азр Азп С1у
210 215 220
Ьуз Ьеи А1а С1у Ьеи Ьеи А1а С1п Агд Мек РЬе Уа1 МеЬ Ьеи Рго Суз
225 230 235 240
С1у С1у Уа1 С1у Уа1 Азр ТЬг Азр ТЬг 11е Тгр Азп С1и Ьеи Низ Зег
245 250 255
Зег Азп А1а А1а Агд Тгр А1а А1а С1у Зег Уа1 ТЬг Азр Ьеи А1а РЬе
260 265 270
Ьуз Уа1 А1а Зег Агд С1и Ьеи Ьуз Азп 61у РЬе А1а Уа1 Уа1 Агд Рго
275 230 285
Рго С1у Низ Н1з А1а Азр Н15 Зег ТЬг А1а МеЬ С1у РЬе Суз РЬе РЬе
290 295 300
Аз η Зег Уа1 А1а 11е А1а Суз Агд С1п Ьеи 61п С1п С1п Зег Ьуз А1а
305 310 315 320
Зег Ьуз 11е Ьеи Не Уа1 Азр Тгр Азр Уа1 Н13 ΗΪ3 61у Азп С1у ТЬг
325 330 335
С1п 61п ТЬг РЬе Туг 61п Азр Рго Зег Уа1 Ьеи Туг 11е Зег Ьеи Низ
340 345 350
- 38 007273
Агд Низ Азр 355 Азр С1у Азп РЬе РЬе 360 Рго С1у Зег С1у А1а 365 Уа1 Азр С1и
Уа1 С1у А1а С1у Зег С1у <31и С1у РЬе Азп Уа1 Азп Уа1 А1а Тгр А1а
370 375 380
С1у С1у Ьеи Азр Рго Рго МеЬ С1у Азр Рго С1и Туг Ьеи А1а А1а РЬе
385 390 395 400
Агд Не Уа1 Уа1 МеЬ Рго Не А1а Агд С1и РЬе Зег Рго Азр Ьеи Уа1
405 410 415
Ьеи УаЬ Зег А1а С1у РЬе Азр А1а А1а С1и С1у Низ Рго А1а Рго Ьеи
420 425 430
СЬу С1у Туг Н13 Уа1 Зег А1а Ьуз Суз РЬе С1у Туг МеЬ ТЬг С1п С1п
435 440 445
Ьеи МеЬ Азп Ьеи А1а С1у С1у А1а Уа1 Уа1 Ьеи А1а Ьеи (Ми С1у С1у
450 455 460
Низ Азр Ьеи ТЬг А1а Не Суз Азр А1а Зег С1и А1а Суз Уа1 А1а А1а
465 470 475 480
Ьеи Ьеи С1у Азп Агд Уа1 Азр Рго Ьеи Зег С1и С1и С1у Тгр Ьуз 61п
485 490 495
Ьуз Рго Азп Ьеи Азп Зег Не Агд Зег Ьеи С1и А1а Уа1 Не Агд Уа1
500 505 510
ΗΪ3 Зег Ьуз Туг Тгр С1у Суз МеЬ С1п Агд Ьеи А1а Зег Суз Рго Азр
515 520 525
Зег Тгр Уа1 Рго Агд Уа1 Рго С1у А1а Азр Ьуз С1и С1и Уа1 С1и А1а
530 535 540
Уа1 ТЬг А1а Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Уа1 С1у 11е Ьеи А1а С1и Азр Агд
545 550 555 560
Рго Зег С1и С1п Ьеи Уа1 С1и С1и С1и С1и Рго МеЬ Азп Ьеи
565 570 <210> 7 <211> 1428 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 7
МеЬ 1 РЬе А1а Агд Зег 5 А1а С1у Ьеи Суз РЬе 10 Рго Тгр Уа1 Рго С1у 15 Уа1
Зег Низ С1у С1у Азр А1а С1и С1и Уа1 Ьеи А1а С1п Низ Рго ТЬг Рго
20 25 30
ТЬг С1у Агд С1у А1а С1и Агд Агд Рго Агд Рго Рго Азр Зег Зег А1а
35 40 45
С1и С1у Азр Рго С1у МеЬ Ьеи Ьуз Рго Суз С1у Суз Уа1 Рго Зег Рго
50 55 60
С1п Ьуз Уа1 А1а Ьеи Ьуз Уа1 С1у А1а Рго РЬе Суз ТЬг Суз С1у Суз
65 70 75 80
РЬе С1п Агд РЬе Н13 Ьеи Рго Ьуз А1а Суз Рго С1у (Мп Мп С1у Зег
- 39 007273
90 95
Рго С1и Зег А1а 100 Агд Рго Агд Азп Агд 105 С1п Рго Туг А1а ТЬг 110 С1п Азп
С1у Рго А1а Рго Агд Рго С1п Уа1 Ьеи Рго С1у Зег Зег Зег Агд Суз
115 120 125
Суз Нхз С1у Туг Не Суз РЬе Ьеи РЬе Азр Зег Зег С1п ТЬг А1а С1и
130 135 140
Уа1 С1и Уа1 С1у Тгр С1у С1у Азр ТЬг С1у Зег 61п Ьеи Агд Рго Ьеи
145 150 155 160
Ьеи Агд С1у А1а Уа1 Туг Азп Зег Агд Мек Тгр Азр Зег С1п Ьуз С1и
165 170 175
Азр Зег Ьуз Рго Азр 11е Ьеи Агд Ьеи С1п Азп ТЬг С1п Ьеи РЬе Низ
180 185 190
Зег Уа1 Зег Ьеи Зег ТЬг Азр С1у ТЬг С1п Уа1 Зег Рго С1у А1а Низ
195 200 205
Туг Суз Зег Рго ТЬг С1у А1а С1у Суз Рго Агд Рго Суз А1а Азр ТЬг
210 215 220
Рго С1у Рго С1п Рго С1п Рго Мек Азр Ьеи Агд Уа1 С1у 61п Агд Рго
225 230 235 240
Рго Уа1 01и Рго Рго Рго С1и Рго ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи С1п Агд Рго
245 250 255
С1п Агд Ьеи Н13 Низ Н13 Ьеи РЬе Ьеи А1а С1у Ьеи С1п С1п С1п Агд
260 265 270
Зег Уа1 С1и Рго Мек Агд Уа1 Ьуз Мек С1и Ьеи Рго А1а Суз С1у А1а
275 280 285
ТЬг Ьеи Зег Ьеи Уа1 Рго Зег Ьеи Рго А1а РЬе Зег 11е Рго Агд ΗΪ3
290 295 300
