CN108785667B - 一种猪圆环病毒3型免疫原性组合物、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒3型病毒免疫原性蛋白，以及该免疫原性蛋白制备的免疫原性组合物，该猪圆环病毒3型病毒蛋白免疫原性好，其制备的免疫原性组合物能针对不同来源的猪圆环病毒3型病毒提供完全的保护，能有效预防、治疗和控制相关疾病。

Description

一种猪圆环病毒3型免疫原性组合物、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽药领域，具体涉及一种猪圆环病毒3型蛋白，含该蛋白的免疫原性组合物、制备方法和应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV)是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为1.7kb，是最小的动物DNA病毒之一。已经确定有两种类型的PCV，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在PK细胞培养物中作为一种污染物鉴定而发现，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases，PCVAD)，主要引起仔猪多系统衰竭综合征，肺炎,猪皮炎和肾病综合征和繁殖障碍，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。

然而，在一起猪的繁殖障碍病例中，分离到一株病毒基因组为2.0kb的圆环病毒，经后续试验证实，其与已知的圆环病毒无论在核苷酸还是氨基酸序列的同源性均小于50％，根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒属中同一种的病毒应该具有＞75％的基因组核苷酸序列的同源性，Cap蛋白＞70％的氨基酸序列的同源性，因此可以肯定这是一种新的猪圆环病毒。其能引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，因此针对该新病毒制备新的疫苗，对猪场疾病控制十分重要。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供一种预防和/或治疗猪圆环3型病毒相关疾病的免疫原性组合物，该免疫原性组合物能对猪圆环病毒3型提供有效的保护，显示出显著的免疫特性。

为此，本发明的一个目的在于提供一种猪圆环病毒3型免疫原性蛋白Cap蛋白，其制备的免疫原性组合物能有效保护流行株的攻击，且针对不同来源的猪圆环病毒3型提供完全的保护。

本发明的另一个目的在于提供一种预防和/或治疗猪圆环病毒3型相关疾病的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物包括免疫量的所述的猪圆环病毒3型抗原以及兽医学上可接受的载体；其中，所述猪圆环病毒3型抗原为所述免疫原性蛋白或重组有所述免疫原性蛋白基因的活载体。

本发明的另一个目的是提供一种制备所述免疫原性组合物的方法，所述制备方法包括：步骤(1)克隆所述猪圆环病毒3型免疫原性蛋白基因；步骤(2)重组、转化所述步骤(1)中克隆的免疫原性蛋白基因；步骤(3)表达所述重组的猪圆环病毒3型免疫原性蛋白；步骤(4)分离纯化所述重组的猪圆环病毒3型免疫原性蛋白，使用非离子表面活性剂处理所述纯化的重组的猪圆环病毒3型免疫原性蛋白；步骤(5)将所述步骤(4)得到的猪圆环病毒3型免疫原性蛋白抗原与佐剂按比例混合，乳化。

本发明还涉及所述的免疫原性组合物在制备预防和治疗猪圆环病毒3型相关疾病的药物中的应用。

本发明首次采用猪圆环病毒3型免疫原性Cap蛋白基因高效表达后，制备免疫原性组合物，可预防或治疗猪圆环病毒3型相关疾病引起的疫情。

本发明猪圆环病毒3型Cap蛋白制备的免疫原性组合物，其免疫原性好，能对猪只的攻毒产生完全保护，能有效对多种地域来源的野毒株进行预防，即在临床应用上能对猪圆环病毒3型的感染、蔓延进行预防、治疗和控制。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

猪圆环病毒3型为一种基因组2.0kb的圆环病毒，其与已知的圆环病毒无论在核苷酸还是氨基酸序列的同源性均小于50％，是一种新的猪圆环病毒，现在已知其能引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。

本发明涉及一种用于猪圆环病毒3型免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物包括免疫量的所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原以及兽医学上可接受的载体；其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原为Cap蛋白或重组有所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的活载体。本发明首次发现猪圆环病毒3型Cap蛋白具有良好的免疫原性，其制备的亚单位抗原或含有其重组基因的活载体均能在免疫后产生良好的免疫效力，对猪只提供100％的保护。

