CN107287149B - 一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系及其建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞，该细胞系的名称为山羊睾丸细胞GT26，已于2017年3月1日保存在中国典型培养物保藏中心保藏编号：CCTCC NO：C201734。该永久细胞系的建立方法包括：(1)羊睾丸细胞永久化的建立；(2)羊睾丸细胞的低血清驯化；(3)羊口疮病毒在新生羊睾丸细胞系的培养。其利用此羊睾丸细胞系接种羊口疮病毒，达到能够稳定增殖病毒的目的，为羊口疮病毒弱毒疫苗和灭活苗研制与生产提供了稳定的细胞环境和标准化的培养方法。

Description

一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系及其建立方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种永久细胞系，具体涉及一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系及其培养方法和应用。
背景技术
羊传染性脓疱又称羊口疮(Orf virus)，是一种由羊口疮病毒所致的人兽共患传染病。本病几乎分布于世界所有养羊国家，自然情况下主要侵害绵羊和山羊，尤其山羊最为易发。本病流行无明显季节性，但春秋季相对较易发生。常呈群发性流行，3～6月龄羔羊最易感染，病羊和带毒羊是本病的传染源。健康羊与病羊直接接触，或接触被病羊污染的用具、饮水、饲槽、饲料等而感染。病毒可随病羊的脓疱、水疱分泌物和唾液以及脱落的痂皮排出，其传播途径主要是经损伤的皮肤或黏膜而感染。
随着我国肉用羊、奶山羊及毛用羊养殖业的迅速发展，我国已成为世界第一养羊大国，养羊业已成为我国许多地方的主要经济来源和增加收入的主要方式。与此同时，羊的疫病控制问题日趋凸显，尤其是羊口疮已成了威胁养羊业的主要疫病之一。养羊户急需质优价廉高效的羊口疮疫苗。
但目前市场上却没有羊口疮疫苗可供用户使用，主要原因是羊口疮疫苗生产没有实用的细胞系，而原代细胞如牛睾丸原代细胞、羊胎儿鼻甲细胞、羊胎儿皮肤成纤维细胞制备过程又存在很多问题：如样品数量有限、制备过程复杂、成本高、耗时长，批次间质量不稳定等，导致企业实现规模生产难度大；同时能用于接种羊口疮的细胞系(MDBK)的增殖病毒的滴度不高。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种用于增殖羊口疮病毒的永久细胞系，其利用该细胞系接种羊口疮病毒(疫苗株)，达到稳定增殖病毒的目的。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于增殖羊口疮病毒的永久细胞系，该细胞系的名称为山羊睾丸细胞GT26，已于2017年3月1日保存在中国典型培养物保藏中心保藏编号：CCTCC NO：C201734。
本发明还有一个目的是提供所述用于增殖羊口疮病毒的永久细胞系建立方法，包括以下步骤：
1)羊睾丸细胞的分离与培养：
无菌条件下，含1％双抗PBS冲洗睾丸3次，剪去睾丸实质上的附睾及白膜，PBS冲洗睾丸实质，直至眼观无血液，将其移至无菌培养皿内。
PBS冲洗将剪成2mm大小的睾丸实质，加入1倍体积的0.5g/L I胶原酶，37℃培养箱静止2h，轻轻吹打5次，加入3倍体积的pH 7.4，0.15％的胰蛋白酶8℃静置12h后，加入含8％血清和1％双抗DMEM培养液培养基，在50mL离心管轻轻将细胞吹散，以1500rpm离心8min，加入完全培养液重悬细胞，调整细胞密度到0.5×106/mL，37℃，5％CO2培养箱培养。
2)羊睾丸细胞永生化的建立：培养的羊睾丸细胞铺满培养瓶的70％～80％时，结果显示，经过驯化的羊睾丸细胞传至30代后细胞生长呈铺路石样。建系过程中使用培养基添加0.1％DMSO和1ug/mL氢化可的松。
