CN102559606B - 一种柯萨奇病毒a16型病毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种柯萨奇病毒A16型病毒株，其保藏号为CGMCC No.5373。在电镜下观察该病毒呈20面立体对称球形，直径23-30nm。对该毒株分别进行了VP1保守区序列分析和质谱分析，结果表明是CA16病毒，该株CA16病毒可在Vero细胞中高效增殖，病毒滴度可达7.0lg CCID₅₀/ml，且该毒株无外源污染，有较好的免疫原性，是一株效果良好的病毒株。

Description

一种柯萨奇病毒A16型病毒株及其应用

技术领域

本发明涉及病毒学、分子生物技术领域，具体地说，涉及一种新的柯萨奇病毒A16型病毒株及其应用。

背景技术

手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报导。1957年新西兰首次报导，1958年分离出柯萨奇病毒，1959年提出HFMD命名。早期发现的手足口病的病原体主要为Cox A16型，手足口病与EV 71感染有关的报导则始自20世纪70年代初，1972年EV 71在美国被首次确认。此后EV 71感染与Cox A16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。其多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿如果病情发展快，导致死亡。其中柯萨奇病毒(Coxasckievirus)A16型(Cox A16，CA16)是手足口病主要病原体之一，它是小RNA病毒科的单股正链RNA病毒，呈20面立体对称球形。虽然重症和死亡病例主要由EV71病毒感染引起，但特别值得关注的是Cox A16与心肌炎、心包炎、难治性休克等综合性疾病相关。

我国自1981年在上海始见本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、西宁、广东等十几个省市均有报道。手足口病的爆发和流行严重影响了人们的日常生活，造成巨大的经济损失和社会负担，利用病毒疫苗从根本上切断病毒的传播是目前较为有效的预防途径之一，目前尚无CA16病毒疫苗的报道，因此分离出适于疫苗生产的CA16病毒株具有巨大的经济和社会效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的柯萨奇病毒A16型病毒株及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种柯萨奇病毒A16型病毒株，其保藏号为CGMCC No.5373，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2011年10月18日。在电镜下观察该毒株，病毒颗粒呈20面立体对称球形，直径约23-30nm。

前述的应用，是将所述柯萨奇病毒A16型病毒株经过感染细胞(如Vero细胞、人二倍体细胞或其它敏感细胞)、培养、收获病毒液、灭活和纯化后，得到疫苗原液，加入免疫佐剂(如氢氧化铝等)后即得柯萨奇病毒A16型疫苗。

前述的应用，病毒株感染细胞后，于37℃培养，待细胞病变达75％以上时，收获病毒液。

前述的应用，灭活使用β-丙内酯或甲醛溶液。优选用1∶100-1∶10000(v/v)的β-丙内酯或1∶1000-1∶10000(v/v)的甲醛溶液灭活。病毒灭活也可在病毒纯化以后进行。

本发明还提供，以本发明的柯萨奇病毒A16型病毒株(CGMCCNo.5373)为免疫原制备抗体或杂交瘤细胞或抗血清。其中，抗血清的制备方法为：病毒株经过感染细胞、培养、收获病毒液、灭活和纯化后，得到疫苗原液，用疫苗原液免疫动物，获得抗血清。所述动物优选为猴、羊、兔等。

通过进一步研究本发明病毒株产生的VP1蛋白，VP1保守区序列分析和质谱分析结果表明该毒株为CA16病毒，且无外源物污染，有较好的免疫原性，是一株效果良好的病毒株。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)通过蚀斑法分离得到的本发明的单克隆CA16病毒株，其子代病毒表现为遗传稳定，可用于人用CA16疫苗生产。

(二)利用本发明的CA16病毒株或由其生产的疫苗可用于预防由CA16病毒引起的疾病(例如手足口病，尤其是儿童的手足口病)，且具有滴度稳定、免疫原性较好、免疫剂量小的特点。

(三)本发明的CA16病毒株可在Vero细胞中高效增殖，病毒滴度可达7.0lg CCID₅₀/ml。

附图说明

图1为本发明CA16病毒株电镜观察结果(放大比例：100,000倍)。

图2为本发明CA16病毒株蛋白质谱分析结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1 CA16病毒株的分离、培养和鉴定

(一)病毒分离、培养

自2010年浙江省手足口疫区(手足口累计发病人数达111783)收集CA16病毒PCR结果阳性的病人粪便标本，经处理后接种至非洲绿猴肾传代细胞(Vero)上，培养三代进行病毒分离，得到CA16病毒后，通过蚀斑法获得CA16病毒株。

(二)病毒鉴定

1、VP1保守区序列分析结果

对该毒株VP1保守区序列进行分析，其与参考株序列(人柯萨奇病毒A16型病毒株shzh00-1，完整基因组序列GenBank：AY790926.1)相比，核苷酸同源性在94.8％以上。

2、电镜检查结果

在电镜下观察该株CA16病毒，病毒颗粒呈20面立体对称球形，直径约23-30nm。(图1)