术语“免疫原性组合物”指含有猪圆环病毒3型免疫原性的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪圆环病毒3型的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由免疫原性组合物提供的保护性免疫力可通过测量例如受试动物的临床征兆如健康产仔的减少、死胎数量的增加、受试动物总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“猪圆环病毒3型抗原”是指至少含有一种猪圆环病毒3型抗原形式的任何组合物，所述猪圆环病毒3型抗原可诱导、刺激或增强猪圆环病毒3型感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、减毒的或亚单位的抗原。

本发明所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原可以是重组表达的Cap蛋白亚单位抗原，其表达体系可以为原核表达系统、真核表达系统，也可以是通过人工合成的合成肽抗原；或者可以是重组有所述猪圆环病毒Cap蛋白基因的活载体。

“亚单位抗原”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的抗原。它比全病毒抗原引起副反应的可能性小。

“合成肽抗原”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的抗原。

“活载体”指的是非致病微生物通过基因工程的方法使之携带并表达某种抗原或抗原决定簇的基因，产生免疫原性，非致病微生物可以是细菌和病毒，病毒活载体常作为载体的病毒有痘苗病毒、禽痘病毒、火鸡疱疹病毒、腺病毒、伪狂犬病毒、反转录病毒、慢病毒；细菌活载体可以是减毒沙门菌、卡介苗、减毒单核细胞李氏杆菌、减毒霍乱弧菌、减毒志贺氏菌、乳酸球菌、芽胚乳酸杆菌、高氏链球菌。

作为本发明的一种实施方式，在本发明的免疫原性组合物中，所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白为序列SEQ.ID NO 1编码的蛋白。

作为本发明的一种实施方式，在本发明的免疫原性组合物中，所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白其编码基因具有SEQ.ID NO 1所示的核苷酸序列或其简并序列。

作为本发明的一种实施方式，在本发明的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为≥20μg/ml。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml。

作为本发明的一种更优选实施方式，在本发明的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原含量为20μg/ml～50μg/ml。

作为本发明的一种更优选实施方式，在本发明的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原含量为30μg/ml～50μg/ml。在本发明的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原含量还可以选自20μg/ml～30μg/ml，30μg/ml～100μg/ml，或50μg/ml～100μg/ml。

作为本发明的一种实施方式，在本发明的免疫原性组合物中，所述重组有猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的活载体为重组减毒沙门氏菌、重组新城疫病毒、重组痘病毒、或重组腺病毒。

本发明的活载体免疫原性组合物因为兼具有灭活疫苗和活疫苗的优点，在免疫效力上可以保证能够对猪进行保护，且其免疫效力更强，可以不添加佐剂。

本发明的猪圆环病毒3型Cap基因还可以应用于表达载体、核酸疫苗、诊断试剂开发以及其他预防和/或治疗猪圆环病毒3型相关疾病的药物开发。

本发明涉及一种猪圆环病毒3型Cap蛋白，其蛋白序列为SEQ.ID No.1所编码。

本发明涉及一种重组载体，所述重组载体能表达本发明所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白，其具有免疫原性并能产生免疫反应。

本发明涉及一种转化子，所述转化子包含有导入的本发明所述的表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组载体。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述免疫原性组合物中，所述兽医学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括(1)氢氧化铝、皂苷、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，(3)水包油乳剂、油包水乳剂或水包油包水乳剂，或(4)Montanide^TMGel。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述免疫原性组合物中，所述佐剂包括(1)皂苷QuilA；(2)丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物与糖或多元醇的聚链烯基醚交联产物卡波姆；(3)所述佐剂包括基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油的乳剂，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯、油与乳化剂一起使用形成乳剂，乳化剂优选非离子表面活性剂；特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121；或(4)Montanide^TMGel。

优选地，所述佐剂为Montanide^TMGel，所述佐剂用量为体积比5～20％；更优选地，所述佐剂用量为体积比10％。

所述佐剂包括白油、德雷克油，以及动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及金属盐；或Montanide^TM Gel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。

优选地，所述佐剂为Montanide^TMGel，所述佐剂用量为体积比5～20％；更优选地，所述佐剂用量为体积比10％。

本发明所述免疫原性组合物中的所述载体为佐剂，所述佐剂包括白油、德雷克油(Drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐；或Montanide^TM Gel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。

