CN103275937A - 表达 pcv2密码子优化orf1和orf2串联基因的重组病毒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种PCV2密码子优化ORF1和ORF2串联基因的重组病毒，属于生物制药领域。人工合成密码子优化的PCV2ORF1和ORF2基因，命名为YHsfORF1-2。将YHsfORF1-2克隆入杆状病毒表达载体pFastBacHTA中，即获得重组质粒pFBHYHsfORF1-2。而后将重组质粒转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒vFBHYHsfORF1-2。在重组杆状病毒vFBHYHsfORF1-2中，ORF1和ORF2蛋白能够成功的高效表达，并能形成病毒样颗粒。本发明还涉及该重组病毒在疫苗方面的应用，动物试验证明由该重组病毒所制的灭活疫苗，可刺激机体产生高效的免疫应答，对PCV2有较好的免疫保护作用。

Description

表达 PCV2密码子优化ORF1和ORF2串联基因的重组病毒

一、技术领域

本发明涉及一种表达PCV2密码子优化ORF1和ORF2串联基因的重组病毒，属于生物工程领域，具体地说，涉及猪圆环病毒ORF1和ORF2密码子的优化、优化序列重组杆状病毒的获得及其制备的基因工程疫苗，属于基因工程疫苗领域。 

二、背景技术

猪圆环病毒病（PCVD）是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的猪传染性疾病，是猪的重要免疫抑制性疾病之一，该病已给全球养猪业造成了巨大的经济损失。众多学者认为，猪圆环病毒病会引起断奶后仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)及猪皮炎肾病综合征(PDNS)，同时还能引起母猪繁殖障碍、新生仔猪先天性震颤(CT)等疾病，也是猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的原发病原之一。目前，国内外猪场普遍存在PCV2感染，我国自2000年报道PCV2感染的血清学证据以来，流行范围已波及全国，猪群平均阳性率最高高达60%，发病猪死亡率为10%-30%不等，较严重的猪场在爆发本病时死亡率高达40%，危害日益严重。 

目前，如何有效防控PCVD已成为全球养猪业关注的焦点。疫苗预防接种是控制本病的最有效手段，国内外研究者也在猪圆环病毒病疫苗研制方面开展了较多工作。首先是全病毒灭活疫苗，目前国内外都有注册的灭活疫苗，但总体而言，灭活疫苗对机体刺激时间比较短，需多次接种，而且PCV2在细胞上增殖滴度低，其制备费用远远高于其他疾病的灭活疫苗，且无法鉴别疫苗免疫与野毒感染，同时由于PCV2抵抗力强，普通灭活剂很难确保能彻底灭活病毒，存在潜在的生物安全风险；其次是亚单位疫苗，相对于其他疫苗，亚单位疫苗产生抗体更早，抗体水平稳定，能够有效阻止病毒的复制，保护力强，目前国外利用杆状病毒表达的Cap蛋白的亚单位疫苗已有注册，FortM等研究也表明该疫苗使用剂量相对较少，免疫效果好，对欧洲及北美的PCV2控制发挥了巨大作用；再次是减毒活疫苗，FenauxM等学者发现了PCV2的致弱位点，为减毒活疫苗的研制提供了方向，该疫苗虽然能够诱导很好的免疫应答，但长期使用存在反强的危险；另外也有学者对其活载体疫苗、核酸疫苗等进行研究，但都没有获得成品。众多研究表明，PCV2疫苗的研制方向应该是基因工程疫苗，尤其是亚单位疫苗。 

目前国外勃林格殷格翰动物保健公司的PCV2疫苗(CircoFlex)已在我国上市，2010年国内由姜平等和刘长明等研发的猪圆环病毒2型灭活疫苗，圆健-SH株和LG株也相继上市。国外疫苗价格十分昂贵，国内灭活疫苗又基于细胞增殖病毒，因PCV2在细胞上增殖滴度低、生产活疫苗和灭活疫苗费时又费力。因而在PCV2流行逐年上升，流行范围逐步扩大，各成长阶段的猪感染严重、混合感染突出、给全国养猪业造成了巨大损失的情况下，如何研制出一种免疫原性好、可以高效生产、价格合适的新型可商品化基因工程疫苗已成为当务之急。 

PCV2主要编码3个阅读框，ORF1编码与复制相关的蛋白即Rep蛋白；ORF2编码病毒的主要结构蛋白即Cap蛋白，是PCV2的主要免疫原；ORF3编码的蛋白与细胞凋亡有关。目前，由于Cap蛋白是主要的免疫原性蛋白，因而基于Cap蛋白的表达以研制成疫苗的研究成为热点。杆状病毒表达系统以其表达外源性蛋白产量高、抗原性好、产物易纯化等优点，在众多疫病的研究中得到广泛应用。目前研究表明，利用杆状病毒表达Cap蛋白能够自我组装成类病毒粒子，且刘长明、FortM等研究表明，杆状病毒表达Cap蛋白具有很好的免疫原性。Maria Fort等研究显示PCV2的Cap蛋白和Rep蛋白都参与了PCV2感染后所介导的细胞免疫。最近又有研究表明，PCV2ORF2与ORF1串联的核酸疫苗、ORF1-2重组腺病毒免疫效果较单独的ORF1/ORF2核酸疫苗或ORF1、ORF2重组腺病毒显得更为优越。因而本发明，将ORF1和ORF2串联表达，以获得更好的免疫原性。 

