CN103614387B - 优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因及其重组质粒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因及其重组质粒和应用。优化的编码PCV2Cap蛋白的基因，序列如SEQ？ID？NO.1、SEQ？ID？NO.2或SEQ？ID？NO.3所示。所述的重组质粒，为含有本发明所述基因的pVAX1载体。Western？Blot试验结果证明这些重组在体外能够有效进行表达，并具有较好的免疫原性。动物免疫实验表明Cap蛋白改造后的重组质粒DNA能够有效诱导小鼠和猪体产生细胞和体液免疫应答，为PCV2基因疫苗的研究方面具有良好的应用前景。

Description

优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因及其重组质粒和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因及其重组质粒和应用。

背景技术

猪圆环病毒2型（Porcinecircovirus2,PCV2）属于圆环病毒科圆环病毒属成员，可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）和猪皮炎肾病综合征（PDNS）等多种疾病，临床上表现进行性消瘦、皮肤苍白等特点。该病毒无囊膜，基因组为一条长约1.76kb的共价闭合环状单链DNA。PCV2基因组含有3个主要的开放阅读框，即ORF1，ORF2和ORF3。PCV2ORF2由702或705个碱基组成，编码233或234个氨基酸，构成病毒的衣壳蛋白（Cap），是主要的免疫原性蛋白。围绕Cap蛋白构建基因工程核酸疫苗已逐渐成为研究热点。核酸疫苗以其构建容易、成本低廉、稳定性高和安全性好等优点，成为国际疫苗研究领域最热门的课题之一。

虽然应用天然PCV2ORF2构建DNA疫苗具有一定的可行性，但天然ORF2在真核表达系统的表达量非常低，严重影响了DNA疫苗的免疫效果。有研究报道，将PCV2ORF2密码子偏嗜性改为哺乳动物猪属可明显提高其在真核系统中的表达量。本研究通过修饰PCV2ORF2基因，并采用KOZAK序列和FMDV2A基因蛋白设计新的Cap序列，进一步提高了基因疫苗免疫的效果。

核酸疫苗在疫病防制中具备了许多优点，但使用普通方法免疫进入机体细胞的效率较低，沙门氏菌属于肠杆菌科，是一组胞内侵袭性致病菌，故能有效递呈抗原，激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液免疫反应与细胞免疫反应，并能同时诱导黏膜免疫与全身免疫。近年来，通过减毒沙门氏菌运送DNA疫苗，被认为是一种很有前途的方法。

分子克隆技术，基因合成及PCR扩增获得优化处理后的基因克隆至pVAX1载体，构建重组质粒后经转染、westernblot鉴定重组蛋白表达情况。

动物免疫试验，以重组质粒免疫小鼠后测定抗体和淋巴细胞增殖指数，筛选出最佳改造基因，将最佳改造基因转入减毒沙门氏菌进行猪体免疫实验和攻毒保护实验，证明改造后的基因具有很好的免疫原性和免疫保护性。

发明内容

本发明的目的是证明以改造后的Cap蛋白基因为基础构建的基因疫苗在动物体内的免疫特性。

本发明的另一个目的是初步验证核酸疫苗能否用于PCV2的防控。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

优化的编码PCV2Cap蛋白的基因，序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。其中SEQIDNO.1为根据哺乳动物偏嗜性，对天然的PCV2ORF2基因密码子进行优化，改成猪偏嗜的基因，并添加KOZAK序列，命名为SynCap；SEQIDNO.2为在SEQIDNO.1的基础上将PCV2ORF2基因起始密码子ATG后的第一个碱基C突变成G，命名为SynCap（m）；SEQIDNO.3为通过2A蛋白编码序列连接两个SynCap（m）基因所得，命名为SynCap-2A-SynCap。

所述的优化的编码PCV2Cap蛋白的基因，优选序列如SEQIDNO.2所示。

含有所述的优化的编码PCV2Cap蛋白的基因的重组质粒。

所述的重组质粒，优选为含有本发明所述基因的pVAX1载体，进一步优选含有SynCap或SynCap（m）基因的pVAX1载体。

含有本发明所述重组质粒的减毒沙门氏菌，优选含有pVAX-SynCap（m）的减毒沙门氏菌。

本发明所述的基因在制备抗猪圆环病毒2型药物或疫苗中的应用。

本发明所述的重组质粒在制备抗猪圆环病毒2型药物或疫苗中的应用。

本发明所述的减毒沙门氏菌在制备抗猪圆环病毒2型药物或疫苗中的应用。

有益效果

本发明根据PCV2Cap蛋白序列按照猪源密码子偏嗜性进行优化处理，并在此基础上做了一系列的改造优化。利用真核表达载体pVAX1构建重组真核质粒pVAX-SynCap、pVAX-SynCap（m）和pVAX-SynCap-2A-SynCap。WesternBlot试验结果证明优化后的Cap蛋白能够在体外表达。小鼠和猪体免疫实验证明构建的重组质粒和携带重组质粒的减毒沙门氏菌能够有效地诱导机体的免疫应答，同时对PCV2攻毒具有很好的免疫保护作用。证明所构建的圆环病毒核酸疫苗具有一定的应用和开发价值。