本发明的免疫原性组合物可使用可用技术来调配，优选为兽医学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。油佐剂既可以是自然来源，也可以是经过人工合成获得的。

术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，(3)免疫原性组合物可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成，或(4)Montanide^TMGel。

尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical ApplicationofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley andSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。

特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。

优选地，本发明选用的佐剂为Montanide^TMGel。

适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需的量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

本发明的Cap蛋白可以通过本领域内任何已知的方法制备，例如可以通过重组表达Cap基因制备Cap蛋白，表达系统可以使用任何已知的表达系统，例如：真核表达系统、原核表达系统。或者直接合成Cap蛋白。真核表达系统可以包括哺乳动物细胞表达系统，酵母表达系统和昆虫表达系统。

本发明还涉及一种制备所述免疫原性组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)克隆所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因，并将所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因重组到表达载体以获得含有所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的重组表达载体；步骤(2)将所述含有所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的重组表达载体和分子伴侣的表达载体共同转化大肠杆菌，表达所述猪圆环病毒3型Cap蛋白；步骤(3)分离所述表达的猪圆环病毒3型Cap蛋白，使用非离子表面活性剂处理除去内毒素；以及步骤(4)将所述去除内毒素的猪圆环病毒3型Cap蛋白与佐剂混匀，得到所述免疫原性组合物。作为本发明的一种实施方式，在所述的制备所述免疫原性组合物的方法中，所述步骤(1)中所述含有猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的重组表达载体为重组pET28a质粒，所述步骤(2)中所述分子伴侣的表达载体为pG-Tf2，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；所述步骤(3)中非离子表面活性剂为Triton X-114。

本发明免疫原性组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物中。例如，本发明的组合物还可以包含以下试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。

为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

可以根据本发明的免疫原性组合物制备成口服剂型或非口服剂型。

优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。

本发明还涉及所述免疫原性组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒3型相关疾病的药物中的应用。

本发明所用术语“猪圆环病毒3型相关疾病”用于指由猪圆环病毒3型感染引起的疾病。非穷举性包括，猪的皮炎肾病终合症、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，但不限于此。

术语“预防和/或治疗”在涉及猪圆环病毒3型相关疾病时是指抑制猪圆环病毒3型的复制、抑制猪圆环病毒3型的传播或防止猪圆环病毒3型在其宿主体内定居，以及减轻猪圆环病毒3型感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1猪圆环病毒3型的分离鉴定

1、病料来源

在国内一商品化猪场，与历史平均值相比，出现母猪死亡率增加9.4％，受孕率降低了1.2％，木乃伊胎增加8.2％的现象。临床表现上，受影响的母猪表现出厌食，呈多灶性丘疹，斑点和表面皮炎的症状。在流产的窝中含有不同胎龄的木乃伊化胎儿，与PCV2感染引起流产的症状一致。虽然在母猪中观察到的总体临床表现以及流产症状与猪圆环病毒2型导致的繁殖障碍疾病一致，但所有母猪的不同组织，包括肾、淋巴结、肺、皮肤以及死胎，通过免疫组化和定量PCR对PCV2、PRRSV、PPV、CSFV、猪肺炎支原体检测均为阴性。为进一步查清原因，选取各组织病料进行病原分离。

2、病毒株的分离与培养

将病料以1：10(体积比)加入DMEM培养液，研磨，制备组织悬液，组织悬液经反复3次冻融后，于12000r/min离心15min，收集上清液，上清液再经0.22μm滤膜滤器过滤，滤液在PK15细胞上传代，37℃培养1h，替换加入含2％犊牛血清的DMEM培养液，置于37℃培养5日。收获病毒，经2次冻融后，收获含病毒的培养液。

3、PCR及测序分析鉴定病毒种属

取以上步骤的病毒培养物，用核酸提取试剂盒提取病毒样品的核酸，使用圆环病毒种属特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果显示，PCR扩增出2000bp目的条带。PCR产物送测序公司进行核苷酸序列测定，序列测定结果进行遗传进化分析。结果显示该病毒株全基因组序列和氨基酸序列同已经报道过的其他圆环病毒的同源性都少于50％，而根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒属中同一种的病毒应该具有＞75％的基因组核苷酸序列的同源性，Cap蛋白＞70％的氨基酸序列的同源性，因此可以肯定，它是一种新的猪圆环病毒，也是目前猪体上发现的第三种圆环病毒。