С1п Зег С1п Зег Зег ТЬг Рго Суз Рго РЬе Ьеи С1у Суз Агд Рго Суз
305 310 315 320
Рго С1п Ьеи Зег Мек Азр ТЬг Рго Мек Рго С1и Ьеи С1п Уа1 С1у Рго
325 330 335
С1п С1и С1п 61и Ьеи Агд С1п Ьеи Ьеи Н13 Ьуз Азр Ьуз Зег Ьуз Агд
340 345 350
Зег Ьуз С1и Уа1 А1а ТЬг Рго А1а С1п Рго Зег Рго ТЬг Зег С1п Уа1
355 360 365
Рго А1а А1а А1а Суз Уа1 А1а Суз А1а Уа1 А1а Зег Зег Уа1 Уа1 Ьуз
370 375 380
С1п Ьуз Ьеи А1а С1и Уа1 11е Ьеи Ьуз Ьуз С1п С1п А1а А1а Ьеи С1и
385 390 395 400
Агд ТЬг Уа1 Низ Рго Азп Зег Рго 61у 11е Рго Туг Агд Зег С1п С1у
405 410 415
Рго Суз Зег С1у С1п Суз Рго Суз Зег Уа1 Рго ТЬг Рго Ьеи Ьуз С1п
420 425 430
- 40 007273
Рго Тгр Юз 435 Зег РЬе Суз Агд ТЬг 440 Ьеи С1и Рго Ьеи С1и 445 ТЬг С1и С1у
А1а ТЬг Агд Зег Мек Ьеи Зег Зег РЬе Ьеи Рго Рго Уа1 Рго Зег Ьеи
450 455 460
Рго Зег Азр Рго Рго 61и ΗΪ3 РЬе Рго Ьеи Агд Ьуз ТЬг Уа1 Зег 61и
465 470 475 480
Рго Азп Ьеи Ьуз Ьеи Агд Туг Ьуз Рго Ьуз Ьуз Зег Ьеи С1и Агд Агд
485 490 495
Ьуз Азр Рго Ьеи Ьеи Агд Ьуз С1и Зег А1а Рго Рго Зег Ьеи Агд Агд
500 505 510
Агд Рго А1а С1и ТЬг Ьеи С1у Азр Зег Зег Рго Зег Зег Зег Зег ТЬг
515 520 525
Рго А1а Зег С1у Суз Зег Зег Рго Азп Азр Зег С1и ΗΪ3 С1у Рго Азп
530 535 540
Рго Не Ьеи С1у Зег С1и А1а Ьеи Ьеи С1у С1п Агд Ьеи Агд Ьеи С1п
545 550 555 560
/--1,, тР. ν Ο 1 7 -, 1 7\ 1 -> η-ν-/-. ГХ 7\ 1 Т , , П ть ν- 17-,1 С Т ,-,-1. Т ^1, Πν-ζ.
их и 1 ИХ ОСХ V С1 X п.х а г ьи и не П.ХС1 ъс и г ьи 1 ИХ ν а щ осх Д-ΐ о и пси Г X УД
565 570 575
А1а Не ТЬг Ьеи С1у Ьеи Рго А1а Рго А1а Агд А1а Азр Зег Азр Агд
580 585 590
Агд ТЬг Юз Рго ТЬг Ьеи С1у Рго Агд С1у Рго Не Ьеи С1у Зег Рго
595 600 605
Юз ТЬг Рго Ьеи РЬе Ьеи Рго Низ С1у Ьеи С1и Рго С1и А1а С1у С1у
610 615 620
ТЬг Ьеи Рго Зег Агд Ьеи С1п Рго Не Ьеи Ьеи Ьеи Азр Рго Зег С1у
625 630 635 640
Зег ΗΪ3 А1а Рго Ьеи Ьеи ТЬг Уа1 Рго С1у Ьеи С1у Рго Ьеи Рго РЬе
645 650 655
ΗΪ3 РЬе А1а С1п Зег Ьеи МеЬ ТЬг ТЬг С1и Агд Ьеи Зег С1у Зег С1у
660 665 670
Ьеи Η13 Тгр Рго Ьеи Зег Агд ТЬг Агд Зег С1и Рго Ьеи Рго Рго Зег
675 680 685
А1а ТЬг А1а Рго Рго Рго Рго С1у Рго МеЬ С1п Рго Агд Ьеи 61и С1п
690 695 700
Ьеи Ьуз ТЬг ΗΪ3 Уа1 С1п Уа1 Не Ьуз Агд Зег А1а Ьуз Рго Зег С1и
705 710 715 720
Ьуз Рго Агд Ьеи Агд С1п Не Рго Зег А1а С1и Азр Ьеи С1и ТЬг Азр
725 730 735
С1у С1у С1у Рго С1у С1п Уа1 Уа1 Азр Азр С1у Ьеи (Ии Юз Агд С1и
740 745 750
Ьеи С1у Юз С1у С1п Рго С1и А1а Агд С1у Рго А1а Рго Ьеи С1п С1п
755 760 765
- 41 007273
Н13 Рго 770 С1п Уа1 Ьеи Ьеи Тгр 775 С1и С1п С1п Агд Ьеи 780 А1а С1у Агд Ьеи
Рго Агд С1у Зег ТЬг С1у Азр ТЬг Уа1 Ьеи Ьеи Рго Ьеи А1а С1п С1у
785 790 795 800
С1у ΗΪ5 Агд Рго Ьеи Зег Агд А1а С1п Зег Зег Рго А1а А1а Рго А1а
805 810 815
Зег Ьеи Зег А1а Рго 31и Рго А1а Зег С1п А1а Агд Уа1 Ьеи Зег Зег
820 825 830
Зег С1и ТЬг Рго А1а Агд ТЬг Ьеи Рго РЬе ТЬг ТЬг С1у Ьеи Не Туг
835 840 845
Азр Зег Уа1 МеЬ Ьеи Ьуз Низ С1п Суз Зег Суз С1у Азр Азп Зег Агд
850 855 860
Н1з Рго С1и Н1з А1а <31у Агд Не С1п Зег Не Тгр Зег Агд Ьеи С1п
865 870 875 880
С1и Агд С1у Ьеи Агд Зег С1п Суз С1и Суз Ьеи Агд С1у Агд Ьуз А1а
885 890 895
Зег Ьеи <31и С1и Ьеи С1п Зег Уа1 Низ Зег С1и Агд Н13 Уа1 Ьеи Ьеи
900 905 910
Туг С1у ТЬг Азп Рго Ьеи Зег Агд Ьеи Ьуз Ьеи Азр Азп С1у Ьуз Ьеи
915 920 925
А1а 61у Ьеи Ьеи А1а С1п Агд МеЬ РЬе Уа1 Мек Ьеи Рго Суз С1у С1у
930 935 940
Уа1 С1у Рго Ьеи А1а ТЬг Ьеи Зег А1а РЬе Ьеи А1а Зег Ьеи А1а Рго
945 950 955 960
ТЬг Уа1 Рго С1п С1у Ьеи Зег Агд Уа1 Зег Тгр С1у Ьеи Ьуз Рго Рго
965 970 975
