CN102363770A - 融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素的重组杆状病毒及其亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒及重组亚单位疫苗。融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年12月17日，保藏号：CGMCC No.4459的。一种亚单位疫苗，含有所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS表达的PCV2Cap-SS融合蛋白BCap-SS和佐剂。本发明首次提出了用杆状病毒表达系统融合表达PCV2 Cap蛋白与生长抑素SS该重组杆状病毒对外源蛋白表达稳定，表达的重组蛋白能诱导产生了针对PCV2的特异抗体，并可促进增重。

Description

融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素的重组杆状病毒及其亚单位疫苗

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒及重组亚单位疫苗。 

技术背景

杆状病毒表达系统是目前比较成熟的表达系统之一，具有安全无毒，外源表达量高，可以对蛋白进行翻译后修饰等优点，已经成功用于多种蛋白的生产和疫苗的制备。而Cap蛋白是由猪圆环病毒2型PCV2的ORF2编码的大约30kD的衣壳蛋白，包含多个抗原表位和中和抗原表位，已被公认为是PCV2主要的免疫保护性抗原。国外已有用杆状病毒系统表达Cap制备的商品化疫苗上市使用，并经临床证明安全有效。生长抑素(SS)是十四个氨基酸的小肽，与下丘脑生长激素释放因子(GHRF)共同调节生长激素(GH)的释放，已有研究报道证实通过与载体蛋白融合，主动免疫动物，可使机体产生针对SS抗体，中和体内SS，解除SS的抑制作用，促进动物的生长。本研究将SS与PCV2 Cap融合在杆状病毒系统中表达，以期开发一种既可防控PCV2又能促进猪体生长的新型亚单位疫苗。 

发明内容

本发明的目的是提供一种融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素的重组杆状病毒。 

本发明的另一目的是提供一种能够有效预防控制PCV2相关疾病的亚单位疫苗，有效防控PCV2相关疾病。 

本发明的实施方案如下： 

融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒rAc-Cap-SS，该重组杆状病毒带有猪圆环病毒2型Cap蛋白基因开放阅读框和生长抑素SS基因形成的融合基因ORF2-SS。 

其中，所述的融合基因ORF2-SS序列如SEQ ID NO.1所示。 

所述的融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年12月17日，保藏号：CGMCC No.4459的。该重组杆状病毒rAc-Cap-SS在分类上属于：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，该重组杆状病毒可以对目的蛋白进行有效的表达，表达的目的蛋白含量较高，免疫原性较好，并可形 成病毒样颗粒，可用于制备新型PCV2亚单位疫苗和仔猪促生长亚单位疫苗。 

本发明重组杆状病毒是通过以下方法构建而成的： 

(1)ORF2-SS基因的扩增、克隆根据PCV2毒株SH(AY686763)的序列设计扩增Cap蛋白基因特异性引物以及引入SS基因的引物，引物序列如下： 

P1：5’CTTGGATCCATGACGTATCCAAGGAG-3’(SEQ ID NO.2) 

PCV2SS1：5’-CTTCCAGAAGAAGTTCTTGCAGCCAGCCATCTTAGGGTTAAGTGGG-3’(SEQ ID NO.3) 

PCV2SS2：5’-ATACTCGAGTTACTAACAGGATGTGAAAGTCTTCCAGAAGAAGTTCTTGC-3’(SEQ ID NO.4) 

采用常规方法提取PCV2病毒DNA，应用PCR技术分两次扩增得到引入SS基因的ORF2-SS基因片段，通过BamH I/Xho I酶切位点，将ORF2-SS基因克隆入供体质粒pFastBac^TMHTB中，通过PCR和酶切鉴定，阳性质粒进一步经测序鉴定，获得阳性重组质粒pF-Cap-SS。 

