CN104694485A - Z-ietd-fmk在提高prrsv体外培养滴度方面的应用及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Z-IETD-FMK在提高PRRSV体外培养滴度方面的应用及其方法，发明人利用PRRSV在体外能引起细胞凋亡的生物学特性，经探索研究发现：通过在体外培养PRRSV的过程中添加caspase-8的特异性抑制剂Z-IETD-FMK，能够抑制caspase-8的活性，阻断PRRSV引起的细胞凋亡信号通路，从而抑制或部分抑制PRRSV引起的细胞凋亡，使PRRSV在细胞内得到更有效复制，最终获得高滴度的PRRSV。据此，发明人建立了利用Z-IETD-FMK提高PRRSV体外培养滴度的方法。推广应用本发明，对降低PRRS传统疫苗生产成本，提高疫苗免疫效果具有重要意义。

Description

Z-IETD-FMK在提高PRRSV体外培养滴度方面的应用及其方法

技术领域

本发明属于病毒体外培养领域，尤其涉及Z-IETD-FMK(氟甲基酮)在提高PRRSV体外培养滴度方面的应用及其方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的，以妊娠母猪发生严重繁殖障碍以及仔猪发生呼吸系统疾病为主要特征的病毒性传染病。该病于1987年最早发生在美国，此后相继在各主要养猪国家发生，现已呈世界性分布，是危害全球养猪业最严重的传染病之一。PRRSV在我国广泛流行，特别是2006年5月以来我国又新发生一种以高热和急性发病死亡为主要临床特征的“高致病性猪繁殖与呼吸综合征”(H-PRRS)，该病的发病率可高达50％-100％，死亡率为20％-100％，已成为当前危害我国养猪业的头号疫病。

目前，PRRS尚无特效药，免疫接种是主要的防治措施，目前广泛使用的PRRS疫苗仍是传统的弱毒疫苗和灭活疫苗。就疫苗本身而言，高滴度的病毒是疫苗产生良好免疫效果的前提，而体外培养却难以获得高滴度的PRRSV，如靠大量培养，再通过浓缩的方法获得高滴度的PRRSV，不仅费时费力，且成本较高。因此，如何在体外培养获得高滴度的PRRSV，已成为制约PRRS疫苗生产的瓶颈。研究证实，PRRSV能引起细胞凋亡，凋亡是细胞本身的一种保护性机制，在病毒培养过程中如果能人为的阻断凋亡的发生，就有可能使病毒在细胞中得到更大量的复制，从而达到提高病毒滴度的目的。国外研究证实，有一大类蛋白酶家族caspase与凋亡的启动密切相关，PRRSV感染细胞后通过与细胞上的死亡受体结合，触发了caspase的级联反应，最终导致凋亡的发生。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供Z-IETD-FMK在提高PRRSV体外培养滴度方面的应用及其方法，为降低PRRS传统疫苗的生产成本和提高其免疫效果提供技术支持。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

Z-IETD-FMK在提高PRRSV体外培养滴度方面的应用。

提高PRRSV体外培养滴度的方法，待细胞接种病毒后添加Z-IETD-FMK。

上述提高PRRSV体外培养滴度的方法，待细胞接种病毒24～60h后添加Z-IETD-FMK。

Z-IETD-FMK浓度为5～20μM。

上述提高PRRSV体外培养滴度的方法，包括以下步骤：

<1>在细胞培养瓶中加入Marc-145细胞悬液，细胞培养液含10％新生牛血清；

<2>待步骤<1>中的细胞培养24～48h后长成单层时，将猪繁殖与呼吸综合征病毒种毒接种到细胞培养瓶中，37℃孵育1h后，加入含2％新生牛血清的培养液；

<3>接种病毒液24～60h后，在接种病毒液的细胞培养瓶中加入5～20μM caspase-8的特异性抑制剂Z-IETD-FMK，继续培养,当三分之二的细胞出现细胞病变时收集细胞毒。