Рго С1у Рго Азп Рго Ьуз Зег Агд Рго А1а Рго Суз Рго Тгр С1у Рго
980 985 990
С1у Агд С1у Уа1 С1у ТЬг ТЬг Рго Ьеи С1у Рго С1у Зег Суз Уа1 Ьуз
995 1000 1005
Рго Тгр Мек Мек Агд А1а Ьеи ТЬг Ьеи А1а Рго 61П Уа1 Азр ТЬг Азр
1010 1015 1020
ТЬг Не Тгр Азп С1и Ьеи Н13 Зег Зег Азп А1а А1а Агд Тгр А1а А1а
1025 1030 1035 1040
С1у Зег Уа1 ТЬг Азр Ьеи А1а РЬе Ьуз Уа1 А1а Зег Агд С1и Ьеи Ьуз
1045 1050 1055
Аз η 61у РЬе А1а Уа1 Уа1 Агд Рго Рго С1у Низ Низ А1а Азр Низ Зег
1060 1065 1070
ТЬг А1а Мек С1у РЬе Суз РЬе РЬе Азп Зег Уа1 А1а 11е А1а Суз Агд
1075 1080 1085
С1п Ьеи С1п С1п <31п Зег Ьуз А1а Зег Ьуз 11е Ьеи Не Уа1 Азр Тгр
1090 1095 1100
Азр Уа1 Низ Низ С1у Азп С1у ТЬг С1п С1п ТЬг РЬе Туг С1п Азр Рго
- 42 007273
1115
1120
Рго СЬу Зег СЬу 1140 А1а УаЬ Азр СЬи УаЬ 1145 СЬу АЬа СЬу Зег СЬу 1150 СЬи СЬу
РЬе Азп УаЬ Азп УаЬ АЬа Тгр А1а С1у СЬу Ьей Азр Рго Рго МеЬ С1у
1155 1160 1165
Азр Рго СЬи Туг Ьей АЬа А1а РЬе Агд Не УаЬ УаЬ Мек Рго 11е АЬа
1170 1175 1180
Агд СЬц РЬе Зег Рго Азр Ьей УаЬ Ьей УаЬ Зег АЬа СЬу РЬе Азр АЬа
1185 1190 1195 1200
А1а СЬи СЬу НЬз Рго АЬа Рго Ьей СЬу СЬу Туг Н13 УаЬ Зег А1а Ьуз
1205 1210 1215
Суз РЬе СЬу Туг МеЬ ТЬг СЬп С1п Ьей МеЕ Азп Ьей АЬа СЬу СЬу А1а
1220 1225 1230
УаЬ УаЬ Ьей А1а Ьей СЬи С1у С1у Н1з Азр Ьей ТЬг А1а ЬЬе Суз Азр
1235 1240 1245
АЬа Зег СЬи А1а Суз УаЬ А1а А1а Ьей Ьей СЬу Азп Агд УаЬ Азр Рго
1250 1255 1260
Ьей Зег СЬи СЬи СЬу Тгр Ьуз СЬп Ьуз Рго Азп Ьей Азп АЬа 11е Агд
1265 1270 1275 1280
Зег Ьей СЬи АЬа УаЬ 1285 11е Агд УаЬ Н13 Зег 1290 Ьуз Суз СЬу Азр СЬу 1295 ТЬг
Ьей АЬа СЬи Ьей Агд Ьей Ьуз Азр Ьей СЬу СЬу ТЬг Ьей Рго Н13 Агд
1300 1305 1310
С1у СЬп 11е Ьей СЬу РЬе Агд Суз С1п Рго СЬу Азр Ьей Ьей Ьей Уа1
1315 1320 1325
Тгр Зег Ьуз 11е Рго УаЬ Зег Азр Рго С1у Зег Азп СЬу С1и Н13 Рго
1330 1335 1340
Рго УаЬ Агд СЬу Туг Рго Ьей Зег Рго Рго Азр СЬу АЬа Зег Агд АЬа
1345 1350 1355 1360
Туг СЬп ТЬг УаЬ АЬа Рго СЬп СЬу Ьуз Туг Тгр С1у Суз МеЬ СЬп Агд
1365 1370 1375
Ьей АЬа Зег Суз Рго Азр Зег Тгр УаЬ Рго Агд УаЬ Рго С1у АЬа Азр
1380 1385 1390
Рго МеЕ Азп Ьей 1425 <210> 8 <211> 1200
- 43 007273 <212> Белок <213> Ното зараепз
<400> 3 Рго 5 Мек Азр Ьеи Агд Уа1 10 С1у С1п Агд Рго Рго 15 Уа1
Рго 1 С1п Рго С1п
С1и Рго Рго Рго С1и Рго ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи С1п Агд Рго С1п Агд
20 25 30
Ьеи Низ Н13 Низ Ьеи РЬе Ьеи А1а С1у Ьеи С1п С1п С1п Агд Зег Уа1
35 40 45
61и Рго Мек Агд Уа1 Ьуз Мек 01и Ьеи Рго А1а Суз С1у А1а ТЬг Ьеи
50 55 60
Бег Ьеи Уа1 Рго Зег Ьеи Рго А1а РЬе Зег 11е Рго Агд Низ С1п Зег
65 70 75 80
С1п Зег Зег ТЬг Рго Суз Рго РЬе Ьеи С1у Суз Агд Рго Суз Рго С1п
85 90 95
Ьеи Зег Мек Азр ТЬг Рго Мек Рго С1и Ьеи С1п Уа1 С1у Рго С1п С1и
100 105 110
С1п С1и Ьеи Агд С1п Ьеи Ьеи Низ Ьуз Азр Ьуз Зег Ьуз Агд Зег Ьуз
115 120 125
С1и Уа1 А1а ТЬг Рго А1а С1п Рго Зег Рго ТЬг Зег С1п Уа1 Рго А1а
130 135 140
А1а А1а Суз Уа1 А1а Суз А1а Уа1 А1а Зег Зег Уа1 Уа1 Ьуз С1п Ьуз
145 150 155 160
Ьеи А1а С1и Уа1 Не Ьеи Ьуз Ьуз С1п С1п А1а А1а Ьеи С1и Агд ТЬг
165 170 175
Уа1 Н13 Рго Азп Зег Рго С1у 11е Рго Туг Агд Зег С1п С1у Рго Суз
180 185 190
Бег С1у <31п Суз Рго Суз Зег Уа1 Рго ТЬг Рго Ьеи Ьуз 61п Рго Тгр
195 200 205
Низ Зег РЬе Суз Агд ТЬг Ьеи С1и Рго Ьеи С1и ТЬг С1и С1у А1а ТЬг
210 215 220
Агд Зег Мек Ьеи Зег Зег РЬе Ьеи Рго Рго Уа1 Рго Зег Ьеи Рго Зег
225 230 235 240
Азр Рго Рго С1и Низ РЬе Рго Ьеи Агд Ьуз ТЬг Уа1 Зег С1и Рго Азп