(2)转化DH10Bac感受态大肠杆菌参照Bac-to-Bac表达系统说明书的方法将鉴定好的pF-Cap-SS转化入DH10Bac感受态大肠杆菌，在Helper质粒的辅助作用下，重组质粒pF-Cap-SS和杆状病毒骨架载体Bacmid之间发生同源重组，实现了把外源基因转入杆状病毒骨架载体，经两次蓝白菌落筛选，挑取白色菌落培养，提取重组Bacmid质粒，分别利用M13F和PCV2SS2以及P1和M13R进行PCR鉴定，获得含ORF2-SS基因的重组Bacmid质粒rBac-Cap-SS。 

(3)重组杆状病毒的获得鉴定好的rBac-Cap-SS通过转染Sf9细胞，重组质粒在Sf9细胞内包装成完整的重组杆状病毒rAc-Cap-SS。 

本发明所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS在制备猪圆环病毒2型疫苗中的应用。 

所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS优选保藏号为CGMCC No.4459的重组杆状病毒。 

一种亚单位疫苗，含有所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS表达的PCV2Cap-SS融合蛋白BCap-SS和佐剂。 

所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS优选保藏号为CGMCC No.4459的重组杆状病毒。 

所述的融合蛋白BCap-SS序列如SEQ ID NO.7所示。 

所述的亚单位疫苗的制备方法：将转染得到的F1代重组杆状病毒rAc-Cap-SS在Sf9细胞上扩增，获得F2/3代病毒。Western-blot试验结果表明BCap-SS蛋白稳定表达，以接毒后72h表达量最高。将扩增得到的病毒接种Sf9细胞，27℃培养，72小时后收获细胞，PBS洗涤1 次，加入PBS，冰上超声裂解细胞20min，裂解物经12000rpm，4℃，离心15min去除细胞碎片，取上清与佐剂混合制备亚单位疫苗。 

有益效果 

本发明首次提出了用杆状病毒表达系统融合表达PCV2 Cap蛋白与生长抑素SS。 

试验证明，本发明构建的重组杆状病毒对外源蛋白表达稳定，而且其效价稳定。通过小鼠免疫和猪体免疫保护试验证明了表达的重组蛋白能诱导产生了针对PCV2的特异抗体，并可促进增重，在猪体可以提供对PCV2攻毒的保护力，且对人、猪等动物没有致病性，容易通过安全性评价。 

生长抑素(SS)是十四个氨基酸的小肽，与下丘脑生长激素释放因子(GHRF)共同调节生长激素(GH)的释放，已有研究报道证实通过与载体蛋白融合，主动免疫动物，可使机体产生针对SS抗体，中和体内SS，解除SS的抑制作用，促进动物的生长。本研究将SS与PCV2Cap融合在杆状病毒系统中表达，开发一种既可防控PCV2又能促进猪体生长的新型疫苗。因此在PCV2的防治方面具有广阔的应用前景。 

亚单位疫苗含有所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS表达的PCV2Cap-SS融合蛋白BCap-SS，能够发挥Cap蛋白和生长抑素SS的双重功效，用于免疫猪只，既能够防控PCV2又能促进猪体生长。 

附图说明

图1PCV2Cap-生长抑素SS基因克隆入载体示意图。 

图2Cap-SS基因重组质粒pF-Cap-SS酶切鉴定结果； 

1：PCR产物对照2：pF-Cap-SS酶切3：DNA Marker DL-2000。 

图3rBac-Cap-SS质粒的PCR鉴定， 

1：以P1和M13R为引物扩增Bacmid，2，3：以P1和M13R为引物扩增rBac-Cap-SS，4：1Kb DNA ladder Marker，5：以M13F和PCV2SS2为引物扩增Bacmid，6，7：以M13F和PCV2SS2为引物扩增rBac-Cap-SS。 