目前，我国关于PCV2相关研究的报道，尤其是遗传变异情况的报道不断增多。有报道表明在中国，PCV2a可细分为2A、2D、2E亚型，PCV2b可细分为1A/1B、1C亚型，还可能存在既非PCV2a又非PCV2b的亚型PCV2c；温立斌等利用RFLP分析技术可将我国流行毒株分为9种基因型，即CHN-2A、CHN-2B、CHN-2C、CHN-2D、CHN-2E、CHN-2F、CHN-2G、CHN-2H和CHN-2I。可见我国PCV2存在基因多样性，因而根据单一的PCV2序列设计的疫苗无法对所有PCV2亚型提供很好的交叉保护。因此本研究将已知的PCV2基因进行系统进化树分析，取其一致序列（Consensus sequence），提高其交叉保护性。 

免疫原基因的密码子优化已成为提高疫苗免疫保护效果的有效策略之一。这一策略已经在新城疫病毒、PRRSV、HBV等病毒的疫苗研究中被应用，试验结果表明其密码子优化可显著提高目的基因的表达，增强免疫效果。基于此，本研究将GenBank中所有PCV2序列比对分析，取ORF1和ORF2基因的一致序列，通过人工合成的方法在不改变氨基酸序列的前提下，将密码子改造为昆虫细胞偏嗜的密码子，同时将相对于杆状病毒的稀有密码子进行优化和改造，提高表达效率。并将其作为免疫原基因,插入杆状病毒表达系统，从而快速、大量获得表达产物。研究其免疫保护性，探讨其在抑制病毒和减少病毒血症方面的优势，从而研制出一种安全、高效的猪圆环病毒基因工程疫苗。 

三、发明内容

技术问题 

本发明的目的在于，提供一种通过基因比对的方法获得PCV2 ORF1和ORF2氨基酸一致序列，提高交叉保护性。 

本发明的另一个目的在于提供一种保持氨基酸不变的前提下，将密码子改造为昆虫细胞偏嗜密码子，提高目的基因表达量。进行密码子优化时，优先选择昆虫细胞使用频率最高的密码子。根据具体情况（避免多个重复序列的出现等）作适当调整，若不能使用频率最高的密码子，则选择使用频率次高的密码子；同时将相对于杆状病毒的稀有密码子进行优化和改造。 

本发明还有一个目的在于，提供通过杆状病毒表达系统，高效表达密码子优化的基因。 

本发明还有一个目的在于，提供一种猪圆环病毒基因工程疫苗。 

本发明还有一个目的在于，提供一种猪圆环病毒基因工程疫苗的构建方法。 

本发明在于获得GenBank中PCV2 ORF1和ORF2氨基酸一致序列的方法，对序列进行密码子优化的方法，并通过杆状病毒表达系统表达优化序列，获得重组病毒样颗粒的疫苗。 

技术方案 

本发明包括以下步骤：首先通过PCV2 ORF1和ORF2氨基酸序列进行比对分析，取其一致序列；对一致序列进行密码子优化；人工合成密码子优化序列YHsfORF1-2，并将其作为免疫原基因克隆到HTA载体，构建重组质粒pFBHYHsfORF1-2；然后通过筛选获得阳性克隆并通过测序验证。将重组质粒pFBHYHsfORF1-2转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒vFBHYHsfORF1-2，该重组病毒表达的ORF1-2可形成病毒样颗粒；vFBHYHsfORF1-2经过高密度表达和灭活获得的基因工程疫苗。 

表达2型猪圆环病毒PCV2密码子优化ORF1和ORF2串联基因的重组病毒，其特征在于，是由以下方法构建而成： 

1）密码子优化PCV2 ORF1和ORF2串联基因 

人工合成经密码子优化的PCV2 ORF1和ORF2串联基因，该基因定名为YHsfORF1-2，其序列为SEQ.ID.NO.1，将YHsfORF1-2连入pMD-18T载体，即pMD-18T-YHsfORF1-2，其基因两端可用SpeI和XholI双酶切； 

2）重组质粒pFBHYHsfORF1-2的构建与鉴定 

将pMD-18T-YHsfORF1-2中YHsfORF1-2基因用SpeI和XholI双酶切，克隆到用相同双酶切线性化的pFastBacHTA载体上，得到重组质粒pFBHYHsfORF1-2，根据Invitrogen公司Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书转化含helper质粒与BacmidDNA的大肠埃希菌DH10Bac，制备pFBHYHsfORF1-2BacmidDNA，并用PCR法进行鉴定； 

3）表达2型猪圆环病毒密码子优化ORF1和ORF2串联基因的重组病毒的获得 

根据说明书使用Cellfection转染试剂将鉴定正确的pFBHYHsfORF1-2 Bacmid DNA转染Sf9细胞，获得重组病毒vFBHYHsfORF1-2。 