245 250 255
Ьеи Ьуз Ьеи Агд Туг Ьуз Рго Ьуз Ьуз Зег Ьеи С1и Агд Агд Ьуз Азп
260 265 270
Рго Ьеи Ьеи Агд Ьуз С1и Зег А1а Рго Рго Зег Ьеи Агд Агд Агд Рго
275 280 285
А1а С1и ТЬг Ьеи С1у Азр Зег Зег Рго Зег Зег Зег Зег ТЬг Рго А1а
290 295 300
Бег С1у Суз Зег Зег Рго Азп Азр Зег С1и Низ С1у Рго Азп Рго 11е
305 310 315 320
- 44 007273
Ьеи С1у Зег С1и А1а 325 Ьеи Ьеи С1у С1п Агд 330 Ьеи Агд Ьеи С1п 31и 335 ТЬг
Зег Уа1 А1а Рго РЬе А1а Ьеи Рго ТЬг Уа1 Зег Ьеи Ьеи Рго А1а 11е
340 345 350
ТЬг Ьеи С1у Ьеи Рго А1а Рго А1а Агд А1а Азр Зег Азр Агд Агд ТЬг
355 360 365
Н13 Рго ТЬг Ьеи С1у Рго Агд С1у Рго 11е Ьеи С1у Зег Рго НЬз ТЬг
370 375 380
Рго Ьеи РЬе Ьеи Рго НЬз С1у Ьеи С1и Рго С1и А1а С1у С1у ТЬг Ьеи
385 390 395 400
Рго Зег Агд Ьеи С1п Рго 11е Ьеи Ьеи Ьеи Азр Рго Зег С1у Зег НЬз
405 410 415
А1а Рго Ьеи Ьеи ТЬг Уа1 Рго С1у Ьеи С1у Рго Ьеи Рго РЬе НЬз РЬе
420 425 430
А1а С1п Зег Ьеи МеЬ ТЬг ТЬг С1и Агд Ьеи Зег С1у Зег С1у Ьеи НЬз
435 440 445
Тгр Рго Ьеи Зег Агд ТЬг Агд Зег С1и Рго Ьеи Рго Рго Зег А1а ТЬг
450 455 460
А1а Рго Рго Рго Рго С1у Рго МеЬ С1п Рго Агд Ьеи С1и С1п Ьеи Ьуз
465 470 475 480
ТЬг НЬз Уа1 С1п Уа1 11е Ьуз Агд Зег А1а Ьуз Рго Зег 61и Ьуз Рго
485 490 495
Агд Ьеи Агд С1п Не Рго Зег А1а 61и Азр Ьеи С1и ТЬг Азр С1у С1у
500 505 510
С1у Рго С1у С1п Уа1 Уа1 Азр Азр С1у Ьеи 61и НЬз Агд 61и Ьеи С1у
515 520 525
ΗΪ3 С1у С1п Рго С1и А1а Агд С1у Рго А1а Рго Ьеи С1п С1п НЬз Рго
530 535 540
61п Уа1 Ьеи Ьеи Тгр С1и С1п С1п Агд Ьеи А1а С1у Агд Ьеи Рго Агд
545 550 555 560
С1у Зег ТЬг С1у Азр ТЬг Уа1 Ьеи Ьеи Рго Ьеи А1а С1п С1у С1у НЬз
565 570 575
Агд Рго Ьеи Зег Агд А1а С1п Зег Зег Рго А1а А1а Рго А1а Зег Ьеи
580 585 590
Зег А1а Рго 61 и Рго А1а Зег С1п А1а у = 1 Ьеи Зег Зег Зег С1и
595 600 605
ТЬг Рго А1а Агд ТЬг Ьеи Рго РЬе ТЬг ТЬг С1у Ьеи 11е Туг Азр Зег
610 615 620
Уа1 Мек Ьеи Ьуз ΗΪ3 С1п Суз Зег Суз С1у Азр Азп Зег Агд НЬз Рго
625 630 635 640
С1и НЬз А1а С1у Агд 11е С1п Зег 11е Тгр Зег Агд Ьеи С1п 61и Агд
645 650 655
С1у Ьеи Агд Зег 61п Суз С1и Суз Ьеи Агд С1у Агд Ьуз А1а Зег Ьеи
- 45 007273
660 665 670
С1и С1и Ьеи С1п Зег Уа1 Низ Зег С1и Агд ΗΪ3 Уа1 Ьеи Ьеи Туг С1у
675 680 685
ТЬг Аз η Рго Ьеи Зег Агд Ьеи Ьуз Ьеи Азр Азп С1у Ьуз Ьеи А1а С1у
690 695 700
Ьеи Ьеи А1а С1п Агд Мек РЬе Уа1 МеЬ Ьеи Рго Суз С1у С1у Уа1 С1у
705 710 715 720
Рго Ьеи А1а ТЬг Ьеи Зег А1а РЬе Ьеи А1а Зег Ьеи А1а Рго ТЬг Уа1
725 730 735
Рго С1п С1у Ьеи Зег Агд Уа1 Зег Тгр С1у Ьеи Ьуз Рго Рго Рго С1у
740 745 750
Рго Азп Рго Ьуз Зег Агд Рго А1а Рго Суз Рго Тгр С1у Рго 61у Агд
755 760 765
61у Уа1 С1у ТЬг ТЬг Рго Ьеи С1у Рго С1у Зег Суз Уа1 Ьуз Рго Тгр
770 775 780
МеЪ Мек Агд А1а Ьеи ТЬг Ьеи А1а Рго С1п Уа1 Азр ТЬг Азр ТЬг 11е
785 790 795 800
Тгр Азп 61и Ьеи Н13 Зег Зег Азп А1а А1а Агд Тгр А1а А1а С1у Зег
805 810 815
Уа1 ТЬг Азр Ьеи А1а РЬе Ьуз Уа1 А1а Зег Агд С1и Ьеи Ьуз Азп С1у
820 825 830
РЬе А1а Уа1 Уа1 Агд Рго Рго С1у Н13 Н1з А1а Азр Н13 Зег ТЬг А1а
835 840 845
Мек С1у РЬе Суз РЬе РЬе Азп Зег Уа1 А1а 11е А1а Суз Агд С1п Ьеи
850 855 860
С1п С1п С1п Зег Ьуз А1а Зег Ьуз 11е Ьеи 11е Уа1 Азр Тгр Азр Уа1
865 870 875 880
Ηί3 Юз 61у Азп С1у ТЬг С1п С1п ТЬг РЬе Туг С1п Азр Рго Зег Уа1
885 890 895
Ьеи Туг Не Зег Ьеи Н13 Агд Н13 Азр Азр С1у Азп РЬе РЬе Рго С1у
900 905 910
Зег С1у А1а Уа1 Азр С1и Уа1 С1у А1а С1у Зег С1у С1и С1у РЬе Азп
915 920 925
Уа1 Азп Уа1 А1а Тгр А1а С1у 61у Ьеи Азр Рго Рго МеЬ С1у Азр Рго