本发明构建重组真核质粒pVAX-SynCap、pVAX-SynCap（m）和pVAX-SynCap-2A-SynCap，WesternBlot试验结果证明这些重组在体外能够有效进行表达，并具有较好的免疫原性。首免后6周pVAX-SynCap（m）和pVAX-SynCap组可检测到ELISA抗体，首免后9周pVAX-SynCap（m）组ELISA抗体达到1:4000，pVAX-SynCap组抗体水平为1:1500。首免后9周，各组刺激孔的细胞上清中均可检测到细胞因子分泌，其中，pVAX-SynCap（m）免疫组产生的IL-4及IFN-γ细胞因子应答高于其他各免疫组（P<0.05），其次为pVAX-SynCap及pVAX-SynCap-2A-SynCap免疫组，pVAX-Cap免疫组中IL-4及IFN-γ的分泌量较低，阴性对照组和pVAX1免疫组的最低。

基于以上研究成果，可见Cap蛋白改造后的重组质粒DNA能够有效诱导小鼠和猪体产生细胞和体液免疫应答，为PCV2基因疫苗的研究方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1Cap蛋白改造方案

SynCap：Cap蛋白全基因序列按猪源密码子偏嗜性进行改造；

SynCap（m）：突变一个碱基的Cap蛋白全基因合成；

SynCap-2A-SynCap：将两个合成的的Cap蛋白基因通过口蹄疫2A基因进行串联；

图2重组真核质粒的双酶切鉴定

M：DNALadderDL5000；1：pVAX1的XhoI和BamHI的双酶切；2：pVAX-Cap的XhoI和BamHI的双酶切；3：pVAX-SynCap的XhoI和BamHI的双酶切；4：pVAX-SynCap（m）的XhoI和BamHI的双酶切；5：pVAX-SynCap-2A-Cap的XhoI和BamHI的双酶切。

图3重组真核质粒转染后的Western-blot鉴定

1：pVAX-SynCap；2：pVAX-SynCap（m）；3：pVAX-Cap；4：pVAX-SynCap-2A-Cap；5：pVAX1.

图4重组质粒免疫小鼠后的体液免疫应答（a）ELISA抗体应答；（b）中和抗体应答

在不同时间点收集血清样品（n=5）和应用间接ELISA检测血清抗体（a）和中和抗体（b）.

中和抗体的滴度应用血清平均稀释度的倒数表示，数据用平均值±S.D来表示。

图5重组真核质粒免疫小鼠后的细胞免疫应答

首免42天和63天收集脾脏细胞样品（n=5），然后应用纯化的PCV2SH毒株进行刺激，每组设定3个重复。刺激72小时后，应用传统的MTT法测定增殖应答。数据用平均值±S.D来表示。

图6重组真核质粒免疫小鼠后的细胞因子应答

首免42天和63天收集脾脏细胞样品（n=5），然后应用纯化的PCV2SH毒株进行刺激，每组设定3个重复。刺激72小时后，收集细胞上清测定上清中细胞因子的含量。数据用平均值±S.D来表示。

图7携带沙门氏菌的重组质粒免疫猪攻毒后病毒血症状态

图8淋巴组织中病毒含量的检测

图9组织病理变化情况

攻毒28天后，对动物进行扑杀，固定组织制备病理组织切片，SynCap（m）（a）,pVAX-SynCap（m）（b）,pVAX1（c）,SL3263（d）和阳性对照（e）（HEstaining,400×.）

生物材料保藏信息

PCV2SH毒株，分类命名为猪圆环病毒2型，于2008年3月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.2389。

具体实施方式：

实施列1Cap基因人工改造的设计、扩增和获得

为了提高Cap蛋白免疫特性，本研究对PCV2ORF2基因进行了修饰，包括（1）根据哺乳动物密码子偏嗜性，对天然的Cap基因密码子进行优化，改成哺乳动物猪偏嗜的基因，并添加KOZAK序列，命名为SynCap，序列如SEQIDNO.1所示；（2）在优化方案（1）的基础上将PCV2ORF2基因起始密码子ATG后的第一个碱基C突变成G，命名为SynCap（m），序列如SEQIDNO.2所示；（3）通过2A蛋白连接两个SynCap（m）基因，命名为SynCap-2A-SynCap，序列如SEQIDNO.3所示。SynCap基因通过化学合成获得。合成的基因序列两端带有BamHI和XhoI酶切位点。

根据PCV2ORF2基因序列设计合成一对特异性引物，以本实验室构建的pMD18T-Cap为模板，扩增Cap基因，序列如SEQIDNO.4所示。

上游引物PCV2-Cap.15’-ATTAGGATCCGCCACCATGACGT-3’(SEQIDNO.5)

下游引物PCV2-Cap.25’-GCGCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTG-3’(SEQIDNO.6)，上下游引物分别含有BamHI和XhoI酶切位点。