所述表达2型猪圆环病毒密码子优化ORF1和ORF2串联基因的重组病毒可灭活后直接用于制备疫苗。 

有益效果 

本发明的特点和优点如下： 

1、本发明应用的杆状病毒表达系统以其表达外源性基因产量高、抗原性好、产物易纯化等优点，在众多疫病的研究中得到广泛应用。 

2、本发明应用的免疫原基因的密码子优化已成为提高疫苗免疫保护效果的有效策略之一。ORF1和ORF2一致序列的优化，不仅提高了疫苗的交叉保护性，其可以对免疫后攻毒小鼠提供大于90%的抑毒率（图9），对免疫后攻毒猪体提供5/5的保护，而且表达量提高了约3倍。 

3、本发明应用ORF1和ORF2基因串联表达，具有更好的免疫原性。 

4、利用杆状病毒表达系统构建表达的PCV2 ORF1-2优化基因，可形成病毒样颗粒。 

5、本发明构建的重组病毒样颗粒，具有良好的的免疫原性和保护性。 

6、本发明构建的重组病毒样颗粒疫苗不但安全性高，而且可以有效的预防PCV2感染及由PCV2感染而导致的猪圆环病毒病（PCVD）的发生，是一种新型的安全有效的侯选疫苗。 

四、附图说明

图1：重组质粒pMD-18T-YHsfORF1-2 SpeI/XholI双酶切鉴定图谱 

1：pMD-18T-YHsfORF1-2；2：M2000；3：M15000 

图2：野毒株PCV2ORF2的扩增 

1：M2000；2：PCV2野毒；3：阳性对照；4：阴性对照 

图3：重组质粒pFBHYHsfORF1-2和pFBHsfORF2SpeI/XholI酶切鉴定图谱 

1：pFBHsfORF2;2：pFBHYHsfORF1-2;3：M2000;4：M15000 

图4：正常的Sf9细胞与重组质粒转染后出现CPE的Sf9细胞 

图5：重组杆状病毒vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2的间接免疫荧光图：vFBHYHsfORF1-2（a）、vFBHsfORF2(b)、vHTA(c)和细胞对照(d) 

图6：vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2蛋白的免疫转印鉴定 

1:vFBHYHsfORF1-2;2:vFBHsfORF2;3:vHTA;4:Marker 

图7：vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2病毒样粒子电镜图 

图8：vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2在小鼠体内的ELISA抗体效价 

图9：vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2在小鼠体内的抑毒率 

五、具体实施方式

1、表达外源基因的重组杆状病毒的构建 

1）PCV2 ORF2基因的优化和合成 

通过比对分析GenBank中PCV2的所有序列，取PCV2 ORF1和ORF2表达氨基酸的一致序列，并通过密码子优化将PCV2 ORF1和ORF2基因组改造为昆虫细胞偏嗜密码子，并根据具体情况（GC含量、避免重复序列等）作适当调整，若不能使用频率最高的密码子，则选择使用频率次高的密码子。并对相对于杆状病毒的稀有密码子进行优化和改造。人工合成经密码子优化的PCV2 ORF1和ORF2串联基因，该基因定名为YHsfORF1-2，其序列为（SEQ.ID.NO.1）： 