тп аос Ч_У ОЛП У Ч V
С1и Туг Ьеи А1а А1а РЬе Агд 11е Уа1 Уа1 МеЬ Рго 11е А1а Агд С1и
945 950 955 960
РЬе Зег Рго Азр Ьеи Уа1 Ьеи Уа1 Зег А1а С1у РЬе Азр А1а А1а С1и
965 970 975
С1у Низ Рго А1а Рго Ьеи С1у С1у Туг ΗΪ3 Уа1 Зег А1а Ьуз Суз РЬе
980 985 990
С1у Туг МеЬ ТЬг С1п С1п Ьеи МеЬ Азп Ьеи А1а С1у С1у А1а Уа1 Уа1
995 1000 1005
- 46 007273
Ьеи А1а 1010 Ьеи С1и 61у С1у Низ 1015 Азр Ьеи ТЬг А1а Не 1020 Суз Азр А1а Зег
С1и А1а Суз Уа1 А1а А1а Ьеи Ьеи С1у Азп Агд Уа1 Азр Рго Ьеи Зег
1025 1030 1035 1040
С1и С1и С1у Тгр Ьуз С1п Ьуз Рго Азп Ьеи Азп А1а Не Агд Зег Ьеи
1045 1050 1055
С1и А1а Уа1 Не Агд Уа1 Н1з Зег Ьуз Суз С1у Азр С1у ТЬг Ьеи А1а
1060 1065 1070
С1и Ьеи Агд Ьеи Ьуз Азр Ьеи С1у С1у ТЬг Ьеи Рго Низ Агд С1у С1п
1075 1080 1085
Не Ьеи С1у Р1те Агд Суз С1п Рго С1у Азр Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 Тгр Зег
1090 1095 1100
Ьуз Не Рго Уа1 Зег Азр Рго С1у Зег Азп С1у С1и Н1з Рго Рго Уа1
1105 1110 1115 1120
Агд 61у Туг Рго Ьеи Зег Рго Рго Азр С1у А1а Зег Агд А1а Туг С1п
1125 ИЗО 1135
ТЬг Уа1 А1а Рго С1п С1у Ьуз Туг Тгр С1у Суз МеЬ С1п Агд Ьеи А1а
1140 1145 1150
Зег Суз Рго Азр Зег Тгр Уа1 Рго Агд Уа1 Рго С1у А1а Азр Ьуз С1и
1155 1160 1165
С1и Уа1 С1и А1а Уа1 ТЬг А1а Ьеи А1а Зег Ьеи Зег Уа1 С1у Не Ьеи
1170 1175 1180
А1а С1и Азр Агд Рго Зег С1и С1п Ьеи Уа1 С1и С1и 61и С1и Рго МеЬ
1185 1190 1195 1200
<210> 9 <211> 1041 <212> Белок <213> Ното зарЬепз
<400> 9 Мер Азр Ьеи Агд Ьеи 10 Азр Η15 С1п РЬе Зег 15 Ьеи
Рго 1 Зег А1а Уа1 Рго 5
Рго Уа1 А1а 61и Рго А1а Ьеи Агд С1и С1п С1п Ьеи С1п С1п С1и Ьеи
20 25 30
Ьеи А1а Ьеи Ьуз С1п Ьуз С1п 61п Не С1п Агд С1п Не Ьеи Не А1а
35 40 45
С1и РЬе С1п Агд С1п Низ С1и С1п Ьеи Зег Агд С1п Низ С1и А1а С1п
50 55 60
Ьеи Низ <31и Низ Не Ьуз С1п С1п 61п С1и МеЬ Ьеи А1а МеЬ Ьуз ΗΪ3
65 70 75 80
С1п С1п С1и Ьеи Ьеи С1и ΗΪ5 С1п Агд Ьуз Ьеи С1и Агд Ньз Агд 61п
85 90 95
С1и 61п С1и Ьеи С1и Ьуз С1п Н13 Агд С1и С1п Ьуз Ьеи С1п С1п Ьеи
100 105 110
- 47 007273
Ьуз Азп Ьуз 115 СЬи Ьуз СЬу Ьуз С1и 120 Зег А1а УаЬ А1а Зег 125 ТЬг СЬи УаЬ
Ьуз МеЬ Ьуз Ьеи СЬп СЬи РЬе УаЬ Ьеи Азп Ьуз Ьуз Ьуз АЬа Ьеи АЬа
130 135 140
НЬз Агд Азп Ьеи Азп НЬз Суз ЬЬе Зег Зег Азр Рго Агд Туг Тгр Туг
145 150 155 Ь60
СЬу Ьуз ТЬг СЬп НЬз Зег Зег Ьеи Азр СЬп Зег Зег Рго Рго С1п Зег
165 170 175
СЬу УаЬ Зег ТЬг Зег Туг Азп НЬз Рго УаЬ Ьеи СЬу МеЕ Туг Азр АЬа
180 185 190
Ьуз Азр Азр РЬе Рго Ьеи Агд Ьуз ТЬг А1а Зег СЬи Рго Азп Ьеи Ьуз
195 200 205
Ьеи Агд Зег Агд Ьеи Ьуз С1п Ьуз УаЬ А1а СЬи Агд Агд Зег Зег Рго
210 215 220
Ьеи Ьеи Агд Агд Ьуз Азр СЬу Рго УаЬ УаЬ ТЬг АЬа Ьеи Ьуз Ьуз Агд
225 230 235 240
Рго Ьеи Азр УаЬ ТЬг Азр Зег АЬа Суз Зег Зег АЬа Рго СЬу Зег СЬу
245 250 255
Рго Зег Зег Рго Азп Азп Зег Зег СЬу Зег УаЬ Зег А1а СЬи Азп СЬу
260 265 270
11е АЬа Рго АЬа УаЬ Рго Зег 11е Рго АЬа С1и ТЬг Зег Ьеи АЬа НЬз
275 280 285
Агд Ьеи Уа1 АЬа Агд СЬи СЬу Зег А1а АЬа Рго Ьеи Рго Ьеи Туг ТЬг
290 295 300
Зег Рго Зег Ьеи Рго Азп 11е ТЬг Ьеи СЬу Ьеи Рго АЬа ТЬг СЬу Рго
305 310 315 320
Зег АЬа СЬу ТЬг АЬа (31 у СЬп СЬп Азр ТЬг СЬи Агд Ьеи ТЬг Ьеи Рго
325 330 335
АЬа Ьеи СЬп СЬп Агд Ьеи Зег Ьеи РЬе Рго СЬу ТЬг ΗΪ5 Ьеи ТЬг Рго
340 345 350
Туг Ьеи Зег ТЬг Зег Рго Ьеи СЬи Агд Азр СЬу СЬу АЬа АЬа НЬз Зег
355 360 365
Рго Ьеи Ьеи СЬп НЬз МеЬ УаЬ Ьеи Ьеи СЬи СЬп Рго Рго АЬа СЬп АЬа
370 375 380
Рго Ьеи УаЬ ТЬг СЬу Ьеи СЬу АЬа Ьеи Рго Ьеи НЬз АЬа СЬп Зег Ьеи
385 390 395 400