图4重组病毒产生的细胞病变(CPE)， 

A：正常Sf9细胞B：rAc-Cap-SS感染细胞2：rAc-Cap感染细胞。 

图5重组病毒的IFA鉴定， 

A：rAc-Cap-SS感染的Sf9细胞  B：rAc-Cap感染的Sf9细胞； 

C：野生型杆状病毒感染的Sf9细胞  D：正常Sf9细胞。 

图6重组蛋白表达的Western blot鉴定(A：阳性猪血清；B：SS抗体)； 

1：rAc-Cap-SS感染细胞裂解物  2：rAc-Cap感染细胞裂解物  3：野毒感染细胞裂解物。 

图7透射电镜观察病毒样颗粒的形成(A：BCap蛋白；B：BCap-SS蛋白)。 

图8小鼠免疫抗体变化规律。 

图9小鼠免疫增重情况。 

图10猪体免疫抗体变化规律。 

图11猪体免疫后各组RDWG变化情况。 

图12猪血清SS水平检测结果。 

图13攻毒后猪体病毒血症检测结果。 

图14猪肺脏、淋巴结组织病理学检测。 

图15猪淋巴结IHC检测结果。 

生物材料保藏信息 

融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒rAc-Cap-SS，于2010年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.4459。 

猪圆环病毒2型PCV2-SH毒株，于2008年03月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.2389。 

具体实施方式：

实施例1PCV2CapSS基因的扩增、克隆和鉴定 

1.1PCR引物设计合成 

根据PCV2毒株SH(AY686763)的序列设计扩增Cap蛋白基因特异性引物以及引入SS基因的引物，引物由上海Invitrogen公司合成。引物序列如下： 

P1：5’CTTGGATCCATGACGTATCCAAGGAG-3’(SEQ ID NO.2) 

PCV2SS1：5’-CTTCCAGAAGAAGTTCTTGCAGCCAGCCATCTTAGGGTTAAGTGGG-3’(SEQID NO.3) 

PCV2SS2：5’-ATACTCGAGTTACTAACAGGATGTGAAAGTCTTCCAGAAGAAGTTCTTGC-3’(SEQ ID NO.4) 

1.2PCR扩增目的基因 

采用常规酚氯仿抽提法提取猪圆环病毒2型PCV2-SH毒株(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2008年3月4日，保藏号：CGMCC No.2389)基因组DNA，应用PCR技术分两次扩增得到引入SS基因的ORF2-SS基因片段。第一次PCR以PCV2 SH毒株的基因组DNA为模板，以P1和PCV2SS1为引物；第二次PCR以第一次PCR产物为模板，以P1和PCV2SS2为引物。PCR体系：DNA模板2.0μl，P1 1.0μl，PCV2SS1或PCV2SS2 1.0μl，2.5mM dNTPs 2.0μl，无Mg²⁺缓冲液2.5μl，25mM Mg²⁺1.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用无菌双蒸水补至总体积25.0μl。在PCR仪上进行反应。循环参数为94℃预变性5min；94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35个循环；然后72℃延伸10min。PCR产物进行1％(g/ml)琼脂糖凝胶电泳。 

1.3PCR产物的克隆 

1.3.1PCR产物回收与纯化 

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖胶块，参照DNA快速回收纯化试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)说明书回收目的片段。 

1.3.2PCR产物酶切与纯化 

酶切反应总体积为20.0μl：10×buffer 2.5μl，PCR回收片段10.0μl，BamH I/Xho I各1.0μl，用无菌双蒸水补至总体积20.0μl。37℃作用4.0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。 

1.3.3pFastBac^TM HTB酶切与纯化 

酶切反应总体积为20μl。10×buffer 2.0μl，质粒pFastBac^TMHTB(Invitrogen公司)10.0μl，BamH I/Xho I各1.0μl，用无菌双蒸水补至总体积20.0μl。37℃作用4.0h，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。 

实施例2重组质粒pF-Cap-SS的构建 

2.1目的基因克隆入pFastBac^TMHT B载体 

通过酶切位点BamH I/Xho I，将1.3.2中纯化的PCR产物与1.3.3中纯化的pFastBac^TMHTB线性大片段连接，从而将ORF2-SS基因克隆入供体质粒pFastBac^TMHTB中(示意图见图1)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单个菌落培养，常规的碱裂解法提取质粒。通过PCR和酶切鉴定，阳性质粒进一步经测序鉴定，获得含序列如SEQ ID NO.1所示的ORF2-SS基因的阳性重组质粒pF-Cap-SS。 