取模板pMD18T-Cap0.5μL，加入PCR混合液24.5μL（2.5μL10×buffer、2μLdNTP（2.5mM）、1.5μLMg²⁺（25mM）、两条引物各1μL（20pM）、0.2μLTaq酶（2.5U）、灭菌双蒸水16.3μL）。反应循环参数：94℃预变性10min；94℃变性45s；58℃退火30s；72℃延伸30s，共进行35个循环；然后72℃延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。

其余衍生序列SynCap（m）、SynCap-2A-SynCap以合成的SynCap为模板经PCR及分子克隆获得。

用于扩增SynCap的引物见表1。

表1不同Cap蛋白基因扩增所需的引物

实施列2Cap蛋白基因改造后重组质粒构建

1.PCR产物及pVAX1的酶切与回收

将回收纯化的Cap、SynCap、SynCap（m）、SynCap-2A-SynCap基因及pVAX1分别用限制性内切酶BamHI和XhoI进行双酶切处理，酶切反应条件为37℃水浴4h，使用DNA胶回收试剂盒将PCR产物与真核质粒pVAX1酶切产物回收纯化。

2.目的基因克隆入pVAX1载体

通过BamHI和XhoI酶切位点，将Cap、SynCap、SynCap（m）、SynCap-2A-SynCap基因分别克隆入空载体pVAX1中。16℃过夜连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布含有卡那青霉素的LB平板培养，挑取单个菌落培养，常规的碱裂解法提取疑似重组质粒。

3.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与转化

感受态大肠杆菌DH5α的制备：取冻存的DH5α菌种划线接种于不含有抗生素的LB平板上，同时划线于含有抗性的培养基上作对照，37℃培养过夜。次日挑取单个菌落接种于3mLLB液体培养基中，37℃200rpm振摇培养过夜。取10μL菌液接种于新的3mLLB液体培养基中，37℃振摇培养约2h至OD600达0.3-0.4。于无菌条件下将培养物倒入冰预冷的无菌Eppendorf管中，4℃12000rpm离心30s，弃掉上清并倒置控干。用800μl冰预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液重悬细菌沉淀，冰浴放置30分钟，4℃12000rpm离心30s，弃上清，倒置控干，最后以100μL冰预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液轻轻地重悬细菌沉淀，4℃保存备用。

连接产物的转化：取连接产物10μL加入到100μL的感受态大肠杆菌DH5α中，拇指轻弹混匀后冰浴30min；将Eppendorf管置42℃水浴中热激90s，然后迅速冰浴2min；加入37℃预热的800μLLB液体培养基，37℃200rpm振摇培养45min；12000rpm离心30s后弃去大部分上清，剩余30μL上清重悬细菌沉淀，涂布于含50μg/mL卡那青霉素的抗性平板上，37℃温箱中培养16-24h。

4.重组质粒的小量提取

挑取连接产物转化后所涂布卡那青霉素抗性平板上的单个菌落，接种于3mL的含50μg/mL卡那青霉素的LB培养基中，37℃200rpm过夜振荡培养。取1.5mL菌液，12000rpm离心30s，沉淀菌体；完全弃去上清后加入300μL4℃预冷的溶液I（50mM葡萄糖；25mMTris-Cl，Ph8.0；10mMEDTA）重悬细菌；加入新配制的溶液II300μL（0.2MNaOH；1%SDS），轻轻颠倒离心管数次，至菌液变清澈，之后将离心管置于冰上；加入225μL用冰预冷的溶液III（5M乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL），轻轻颠倒数次至蛋白变性成白色团块，置冰上3-5min；4℃12000rpm离心10min，将上清移至新的离心管中；加入等体积的酚∶氯仿，颠倒混匀后室温静置5min，12000rpm离心5min；取上清到新的离心管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min；12000rpm离心l5min，弃上清，用70%乙醇洗涤一次，室温自然干燥，加入20μL的双蒸水溶解；加入0.5μLRNaseA（10mg/mL），37℃作用30min（此步可在酚∶氯仿抽提之前完成）；1%的琼脂糖凝胶电泳分析。

5.重组质粒的酶切鉴定及序列分析

抽提疑似重组质粒经PCR及双酶切鉴定（图2）后，将含有阳性质粒的菌液送由Invitrogen公司进行测序鉴定。最后将正确的阳性重组质粒pVAX-Cap、pVAX-SynCap、pVAX-SynCap（m）和pVAX-SynCap-2A-SynCap用于后续试验。

实施例3重组质粒的体外表达与鉴定

1.质粒的纯化

方法参照Promega公司质粒小量纯化试剂盒说明书。具体操作如下：分别挑取含重组真核质粒pVAX-Cap、pVAX-SynCap、pVAX-SynCap（m）和pVAX-SynCap-2A-SynCap的DH5α单菌落，接种于3.0mL的含50μg/mL卡那青霉素的LB培养基中，200rpm过夜振荡培养。分别取5×1.5mL菌液，12000rpm离心30s，沉淀菌体；完全弃去上清后加入250μL4℃预冷的溶液I（20μg/mLRNaseA）重悬细菌；加入250μL溶液II，轻轻颠倒离心管多次裂解完全，将离心管置于冰上（不超过5min）；加入350μL的溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和颠倒至蛋白变性成白色团块，置冰上3-5min；4℃12000rpm离心10min；将上清转移至吸附柱中，10000rpm离心1min；将滤液重复过柱一次，以提高回收率；加入500μL的WB溶液，12000rpm离心1min；弃去滤液后重复洗涤一次；12000rpm离心柱子2min，干燥吸附柱；加入50μL的50℃预热的ElutionBuffer，室温放置3min，12000rpm离心1min，洗脱质粒DNA；用分光光度计测定OD260和OD280，计算各重组真核质粒含量和纯度。