1    ATGCCCTCAAAGAAGAACGGTAGAAGCGGACCACAGCCACACAAGAGATG 

51   GGTTTTCACACTCAACAACCCCTCAGAAGACGAGCGTAAGAAGATCAGAG 

101  AGTTGCCAATCTCCCTGTTCGACTACTTCATCGTGGGCGAGGAAGGCAAC 

151  GAGGAAGGTCGTACCCCTCACCTCCAGGGCTTCGCCAACTTCGTCAAGAA 

201  GCAAACTTTCAACAAGGTTAAGTGGTACTTCGGCGCCAGGTGCCACATCG 

251  AGAAGGCTAAGGGAACCGACCAGCAAAACAAGGAGTACTGCTCCAAGGAA 

301  GGAAACCTGCTCATCGAATGTGGCGCCCCTAGATCTCAGGGACAACGTTC 

351  AGACTTGTCGACAGCTGTGAGCACCTTGCTGGAGTCTGGTAGCCTGGTGA 

401  CTGTCGCCGAACAGCACCCAGTCACATTCGTTCGCAACTTCAGGGGACTG 

451  GCTGAGCTCTTGAAGGTCTCTGGCAAGATGCAAAAGCGTGACTGGAAGAC 

501  TAACGTTCACGTGATCGTCGGTCCTCCCGGTTGCGGCAAGAGCAAGTGGG 

551  CTGCCAACTTCGCTGACCCCGAAACCACTTACTGGAAGCCACCGCGCAAC 

601  AAGTGGTGGGATGGATACCACGGCGAGGAAGTGGTCGTTATCGACGATTT 

651  CTACGGATGGTTGCCTTGGGACGATCTGCTCCGCTTGTGTGACAGGTACC 

701  CCCTGACCGTGGAGACTAAGGGTGGCACCGTCCCTTTCCTGGCCCGTTCG 

751  ATCCTCATCACTTCCAACCAGACACCACTGGAGTGGTACTCCTCTACTGC 

801  TGTGCCGGCCGTCGAAGCTCTCTACCGTCGCATCACATCATTGGTTTTCT 

851  GGAAGAACGCTACCGAGCAGTCGACTGAGGAAGGAGGTCAATTCGTCACT 

901  CTGTCCCCTCCCTGCCCAGAGTTCCCGTACGAAATCAACTACGGCGGAGG 

951  TGGCTCTGGAGGTGGCGGAAGCATGACCTACCCAAGGAGACGTTACCGCA 

1001 GGAGACGTCACAGGCCGAGATCCCACCTCGGCCAAATCTTGAGAAGGAGA 

1051 CCATGGCTCGTGCACCCTCGTCACCGCTACAGGTGGCGTCGCAAGAACGG 

1101 TATCTTCAACACAAGATTGTCACGTACATTCGGCTACACCATCAAGCGCA 

1151 CAACCGTTAAGACCCCATCGTGGGCCGTGGACATGATGAGGTTCAACATC 

1201 AACGATTTCCTGCCACCGGGTGGCGGAAGCAACCCAAGATCAGTCCCGTT 

1251 CGAGTACTACAGAATCCGTAAGGTTAAGGTGGAATTCTGGCCCTGTTCCC 

1301 CTATCACCCAGGGCGACAGGGGAGTCGGTAGCTCAGCTGTTATCCTGGAC 

1351 GATAACTTCGTGACAAAGGCTACCGCCCTCACTTACGATCCCTACGTCAA 

1401 CTACTCGTCCAGACACACTATCACACAGCCTTTCTCCTACCACTCTCGTT 

1451 ACTTCACCCCCAAGCCTGTGCTGGACTCAACTATCGATTACTTCCAACCT 

1501 AACAACAAGCGCAACCAGTTGTGGCTGAGGCTCCAAACAGCCGGTAACGT 

1551 TGACCACGTGGGCCTCGGAACCGCTTTCGAGAACTCTATCTACGATCAGG 

1601 AATACAACATCCGCGTCACAATGTACGTTCAGTTCAGAGAGTTCAACCTC 

1651 AAGGACCCACCCCTCAACCCCAAG 

蛋白序列（SEQ.ID.NO.2）如下： 

1    MPSKKNGRSGPQPHKRWVFTLNNPSEDERKKIRELPISLFDYFIVGEEGN 

51   EEGRTPHLQGFANFVKKQTFNKVKWYFGARCHIEKAKGTDQQNKEYCSKE 

101  GNLLIECGAPRSQGQRSDLSTAVSTLLESGSLVTVAEQHPVTFVRNFRGL 

151  AELLKVSGKMQKRDWKTNVHVIVGPPGCGKSKWAANFADPETTYWKPPRN 

201  KWWDGYHGEEVVVIDDFYGWLPWDDLLRLCDRYPLTVETKGGTVPFLARS 

251  ILITSNQTPLEWYSSTAVPAVEALYRRITSLVFWKNATEQSTEEGGQFVT 

301  LSPPCPEFPYEINYGGGGSGGGGSMTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRR 

351  PWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTIKRTTVKTPSWAVDMMRFNI 

401  NDFLPPGGGSNPRSVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSAVILD 

451  DNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQP 

501  NNKRNQLWLRLQTAGNVDHVGLGTAFENSIYDQEYNIRVTMYVQFREFNL 

551  KDPPLNPK 

根据HTA载体分析，在优化基因的两端分别加入酶切位点SpeI和XholI，人工合成含有酶切位点的优化基因并克隆入载体pMD-18T（购自Takara公司）（由GenScript公司完成），获得pMD-18T-YHsfORF1-2，测序验证正确。 

2）重组质粒pFBHYHsfORF1-2的构建与鉴定 

利用双酶切位点(SpeI/XholI)将目的片段克隆至载体pFastBacHTA（购自Invitrogen公司，

HT Vector Kit）中；用SpeI/XholI双酶切（图2）及测序分析进行鉴定，将重组质粒命名为pFBHYHsfORF1-2。如图2所示，电泳可见1680的特异性片段，与预期结果一致，证明重组质粒构建成功。 

3）重组质粒pFBHsfORF2的构建与鉴定 

根据GenBank中收录的PCV2 Haian株和HBxz-PCV2a株的基因序列（GenBank accession number：FJ712216和FJ870968），利用Oligo6.0软件设计可以扩增PCV2ORF2全基因的特异性引物，由上海英骏公司合成；以野毒PCV2 Haian株（参见郭容利,何孔旺,钟书霖等.两株猪圆环病毒2型病毒的分离鉴定及其序列分析[J].江苏农业学报.2009.25(5):1063-1067.）DNA作为模板，使用特异性引物扩增出PCV2 ORF2全基因片段并连入pMD-18T载体（购自Takara），酶切鉴定正确并送Invitrogen公司测序验证正确的质粒pMD-18T-WORF2；利用双酶切位点(SpeI/XholI)酶切pMD-18T-WORF2，将目的片段克隆至载体pFastBacHTA（购自Invitrogen公司）中；用SpeI/XholI双酶切（图2）及测序分析进行鉴定，将重组质粒命名为pFBHsfORF2。由酶切结果和测序结果可知，重组质粒pFBHsfORF2构建成功。 