2.2重组质粒的提取和鉴定 

提取后的重组质粒pF-Cap-SS采用PCR(P1和PCV2SS2为引物)和BamH I/Xho I双酶切鉴定，结果见图2，在PCR和双酶切鉴定中都可以见到目的条带。 

实施例3重组Bacmid质粒rBac-Cap-SS的获得 

3.1大肠杆菌DH10Bac感受态细菌的制备与转化 

在卡那霉素(50μg/ml)抗性平板上挑取一个新鲜的DH10Bac(Invitrogen)菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的5ml LB培养基中，37℃200rpm过夜振荡培养；第二天按1/100体积接种于一新的含卡那霉素的LB培养基中，振荡培养。取1.5ml菌液制备感受态细胞，方法参见分子克隆。按照Bac-to-Bac表达系统说明书进行重组质粒pF-Cap-SS转化DH10Bac感受态细胞，在DH10Bac中Helper质粒的辅助作用下，重组质粒pF-Cap-SS和杆状病毒骨架载体Bacmid之间发生同源重组得到含ORF2-SS基因的重组Bacmid质粒rBac-Cap-SS，实现了把外源基因转入杆状病毒骨架载体，最终以10^-1、10^-2两个梯度涂板。 

3.2重组细菌的挑选和质粒提取 

经过48h培养，挑取平板上大的白色菌落进行第二次蓝白斑筛选，挑取二次筛选仍为白色的菌落接种于3.0ml含四环素(10μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)、庆大霉素(7μg/ml)的LB培养基中，过夜培养；按照说明书提供的方法提取重组Bacmid质粒rBac-Cap-SS，溶于30μl无菌双蒸水中，然后进行0.8％(g/ml)的琼脂糖凝胶电泳。 

3.3重组质粒的PCR鉴定 

提取的重组质粒rBac-Cap-SS作为模板，以M13F(5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’，SEQID NO.5)、PCV2SS2、P1以及M13R(5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’，SEQ ID NO.6)进行PCR鉴定。25.0μl的反应总体积：质粒0.5μl，上、下游引物各1.0μl，2.5mM dNTPs 2.0μl，25mM Mg²⁺1.5μl，10×Mg²⁺free buffer 2.5μl，Taq酶0.25μl，加水至终体积25.0μl。PCR循环参数参照Bac-to-Bac表达系统说明书进行，扩增出目的条带大小约2500bp和1400bp，结果见图3。 

实施例4重组杆状病毒的获得与鉴定 

4.1重组质粒转染Sf9细胞 

转染在24孔板上进行，在转染的前一天，在24孔板上的每一孔接种5.0×10⁴个Sf9细胞，每一孔用营养液0.5ml，营养液含10％的胎牛血清；在转染前取出-20℃保存的阳离子脂质体转 染试剂TransFast^TM Transfection Reagent(Promega)，使之达到室温并涡漩，如果溶液在管的上部，可以通过离心把它沉到管底；在一个灭菌的EP管中按1μg质粒加入3μL转染试剂的比例加入rBac-Cap-SS和转染试剂共11μL(重组质粒8μL，转染试剂3μL)，然后用无血清的Grace’s培养基补足体积至200μl，室温温育混合物15min；从温箱中取出细胞板，弃去上清；把200μl混合物加入细胞孔。然后立即把细胞板放入温箱中，温育1.0h后，轻轻加入0.5ml室温的完全生长液，把细胞放入温箱，每天观察细胞病变。转染同时设立野生型Bacmid转染对照，以获得野生型杆状病毒。 