УаЬ СЬу АЬа Азр Агд УаЬ Зег Рго Зег 11е НЬз Ьуз Ьеи Агд СЬп НЬз
405 410 4Ь5
Агд Рго Ьеи СЬу Агд ТЬг СЬп Зег А1а Рго Ьеи Рго СЬп Азп АЬа СЬп
420 425 430
АЬа Ьеи СЬп НЬз Ьеи УаЬ ЬЬе СЬп СЬп СЬп НЬз СЬп С1п РЬе Ьеи СЬи
435 440 445
Ьуз НЬз Ьуз СЬп С1п РЬе СЬп СЬп СЬп СЬп Ьеи СЬп МеЬ Азп Ьуз 1Ье
450 455 460
11е 455 Рго Ьуз Рго Зег С1и 470 Рго А1а Агд С1п Рго 475 С1и Зег Низ Рго С1и 480
С1и ТЬг С1и С1и С1и Ьеи Агд С1и Низ С1п А1а Ьеи Ьеи Азр С1и Рго
485 490 495
Туг Ьеи Азр Агд Ьеи Рго С1у С1п Ьуз 61и А1а Низ А1а С1п А1а С1у
500 505 510
Уа1 С1п Уа1 Ьуз С1п С1и Рго 11е С1и Зег Азр С1и С1и С1и А1а С1и
515 520 525
Рго Рго Агд С1и Уа1 С1и Рго С1у С1п Агд 61п Рго Зег С1и С1п С1и
530 535 540
Ьеи Ьеи РЬе Агд С1п С1п А1а Ьеи Ьеи Ьеи С1и С1п С1п Агд 11е Низ
545 550 555 560
С1п Ьеи Агд Азп Туг 61п А1а Зег МеЬ С1и А1а А1а С1у 11е Рго Уа1
565 570 575
Зег РЬе С1у С1у Низ Агд Рго Ьеи Зег Агд А1а С1п Зег Зег Рго А1а
580 585 590
Зег А1а ТЬг РЬе Рго Уа1 Зег Уа1 С1п С1и Рго Рго ТЬг Ьуз Рго Агд
595 600 605
РЬе ТЬг ТЬг С1у Ьеи Уа1 Туг Азр ТЬг Ьеи Мер Ьеи Ьуз Низ С1п Суз
610 615 620
ТЬг Суз С1у Зег Зег Зег Зег Низ Рго С1и Низ А1а С1у Агд 11е С1п
625 630 635 640
Зег 11е Тгр Зег Агд Ьеи С1п С1и ТЬг С1у Ьеи Агд С1у Ьуз Суз С1и
645 650 655
Суз 11е Агд С1у Агд Ьуз А1а ТЬг Ьеи С1и С1и Ьеи С1п ТЬг Уа1 Низ
660 665 670
Зег С1и А1а Низ ТЬг Ьеи Ьеи Туг С1у ТЬг Азп Рго Ьеи Азп Агд С1п
675 680 685
Ьуз Ьеи Азр Зег Ьуз Ьуз Ьеи Ьеи С1у Зег Ьеи А1а Зег Уа1 РЬе Уа1
690 695 700
Агд Ьеи Рго Суз С1у С1у Уа1 С1у Уа1 Азр Зег Азр ТЬг 11е Тгр Азп
705 710 715 720
С1и Уа1 Низ Зег А1а С1у А1а А1а Агд Ьеи А1а Уа1 С1у Суз Уа1 Уа1
725 730 735
61и Ьеи Уа1 РЬе Ьуз Уа1 А1а ТЬг С1у С1и Ьеи Ьуз Азп С1у РЬе А1а
740 745 750
Уа1 Уа1 Агд Рго Рго 61у Нйз Низ А1а С1и С1и Зег ТЬг Рго МеЬ С1у
755 760 765
РЬе Суз Туг РЬе Азп Зег Уа1 А1а Уа1 А1а А1а Ьуз Ьеи Ьеи С1п С1п
770 775 780
Агд Ьеи Зег Уа1 Зег Ьуз 11е Ьеи 11е Уа1 Азр Тгр Азр Уа1 Низ Низ
785 790 795 800
- 49 007273
СЬу Азп СЬу ТЬг СЬп 805 СЬп АЬа РЬе Туг Зег 8Ь0 Азр Рго Зег УаЬ Ьей 815 Туг
МеЕ Зег Ьей Юз Агд Туг Азр Азр СЬу Азп РЬе РЬе Рго СЬу Зег СЬу
820 825 830
АЬа Рго Азр СЬи УаЬ СЬу ТЬг СЬу Рго СЬу УаЬ СЬу РЬе Азп УаЬ Азп
835 840 845
МеЬ АЬа РЬе ТЬг СЬу СЬу Ьей Азр Рго Рго МеЬ СЬу Азр АЬа СЬи Туг
850 855 860
Ьей АЬа АЬа РЬе Агд ТЬг УаЬ УаЬ МеЬ Рго 11е АЬа Зег СЬи РЬе АЬа
865 870 875 880
Рго Азр УаЬ УаЬ Ьей УаЬ Зег Зег СЬу РЬе Азр АЬа УаЬ СЬи С1у Юз
885 890 895
Рго ТЬг Рго Ьей СЬу СЬу Туг Азп Ьей Зег АЬа Агд Суз РЬе СЬу Туг
900 905 9Ь0
Ьей ТЬг Ьуз СЬп Ьей МеЬ СЬу Ьей АЬа СЬу СЬу Агд ЬЬе УаЬ Ьей АЬа
915 920 925
Ьей СЬи СЬу СЬу Н13 Азр Ьей ТЬг АЬа 1Ье Суз Азр АЬа Зег СЬи АЬа
930 935 940
Суз УаЬ Зег АЬа Ьей Ьей СЬу Азп СЬи Ьей Азр Рго Ьей Рго СЬи Ьуз
945 950 955 960
УаЬ Ьей СЬп С1п Агд Рго Азп АЬа Азп АЬа УаЬ Агд Зег МеЬ С1и Ьуз
965 970 975
УаЬ МеЬ С1и ЬЬе Н13 Зег Ьуз Туг Тгр Агд Суз Ьей СЬп Агд ТЬг ТЬг
980 985 990
Зег ТЬг АЬа СЬу Агд Зег Ьей 1Ье СЬи АЬа СЬп ТЬг Суз СЬи Азп СЬи
995 1000 1005
СЬи АЬа СЬи ТЬг УаЬ ТЬг А1а МеЬ АЬа Зег Ьей Зег УаЬ СЬу УаЬ Ьуз
1010 1015 1020
Рго АЬа С1и Ьуз Агд Рго Азр С1и СЬи Рго МеЬ СЬи СЬи СЬи Рго Рго
1025 1030 1035 1040
Ьей

Claims (34)

1. Выделенный полипептид, имеющий выведенную аминокислотную последовательность клона р74, приведенную на фиг.7, или ее варианты, полученные, как раскрыто в описании, способные взаимодействовать с субъединицей 1 и/или субъединицей 2 каспазы-8.