DNA含量（μg/mL）=样品稀释倍数×50×OD260。

2.质粒转染BHK-21细胞

方法参照TransFastTMTransfectionReagent（Promega）操作手册。转染在24孔细胞板上进行，于转染前一天，消化细胞瓶中BHK-21细胞，用含10%犊牛血清的DMEM（不含抗生素）稀释细胞，使其密度达到2.5×10⁵个细胞/mL，在24孔细胞板上每孔接种1.0mL，置5%CO₂、37℃饱和湿度下培养；在转染前4h，把24孔细胞板的营养液更换为新的营养液；取出-20℃保存的转染试剂，室温融化并涡漩；在四个灭菌的1.5mL离心管中先加入200μL不含血清的DMEM，然后分别加入0.5μg的重组真核质粒pVAX-Cap、pVAX-SynCap、pVAX-SynCap（m）和pVAX-SynCap-2A-SynCap，混匀后加入3.0μL的TransFastTMTransfectionReagent（使lipid∶DNA的体积/μL与质量/μg比为2∶1）后立即涡漩，在室温温育TransFastTMTransfectionReagent/DNA混合物l0-15min；从二氧化碳细胞培养箱中取出细胞板，弃去上清；再一次短暂涡漩TransFastTMTransfectionReagent/DNA混合物，把混合物轻轻加入到细胞表面；轻轻混匀，使脂质体/DNA混合物覆盖细胞面，然后立即把细胞板放入二氧化碳培养箱中。温育1.0h后，轻轻加入1.0mL37℃预热的2%犊牛血清的DMEM（不含抗生素），把细胞放回二氧化碳培养箱，37℃培养3d。设置转染pVAX1和未转染的对照孔。

3.Westernblot鉴定蛋白的表达

3.1SDS-PAGE

将转染后的细胞板保存在-20℃，并反复冻融3次，收取细胞。取适量的细胞液加1/4体积5×电泳上样缓冲液（0.1MTris-HCl（pH6.18）、0.2MDTT、4%SDS、0.12%溴酚兰、20%甘油），100℃煮沸5min，瞬时离心后，进行12%聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶（SDS-PAGE）电泳。

3.2Westernblot

将SDS-PAGE凝胶、NC膜和Whatman滤纸置转印缓冲液中浸泡10min；转印顺序为：＋极－海绵－NC膜－凝胶－海绵－－极，体积依次增大，半干转印条件为20V，30min；转印完毕，用5%的丽春红染色NC膜，以确定转印效果；用PBST漂洗，洗脱丽春红。

将NC膜置于10%的脱脂乳（PBST稀释）中，37℃摇动孵育2h；用PBST洗涤3次，每次5min；加入PBST稀释的一抗（PCV25H7单抗，1:10000稀释），37℃摇动孵育2h；用PBST洗涤3次，每次5min；用PBST稀释的羊抗鼠IgG-HRP（1:15000），37℃摇动孵育45min；用PBST洗涤5次，每次5min；干燥NC膜，等量混匀适量化学发光底物ECL的A液和B液，将混合液直接滴加到NC膜上，孵育2-5min；用保鲜膜包好，暗室中在X-光胶片上曝光，经显影、定影后观察，结果见图3。WesternBlot试验结果证明pVAX-SynCap、pVAX-SynCap（m）、pVAX-SynCap-2A-Cap重组质粒在体外均能够有效进行表达，并具有较好的免疫原性。

实施例4重组质粒和携带重组质粒减毒沙门氏菌的制备与动物免疫试验

1.质粒的大量制备

方法参照实施例3。将10μL菌种接种于3mL的含50μg/mL卡那青霉素的LB培养基中，37℃200rpm振荡培养6h；将3mL菌液全部倒入含50μg/mL卡那青霉素的200mLLB培养基中，37℃200rpm过夜振荡培养；次日收集菌液7500rpm离心10min，完全弃去上清后加入100mL4℃预冷的STE（10mMTris-HCl、0.1MNaCl、1mMEDTA，pH8.0），重悬沉淀；7500rpm离心10min；弃去上清后加入2mL4℃预冷的溶液I（50mM葡萄糖；25mMTris-Cl，PH8.0；10mMEDTA）充分重悬细菌，并分装至EP管中，200μL/管；加入新配制的溶液II400μL（0.2MNaOH；1%SDS），轻轻颠倒离心管数次，将离心管置于冰上，至菌液基本变透亮；加入300μL用冰预冷的溶液III（5M乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL），快速颠倒数次至蛋白变性成白色团块，置冰上3-5min；4℃12000rpm离心10min，将上清移至新的离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后置于-20℃1h以上；4℃12000rpm离心10min；弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤一次；4℃12000rpm离心5min，室温自然干燥后加入50μL的双蒸水溶解；加入5μLRNaseA（10mg/mL），37℃作用30min后，合并至一管；加入等体积的酚∶氯仿，涡旋混匀后置室温5min，4℃12000rpm离心5min；取上清到新的离心管，加入等体积的氯仿，颠倒混匀，4℃12000rpm离心5min；取上清到新的离心管，加入40μLNaAc（pH5.2）和0.9mL无水乙醇，颠倒混匀，置于-20℃1h以上；4℃12000rpm离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤一次；4℃12000rpm离心5min，室温自然干燥后加入1mL的双蒸水溶解沉淀，-20℃保存；用分光光度计测定OD260和OD280，计算各重组真核质粒含量和纯度。

