实施例5灭活疫苗的制备与免疫效率测定
1.疫苗制备:取PRRSV-N3544毒株病毒液(107.0TCID50/ml)和rBB毒株病毒液(107.0TCID50/ml),各50ml,分别加入过氧化氢溶液至过氧化氢在病毒液中的终浓度为1wt%,混匀,放置于20℃灭活2h,然后分别加入25%Na2SO3溶液调节pH值至7.0左右,得灭活的病毒液;然后再向灭活的病毒液中分别加入其15%体积的卡波姆佐剂,混合均匀,制得PRRSV-N3544灭活疫苗和rBB灭活疫苗,2-8℃保存备用。
2.猪体疫苗免疫
将15头4周龄PCV2和PRRSV抗原、抗体均阴性的断奶仔猪,随机分为3组,每组5头。第1组接种由rBB灭活病毒配制而成的rBB灭活疫苗,肌肉注射,2ml/头,第2组接种由PRRSV-N3544灭活病毒配制而成的PRRSV-N3544灭活疫苗,肌肉注射,2ml/头,第3组肌肉注射接种同等量的DMEM。隔离饲养,间隔3周后采用相同方法加强免疫一次。首免后每隔2周采血一次,分离血清,用于PRRSVELISA抗体和中和抗体检测。首免后8周,采取抗凝血用于分离外周血淋巴细胞,测定淋巴细胞增殖反应,并测定细胞分泌细胞因子(IL-4和IFN-γ)的量。
3.PRRSVELISA抗体检测
以超离浓缩纯化的PRRSVBB0907毒株抗原2.4μg/mL包被酶标板,37℃2h,后转入4℃包被过夜;PBST洗涤3次,每次5min;加入1%的BSA,200μL/孔,37℃封闭2h;PBST洗涤3次,每次5min;将猪血清作1:100稀释后加入酶标孔,每个样品重复3个孔,同时设定阴、阳性对照,100μL/孔,37℃1h;PBST洗涤3次,每次5min;将SPA-HRP用稀释液稀释(1:20000)后,加入酶标孔,100μL/孔,37℃1h;PBST洗涤3次,每次5min;加入TMB显色液,100μL/孔,37℃15min;加入终止液(2MH2SO4),50μL/孔;测定OD450nm的值。符合下列条件判为阳性,否则为阴性。S/N=样品OD值/阴性对照OD值≥2.1。
检测结果如图10A所示,从图中可以看出,灭活疫苗免疫组在首免4周后PRRSV特异性抗体开始转为阳性,而DMEM免疫组PRRSV抗体特异性抗体检测仍为阴性。两组免疫组PRRSV特异性抗体产生并没有明显差异。
4.PRRSV中和抗体检测
采用间接免疫荧光方法测定PRRSV中和抗体。将MARC-145细胞铺于96孔板,待细胞密度为90%左右开始试验。将血清用10%血清的DMEM进行2倍比稀释,血清体积为100μL/孔。然后每孔加入100TCID50的PRRSVBB0907毒株病毒液,同时设定阳性对照,阳性对照为只加入100TCID50的病毒,不加血清。每个实验组重复4个孔。48h后,用PRRSVN蛋白单抗进行IFA测定。判定标准为:当实验组的荧光数比阳性对照少50%以上,判定为中和抗体阳性孔。
检测结果如图10B所示,PRRSV-N3544灭活免疫组在首免后6周能够检测到中和性抗体,并且能够达到1:16以上,而且能够持续到第8周。但是,rBB灭活免疫组在整个免疫周期均没有检测到中和抗体的产生。DMEM免疫组也没有中和抗体的产生。
5.淋巴细胞增殖试验
采用无菌方法,自猪前腔静脉采取血样,保存在肝素锂管中。使用人淋巴细胞分离液进行密度梯度离心分离PBMCs。淋巴细胞分离液与抗凝血按1:1的比例加入10mL玻璃离心管中,将5mL抗凝血小心加于5mL淋巴细胞分离液之液面之上,以1500rmp离心10min。此时离心管中自上而下细胞分四层。第一层为血浆或组织匀浆液,第二层为环状乳白色淋巴细胞或单核细胞层,第三层为透明分离液层,第四层为红细胞层。用巴氏吸管吸取第二层细胞,用PBS洗涤,以1500rmp离心10min,再用1640洗涤一次,最后用10%的1640营养液重悬细胞,细胞计数后,密度调至5×106个/mL,24孔板每孔铺500μL。然后进行淋巴细胞增殖试验,将超离纯化、浓缩的PRRSVBB0907按20μg/mL的终浓度灭活后作为刺激抗原,每个试验动物的淋巴细胞分为2组,分别为:PRRSV灭活抗原刺激和未加任何刺激,每组设三个重复。加入刺激原后,37℃培养66h,然后每孔加入40μLMTT(5mg/mL),于37℃继续培养4h。吸取培养液,每孔加入100μLDMSO,振荡融解结晶,测定OD570nm的值。