4.2重组病毒的获得与增殖 

转染后每天观察细胞病变情况，在转染后3天可以看到细胞出现变大变圆的病变表现(图4)，继续培养至第5天，收获培养上清，2000×g，离心10min，将上清转移至新的灭菌离心管中，此即为第一代病毒(P1 viral stock)。将第一代重组病毒rAc-Cap-SS按1∶10(重组病毒：Sf9)的体积比感染处于对数生长期的Sf9细胞，27℃培养3-4d至细胞出现明显病变时，即可收获上清得到第二代病毒(P2)；用同样的方法获得第三代病毒(P3)，每一代病毒均置4℃避光保存。野生杆状病毒亦用同样方法扩增保存。 

4.3空斑试验测定重组病毒滴度 

按照Bac-to-Bac表达系统说明书的方法进行空斑试验，计算重组病毒的滴度。用营养液将重组病毒作10倍梯度稀释。然后分别接种于长满Sf9细胞单层的24孔细胞培养板，每个稀释度接种2个孔，每孔接种100μL。同时设定不接毒的阴性对照。27℃吸附1h，弃去病毒液，每孔加入配制好的琼脂0.5mL，27℃培养7-10天，中性红染色2h后计算每个稀释度每孔中空斑数量。计算出病毒的滴度可达5×10⁷pfu/mL。 

4.4重组病毒的IFA鉴定 

重组病毒rAc-Cap(本采用引物P1：5′-CTTGGATCCATGACGTATCCAAGGAG-3′(SEQ IDNO.2)和P2：5′-CTTCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGG-3′(SEQ ID NO.8)扩增Cap全基因，克隆入pFast载体，转化DH10Bac获得重组Bacmid，转染Sf9细胞得到)(李文良，王先炜，马涛，李玉峰，姜平.PCV2SH1分离株Cap蛋白在杆状病毒中的表达与鉴定.中国兽医科学(2010)40(11)：1156-1160.)和rAc-Cap-SS感染培养于96孔板的单层Sf9细胞，同时设野生型杆状病毒感染和正常Sf9细胞对照，细胞出现病变后，弃培养上清液，PBS洗涤细胞后用预冷的无水乙醇固定，PBS洗2次，加入1∶100稀释的Cap蛋白单克隆抗体，37℃孵育1h，PBS洗3次，加入1∶200稀释的FITC-羊抗鼠IgG，37℃孵育45min，PBS洗3次，于荧光显微镜下观察，重组病毒感染细胞胞浆内有特异荧光出现，而野生型杆状病毒感染细胞和正常细胞中无特异荧光出 现(图5)。 

4.5Western blot鉴定 

将扩增得到的重组杆状病毒rAc-Cap-SS接种Sf9细胞，同时设立野生型杆状病毒和重组病毒rAc-Cap对照，在感染后72h收取细胞培养物。具体操作为：弃去细胞培养上清，加入预冷的0.01mol/L pH 7.2PBS洗涤细胞两次，加入PBS，在冰上超声裂解细胞，于4℃12000r/min离心15min，吸取上清，加入5×Loading Buffer煮沸处理5min。取15μL样品进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝R-250染色观察。 

Western-blot鉴定采用PCV2阳性猪血清(VMRD，pullman，WA，USA)和商品化兔抗SS多抗(北京博奥森生物公司)进行。SDS-PAGE电泳结束后，采用半干转印的方法将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，10％脱脂乳室温封闭4h，分别加入1∶100稀释的Cap单克隆抗体和1∶200稀释的兔抗SS多抗，室温孵育2.5h，PBST洗涤3次，加入1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG(武汉博士德)，室温孵育1.5h，PBST洗涤3次，加入化学发光显色液，在暗室进行X光片显影，观察特异性蛋白条带，结果见图6，由图5和图6可见重组杆状病毒rAc-Cap-SS能够对目的蛋白Cap和SS进行有效的表达。将该重组杆状病毒rAc-Cap-SS送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，该中心地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏日期2010年12月17日，保藏号CGMCC No.4459。 