DNA含量（μg/mL）=样品稀释倍数×50×OD260。

2.小鼠免疫试验

2.1小鼠分组与免疫实验

取6-8周龄雌性Balb/c小鼠90只，分为6组，每组15只。第一、二、三、四、五组分别腿部肌肉注射免疫pVAX-SynCap、pVAX-SynCap（m）、pVAX-Cap、pVAX-SynCap-2A-SynCap和pVAX1，剂量为每只小鼠免疫100μg，第六组为阴性对照组，注射PBS，21、42天后分别以相同的剂量加强免疫（免疫质粒前24h，腿部肌肉注射2%盐酸利多卡因，50μL/只）。分别于首次免疫后42和63d采血测定ELISA抗体和中和抗体；取脾脏，分离淋巴细胞，测定淋巴细胞增殖反应；并测定脾脏淋巴细胞体外刺激后细胞因子应答。

2.2ELISA抗体检测

2.2.1Cap-C蛋白的制备

（1）引物设计

根据PCV2SH株基因序列（AY686763）设计引物，扩增ORF251-234片段，并命名为Cap-C。上下游引物各引入BamHⅠ和XhoⅠ位点。序列如下：

Cap51F5’-AAGGATCCCGCACCATCGGTTATAC-3’(SEQIDNO.12)

Cap234R5’-CTTCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGG-3’(SEQIDNO.13)

以上引物由上海Invitrogen公司合成。

（2）PCR扩增

采用常规酚氯仿抽提法提取病毒PCV-SH(CGMCCNo.2389)毒株DNA：取病毒液500μL，加入终浓度为分别为1%和50μg/μL的SDS和蛋白酶K，55℃作用30min；加入等体积的酚抽提，振荡混匀，12000rpm离心10min；取上清液，加入等体积的酚/氯仿抽提，振荡混匀，12000rpm离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿抽提，12000rpm离心10min；取上清液，加入1/10体积的3M乙酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃过夜，沉淀DNA；然后12000rpm离心15min，弃掉上清液，室温干燥；最后加入20μl无菌ddH₂O溶解。以其为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为：上游、下游引物（10pmol/L）各1.0μL；MgCl₂（25mmol/L）1.5μL；dNTPs（2.5mmol/L）2.0μL；10×PCRbuffer2.5μL；稀释的质粒模板2.0μL；Taq酶（5U/μL）0.2μL；灭菌双蒸水补至25μL。循环参数：95℃预变性5min；以94℃45s，54℃45s，72℃45s进行35次循环；最后72℃延伸10min。1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示在相应位置均有一条特异性条带，与预期大小结果相符

（3）重组质粒的构建与酶切鉴定

PCR扩增目的同时，按照质粒提取试剂盒说明书提取pET32a（+）质粒。电泳结束后，按照试剂盒说明书回收PCR产物，PCR产物与质粒分别经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切再次回收纯化。

酶切反应体系如下：

将回收得到的酶切的PCR产物和载体pET-32a（+）16℃过夜连接。

连接体系如下：

然后转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，37℃培养18h左右。挑取若干单个菌落，接种LB液体培养基37℃培养16-18h，常规碱裂解法提取质粒，经PCR、酶切鉴定阳性质粒送Invitrogen公司进行测序鉴定。鉴定正确无误的阳性质粒pET-32a-CapC用于后续试验。

（4）Cap-C蛋白的表达

经序列测定正确的重组质粒转化BL21，同时将空质粒pET-32a同法转化感受态大肠杆菌BL21。37℃培养24h，挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜振摇培养。

①取过夜培养的菌液10μL接种于3ml含有氨苄青霉素（50μg/mL）的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养3h左右，使OD₆₀₀达到0.6-0.8，取100μL样品于无菌Eppendorf管中作为诱导前对照；

②向上述菌液中加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG进行重组蛋白的诱导表达，并在加入IPTG后第2、3、4、5、6h取样；