4）重组Bacmid DNA的构建 

将pFBHYHsfORF1-2和pFBHsfORF2质粒转化含helper质粒与BacmidDNA的大肠埃希菌DH10Bac（购自Invitrogen），使发生转座，产生分别含ORF1-2优化基因和野毒ORF2基因的重组Bacmid DNA，涂布于LB选择培养平板（卡那霉素50μg/ml，庆大霉素7μg/ml，四环素10μg/ml，IPTG20μg/ml，X-gal100μg/ml），37℃培养48h后挑选白色单克隆菌落，接种于加入卡那霉素、庆大霉素和四环素的LB培养基，37℃振摇18h之后提取小量Bacmid DNA；重组Bacmid DNA经PCR鉴定正确，冻存-20℃备用。 

5）重组杆状病毒的获得 

根据说明书使用Cellfection转染试剂（购自Invitrogen）将鉴定正确的pFBHYHsfORF1-2和pFBHsfORF2 Bacmid DNA转染Sf9细胞（ATCC），置27℃培养，每日观察细胞病变情况。pFBHYHsfORF1-2和pFBHsfORF2转染后72h，细胞出现明显的CPE，收获细胞上清，分装置无菌冻存管中，置4℃或-70℃保存，并将此病毒感染Sf9细胞进行扩增传代。传代感染细胞在感染后24-48h，观察到细胞变圆，直径增加，细胞核增大、膨胀，细胞折光性下降；72h细胞开始脱落、漂浮（图4）。 

6）病毒样粒子的生物学特征研究 

①间接免疫荧光 

将重组病毒稀释后接种于长满单层的Sf9细胞，27℃培养，约48h，弃去上清，用PBS洗涤一次；冰的无水乙醇4℃固定45min，PBST洗涤3次；加入1:1000稀释的猪抗PCV2的阳性血清（购自VMRD），37℃作用1h，用PBST洗涤3次；加入1：100稀释的FITC标记的羊抗猪二抗（购自博士德公司），37℃作用1h，PBST洗涤3次；显微镜观察（图5）。结果显示，vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2感染的Sf9细胞的胞浆内均可以观察到特异性的绿色荧光，而正常Sf9细胞和接种HTA空载体表达产物的Sf9细胞均未观察到荧光，这也表明无论是野生型ORF2基因或经密码子优化的ORF1-2基因在Sf9细胞中均得到表达。 

②Western blot分析 

将重组病毒感染长满单层的Sf9细胞,同时设定正常Sf9细胞培养物为阴性对照。经过洗涤、裂解后进行常规SDS—PAGE电泳，转印到硝纤膜后，10%脱脂乳封闭过夜；加入PCV2 ORF2的特异性单克隆抗体（参见曹彦琼、王先炜媛等.猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定[J].中国兽医科学.2011.9(41):911-916.）(1∶1000倍稀释)室温作用2h;洗涤3次，加入HRP标记羊抗鼠IgG（购自武汉博士德）(1∶4000倍稀释)，室温作用1.5h；充分洗涤后，加入化学发光法显色液（DAB）（购自武汉博士德）,观察特异性蛋白条带。结果表明，vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2出现与PCV2单克隆抗体特异性结合的条带，分子量分别为61.1KD和28.7KD，而空白细胞和接种HTA空载体表达物的细胞均未出现条带，说明无论是野生型或经密码子优化的ORF2基因在Sf9细胞中均得到表达，且重组蛋白具有免疫学反应性（图6）。通过Bandscan和紫外风光光度计进行目的蛋白含量测定，结果表明vFBHYHsfORF1-2的表达量约是vFBHsfORF2的3倍。 

③病毒样粒子的电镜观察 

收集vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2的病变细胞，用PBS洗两次，1000r/min15min离心，重悬于50mmol/lNaHCO3中，超声波裂解后，24000r/min离心15min，上清液中含有病毒样颗粒。收集的上清中加入PEG-6000至终浓度10%，4℃搅拌过夜进行沉淀，然后10000g/min离心20min，沉淀重悬于PBS中即为病毒样颗粒的浓缩粗提物。在重悬液中加入1：100稀释的PCV2ORF2的特异性单克隆抗体（参见曹彦琼、王先炜媛等.猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定[J].中国兽医科学.2011.9(41):911-916.）37℃作用1h后再4℃过夜，以12000r/min离心90min，收集沉淀即为纯化的病毒样颗粒。取沉淀重悬于少量ddH₂O中，用3%的磷钨酸负染后经透射电镜观察。如图7所示，vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2均可见17nm左右的病毒样颗粒，这也进一步表明密码子优化和ORF1与ORF2的串联并没有影响其生物学特性。 