2. Полипептид по п.1, расщепляемый ίη νίΐΐΌ каспазой-8.
3. Полипептид по п.1, расщепляемый ίη упо каспазой-8.
4 . Выделенная последовательность ДНК, кодирующая полипептид по любому из пп.1-3.
5. Выделенная последовательность ДНК по п.4, имеющая нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 5а.
6. Выделенная последовательность ДНК, способная гибридизоваться с последовательностью ДНК по п.4 в умеренно строгих условиях, раскрытых в описании.
7. Вектор, содержащий последовательность ДНК по п.5 или 6 и регуляторные последовательности, в частности, промотор СМУ человека.
8. Эукариотическая или прокариотическая клетка-хозяин, содержащая вектор по п.7.
9. Способ получения полипептида по п.1, включающий выращивание эукариотической клеткихозяина по п.8 в условиях, обеспечивающих продуцирование указанного белка и его посттрансляционные модификации, и выделение указанного белка.
- 50 007273
10. Способ получения полипептида по п.1, включающий выращивание прокариотической клеткихозяина по п.8 в условиях, обеспечивающих продуцирование указанного белка, и выделение указанного белка.
11. Способ по п.9, согласно которому эукариотической клеткой является клетка млекопитающего, насекомого или дрожжей.
12. Способ по п.11, согласно которому клеткой млекопитающего является клетка НеБа или 293 Т НЕК.
13. Рибозим, специфический для нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательности ДНК по п.5 или 6.
14. Антисмысловой олигонуклеотид, включающий по меньшей мере 9 нуклеотидов, соответствующих последовательности ДНК по п.5 или 6.
15. Антитело, направленное против эпитопа полипептида по п.1.
16. Набор для иммуноанализа, предназначенный для обнаружения полипептида по п.1, включающий в качестве реагента антитело по п.15.
17. Применение полипептида по п.1 для модуляции активности каспазы-8.
18. Применение рибозима по п.13 для модуляции активности каспазы-8.
19. Применение антисмыслового олигонуклеотида по п.14 для модуляции активности каспазы-8.
20. Применение антитела по п.15 для модуляции активности каспазы-8.
21. Применение полипептида по п.1 для модуляции активностей, опосредованных ΤΝΕ-рецептором или Еа§.
22. Применение рибозима по п.13 для модуляции активностей, опосредованных ΤΝΕ-рецептором или Еа§.
23. Применение антисмыслового олигонуклеотида по п.14 для модуляции активностей, опосредованных ΤΝΕ-рецептором или Еа§.
24. Применение антитела по п.15 для модуляции активностей, опосредованных ΤΝΕ-рецептором или Еа§.
25. Применение полипептида по п.1 для модуляции апоптоза.
26. Применение рибозима по п.13 для модуляции апоптоза.
27. Применение антисмыслового олигонуклеотида по п.14 для модуляции апоптоза.
28. Применение антитела по п.15 для модуляции апоптоза.
29. Применение полипептида по п.1 в качестве лекарственного средства для терапии заболеваний, связанных с необходимостью модуляции активности каспазы-8.
30. Применение рибозима по п.13 в качестве лекарственного средства для терапии заболеваний, связанных с необходимостью модуляции активности каспазы-8.
31. Применение антисмыслового олигонуклеотида по п.14 в качестве лекарственного средства для терапии заболеваний, связанных с необходимостью модуляции активности каспазы-8.
32. Применение антитела по п.15 в качестве лекарственного средства для терапии заболеваний, связанных с необходимостью модуляции активности каспазы-8.
33. Применение по любому из пп.29-32, где указанным заболеванием является рассеянный склероз с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунный увеоретинит, диабет, волчанка, аутоиммунный миокардит I, опосредованный НСУ хронический гепатит, хронический гастрит, например, гастрит типа А, смешанная болезнь соединительной ткани (МС'П)), болезнь Крона или неспецифический язвенный колит.
34. Применение полипептида по п.1 для выделения, идентификации и клонирования другого белка того же класса.
EA200401390A 1998-12-24 1999-12-23 Выделенный полипептид, связывающийся с каспазой -8, и способы его применения EA007273B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL12772198A IL127721A0 (en) 1998-12-24 1998-12-24 Caspase-8 interacting proteins
IL13210599A IL132105A0 (en) 1998-12-24 1999-09-28 Caspase-8 interacting proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200401390A1 EA200401390A1 (ru) 2005-02-24
EA007273B1 true EA007273B1 (ru) 2006-08-25

Family

ID=26323761

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200401390A EA007273B1 (ru) 1998-12-24 1999-12-23 Выделенный полипептид, связывающийся с каспазой -8, и способы его применения
EA200000875A EA005853B1 (ru) 1998-12-24 1999-12-23 N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилаза человека, взаимодействующая с каспазой-8, и способы ее применения

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200000875A EA005853B1 (ru) 1998-12-24 1999-12-23 N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилаза человека, взаимодействующая с каспазой-8, и способы ее применения

Country Status (20)

Country Link
US (3) US6762283B1 (ru)
EP (1) EP1058691A1 (ru)
JP (1) JP2002536965A (ru)
KR (2) KR100646074B1 (ru)
CN (2) CN1603342A (ru)
AR (1) AR029321A1 (ru)
AU (1) AU780585B2 (ru)
BG (2) BG65375B1 (ru)
BR (1) BR9909252A (ru)
CA (1) CA2321672A1 (ru)
EA (2) EA007273B1 (ru)
EE (1) EE200000487A (ru)
HK (1) HK1037197A1 (ru)
HU (1) HUP0100671A3 (ru)
IL (3) IL132105A0 (ru)
NO (1) NO20004167L (ru)
NZ (1) NZ506477A (ru)
PL (1) PL350181A1 (ru)
SK (1) SK12682000A3 (ru)
WO (1) WO2000039160A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2503682C2 (ru) * 2007-02-23 2014-01-10 Йеда Ресеарч Энд Девелопмент Ко. Лтд Антитела и содержащие их фармацевтические композиции, подходящие для ингибирования активности металлопротеинов