4.5病毒样颗粒的形成 

将重组杆状病毒rAc-Cap-SS(CGMCC No.4459)接种Sf9细胞，大量表达重组蛋白BCap-SS，收获细胞裂解后4℃12000r/min离心20min收获上清，上清60000×g，4℃，离心3h，沉淀用PBS重悬，铺于20-60％蔗糖上，100000×g，4℃，离心2h，吸取不同梯度分界面的样品，进行Westernblot鉴定，方法同前，选取蛋白含量最高最纯的样品再次超速离心除去蔗糖，沉淀用PBS重悬，进行电镜观察，检测病毒样颗粒的形成，见图7，结果表明重组蛋白BCap-SS可以形成病毒样颗粒。 

实施例5亚单位疫苗的制备和小鼠免疫试验 

将扩增得到的重组杆状病毒rAc-Cap和rAc-Cap-SS(CGMCC No.4459)接种Sf9细胞，27℃培养72h收取细胞培养物。具体操作为：弃去细胞培养上清，加入预冷的0.01mol/L pH 7.2PBS洗涤细胞两次，加入PBS于冰上裂解细胞20min，再于4℃12000r/min离心15min，吸取上清，分光光度计测定蛋白浓度，-20℃保存备用。 

分别取上一步制备的重组蛋白Bcap(rAc-Cap分泌)，BCap-SS，按终浓度0.5mg/mL分 别加入CP940佐剂，充分混匀，即成亚单位疫苗。 

取90只6周龄健康清洁级小白鼠随机分成3组，每组30只。BCap、BCap-SS、空白对照(NC)各一组，免疫剂量为0.2mL，背部皮下多点注射，免疫2次，间隔时间2周，在1免和2免后2周采集小鼠血清做ELISA试验测定血清抗体水平，结果见图8。由图8可见：一免后2周可以检出相应抗体，BCap、BCapSS免疫组抗体效价在1∶200左右，2免后抗体效价迅速升高平均可达1∶1600，两个免疫组无显著差异，空白对照组一直为阴性。 

首次免疫后第0、14、28、42和56天称量每只小鼠体重，计算每组小鼠增重情况。结果见图9。由图9可见第14天时三组无明显差异，第28天时BCap-SS免疫组增重开始升高，第42天时BCap-SS免疫组增重继续增加，高于其余两组；第56天时，虽然还高于另两组，但已无明显差异，说明BCap-SS免疫后能够在一定时间内促进机体增重。 

实施例6亚单位疫苗的猪体免疫保护试验 

6.1试验设计 

25头28日龄断奶仔猪，经PCR和RT-PCR检测PCV2和PRRSV为阴性，ELISA检测抗体阴性。随机分为5组，每组5头。第一、二组分别接种PCV2亚单位疫苗(BCap和BCap-SS，实施例5制备)，第三组接种PCV2灭活疫苗(iPCV2，江苏南农高科技股份有限公司)，第四、五组不接种分别作为攻毒对照(CC)和空白对照(NC)，一免后14天前三组分别加强免疫，剂量方法同第一次(表1)。 

在第28天每头猪攻毒2mL(PCV2SH，10⁵TCID50/mL，滴鼻2mL，每个鼻孔1mL)，攻毒后第4、7天每头猪腋下和臀部四点注射经弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(1mg/mL)，同时腹腔注射10mL巯基乙酸培养基，第11、19天腹腔注射10mL巯基乙酸培养基。所有猪在攻毒后25天均剖杀，实验设计见表1。 

各组猪隔离饲养，免疫后观察各免疫组有无异常表现(发热、腹泻、精神不好)以及注射部位有无红肿反应。攻毒后，每天上午测量每头猪直肠温度，上下午两次观察有无异常临床表现(精神沉郁、咳嗽、呼吸困难、皮肤被毛、食欲减退)，并进行打分(0-6分)。首免后14天、28天，攻毒后7、11、19和25天分别采血，分离血清，用于抗体水平和病毒血症的检测。 