7）小鼠免疫保护实验 

4周龄的BALB/C小鼠20只，随机分为4组，每组5只。第一组免疫灭活的vFBHYHsfORF1-2，第2组免疫灭活的vFBHsfORF2，第3组免疫HTA空载体表达产物，第4组注射细胞培养基作为空白对照组，各组均加入等体积弗氏不完全佐剂乳化，腹腔注射200μL/只，免疫前和免疫后1、2和3周尾静脉采血，分离血清用原核表达纯化的PCV2 Cap蛋白包被酶标板检测BALB/C小鼠血清中的PCV2抗体水平。具体ELISA方法如下：由ELISA方阵试验可以得出，当抗原包被浓度为2.5μg/mL，抗体稀释100倍，一抗37℃分别孵育1.0h，酶标二抗37℃孵育45min，加TMB-H₂O₂（四甲基联苯胺-过氧化氢）（购自英创生物科技有限公司）溶液显色，37℃反应10-15min。加2MH₂SO₄溶液，终止反应，50μL/孔。反应条件比较合适，此时P/N值较大，且阴性血清的OD值较小，即非特异性比较小。结果判定：P-N>0.15时实验有效。(样品OD值-N)/(P-N)≥0.45阳性；(样品OD值-N)/(P-N)<0.45阴性。其中P表示：阳性对照平均值；N表示：阴性对照平均值。结果可见，vFBHYHsfORF1-2和 vFBHsfORF2免疫后7天，几乎所有小鼠均产生了针对PCV2的IgG特异性抗体，免疫后1-3周抗体水平呈上升趋势，而免疫HTA空载体表达产物组以及空白对照组不产生抗体，这也说明vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2可以刺激小鼠产生特异性抗体，且vFBHYHsfORF1-2诱导产生的抗体值显著高于vFBHsfORF2，免疫效果较好。 

所有上述3组于免疫后第21天每只腹腔注射0.2ml的PCV2 2010AHCY（参见王小敏，张文文，何孔旺等.2009-2010年华东地区猪圆环病毒2型的基因型分析[J].江苏农业学报.2011.27(5):1037-1042.）（10⁵TCID50）进行攻毒，攻毒后1、2、3和4周尾静脉采血，利用Real-time PCR方法检测血清样品中的PCV2病毒拷贝数，根据公式【（攻毒对照组病毒平均拷贝数-免疫组病毒平均拷贝数）/攻毒对照组病毒平均拷贝数】X100%，计算灭活的重组病毒vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2所制疫苗对病毒复制产生的抑制率。如图9所示，定量检测结果表明，免疫vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2的小鼠攻毒后血清样品中的PCV2病毒拷贝数与只免疫空载体HTA表达物和空白对照组经t检验差异显著，重组病毒vFBHYHsfORF1-2对病毒复制的抑制率最佳，达到90%以上，显著优于vFBHsfORF2组。 

8）猪体免疫保护试验 

选取3周龄未注射疫苗、PCV2抗体和PRRSV抗体（抗体检测试剂盒分别购自韩国金诺和IDEXX公司）及PCR检测阴性猪，随机分组，每组5头，设立1）vFBHYHsfORF1-2组；2）vFBHsfORF2组；3）安慰剂对照组（生理盐水）；4）阴性对照组。1）和2）组颈部肌肉注射免疫接种1ml灭活病毒与1313水质佐剂（购自SEPPIC）所制疫苗，21天后1）、2）和3）组以肌注法和滴鼻法人工感染PCV2强毒。攻毒前3天和攻毒后第4日，所有试验组在猪腋下及臀部注射免疫刺激剂KLH（购自Sigma公司）。综合临床、病理、病毒载量、病毒血症持续时间、免疫及生产性能指标等判定疫苗的免疫效果。 

①免疫后猪体情况 

2组疫苗接种仔猪精神状况良好、采食和排便正常，接种部位也未见红肿、硬块等不良反应。 

②攻毒后临床观察 

攻毒后安慰剂对照组5头猪均出现食欲减退、精神萎靡和贫血，且3/5出现体温≥40℃持续5-6日现象，2/5出现体温≥40℃持续3日现象。而免疫猪和阴性对照组在整个观察期内，精神和食欲都很良好，无异常临床反应，只有vFBHsfORF2免疫组1/5出现体温≥40℃1日现象。 

③PCV2抗体效价： 

免疫后7、14和21日采集所有试验猪血清，检测PCV2抗体效价（抗体检测试剂盒购自韩国金诺），结果表明免疫后7日只有vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2组部分猪抗体转阳，14日和21日免疫组均能测出PCV2抗体，且vFBHYHsfORF1-2免疫组的效价最高，其14日和21日抗体平均值分别为1：280和1：880。 

表1：vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2在猪体内的ELISA抗体效价 

④攻毒后PCV2病毒血症的动态变化 

攻毒后7、14、21日采集的猪血清检测PCV2病毒血症的发生情况。安慰剂组出现PCV2病毒血症，7、14、21日都可以检测到PCV2；免疫组只有vFBHsfORF2组有1头猪在攻毒后7天可检测到PCV2；其他猪为阴性。结果表明，免疫组产生的抗体可以降低病毒血症的发生，且vFBHYHsfORF1-2免疫组降低病毒血症发生的效果最好，5头猪在不同的时间点PCV2检测都为阴性。 

⑤病理检查和免疫组化 

安慰剂（生理盐水）对照组在攻毒后4/5猪肾脏表面发黄甚至有坏死点，5/5出现淋巴组织不同程度的水肿；vFBHsfORF2免疫猪1/5出现淋巴结水肿；vFBHsfORF2免疫猪1/5出现轻微淋巴结水肿；而免疫组vFBHYHsfORF1-2免疫猪未出现病变。免疫组化结果表明安慰剂对照组均可以检测出，vFBHsfORF2免疫猪1/5可以检出；而免疫组vFBHYHsfORF1-2免疫猪均未检出。 