实施例2pET28a-PCV3-Cap表达载体的构建

1、PCV3病毒DNA的提取

质粒提取试剂盒购自天根生物；T4DNA Ligase购自BioLab；pET28a质粒购自Novagen；琼脂糖凝胶胶回收试剂盒购自天泽生物，其他试剂均为分析纯。

按照病毒DNA提取试剂盒说明书，取0.2ml猪圆环病毒3型病毒液于无菌1.5ml离心管中，加0.4ml VB于病毒液中，旋涡混匀，室温静置10分钟。加0.45ml AD buffer于病毒液中，用力混匀。将VB柱放入2ml收集管中，取0.6ml混合液加入VB柱中，14000g离心1分钟，将剩余的混合液加入VB柱中，14000g离心1分钟，弃掉2ml收集管，将VB柱放入新的2ml收集管中，加入0.4ml W1buffer，14000g离心30秒，加0.6ml Wash buffer于VB柱，14000g离心30秒，然后不加buffer再空置离心3分钟，将VB柱放入新的1.5ml EP管中，加入50μl RNasefree water置于膜中央，静置3分钟，14000g离心1分钟，EP管中离心下来的液体即为DNA基因组溶液。

2、Cap基因扩增

根据Cap基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，进行PCR。引物序列见表1。

表1 Cap基因扩增引物

Cap-F	CCA CAG AAG GCG CTA TGT C
		Cap-R	CCG CAT AAG GGT CGT CTT G

将PCR产物送Invitrogen公司测序，根据测序结果对Cap基因进行密码子优化，优化后的Cap基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

3、表达载体构建

优化后Cap基因送苏州泓迅生物科技股份有限公司进行全序列合成，并连接到pET28a质粒上。连接后的质粒和分子伴侣质粒pG-Tf2共转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，阳性克隆即为pET28a-PCV3-Cap/pG-Tf2表达菌株。

实施例3Cap蛋白的表达

将实施例2中制备的pET28a-PCV3-Cap/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3)菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中，同时LB培养基中含有5-10ng/ml四环素用于分子伴侣蛋白的诱导表达，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD₆₀₀＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调节pH至7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。表达产物中可溶性目的蛋白含量较高，表达量可达菌体蛋白总量的25％，内毒素含量为0.28×10⁵EU/ml。

实施例4大肠杆菌表达Cap蛋白内毒素清除

1.5ml离心管中加入0.5ml待处理的含可溶性Cap蛋白的上清溶液和终浓度为1％(v/v)的曲拉通X-114(Triton X-114)(加入量5μl)，涡旋振荡。涡旋振荡混匀的样品在冰上放置5分钟。样品冷却后，离心管立即放入37℃水浴中温浴5min，使得产生新的两相。然后，把样品在37℃离心60s。离心过后，目的蛋白将留在上层，而含有内毒素的非离子表面活性剂将会以油滴的形状残留在离心管底部，分离两相。整个去除内毒素的操作循环3次。经测定，蛋白纯度没有降低，内毒素含量下降为0.008×10⁵EU/ml；同时，通过200KV透射电镜，放大倍数60000倍，观察经5％磷钨酸负染、固定于喷碳的铜网上的PCV3病毒样颗粒，结果显示大量的病毒样颗粒，且大小均匀，呈现为空心粒子状态。

结果表明Triton X-114能够清除重组蛋白中残留的内毒素，且对蛋白的纯度没有影响；同时，也没有影响PCV3病毒样颗粒的形成及稳定形态。

实施例5猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物的制备

将按实施例4的方法纯化后的Cap蛋白缓缓加入到水溶性佐剂Gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀。免疫原性组合物的具体配方见表2。