在细胞密度到达80％～90％时进行传代，弃去原培养基，用PBS洗涤3次，使用0.15％胰酶消化细胞至变圆收缩，补新鲜完全培养基拍下混匀细胞后，置于含37℃，5％CO2培养箱培养，即为一次细胞传代。
注：一般细胞生长3天即可传代，若间隔3天细胞密度稍低(＜70％)，可弃去部分旧培养基，补加新鲜培养基，细胞传代时间间隔不应大于10天。
3)羊睾丸永生化细胞的低血清驯化：在细胞密度到达90％～95％时进行传代，先弃去旧培养基，用PBS洗涤2～3次，使用0.15％胰酶消化细胞至变圆收缩，补加含不同血清浓度培养基血清拍下混匀细胞，依次使用含血清浓度为8％、6％、4％、3％、2％的生长培养基，置于37℃、5％CO2培养箱培养。
注：1：每个血清浓度的培养基培养细胞3代；2：在使用较低血清传代前先使用低血清的培养基，使细胞适应培养基。
步骤1)中羊睾丸细胞的培养液为M199、DMEM高糖或MEM培养基。
步骤3)中在羊睾丸细胞永久化细胞低血清培养，利用连续渐进降低培养基中血清浓度获得，羊睾丸细胞系的培养(正常)结果。
本发明还有一个目的是提供上述永久细胞系在制备基于羊口疮病毒的疫苗中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
本发明分离最大限度分离到羊睾丸中的细胞，经过自然传代获得羊睾丸永生化细胞并经过降低其培养的血清浓度，建立低血清培养的羊睾丸细胞系。利用此羊睾丸细胞系接种羊口疮病毒(疫苗株)，病毒(疫苗株)能够在该系细胞培养环境中稳定增殖，并可减少对于血清的使用。为羊口疮病毒弱毒疫苗研制和生产提供了稳定的细胞环境和标准化的培养方法，可用于羊口疮疫苗的大量生产。
附图说明
图1为羊睾丸细胞系的培养(正常)结果；
图2为羊睾丸细胞系接种羊口疮病毒疫苗株72h后的细胞病变结果；
图3所示为羊睾丸细胞系接种羊口疮病毒疫苗株96h后的细胞病变结果。
具体实施方式
下面结合实施实例对本发明做进一步描述，这些实例仅用于例证，不限制本发明保护范围。若未特别指明，实施实例中所用的技术手段为本领域常用技术方法。
本发明的一种用于增殖羊口疮病毒的永久细胞系，该细胞系的名称为山羊睾丸细胞GT26，已于2017年3月1日保存在中国典型培养物保藏中心保藏编号：CCTCC NO：C201734，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
本发明一种用于增殖羊口疮病毒的永久细胞系建立方法，具体包括下列步骤：
无菌条件下，含1％双抗PBS冲洗睾丸3次，剪去睾丸实质上的附睾及白膜，PBS冲洗睾丸实质，直至眼观无血液，将其移至无菌培养皿内。
PBS冲洗将剪成2mm大小的睾丸实质，加入1倍体积的0.5g/L I胶原酶，37℃培养箱静止2h，轻轻吹打5次，加入3倍体积的pH 7.4，0.15％的胰蛋白酶8℃静置12h后，加入含8％血清和1％双抗DMEM培养液培养基，在50mL离心管轻轻将细胞吹散，以1500rpm离心8min，加入完全培养液重悬细胞，调整细胞密度到0.5×106/mL，37℃，5％CO2培养箱培养。
2)羊睾丸细胞永生化的建立：培养的羊睾丸细胞铺满培养瓶的70％～80％时，结果显示，经过驯化的羊睾丸细胞传至30代后细胞生长呈铺路石样。建系过程中使用培养基添加0.1％DMSO和1ug/mL氢化可的松。
在细胞密度到达80％～90％时进行传代，弃去原培养基，用PBS洗涤3次，使用0.15％胰酶消化细胞至变圆收缩，补新鲜完全培养基拍下混匀细胞后，置于含37℃，5％CO2培养箱培养，即为一次细胞传代。
注：一般细胞生长3天即可传代，若间隔3天细胞密度稍低(＜70％)，可弃去部分旧培养基，补加新鲜培养基，细胞传代时间间隔不应大于10天。
3)羊睾丸永生化细胞的低血清驯化：在细胞密度到达90％～95％时进行传代，先弃去旧培养基，用PBS洗涤2～3次，使用0.15％胰酶消化细胞至变圆收缩，补加含不同血清浓度培养基血清拍下混匀细胞，依次使用含血清浓度为8％、6％、4％、3％、2％的生长培养基，置于37℃、5％CO2培养箱培养。