刺激指数的计算方法如下:刺激指数SI=刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值。
实验结果如图11A所示,相比DMEM免疫组,灭活免疫组均能产生PRRSV特异的T淋巴细胞增殖。并且,两个病毒灭活免疫组的T淋巴细胞增殖应答无明显差异。
6.细胞因子的测定
收集猪体首免后8周时淋巴细胞增殖试验中各组刺激孔培养66h的细胞上清,按美国R&D公司猪IL-4及IFN-γ说明书检测其中IL-4及IFN-γ含量。
检测结果如图11B和11C所示,从图中可以看出,在灭活免疫组中均能产生一定量的IFN-γ,DMEM不能产生IFN-γ。而各组中的IL-4含量较低,且没有明显差异。
7.猪体免疫后攻毒实验
首免后8周后,每头猪通过颈部肌肉接种2×105.0TCID50/mlPRRSVBB0907病毒液。攻毒后隔离饲养,每天观察仔猪临床表现,测量直肠温度。攻毒后第3、7、10和14天采血分离血清,用于病毒血症及PRRSV特异性抗体的检测。攻毒后第15天扑杀所有试验猪,采集肺脏组织,并进行病理学检查。
7.1体温变化及临床症状统计
攻毒后每天测量各组猪的体温,并做好记录。临床症状统计具体如下:攻毒后根据猪的临床表现、呼吸及咳嗽状况,对上述三项指标分别进行打分,分值在1~4之间。分值越高代表症状越严重,对上述任一指标而言,1分代表正常,2分代表症状轻微,3分代表症状严重,死亡猪的各项指标都为4分。攻毒后每天分别对各组猪进行打分,将三项指标分数求和得到每头猪每天的临床分数,攻毒后观察15天,得到每头猪15天的临床分数平均值。最后计算每组的平均临床分数统计分数。
攻毒后体温变化如图12A所示,从图中可以看出,DMEM免疫组体温明显升高,而rBB灭活免疫组在前几天体温也明显身高,整体温度高于PRRSV-N3544灭活免疫组。整个攻毒期间,DMEM免疫组攻毒后,出现典型的PRRSV症状,如皮肤发红,厌食,嗜睡,粗毛,呼吸困难,眼周水肿,眼睑水肿和轻度腹泻等。rBB灭活免疫组也出现明显的临床症状,但较DMEM免疫组轻。而PRRSV-N3544灭活免疫组没有出现明显的临床症状。临床症状评价如图12B所示。
7.2.PRRSVELISA抗体检测
以超离浓缩纯化的PRRSVBB0907毒株抗原2.4μg/mL包被酶标板,37℃2h,后转入4℃包被过夜;PBST洗涤3次,每次5min;加入1%的BSA,200μL/孔,37℃封闭2h;PBST洗涤3次,每次5min;将采集的猪血清作1:100稀释后加入酶标孔,每个样品重复3个孔,同时设定阴、阳性对照,100μL/孔,37℃1h;PBST洗涤3次,每次5min;加入抗鼠IgG-HRP(用PBST作1:20000稀释),100μL/孔,37℃1h;PBST洗涤3次,每次5min;加入TMB显色液,100μL/孔,37℃15min;加入终止液(2MH2SO4),50μL/孔;测定OD450nm值,计算P/N比值,P/N=样品OD值/阴性对照OD值,P/N≥2.1判为阳性。结果见图13A,2个疫苗免疫攻毒组ELISA水平相似,但与对照攻毒组有明显差异(P>0.05)。
7.3病毒血症的检测
采用标准的TCID50法来测定血清中的病毒含量。在96孔板中铺好MARC-145细胞,待细胞密度约为90%时开始进行血清中PRRSV滴度的测定。实验前先将血清过滤后,然后用10%犊牛血清的DMEM进行10倍比稀释,然后接种到96孔板中,每孔为100μL。同时设定阳性对照,阳性对照为100TCID50的病毒液100μL。每个实验组重复4个孔。5天后,观察统计细胞病变数,采用Reed-Muench法计算。结果如图13B所示,PRRSV-N3544灭活免疫病毒血症组明显低于rBB灭活免疫组和DMEM免疫组(P>0.05)。
7.4肺脏大体病变统计
肺脏大体病变统计按参考文献(HalburPG,PaulPS,FreyML,LandgrafJ,EernisseK,MengXJ,etal.ComparisonofthepathogenicityoftwoUSporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolateswiththatoftheLelystadvirus.Veterinarypathology.1995;32:648-60.)的方法。根据各肺叶所占整个肺的体积比,给其分配相应的分数,两侧肺的尖叶和心叶各分配10分,两侧肺的膈叶各分配27.5分,右侧肺的副叶分配5分,这样整个肺总分100分。如果整个肺病变就是100分,50%表面积病变就是50分,即病变面积越大分数就越高。根据各肺叶的病变程度,按照其所占比重分别打分,最后计算该肺病变程度的总分。