③4℃8000rpm离心5min收集诱导表达的细菌，PBS（pH7.2）重悬，如此洗涤2次；

④完全弃上清，用适量PBS重悬细菌沉淀；

⑤将菌液反复冻融3次；

⑥超声波裂解细菌：功率选用200W，在冰盒上操作，超声裂解5s，停顿5s，直至菌液变得清澈；

⑦4℃8000rpm离心10min，分别收集上清与沉淀：将沉淀用与上清等体积的PBS重悬，上清与沉淀悬浮液各取100μL备用。

⑧样品中加入5×蛋白样品上样缓冲液，充分混匀后100℃煮沸5min，上样前离心，吸取上清进行SDS-PAGE。

⑨Cap-C蛋白的鉴定

将pET-32a-Cap-C转化BL21，挑取重组菌进行诱导表达，经SDS-PAGE分析发现重组菌在诱导4h后均出现一条明显蛋白条带，与预期一致，表明Cap-C重组融合蛋白获得较好表达。对菌体进行超声裂解，分离上清和包涵体沉淀，发现目的蛋白主要存在于包涵体中。对目的蛋白进行纯化，并通过稀释透析相结合的方法对目的蛋白进行复性，目的蛋白得到较好的纯化。通过Westernblot进一步对重组蛋白的抗原性进行鉴定，结果显示重组Cap-C蛋白可以被组氨酸特异性单抗所识别，表明重组蛋白以带有组氨酸标签的融合蛋白形式表达，且具有良好的抗原性。

2.2.2ELISA抗体检测

以纯化的重组Cap-C蛋白2μg/mL包被酶标板，37℃2h后转入4℃过夜；PBST洗涤3次，每次5min；5%的脱脂乳，200μL/孔，37℃封闭2h；PBST洗涤3次；将待检血清作倍比稀释，将各稀释度的血清样品加入酶标孔，每个样品重复2个孔，同时同样方法设立PCV2阴性鼠血清对照，并设定阳性对照，100μL/孔，37℃作用1h；；PBST洗涤3次；将羊抗小鼠IgG-HRP1:20000稀释后，加入酶标孔，100μL/孔，37℃作用0.5h；PBST洗涤3次；加入等体积混匀TMB显色液的A液和B液，100μL/孔，37℃作用15min；加入2M的H₂SO₄终止反应，50μL/孔；测定OD450nm的值。符合下列条件判为阳性，否则为阴性，以判定阳性的血清最大稀释度作为该样品的抗体滴度，从图4a可以看出pVAX-SynCap(m)诱导的ELISA抗体高于其它组。免后6周pVAX-SynCap（m）和pVAX-SynCap组可检测到ELISA抗体，首免后9周pVAX-SynCap（m）组ELISA抗体达到较高的水平（约1:4000），pVAX-SynCap组抗体水平为1:1500，二者的抗体水平均显著高于其它组（P<0.01），pVAX1、pVAX-Cap、和pVAX-SynCap-2A-SynCap和阴性组均未检测到PCV2特异性抗体。

Sample/Negative（S/N）＝ODsample/ODnegative≥2.1。

2.3病毒中和试验

将PCV2SH株病毒冻融3次，10000g离心5min取上清备用。于病毒滴度测定前24h左右将PK15细胞种植96孔细胞板，细胞长满单层后，用维持液（含2%犊牛血清的DMEM）将病毒作10倍比稀释，并向细胞接种稀释好的病毒液，每个稀释度作4个重复孔，100μL/孔；同时设定病毒原液及维持液对照；37℃、5%CO2饱和湿度下培养3d，并进行间接免疫荧光试验，观察荧光，记数每个稀释度的荧光孔数，按Karber法计算病毒的TCID50。

于病毒中和试验前24h左右将PK15细胞种植96孔细胞板，待检血清56℃灭活30min，10000rpm离心5min除菌后，小心吸出上清，用维持液（2%DMEM）将血清按1∶4、1∶8、1∶16、1∶32，……，作2的连续倍比稀释，并接种于长满单层的细胞上；具体操作如下：取待检血清及阴性对照血清150μL，56℃灭活30min后，10000rpm离心5min，小心吸出上清120μL，加入到360μL的DMEM中，将血清作1∶4稀释，混匀后再从中取出240μL加入到240μL新的维持液中，作1∶8稀释，依次类推；将病毒用维持液稀释至含200TCID50/100μL，然后将稀释的血清与等体积的病毒液（含200TCID50/100μL）混合，于37℃水浴作用1h。弃去已长满单层PK15细胞的96孔培养板中的营养液，将血清病毒混合液加入到细胞孔中，100μL/孔，每个血清稀释度作4个重复孔，37℃培养4-5d。同时设定以下对照：（I）病毒-阴性血清对照，（II）阴性血清对照，（III）空白对照，并进行间接免疫荧光试验。结果判定，当病毒-阴性血清对照孔出现荧光，而阴性血清及空白对照孔均未出现荧光时记录每个血清稀释度的荧光孔数。以能够完全抑制荧光出现的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，结果见图4b,可以看出pVAX-SynCap(m)诱导的中和抗体高于其它组。

2.4淋巴细胞增殖试验

将PCV2SH病毒用含10%血清的RPMI-1640培养基调节至25μg/mL作为刺激抗原，每孔加入100μL，对照孔加入100μL含10%血清的RPMI-1640培养基，各做3个重复孔。37℃下培养66h，然后每孔加入40μLMTT（5mg/mL），37℃下继续培养4h。吸弃培养液，每孔加入100μLDMSO，振荡融解结晶，测定OD570nm的值。计算刺激指数：刺激指数SI＝刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值。结果见图5。