首免时、首免后14天、28天和剖杀时每头猪分别称重，用于计算相对日增重(RDWG＝(检测时体重-初始体重)/天数/初始体重)。评价免疫后和攻毒前后各组猪体增重差异。剖杀时观察每头猪病变，取淋巴结、肺脏于10％缓冲福尔马林固定，用于组织切片制作和免疫组化实验。 

表1实验设计 

6.2PCV2特异抗体检测 

用纯化的重组Cap蛋白BCap包被酶标板，每孔0.4μg，37℃放置2小时，4℃过夜，PBST洗涤3次；每孔加入200μL 5％脱脂乳，37℃封闭2小时，PBST洗涤3次，拍干。血清样品从1∶50开始进行2倍稀释，37℃作用1.5h，弃去孔中样品，PBST洗涤3次，拍干；每孔加入1∶20000稀释的酶标二抗HRP-SPA(或HRP-羊抗小鼠IgG)，37℃作用1h，弃去孔中样品，PBST洗涤3次，拍干；将TMB显色液A、B液等体积混合，每孔加入100μL，反应10-15min，加入50μL2M H₂SO₄终止反应，在酶标仪上读取OD450值。以P/N＞2.1的血清最大稀释度作为该血清的效价。结果如图10所示，免疫后2周各免疫组血清全部转阳，已有较高水平的抗体产生，加强免疫后至28天抗体水平又有升高，重组蛋白免疫组和灭活病毒免疫组抗体效价分别可达1∶2¹⁰和1∶2¹¹，蛋白免疫组效价略低于灭活疫苗组。 

6.3免疫后体重变化 

首免后第14天和28天称重，计算相对于每头猪增重情况，结果见图11，在14天时BCap-SS组猪体RDWG已高于其他各组，且有3/5高于整体平均值0.0079，其余各组均值差异不大；到28天时，BCap-SS组猪体RDWG进一步增高，达到0.0141，而其余各组均值在0.009左右，BCap-SS组有4/5高于整体均值0.01，BCap、iPCV2组和CC、NC组分别有1/5和2/5高于整体均值。这表明SS的主动免疫可以发挥促生长作用。 

6.4猪血清SS水平检测 

在首免后14天、28天、攻毒后25天采血，分离血清，采用商品化猪生长抑素ELISA试剂盒(上海朗顿生物公司)检测血清中SS水平。按照说明书操作：将标准品稀释成120ng/L、60ng/L、30ng/L、15ng/L、7.5ng/L，同时样品也做2倍稀释；将标准品和样品加入酶标板，37℃作用0.5h；洗涤5次，加入酶标试剂，37℃作用0.5h；洗涤5次，加入显色液显色10min后终止反应，在酶标仪读取OD450值，根据标准曲线计算出每份样品的浓度。结果如图12所示，BCap-SS免疫组SS水平低于其余四组，在2周时差异显著(P＜0.05)，到4周时，差异虽不显著(P＞0.05)，但仍低于其余各组。 

6.5攻毒后临床指标检测 

攻毒后对照组猪体温超过40℃的天数高于免疫组和空白对照组(表2)。从第7天开始，攻毒组猪(4/5)开始表现出精神沉郁，其余免疫组猪均只有1-2头猪在短时间内表现出精神稍差，空白对照组保持正常，临床症状打分结果攻毒组明显高于其余各组(表2)。 

攻毒前后(28天和53天)各组猪称重，计算RDWG，结果为攻毒对照组在攻毒后的25天内RDWG明显低于其余各组(表2)。攻毒对照组全部低于整体均值0.02，而各免疫组和空白对照组均只有1头低于此值。表明三种疫苗免疫均能改善猪体日增重，减轻攻毒的影响。 

表2攻毒后各实验组猪临床检测指标汇总 

(各栏内相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著；RDWG表示攻毒前后计算结果) 