攻毒15天后,剖杀所有猪,观察肺脏大体病变。PRRSV-N3544灭活免疫组猪的肺没有出现明显病变,只有轻微的间质增宽。而DMEM免疫组和rBB灭活免疫组的猪肺部出现明显的蚀变,间质明显增宽。如图所示14A,肺脏大体病变统计,PRRSV-N3544组得分明显低于rBB灭活免疫组和DMEM免疫组。
7.5.病理组织切片的制备
病理组织切片的制备按参考文献(HalburPG,PaulPS,FreyML,LandgrafJ,EernisseK,MengXJ,etal.ComparisonoftheantigendistributionoftwoUSporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolateswiththatoftheLelystadvirus.Veterinarypathology.1996;33:159-70)的方法。从猪肺脏上取下不大于2cm2×4mm厚的组织块,迅速放入固定液中(终浓度4%甲醛PBS溶液);固定完全后,组织块用流水冲12h,除去多余的固定剂;组织块梯度酒精脱水,75%,1.5h;75%,1.5h;85%,1h;85%,1h;95%,1h;95%,1h;100%,1h;100%,1h;组织块透明,用二甲苯脱去组织中的乙醇,再在新的二甲苯中作用至组织边缘透明为止;透蜡,将透明好的组织放入融化好的蜡中浸1.5h,再转入新的蜡中浸1.5h;石蜡包埋,往包埋模具中加入融化好的石蜡,趁石蜡没有凝固迅速用镊子将组织块放入其中,将组织块平面贴于底部中央,标记好后待室温凝结完全;组织切片制备,将石蜡包埋好的组织块修成合适的大小及形状,夹于切片机上调成切片厚度并进行切片,厚度一般为4μm,将切下的薄片组织在42℃水上展开,使其贴敷于载玻片上,然后将贴有组织的玻片置于60℃温箱中恒温烘烤20min,使组织固定于载玻片。最后进行HE染色。二甲苯脱蜡:切片依次进入二甲苯I5min,二甲苯II5min;组织梯度酒精复水:准备分别盛有100%、95%、85%和75%乙醇的染色杯,切片依次进入100%酒精3~5min,100%酒精3~5min,95%酒精3min,95%酒精3min,85%酒精1~2min,85%酒精1~2min,75%酒精1~2min,75%酒精1~2min,去离子水1~2min;染色:苏木精1~2min,水洗3~5min,伊红0.5~1min;梯度酒精脱水:75%酒精1~2min,85%酒精1~2min,95%酒精3~5min,100%酒精3~5min,100%酒精3~5min。二甲苯透明:二甲苯I3~5min,二甲苯II3~5min;中性树胶封固后观察。
如图15所示,肺部组织切片HE染色后,于显微镜观察。DMEM免疫对照组试验猪主要表现为肺泡壁增厚,有单核细胞浸润,支气管上皮细胞增生;rBB灭活免疫组也有类似的肺脏组织病理学变化,但程度稍微轻于DMEM免疫对照组;而PRRSV-N3544灭活免疫组只有轻微的间质增宽出现。病理变化统计得分如图14B所示。
8.结论
从上述免疫实验和免疫后攻毒实验结果可以看出:PRRSV-N3544毒株采用过氧化氢可以有效灭活并保留免疫原性,猪体后6周即可诱导产生PRRSV中和抗体,同时产生明显细胞免疫应答。免疫后8周能够提供对同源PRRSV毒株的保护作用,有效降低病毒血症和组织病理学变化,免疫效果明显优于原始病毒灭活疫苗。
<110>南京农业大学;江苏南农高科技股份有限公司
<120>一种猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程毒株及其灭活疫苗和疫苗制备方法
<160>3
<210>1
<211>15361
<212>DNA
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<400>1
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