注：1：每个血清浓度的培养基培养细胞3代；2：在使用较低血清传代前先使用低血清的培养基，使细胞适应培养基。
步骤1)中羊睾丸细胞的培养液为M199、DMEM高糖或MEM培养基。
步骤3)中在羊睾丸细胞永久化细胞低血清培养，利用连续渐进降低培养基中血清浓度获得的如图1所示，羊睾丸细胞系的培养(正常)结果。
4)羊口疮病毒的稳定增殖
将冻存细胞复苏后，用含2％犊牛血清的MEM培养基细胞，于37℃，5％CO2培养。待细胞融合度达到80％～90％时，将5～10％的羊口疮疫苗株病毒接种于细胞，于37℃，5％CO2培养，继续培养72～96h，观察病变如图2和图3所示为羊睾丸细胞系接种羊口疮病毒疫苗株72h后的细胞病变，细胞出现变圆、破碎；待培养细胞病变70％左右时，反复冻融整个培养物三次后，7000～10000rpm离心10min，收集上清用于测定其中病毒滴度。
5)病毒滴度测定(TCID50检测)
1、将细胞消化后加生长培养基，调整细胞密度为1～2×105个/ml，接种到96孔板，每孔加入细胞悬液100ul，待细胞融合度达到70％左右可接毒。
2、将病毒用维持培养基连续10倍稀释，分别为、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10，将稀释的病毒按照顺序依次接种到96孔板，每个浓度接种一纵列共8孔，每孔100ul。
设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排；为100ul生长液+100ul细胞悬液；37℃，5％CO2培养，逐日观察并记录结果，一般需要观察5～7天，其结果见表1。
表1为羊口疮病毒接种羊睾丸细胞系后72h的滴度测定结果。
Figure BSA0000145096060000061
从表1可以看出，本发明的羊睾丸细胞系使用效果要比原代睾丸细胞好。

Claims (3)

1.一种用于增殖羊口疮病毒的永久细胞系，该细胞系的名称为山羊睾丸细胞GT26，已于2017年3月1日保存在中国典型培养物保藏中心保藏编号：CCTCC NO：C201734。
2.权利要求1所述永久细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)羊睾丸细胞的分离与培养
无菌条件下，含1％双抗PBS冲洗睾丸3次，剪去附睾及白膜，留下睾丸实质， PBS冲洗睾丸实质，至眼观无血液，将其移至无菌培养皿内；
将睾丸剪碎成1mm大小，PBS冲洗静止并弃去上清，加1倍体积的0.5g/L I胶原酶，37℃培养箱静止2h，轻轻吹打5次，加5倍体积的pH 7.4，0.15％的胰蛋白酶，8℃静置12h后，弃去上层胰蛋白酶，加入含8％血清和1％双抗DMEM培养液培养基，将细胞轻轻吹散，移入到50mL离心管离心，1500rpm离心8min，用完全培养液重悬细胞，调整细胞密度到0.5×106/mL，37℃，5％CO2培养箱培养；
2)羊睾丸细胞永久化的建立
培养的羊睾丸细胞铺满培养瓶的70％～80％时，结果显示，经过驯化的新生羊睾丸细胞传至30代以后细胞生长呈铺路石样；
在细胞密度到达80％～90％时进行传代，弃去原培养基，用PBS洗涤3次，使用0.15％胰酶消化细胞至变圆收缩，用新鲜完全培养基轻轻拍下细胞后，置于含37℃，5％ CO2培养箱培养，即为一次细胞传代；
3)羊睾丸永久化细胞低血清培养的驯化
在细胞密度到达90％～95％时进行传代，先弃去旧培养基，用PBS洗涤2-3次，使用0.15％胰酶消化细胞至变圆收缩，用含不同浓度血清新鲜生长培养基轻轻拍下细胞后，血清浓度依次为8％、6％、4％、3％、2％，置于37℃、5％ CO2培养箱培养。
3.权利要求1所述永久细胞系在制备基于羊口疮病毒的疫苗中的应用。
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Patentee before: YANGLING BODEYUE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.