2.5细胞因子测定

收集免疫后63天时淋巴细胞增殖实验中各组刺激孔72h的细胞上清，混匀后测定其中IL-4及IFN-γ含量，按美国R＆D公司鼠IL-4及IFN-γ说明书进行，结果见图6。结果显示：首免后9周，各组刺激孔的细胞上清中均可检测到细胞因子分泌，其中，pVAX-SynCap（m）免疫组产生的IL-4及IFN-γ细胞因子应答高于其他各免疫组（P<0.05），其次为pVAX-SynCap及pVAX-SynCap-2A-SynCap免疫组，pVAX-Cap免疫组中IL-4及IFN-γ的分泌量较低，阴性对照组和pVAX1免疫组的最低。

3.重组减毒沙门氏菌的构建及鉴定

3.1减毒沙门氏菌感受态细胞的制备

取冻存的鼠伤寒沙门氏菌SL3263划线接种无抗性LB平板，37℃过夜培养；挑取平板上的单个菌落接种5mLLB液体培养基，37℃过夜振荡培养；每5mLLB液体培养基接种100μL过夜培养物，37℃，200rpm振荡培养，至OD600nm=0.6；培养物冰浴30min，4000rpm离心10min；弃上清，用等体积冰浴的WB溶液重悬细菌，4000rpm离心10min（WB=10%甘油，90%双蒸水，过滤）；重复上一步2次；弃去大部分WB，使剩余体积为50μL（每10mL原始培养物制备感受态细胞50μL，即0.5%），混匀即为感受态细胞。

3.2电转化

40μL感受态细胞中加入4μL质粒pVAX-SynCap（m），混匀；混合液加入冰浴冷的电极杯中，冰浴5min；然后进行电转化，参数设置为2500V，200Ω，25μF[11]，t=4.3s；另取不加质粒的感受态细胞电转化作为对照；电击后，立即向电极杯中加入500μLLB，混匀；迅速将其转入EP管后，37℃振荡培养40min；取100μL涂布含50μg/mL卡那青霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养。

3.3鉴定

挑取疑似阳性单菌落，接种于含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基中，至OD600nm约为1.0采用碱裂法提取质粒，并将质粒重新转化DH5α感受态细胞，采用碱裂法再次提取质粒，双酶切鉴定，37℃作用2h。酶切完毕后1%琼脂糖电泳分析。

4.仔猪攻毒保护试验

将23头仔猪随机分为5组，每组4-5头，隔离饲养，如图5-1。第1组接种质粒pVAX-SynCap（m）（500μg/头），第2组口服免疫SL-pVAX-SynCap（m）（108CFU/mL），第3组免疫PBS2mL/头，第4组接种质粒pVAX1（500μg/头），第5组口服免疫SL3263（108CFU/mL）。免疫两次间隔三周。二免后两周用PCV2SH株攻毒，每头猪滴鼻3mLTCID50为1.0-5.0/mL的病毒液，每个鼻孔各1.5mL。分别在首次免疫后21天（二免前）、35天（攻毒前）及攻毒后第4天、7天、11天、19天、28天采血，分离血清，用于PCV2特异性ELISA抗体、中和抗体及病毒血症检测。攻毒当天和剖杀时每头猪分别称重，用于计算每头猪相对日增重[RDWG=（剖杀时体重-攻毒时体重）/28/攻毒时体重]。攻毒后每日观察记录猪的临床表现，测量每只猪直肠体温。所有组实验动物于攻毒后28天剖检，观察并记录淋巴结及肺脏病理变化，采集淋巴结和肺脏样品用于制备组织病理切片。

表2仔猪免疫保护试验设计方案

4.1PCV2特异性ELISA抗体检测和中和抗体检测

ELISA抗体检测方法同2.2.2，酶标记抗体改为1:20000稀释的SPA-HRP。分别于一免后21天、二免后14天采集血清，测定中和抗体，方法同2.3。

首免后3周，pVAX-SynCap（m）免疫组产生了1:40的ELISA抗体水平，SL-pVAX-SynCap（m）免疫组产生了1:50的ELISA抗体水平，其余各组均未检出ELISA抗体和中和抗体。首免后5周，pVAX-SynCap（m）免疫组ELISA抗体水平为1:150，中和抗体水平为0，SL-pVAX-SynCap（m）免疫组ELISA抗体水平为1:280，中和抗体水平为0，其他各组未检出PCV2特异性抗体，说明重组真核质粒及重组沙门氏菌具有一定的免疫效力，但其引起的抗体效价不高。

表3试验猪ELISA及中和抗体测定结果

4.2血清及淋巴组织PCV2病毒含量检测

4.2.1样品DNA的提取

血清DNA提取：取200ul血清，加入400ulPBS，终浓度1%的SDS和终浓度50μg/mL的蛋白酶K，56℃水浴30min，加入等体积的酚，振荡混匀，12000rpm离心10min；小心吸取上清至新的EP管，加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀，12000rpm离心10min；小心吸取上清至新的EP管，加入等体积的氯仿，振荡混匀，12000rpm离心10min；小心吸取上清至新的EP管，加入1/10体积的3M乙酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃过夜沉淀DNA；12000rpm离心15min，弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤一次，室温干燥；最后加入20μL无菌双蒸水溶解DNA，-20℃保存备用。