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005501545A (ja) * 2001-09-04 2005-01-20 イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド カスパーゼ結合タンパク質、その調製物および使用
US20040072770A1 (en) * 2002-07-03 2004-04-15 Besterman Jeffrey M. Methods for specifically inhibiting histone deacetylase-7 and 8
IL158599A0 (en) * 2003-10-26 2004-05-12 Yeda Res & Dev Methods of modulating hematopoiesis
WO2010006177A2 (en) * 2008-07-10 2010-01-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Muc1, caspase-8,and ded-containing proteins
CA2960209C (en) 2014-09-04 2023-08-29 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Globin gene therapy for treating hemoglobinopathies
CN104694485A (zh) * 2015-02-13 2015-06-10 广西壮族自治区兽医研究所 Z-ietd-fmk在提高prrsv体外培养滴度方面的应用及其方法
CN106146665B (zh) * 2016-08-31 2019-08-09 中国农业科学院植物保护研究所 一种用于制备针对甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体的方法
US10894091B2 (en) * 2017-03-16 2021-01-19 Immunwork Inc. Linker units and molecular constructs comprising the same

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL73883A (en) * 1984-12-20 1990-12-23 Yeda Res & Dev Monoclonal antibodies against tnf-alpha,hybridomas producing them and method for the purification of tnf-alpha
IL83878A (en) * 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
IL94039A (en) * 1989-08-06 2006-09-05 Yeda Res & Dev Antibodies to tbp - 1 and their use
JPH0625292A (ja) * 1990-10-31 1994-02-01 Mitsui Toatsu Chem Inc タンパク質及びその遺伝子
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
AU3665893A (en) * 1992-02-12 1993-09-03 United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Sequences characteristic of human gene transcription product
US5364503A (en) 1992-02-20 1994-11-15 Macmillan Bloedel Limited Nitric oxide treatment for ozone bleaching
IL101769A (en) * 1992-05-03 2007-02-11 Yeda Res & Dev Modulation of TNF receptor action
IL104355A (en) * 1993-01-10 2006-08-20 Yeda Res & Dev Tnf receptor promoter
IL109633A (en) * 1994-05-11 2005-05-17 Yeda Res & Dev Tnf receptor promoter
EP0914424A1 (en) * 1996-06-17 1999-05-12 Genzyme Corporation Novel human chromosome 16 genes, compositions, methods of making and using same
US6242569B1 (en) * 1997-02-05 2001-06-05 Tularik, Inc. Regulators of apoptosis
WO1999061626A2 (en) * 1998-05-29 1999-12-02 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human hydrolase homologs: n-terminal asparagine amidohydrolase, glycosyl hydrolase, glucohydrolase, biotinidase, and n-acetylglucosamine 6-p deacetylase
US6326354B1 (en) * 1998-08-19 2001-12-04 Washington University Modulation of apoptosis with bid
EP1002900A1 (de) 1998-11-18 2000-05-24 SP Beton GmbH &amp; Co. KG Verkehrsflächen-Bodenbelag mit Bodenbelagelementen aus Kunststeinmaterial
CA2350415A1 (en) * 1998-11-18 2000-05-25 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Inflammation-associated genes

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2503682C2 (ru) * 2007-02-23 2014-01-10 Йеда Ресеарч Энд Девелопмент Ко. Лтд Антитела и содержащие их фармацевтические композиции, подходящие для ингибирования активности металлопротеинов

Also Published As

Publication number Publication date
CN1298411A (zh) 2001-06-06
AR029321A1 (es) 2003-06-25
US20080139476A1 (en) 2008-06-12
IL178921A0 (en) 2007-03-08
US7339047B2 (en) 2008-03-04
EA005853B1 (ru) 2005-06-30
KR100646075B1 (ko) 2006-11-15
EE200000487A (et) 2002-02-15
JP2002536965A (ja) 2002-11-05
US20040229260A1 (en) 2004-11-18
BR9909252A (pt) 2000-11-28
HK1037197A1 (en) 2002-02-01
SK12682000A3 (sk) 2001-03-12
WO2000039160A3 (ru) 2001-08-23
WO2000039160A2 (en) 2000-07-06
IL138025A (en) 2007-08-19
EP1058691A1 (en) 2000-12-13
EA200401390A1 (ru) 2005-02-24
HUP0100671A2 (hu) 2001-06-28
BG104707A (en) 2001-04-30
EA200000875A1 (ru) 2001-10-22
CA2321672A1 (en) 2000-07-06
NO20004167D0 (no) 2000-08-21
BG109904A (bg) 2008-01-31
AU780585B2 (en) 2005-04-07
AU1795000A (en) 2000-07-31
US6762283B1 (en) 2004-07-13
PL350181A1 (en) 2002-11-18
KR20010041250A (ko) 2001-05-15
NO20004167L (no) 2000-10-19
CN1603342A (zh) 2005-04-06
NZ506477A (en) 2003-08-29
CN1223608C (zh) 2005-10-19
BG65375B1 (bg) 2008-04-30
KR20060090770A (ko) 2006-08-16
HUP0100671A3 (en) 2006-04-28
KR100646074B1 (ko) 2006-11-13
IL132105A0 (en) 2001-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5691147A (en) CDK4 binding assay
JP3462498B2 (ja) レセプターチロシンキナーゼ標的タンパク質のｃＤＮＡクローニング方法及びｈＧＲＢタンパク質
JP3787355B2 (ja) Ｆａｓ／ａｐｏ１受容体機能のモジュレーター
JPH10511843A (ja) Ｅ６結合タンパク質
CN101517074B (zh) 蛋白酶筛选方法及由此鉴别的蛋白酶
JP2008113660A (ja) ヒストンデアセチラーゼ関連遺伝子およびタンパク質
US20080139476A1 (en) Caspase-8 interacting proteins
ES2242195T3 (es) Moduladores de proteinas reguladoras.
JPH11505705A (ja) Ｍｃｈ２、アポトーシス性システインプロテアーゼ、ならびに組成物、ならびにそれを製造および使用する方法
US6296853B1 (en) E6 binding proteins
JPH10210982A (ja) 新規なタンパク質
JPH08510904A (ja) 新規な受容体型ホスホチロシンホスファターゼ−κ
EA006874B1 (ru) Полипептид, обладающий активностью rap [белка, ассоциированного с rip (взаимодействующим с рецептором белком)], кодирующая его последовательность днк и способы их получения и использования
EA009956B1 (ru) Внутриклеточный полипептид (cari) и способы его применения
JP2003527091A (ja) 新規カルパインプロテアーゼ２６１７６およびその使用
EA003269B1 (ru) Cash (гомолог каспазы) с &#34;гибель-эффекторным&#34; доменом, модуляторы функций fas-рецепторов
WO1999035159A1 (en) Lymphoma/leukemia oncogene, oncoprotein and methods of use
AU2004240157B2 (en) Caspase-8 interacting proteins
US7309783B2 (en) Mammalian early developmental regulator gene
US20020098174A1 (en) 33166, a human hydrolase-like molecule and uses thereof
WO2001002432A1 (en) Sh3-containing protein, dna and uses thereof
MXPA00008260A (en) Caspase-8 interactingproteins