3、质谱分析结果

对该株CA16病毒蛋白进行质谱分析，结果表明此毒株蛋白确为CA16病毒蛋白(图2)。

4、无菌、支原体检查结果

对该株CA16病毒进行无菌、支原体检查，结果表明无支原体和其它微生物污染。(按照《中国药典》方法进行检测)

5、病毒滴度检测结果

采用微量滴定法测定该株病毒收获液的病毒滴度，病毒滴度可达7.0lg CCID50/ml。方法如下：采用Vero细胞进行病毒滴度的测定。用96孔细胞培养板培养Vero细胞，细胞成片后将病毒用细胞维持液从10^-1倍比稀释至10^-8，弃去Vero细胞上清，分别加入每个稀释度的病毒液，接种50μl/孔，每个稀释度接种8孔，同时设细胞对照。置37℃，5％CO₂培养箱培养，7d观察细胞感染病毒情况，计算病毒滴度。

6、抗原含量检测

采用酶联免疫法对该株CA16病毒抗原含量进行检测，抗原含量不低于200U/ml。采用双抗体夹心法定量测定样品中CA16抗原含量。首先将特异性CA16多克隆抗体包被于酶标板形成固相抗体；然后加入CA16样品，与固相抗体形成固相抗原抗体复合物；最后加入酶标记抗体，样品中的CA16抗原可与酶标抗体发生特异性结合，当加入底物时出现成色反应，用酶标仪在适当波长测定OD值，通过EXCEL统计分析结果。

实施例2 CA16疫苗的制备

CA16病毒株经过感染Vero细胞、培养、收获病毒液、灭活和纯化后，得到疫苗原液，用于进一步制备CA16疫苗。

(1)建立细胞主种子和工作种子库(Vero细胞)

将源自美国ATCC，120代非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)种子复苏，具体操作是：自液氮中取出细胞冻存管，置于39-40℃无菌水中，一分钟之内解冻细胞，无菌吸出悬液，1000rpm离心3min，弃上清，加入含10％小牛血清的MEM细胞生长液，轻轻吹打使其混匀，将混匀的细胞悬液接种于25cm²的细胞培养瓶中，置37℃，5％CO₂培养箱培养，待其贴壁后进行换液，再置37℃，5％CO₂培养箱培养，5-7天细胞汇合度达到100％时按1∶4进行传代，每传代一次细胞代次增加一代。按上述方法制备129代Vero细胞工作种子库。依据上述方法，本领域的研究人员能同样制备出满足本发明要求的工作种子库。

细胞主种子库和工作种子库均保存在液氮(-196℃)中。

(2)建立主代病毒种子库和工作种子库

CA16病毒PCR结果阳性的手足口病患者的临床标本，经处理后接种至非洲绿猴肾传代细胞(Vero)上，培养三代进行病毒分离，得到CA16病毒后，通过蚀斑法获得CA16病毒株。按照《中国药典》关于种子库建立方法的要求建立病毒主种子库和工作种子库，种子库均冷冻保存(-60℃以下)。

建库方法如下：将CA16病毒株按1∶1000(体积比)接种至汇合度在100％的Vero细胞(来自细胞工作种子库)瓶中(培养基是含2％小牛血清的MEM病毒生长液)，置37℃，5％CO₂培养箱培养，每天观察细胞病变(CPE)。当CPE达+++至++++时收获病毒，置-20℃冷冻，室温融化后，将冻融物按上述方法继续传代建立病毒主代种子库和工作种子库。并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏。其保藏号为CGMCC No.5373。

每一批收获液记为一代。

(3)病毒收获液制备

复苏Vero工作种子库细胞，经扩增后，将本发明的CA16病毒株按比例接种于长至薄单层的细胞瓶内，37℃培养，每天观察细胞病变，当细胞病变达50％以上时，收获病毒液，混匀后置-20℃保存，备用。

(4)病毒灭活和纯化

将上述制备的CA16病毒收获液用1∶100-1∶10000(v/v)的β-丙内酯或1∶1000-1∶10000(v/v)的甲醛溶液灭活。病毒灭活也可在病毒纯化以后进行。

病毒灭活后将上述灭活液进行离心澄清后，进行超滤透析，体积浓缩至原体积的1/10-50。得到的病毒超滤液加入磁力搅拌子，置于磁力搅拌器上搅拌，同时缓慢加入PEG(分子量为6000)使PEG终浓度为5-15％，调pH值至5.0-7.0之间，继续搅拌10-60min。于2-8℃沉淀8-24h后离心20-60min，沉淀用PBS缓冲液重溶，离心后获得病毒沉淀液。病毒沉淀液再经蔗糖密度梯度离心，收集病毒所在区带后，经超滤脱糖得到病毒脱糖液。病毒脱糖液经分子筛层析后得到病毒层析液，层析液经除菌后得到疫苗原液。