综上所述，免疫组vFBHsfORF2免疫猪1/5出现体温≥40℃1日现象，其他免疫猪在整个观察期内精神状态和食欲都良好、无异常临床反应。抗体水平、病毒血症和病理变化等情况结果表明，相对于vFBHYHsfORF2免疫组而言，vFBHYHsfORF1-2免疫组PCV2抗体平均滴度最高、降低病毒血症出现的效果最佳、且攻毒后5/5全部保护，未观察到任何特异性临床表现和病理变化,免疫组化检测结果亦全部为阴性。 

本发明成功构建了表达密码子优化的PCV2ORF1和ORF2的重组杆状病毒，通过免疫荧光和 Western blot试验验证了其高效表达，且表达的重组蛋白具有生物学活性，可以与PCV2的阳性血清和PCV2 ORF2特异性单克隆抗体发生特异性反应。电镜观察进一步证明重组杆状病毒表达的密码子优化的ORF1-2和未优化的野毒ORF2类似，都可以形成17nm左右的病毒样颗粒，说明密码子优化和蛋白串联并未改变其生物学活性。小鼠免疫保护试验和猪体免疫保护试验结果表明，重组病毒vFBHYHsfORF1-2和vFBHsfORF2对小鼠体内和猪体内的PCV2复制具有很好的抑制作用，且vFBHYHsfORF1-2对PCV2病毒的抑制效果和免疫保护作用要优于vFBHsfORF2。这也表明本发明构建的重组疫苗不但安全性高而且可以有效的预防PCV2感染，是一种新型的安全有效的候选疫苗。 

SEQUENCE LISTING<110>  江苏省农业科学院<120>  表达 PCV2密码子优化ORF1和ORF2串联基因的重组病毒<130>  0<160>  2     <170>  PatentIn version 3.1<210>  1<211>  1674<212>  DNA<213>  人工<220><221>  YHsfORF1-2基因<222>  (1)..(1674)<223> 

 

<400>  1

atgccctcaa agaagaacgg tagaagcgga ccacagccac acaagagatg ggttttcaca     60

 

ctcaacaacc cctcagaaga cgagcgtaag aagatcagag agttgccaat ctccctgttc    120

 

gactacttca tcgtgggcga ggaaggcaac gaggaaggtc gtacccctca cctccagggc    180

 

ttcgccaact tcgtcaagaa gcaaactttc aacaaggtta agtggtactt cggcgccagg    240

 

tgccacatcg agaaggctaa gggaaccgac cagcaaaaca aggagtactg ctccaaggaa    300

 

ggaaacctgc tcatcgaatg tggcgcccct agatctcagg gacaacgttc agacttgtcg    360

 

acagctgtga gcaccttgct ggagtctggt agcctggtga ctgtcgccga acagcaccca    420

 

gtcacattcg ttcgcaactt caggggactg gctgagctct tgaaggtctc tggcaagatg    480

 

caaaagcgtg actggaagac taacgttcac gtgatcgtcg gtcctcccgg ttgcggcaag    540

 

agcaagtggg ctgccaactt cgctgacccc gaaaccactt actggaagcc accgcgcaac    600

 

aagtggtggg atggatacca cggcgaggaa gtggtcgtta tcgacgattt ctacggatgg    660

 

ttgccttggg acgatctgct ccgcttgtgt gacaggtacc ccctgaccgt ggagactaag    720

 

ggtggcaccg tccctttcct ggcccgttcg atcctcatca cttccaacca gacaccactg    780

 

gagtggtact cctctactgc tgtgccggcc gtcgaagctc tctaccgtcg catcacatca    840

 

ttggttttct ggaagaacgc taccgagcag tcgactgagg aaggaggtca attcgtcact    900

 

ctgtcccctc cctgcccaga gttcccgtac gaaatcaact acggcggagg tggctctgga    960

 

ggtggcggaa gcatgaccta cccaaggaga cgttaccgca ggagacgtca caggccgaga   1020

 

tcccacctcg gccaaatctt gagaaggaga ccatggctcg tgcaccctcg tcaccgctac   1080

 

aggtggcgtc gcaagaacgg tatcttcaac acaagattgt cacgtacatt cggctacacc   1140

 

atcaagcgca caaccgttaa gaccccatcg tgggccgtgg acatgatgag gttcaacatc   1200

 

aacgatttcc tgccaccggg tggcggaagc aacccaagat cagtcccgtt cgagtactac   1260

 

agaatccgta aggttaaggt ggaattctgg ccctgttccc ctatcaccca gggcgacagg   1320

 

ggagtcggta gctcagctgt tatcctggac gataacttcg tgacaaaggc taccgccctc   1380

 

acttacgatc cctacgtcaa ctactcgtcc agacacacta tcacacagcc tttctcctac   1440

 

cactctcgtt acttcacccc caagcctgtg ctggactcaa ctatcgatta cttccaacct   1500

 

aacaacaagc gcaaccagtt gtggctgagg ctccaaacag ccggtaacgt tgaccacgtg   1560

 

ggcctcggaa ccgctttcga gaactctatc tacgatcagg aatacaacat ccgcgtcaca   1620

 

atgtacgttc agttcagaga gttcaacctc aaggacccac ccctcaaccc caag         1674

 

 

<210>  2<211>  558<212>  PRT<213>  人工<220><221>  YHsfORF1-2基因蛋白氨基酸序列<222>  (1)..(558)<223> 