6.6PCV2病毒血症检测 

参照实验室建立的Real-time方法检测病毒血症变化(Feng，Z.，Jiang，P.，Wang，X.，Li，Y.，Jiang，W.，2008，Adenovirus-mediated shRNA interference against porcine circovirus type 2replication both in vitro and in vivo.Antiviral Res 77，186-194.)，结果见图13，由图13可以看出所有猪在攻毒后均产生病毒血症，7天时攻毒组病毒即达较高水平(10e4.6拷贝/0.1mL)，免疫组处于较低水平；至11攻毒组继续升高达到10e5.1拷贝/0.1mL，其余免疫组亦有所上升，但仍明显低于前者，19天时各组均略有下降但攻毒组仍高于免疫组(P＜0.05)。这说明疫苗免疫可以延缓病毒血症产生的时间， 降低病毒血症的强度。 

6.7病理学观察 

6.7.1眼观病变 

在剖检时主要对肺脏和淋巴结病变进行观察，肺脏的实变、水肿、出血等，淋巴结水肿、出血情况，肾脏、脾脏、肝脏等病变情况，逐一记录。结果见表3，除空白对照组，各组均有猪肺脏(2/5)存在不同程度的实变、萎陷和出血点，但攻毒组五头猪均有病变(5/5)，且程度明显比免疫组严重；淋巴结眼观基本正常，仅攻毒组有个别淋巴结出现轻微水肿、出血；肾脏均较正常，未见白色坏死，脾脏肝脏也均正常。 

表3各组猪肺脏和淋巴结眼观病变情况 

注：-表示无病变；+表示轻微病变；++表示中等程度病变；+++表示严重病 

6.7.2组织病理学观察 

取肺脏、淋巴结制作切片进行组织病理学观察。结果表明：攻毒组病变严重者可见明显的间质性肺炎表现，间质增生，肺泡壁增厚，肺泡腔缩小，肺泡腔或器官内有出血和炎性渗出物。免疫组的肺脏则基本正常，个别出现轻度的间质增生，肺泡壁增厚。攻毒组淋巴结出现淋巴细胞缺失，淋巴滤泡边界模糊或消失，其余各免疫组基本正常，无明显差异(图14)。这说明BCap与BCap-SS疫苗免疫均能减轻肺脏、淋巴结组织学病变且与灭活疫苗效果一致。 

6.8免疫组化 

采用PCV2阳性猪血清对所有淋巴结样品中PCV2抗原进行免疫组化检测，置显微镜下观察，发现视野中有多量染色呈棕黄色的阳性细胞即判为阳性。结果表明：攻毒对照组猪淋巴结含有较多棕黄色阳性细胞，3/5猪为PCV2抗原阳性，伴有淋巴细胞缺失、淋巴滤泡受损。其余各组无阳性染色的细胞，基本没有病变或轻微(图15)。 

Claims (9)

1.融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒rAc-Cap-SS，其特征在于该重组杆状病毒带有猪圆环病毒2型Cap蛋白基因开放阅读框和生长抑素基因形成的融合基因ORF2-SS。

2.根据权利要求1所述的融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒rAc-Cap-SS，其特征在于所述的融合基因ORF2-SS序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒rAc-Cap-SS，其特征在于该重组杆状病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年12月17日，保藏号：CGMCC No.4459。

4.权利要求1所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS在制备猪圆环病毒2型疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于重组杆状病毒rAc-Cap-SS为保藏号为CGMCCNo.4459的毒株。

6.一种亚单位疫苗，其特征在于含有权利要求1所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素的融合蛋白BCap-SS和佐剂。

7.根据权利要求6所述的亚单位疫苗，其特征在于所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS为保藏号为CGMCC No.4459的毒株。

8.根据权利要求7所述的亚单位疫苗，其特征在于所述的融合蛋白BCap-SS序列如SEQID NO.7所示。

9.权利要求6所述的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于将重组杆状病毒rAc-Cap-SS接种Sf9细胞，27℃培养，72小时后收获细胞，PBS洗涤，加入PBS，于冰上超声裂解细胞，裂解物经12000rpm，4℃，离心15min，取上清测定蛋白浓度后与佐剂混合制得亚单位疫苗。

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