表2 猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物配比

实施例6猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物免疫原性试验

将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体均为阴性的健康仔猪25头随机分成5组，5头/组，免疫实施例5制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物。第1～4组仔猪分别免疫免疫原性组合物1～4，第5组仔猪不免疫作为攻毒对照组。各免疫组仔猪注射免疫原性组合物2ml/头，攻毒对照组仔猪接种生理盐水2ml/头。免疫后28日各组进行攻毒，攻毒剂量为猪圆环病毒3型SG株(Porcine Circovirus type 3，strain SG，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201712，保藏日期为2017年3月23日，保藏地址：中国武汉·武汉大学)，10^5.0TCID₅₀/头，攻毒后连续观察各组仔猪，攻毒后25天剖杀所有试验猪，根据各组仔猪临床症状、病理变化和病毒检测结果进行判定，具体结果见表3。

表3 猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物免疫原性试验结果

结果显示，猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物免疫仔猪后，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病。表明本发明提供的猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物具有很好的保护力。

实施例7猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物广谱性保护试验

将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体均为阴性的健康仔猪50头随机分成10组，5头/组，第6～10组免疫实施例5制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物1，第11～15组不免疫作为攻毒对照组。各免疫组仔猪注射免疫原性组合物2ml/头，对照组仔猪接种生理盐水2ml/头。免疫后28日进行攻毒，第6组、第11组仔猪用新近从中国河南省分离的猪圆环病毒3型HN12株强毒株攻毒；第7组、第12组仔猪用新近从中国江苏省分离的猪圆环病毒3型JS08株强毒株攻毒；第8组、第13组仔猪用新近从中国吉林省分离的猪圆环病毒3型JL11株强毒株攻毒；第9组、第14组仔猪用新近从中国重庆市分离的猪圆环病毒3型CQ04株强毒株攻毒；第10组、第15组仔猪用新近从中国广东省分离的猪圆环病毒3型GD05株强毒株攻毒；攻毒剂量均为10^5.0TCID₅₀/头，攻毒后连续观察各仔猪，于攻毒后25天剖杀所有试验猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测进行判定，具体结果见表4。

表4 猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物广谱性保护试验结果

结果显示，第11～15组各对照组攻毒后均不同程度出现体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓等临床症状，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点的病理变化，通过各内脏、器官组织进行PCR检测，可再次分离到猪圆环病毒3型病毒；而第6～10组各免疫组攻毒后无异常临床症状，剖检各组织器官也无异常，通过各内脏、器官组织进行PCR检测，均显示PCV3阴性。表明本发明提供的猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物可对猪只针对不同地域来源的猪圆环病毒3型攻毒提供有效的、完全免疫保护，且从各内脏、器官组织中不能检出攻毒的PCV3株。本发明的免疫原性组合物具有广谱的免疫原性，对于不同地域来源的猪圆环病毒3型均能提供完全保护。由于免疫后猪体中没有感染的病毒，本发明的免疫原性组合物对于感染了PCV3的猪场的净化有重要意义。

实施例8猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物应用试验

在国内一商品化猪场，与历史平均值相比，出现母猪死亡率增加8.9％，受孕率降低了1.4％，木乃伊胎增加8.5％的现象。临床表现上，受影响的母猪表现厌食，呈多灶性丘疹，斑点和表面皮炎的症状。在流产的窝中含有不同胎龄的木乃伊化胎儿，将具有临床表现症状的母猪中选取38头怀孕母猪随机分成两组A组、B组，19头/组，A组为免疫原性组合物接种组，A组免疫实施例5制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物1，B组为空白对照组。免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，空白对照组接种生理盐水2ml/头。统计两组母猪产子情况，结果见表5。

表5 母猪产子统计结果

结果显示，免疫组母猪产子无异常，生产健康仔猪，平均11.79头/窝，健康率高达99.6％，而对照组出现明显的木乃伊胎及弱仔猪情况，生产健康仔猪平均7.6头/窝，健康率65.0％，其中还有两头母猪出现流产情况，全窝木乃伊胎，免疫组和对照组差异显著。

表5的结果证明了本发明猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物对感染猪圆环病毒3型的母猪有着良好的免疫保护作用，且能针对已经感染了PCV3病毒的母猪、所产仔猪进行保护。