(5)疫苗制备

将上述疫苗原液与氢氧化铝佐剂按适宜比例吸附后即获得CA16疫苗半成品。CA16半成品经分装，检定后即为成品疫苗。

实施例3 CA16病毒株免疫原性试验

将实施例2中制备的CA16毒株疫苗原液进行纯化，灭活后免疫小鼠、新西兰兔、羊均获得较好的保护效果。

原液制备方法同实施例2所述。

其中，对羊进行的免疫原性试验如下：

将疫苗原液与氢氧化铝佐剂等比例吸附后，于第0天、7天、14天、21天对羊进行免疫，2ml/只/次，在整个试验期内，对动物的健康情况、行为变化等做详细记录。在免疫当天动物应当观察半小时。每天两次观察动物有无死亡情况。分别于第0天、7天、14天、21天、28天进行采血。静脉采少量血，3000rpm离心10min，分离血清。进行抗CA16中和抗体滴度测定，方法如下：在96孔细胞培养板内加入分离获得的羊血清，用维持液进行倍比稀释至一定浓度后，加入事先稀释至100CCID50的CA16检定毒株病毒液，中和1.5h-2h后加入检定用细胞悬液，细胞浓度为1.5-2.0×10⁵个/ml，置于37℃，CO₂培养箱进行培养。5-7天后观察细胞病变情况，其中以出现细胞病变的血清最高稀释度为血清中和效价，阳性判定指标：中和效价大于1∶8，阴性对照血清效价小于1∶8。结果见表1。

表1 对羊进行免疫原性试验的中和抗体检测结果

采血时间	血清名称	中和效价(1：)
			0d	阴性血清	＜8
7d	CA16疫苗免疫羊血清	8
			14d	CA16疫苗免疫羊血清	16
21d	CA16疫苗免疫羊血清	32
			28d	CA16疫苗免疫羊血清	32

从表1可以看出，使用本发明毒株制备的CA16疫苗从免疫动物第7天开始，就可诱发羊机体产生抗CA16病毒抗体，并且随免疫次数的增加而呈上升趋势。这一结果表明，使用该毒株制备的疫苗对羊具有较好的保护效果。

实施例4 以CA16病毒株为免疫原制备多抗血清

将实施例2中使用CA16毒株制备的疫苗原液进行扩大培养，纯化，灭活后免疫新西兰兔，获得了中和抗体效价较高的兔抗CA16多抗血清。

原液制备方法同实施例2所述。

将上述原液与弗氏完全佐剂充分乳化后，采取颈背部皮下与肌肉多点注射，3ml/只，5只/批。首次免疫后两周加强，加强免疫疫苗原液与弗氏不完全佐剂充分乳化后，同样采取颈背部皮下与肌肉多点注射，2ml/只/次，以后每周加强免疫一次，2ml/只/次，共加强免疫4次，每次加强免疫之前采血，对所得血清进行中和抗体效价测定，判断最后采血时间。

在中和抗体效价达到较高水平后，则在免疫后一周采血，在4℃条件下，3500r/min离心4min，收集血清，进行中和抗体效价测定，方法如下：在96孔细胞培养板内加入分离获得的兔血清，用维持液进行倍比稀释至一定浓度后，加入事先稀释至100CCID50的CA16检定毒株病毒液，中和1.5h-2h后加入检定用细胞悬液，细胞浓度为1.5-2.0×10⁵个/ml，置于37℃，CO₂培养箱进行培养。5-7天后观察细胞病变情况，其中以出现细胞病变的血清最高稀释度为血清中和效价，阳性判定指标：中和效价大于1∶8，阴性对照血清效价小于1∶8。结果在试验成立前提下，五只新西兰兔抗CA16血清混合液，血清效价在1∶512以上。该结果表明使用本发明的CA16病毒株免疫新西兰兔，可获得血清效价较好的兔抗CA16多抗血清。

为进一步验证本发明CA16疫苗的免疫保护作用，发明人进行了动物实验，即将本发明的CA16疫苗接种实验动物后，对实验动物进行毒攻，与未接种疫苗的实验动物进行比较，结果表明，本发明的CA16疫苗具有较好的疫苗保护作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种柯萨奇病毒A16型病毒株，其保藏号为CGMCC No.5373。

2.权利要求1所述病毒株在制备预防或治疗由柯萨奇病毒所致传染病的疫苗及诊断试剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，权利要求1所述病毒株经过感染细胞、培养、收获病毒液、灭活和纯化后，得到疫苗原液，加入免疫佐剂后即得柯萨奇病毒A16型疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，病毒株感染的细胞为非洲绿猴肾细胞或人二倍体细胞。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，感染细胞后，于37℃培养，待细胞病变达75%以上时，收获病毒液。

6.根据权利要求3-5任一项所述的应用，其特征在于，灭活使用β-丙内酯或甲醛溶液。

7.根据权利要求3-5任一项所述的应用，其特征在于，免疫佐剂为氢氧化铝。

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