 

<400>  2

 

Met Pro Ser Lys Lys Asn Gly Arg Ser Gly Pro Gln Pro His Lys Arg

1               5                   10                  15     

 

 

Trp Val Phe Thr Leu Asn Asn Pro Ser Glu Asp Glu Arg Lys Lys Ile

            20                  25                  30         

 

 

Arg Glu Leu Pro Ile Ser Leu Phe Asp Tyr Phe Ile Val Gly Glu Glu

        35                  40                  45             

 

 

Gly Asn Glu Glu Gly Arg Thr Pro His Leu Gln Gly Phe Ala Asn Phe

    50                  55                  60                 

 

 

Val Lys Lys Gln Thr Phe Asn Lys Val Lys Trp Tyr Phe Gly Ala Arg

65                  70                  75                  80 

 

 

Cys His Ile Glu Lys Ala Lys Gly Thr Asp Gln Gln Asn Lys Glu Tyr

                85                  90                  95     

 

 

Cys Ser Lys Glu Gly Asn Leu Leu Ile Glu Cys Gly Ala Pro Arg Ser

            100                 105                 110        

 

 

Gln Gly Gln Arg Ser Asp Leu Ser Thr Ala Val Ser Thr Leu Leu Glu

        115                 120                 125            

 

 

Ser Gly Ser Leu Val Thr Val Ala Glu Gln His Pro Val Thr Phe Val

    130                 135                 140                

 

 

Arg Asn Phe Arg Gly Leu Ala Glu Leu Leu Lys Val Ser Gly Lys Met

145                 150                 155                 160

 

 

Gln Lys Arg Asp Trp Lys Thr Asn Val His Val Ile Val Gly Pro Pro

                165                 170                 175    

 

 

Gly Cys Gly Lys Ser Lys Trp Ala Ala Asn Phe Ala Asp Pro Glu Thr

            180                 185                 190        

 

 

Thr Tyr Trp Lys Pro Pro Arg Asn Lys Trp Trp Asp Gly Tyr His Gly

        195                 200                 205             

 

 

Glu Glu Val Val Val Ile Asp Asp Phe Tyr Gly Trp Leu Pro Trp Asp

    210                 215                 220                

 

 

Asp Leu Leu Arg Leu Cys Asp Arg Tyr Pro Leu Thr Val Glu Thr Lys

225                 230                 235                 240

 

 

Gly Gly Thr Val Pro Phe Leu Ala Arg Ser Ile Leu Ile Thr Ser Asn

                245                 250                 255    

 

 

Gln Thr Pro Leu Glu Trp Tyr Ser Ser Thr Ala Val Pro Ala Val Glu

            260                 265                 270        

 

 

Ala Leu Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Leu Val Phe Trp Lys Asn Ala Thr

        275                 280                 285            

 

 

Glu Gln Ser Thr Glu Glu Gly Gly Gln Phe Val Thr Leu Ser Pro Pro

    290                 295                 300                

 

 

Cys Pro Glu Phe Pro Tyr Glu Ile Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly

305                 310                 315                 320

 

 

Gly Gly Gly Ser Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg

                325                 330                 335    

 

 

His Arg Pro Arg Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp

            340                 345                 350        

 

 

Leu Val His Pro Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile

        355                 360                 365            

 

 

Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr

    370                 375                 380                

 

 

Thr Val Lys Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile

385                 390                 395                 400

 

 

Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro

                405                 410                 415    

 

 

Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys

            420                 425                 430        

 

 

Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile

        435                 440                 445            

 

 

Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro

    450                 455                 460                

 

 

Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr

465                 470                 475                 480

 

 

His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp

                485                 490                 495    

 

 

Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln

            500                 505                 510        

 

 

Thr Ala Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn

        515                 520                 525            

 

 

Ser Ile Tyr Asp Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln

    530                 535                 540                 

 

 

Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

545                 550                 555            

 

Claims (2)

1.表达2型猪圆环病毒（PCV2）密码子优化ORF1和ORF2串联基因的重组病毒，其特征在于，是由以下方法构建而成：

1） 密码子优化PCV2 ORF1和ORF2基因

人工合成经密码子优化的PCV2 ORF1和ORF2基因，该基因定名为YHsfORF1-2，其序列为SEQ.ID.NO.1，将YHsfORF1-2连入pMD-18T载体，获得pMD-18T- YHsfORF1-2；

2） 重组质粒pFBHYHsfORF1-2的构建与鉴定

将pMD-18T-YHsfORF1-2中YHsfORF1-2基因用SpeI和XholI双酶切，克隆到用相同双酶切线性化的pFastBacHTA载体上，得到重组质粒pFBHYHsfORF1-2，转化含helper质粒与Bacmid DNA的大肠埃希菌DH10Bac，制备pFBHYHsfORF1-2 Bacmid DNA，并用PCR法进行鉴定；

3） 表达2型猪圆环病毒密码子优化ORF1和ORF2串联基因的重组病毒的获得

将pFBHYHsfORF1-2 Bacmid DNA转染Sf9细胞，获得重组病毒vFBHYHsfORF1-2。

2.用权利要求1所述表达2型猪圆环病毒密码子优化ORF1和ORF2串联基因的重组病毒制备的疫苗。

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