针对目前PRRS疫苗生产难以获得高滴度的PRRSV的问题，发明人利用PRRSV在体外能引起细胞凋亡的生物学特性，经探索研究发现：通过在体外培养PRRSV的过程中添加caspase-8的特异性抑制剂Z-IETD-FMK，能够抑制caspase-8的活性，阻断PRRSV引起的细胞凋亡信号通路，从而抑制或部分抑制PRRSV引起的细胞凋亡，使PRRSV在细胞内得到最大量的复制，最终获得高滴度的PRRSV。据此，发明人建立了利用Z-IETD-FMK提高PRRSV体外培养滴度的方法。推广应用本发明，对降低PRRS传统疫苗生产成本，提高疫苗免疫效果具有重要意义。

具体实施方式

一、有效抑制剂的筛选

按10倍系列稀释PRRSV种毒，稀释度从10^-3到10^-10，并接种在96孔细胞培养板中长成单层的Marc-145细胞，每个稀释度接种4个孔，另留2孔不加病毒液的正常细胞作为阴性对照，待细胞接毒24h后，加入不同浓度(5μM、10μM、15μM、20μM)的Z-VAD-FMK(caspase广谱抑制剂)、Z-IETD-FMK(caspase-8特异性抑制剂)和Z-LEHD-FMK(caspase-9特异性抑制剂)，分别测定3种抑制剂在不同浓度时的病毒滴度。

结果显示Z-IETD-FMK在4个浓度下的病毒滴度均高于对照组，与对照组比较差异显著(P<0.05)；Z-VAD-FMK和Z-LEHD-FMK在4个浓度下的病毒滴度均低于对照组，与对照组比较差异显著(P<0.05)；Z-IETD-FMK组在4个浓度下的病毒滴度均高于Z-VAD-FMK组和Z-LEHD-FMK组，差异显著(P<0.05)，因此选择Z-IETD-FMK作为抑制剂进行下一步试验。

二、抑制剂使用浓度的筛选

按10倍系列稀释PRRSV种毒，稀释度从10^-3到10^-10，并接种在96孔细胞培养板中长成单层的Marc-145细胞，每个稀释度接种4个孔，另留2孔不加病毒液的正常细胞作为阴性对照，待细胞接毒24h后，加入不同浓度(0μM、5μM、10μM、20μM、50μM、80μM、100μM、150μM)的Z-IETD-FMK，分别测定加入不同浓度Z-IETD-FMK时的病毒滴度，每个浓度做10次重复。结果显示当Z-IETD-FMK浓度为5～20μM时，PRRSV的病毒滴度高于对照组，平均为10^5.96TCID₅₀/0.1mL～10^6.25TCID₅₀/0.1mL，对照组的病毒滴度平均为10^5.25TCID₅₀/0.1mL，与对照组比较差异显著(P<0.05)；而50μM、80μM、100μM和150μM4个浓度对细胞产生毒性，在50μM时细胞部分变圆死亡，在80μM、100μM和150μM时细胞全部变圆死亡，因此Z-IETD-FMK的较佳使用浓度定为5～20μM。

三、抑制剂添加时间的筛选

<1>在96孔细胞培养板中加入100μL Marc-145细胞悬液，每孔细胞约1×10⁵个/mL，细胞培养液含10％新生牛血清，在37℃5％CO₂条件下进行培养；

<2>用含2％新生牛血清的培养液将猪繁殖与呼吸综合征病毒种毒作10倍系列稀释，稀释后的病毒浓度为10^-1～10^-10；

<3>待步骤<1>中的细胞培养24～48h后长成单层时，将步骤<2>中稀释好的病毒液接种到96孔细胞培养板中，每个稀释度接种一纵排，共8孔，每孔接种10μL，37℃孵育1h后，每孔加入90μL含2％新生牛血清的培养液，同时将剩余2纵排未接种病毒液的正常细胞作为阴性对照，每孔加入100μL含2％新生牛血清的培养液，在37℃5％CO₂条件下培养，逐日观察并记录每孔细胞的病变情况；