组织DNA提取：取0.2g腹股沟淋巴结组织，剪碎，加入1.2mlPBS后匀浆，反复冻融三次，4000rpm离心10min，取50ul上清于新的EP管，加入500ulDNAZOL，涡旋混匀后室温静置10min；加入250ul预冷的无水乙醇，混匀后于4℃静置5min；12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤一次，室温干燥；最后加入20μL无菌双蒸水溶解DNA，-20℃保存备用。

4.3.2Real-timePCR

Real-timePCR反应体系为：DNA2μL，2×PowerSYBRGreenPCRMasterMix（TOYOBO公司）10μL，上下游引物各1μL（终浓度400nM，PCV2F:5’-CCAGGAGGGCGTTCTGACT-3’(SEQIDNO.14)；PCV2R:5’-CGTTACCGCTGGAGAAGGAA-3’(SEQIDNO.15)），无菌双蒸水补足体积至20μL。置ABI7300realtimePCR仪上进行，反应程序为：预变性95℃2min，95℃15s，60℃1min，进行40个循环。同时设定阴性对照并用阳性质粒模板pT-SH10倍倍比稀释作为模板，按同样方法操作，绘制标准曲线，根据样品Ct值和标准曲线计算出相应的拷贝数，见图7和8。

4.4体温变化及肺脏大体病变统计

攻毒后每天定时测定猪群的体温，并做好记录。攻毒后28天，按常规方法进行病理解剖，观察淋巴结、肺脏大体病变，根据病变轻重，将病理变化分为3级。并采取肺脏及淋巴结组织用4%甲醛溶液固定，用于后续病理切片的制备。大体病理变化见表4。证明了pVAX-SynCap(m)组各组织器官的病理变化要显著轻于其他组。

表4各组猪肺脏淋巴结眼观病变及组织病理学变化情况

-表示无病变；+表示轻微病变；++表示中等程度病变；+++表示严重病变

4.5组织病理学观察

4.5.1病理组织切片的制备

从动物的肺脏及淋巴结上取下不大于2cm×4mm厚的组织块，迅速放入50mL4%甲醛溶液中固定；组织标本用PBS反复冲洗并浸泡6h，除去多余的固定剂；梯度酒精脱水：75%：1h，75%：1h，85%：1h，85%：1h，95%：1h，95%：1h，100%：1h，100%：1h。二甲苯中透明10min左右，置60℃石蜡中透蜡2-3h，最终将组织块包埋于旧石蜡中。将石蜡包埋组织块削成合适大小及形状，夹于切片机上，调节切片厚度并进行切片。

4.5.2石蜡包埋组织切片染色

二甲苯脱蜡2次，每次5-10min。准备分别盛有100%、95%、85%和75%乙醇的染色杯，将切片依次浸入各1min、1.5min、2min、2.5min；自来水冲1-2min；苏木精染色1min，水洗蓝化（在显微镜下掌握染色程度）。伊红染色30s-1min，水洗1-2min。95%，5min，×3次；100%，5min，×2次。二甲苯透明：5-10min，×2次。中性树胶封固后观察，结果见图9。肺脏和淋巴结的病变分为三级（-：无病变；+：有轻微病变；++：中等程度病变；+++：严重病变）。见表4。组织病变观察结果显示：pVAX1免疫组、SL3263免疫组和非免疫攻毒对照组所有猪均出现明显的肺泡壁增厚、单核细胞浸润、支气管分泌物增多和肺泡水肿等间质性肺炎，淋巴结出现淋巴细胞缺失，淋巴滤泡边界模糊或消失，pVAX-SynCap（m）免疫组基本呈现中等病变程度，而SL-pVAX-SynCap（m）病变较轻微，空白对照组肺脏及淋巴结基本正常（图9）。以上结果表明，SL-pVAX-SynCap（m）和pVAX-SynCap（m）能减轻由攻毒感染引起的肺脏及淋巴结的组织病变。

注：上述实施例中应用SPSS软件，对数据统计分析，进行ANOVA及LSD多重分析，比较各组差异，P<0.05表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。

Claims (8)

1.优化的编码PCV2Cap蛋白的基因，其特征在于序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。

2.根据权利要求1所述的优化的编码PCV2Cap蛋白的基因，其特征在于序列如SEQIDNO.2所示。

3.含有权利要求1所述的基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于为含有权利要求1所述基因的pVAX1载体。

5.含有权利要求3所述重组质粒的减毒沙门氏菌。

6.权利要求1所述的基因在制备抗猪圆环病毒2型疫苗中的应用。

7.权利要求3所述的重组质粒在制备抗猪圆环病毒2型疫苗中的应用。

8.权利要求5所述的减毒沙门氏菌在制备抗猪圆环病毒2型疫苗中的应用。