<4>分别于接种病毒后0h、24h、48h和60h，在接种病毒液的细胞培养孔中加入5μMcaspase-8的特异性抑制剂Z-IETD-FMK，每个稀释度仅在其中4孔中加入Z-IETD-FMK，继续在37℃5％CO₂条件下培养，逐日观察并记录每孔细胞的病变情况；

<5>待步骤<4>中产生细胞病变的孔数不再增加时，按Karber法分别计算接种病毒后不同时间添加Z-IETD-FMK时的病毒滴度和Z-IETD-FMK未添加组的病毒滴度；

<6>重复操作步骤<1>-<5>十遍。

结果显示在接毒后24～60h添加Z-IETD-FMK时，PRRSV的病毒滴度高于对照组，平均为10^5.46TCID₅₀/0.1mL～10^10.16TCID₅₀/0.1mL，对照组的病毒滴度平均为10⁵TCID₅₀/0.1mL。此外，0h:10^4.35TCID₅₀/0.1mL。因此，将添加Z-IETD-FMK的时间定为接种病毒后24～60h。四、结论与讨论

结论：试验表明，通过在体外培养PRRSV的过程中添加caspase-8的特异性抑制剂Z-IETD-FMK，能使PRRSV在细胞内得到最大量的复制，最终获得高滴度的PRRSV。

讨论：马志涛的《猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起细胞凋亡的机理研究》，筛选出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起细胞凋亡的相关病毒蛋白，并探讨PRRSV诱导细胞发生凋亡的分子机理，从而解释PRRSV的致病性，属于基础性研究。而本发明则侧重应用，提供了一种提高PRRSV体外培养滴度的方法，解决目前PRRSV传统疫苗生产过程中病毒培养滴度低的瓶颈问题。此外，两者还存在以下重大区别：

<1>加入Z-IETD-FMK的时间不同

马志涛的研究中，Z-IETD-FMK是先与细胞共孵育2h后，再接种PRRSV。而本发明是在细胞接种PRRSV后一定时间，再加入Z-IETD-FM。前述试验也表明，在不同时间加入Z-IETD-FMK，其发挥的作用效果会有差异，同时对细胞及病毒的生物学特性会产生不同程度的影响，从而影响PRRSV引起细胞凋亡的程度和PRRSV在细胞中的增殖。

<2>加入Z-IETD-FMK的效果不同

马志涛的研究中，加入Z-IETD-FMK后，PRRSV引起的细胞凋亡受到抑制，但PRRSV的复制与对照组相比没有受到显著影响。而本发明在特定时间加入一定浓度的Z-IETD-FMK后，虽然PRRSV引起的细胞凋亡也受到抑制，但与对照组相比，PRRSV的培养滴度获得了明显提高。

Claims (5)

1.Z-IETD-FMK在提高PRRSV体外培养滴度方面的应用。

2.一种提高PRRSV体外培养滴度的方法，其特征在于：待细胞接种病毒后添加Z-IETD-FMK。

3.根据权利要求2所述的提高PRRSV体外培养滴度的方法，其特征在于：待细胞接种病毒24～60h后添加Z-IETD-FMK。

4.根据权利要求3所述的提高PRRSV体外培养滴度的方法，其特征在于：所述Z-IETD-FMK浓度为5～20μM。

5.根据权利要求4所述的提高PRRSV体外培养滴度的方法，其特征在于包括以下步骤：

<1>在细胞培养瓶中加入Marc-145细胞悬液，细胞培养液含10％新生牛血清；

<2>待步骤<1>中的细胞培养24～48h后长成单层时，将猪繁殖与呼吸综合征病毒种毒接种到细胞培养瓶中，37℃孵育1h后，加入含2％新生牛血清的培养液；

<3>接种病毒液24～60h后，在接种病毒液的细胞培养瓶中加入5～20μM caspase-8的特异性抑制剂Z-IETD-FMK，继续培养,当三分之二的细胞出现细胞病变时收集细胞毒。