同时，对B组对照组所产健康仔猪分别隔离、按窝饲养，作为以下实验的对象，17窝分成两组B1组(包括B-1窝至B-15窝，除B-4窝因全窝木乃伊胎不计外，共14窝仔猪)、B2组(包括B-16至B-19窝，除B-18窝因全窝木乃伊胎不计外，共3窝仔猪)，B1组吃母乳之前免疫实施例5制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物1，B2组为空白对照组。免疫组仔猪注射免疫原性组合物2ml/头，空白对照组仔猪接种生理盐水2ml/头。连续观察各仔猪，死亡仔猪即时解剖，于25天剖杀B1组抽检仔猪及B2组存活仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测进行判定，具体结果见表6。

表6 猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物对仔猪的免疫保护试验

结果显示，免疫组仔猪无异常临床症状，随机剖检各组织器官也无异常，通过剖检猪只各内脏、器官组织进行PCR检测，均显示PCV3阴性，而空白对照组仔猪均不同程度出现体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓等临床症状，部分猪只死亡，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点的病理变化，通过各内脏、器官组织进行PCR检测，可再次分离到猪圆环病毒3型。

由于PCV3在猪群中是可以通过垂直传播的，因此表6的结果证明了本发明猪圆环病毒3型Cap蛋白免疫原性组合物对感染猪圆环病毒3型的仔猪有着良好的免疫保护作用，且能针对已经感染了PCV3病毒的仔猪进行保护，保护率为100％。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司 斯澳生物科技（苏州）有限公司

<120> 一种猪圆环病毒3型免疫原性组合物、制备方法和应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 645

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒3型

<400> 1

atgcgtcacc gtgctatctt ccgtcgtcgt ccgcgtccgc gtcgtcgtcg tcgtcaccgt 60

cgtcgttacg ctcgtcgtaa actgttcatc cgtcgtccga ccgctggtac ctactacacc 120

aaaaaatact ctaccatgaa cgttatctct gttggtaccc cgcagaacaa caaaccgtgg 180

cacgctaacc acttcatcac ccgtctgaac gaatgggaaa ccgctatctc tttcgaatac 240

tacaaaatcc tgaaaatgaa agttaccctg tctccggtta tctctccggc tcagcagacc 300

aaaaccatgt tcggtcacac cgctatcgac ctggacggtg cttggaccac caacacctgg 360

ctgcaggacg acccgtacgc tgaatcttct acccgtaaag ttatgacctc taaaaaaaaa 420

cactctcgtt acttcacccc gaaaccgctg ctggctggta ccacctctgc tcacccgggt 480

cagtctctgt ctttcttctc tcgtccgacc ccgtggctga acacctacga cccgaccgtt 540

cagtggggtg ctctgctgtg gtctatctac gttccggaaa aaaccggtat gaccgacttc 600

tacggtacca aagaagtttg gatccgttac aaatctgttc tgtaa 645

Claims (12)

1.一种猪圆环病毒3型免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物包括免疫量的所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原以及兽医学上可接受的载体；所述猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原为Cap蛋白或重组有所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的活载体；其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白为序列SEQ.ID No.1编码的蛋白。

2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为≥20μg/ml。

3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml。

4.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为20μg/ml～50μg/ml。

5.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为30μg/ml～50μg/ml。

6.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述重组有所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的活载体为重组减毒沙门氏菌、重组新城疫病毒、重组痘病毒、或重组腺病毒。

7.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述兽医学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂为Gel佐剂，所述佐剂用量为体积比5～20％。

8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中，所述佐剂用量为体积比10％。

9.一种制备权利要求1所述免疫原性组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)克隆所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白为序列SEQ.ID No.1编码的蛋白，并将所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因重组到表达载体以获得含有所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的重组表达载体；

步骤(2)将所述含有所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的重组表达载体和分子伴侣的表达载体共同转化大肠杆菌，表达所述猪圆环病毒3型Cap蛋白；

步骤(3)分离所述表达的猪圆环病毒3型Cap蛋白，使用非离子表面活性剂处理除去内毒素；以及

步骤(4)将所述去除内毒素的猪圆环病毒3型Cap蛋白与佐剂混匀，得到所述免疫原性组合物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述步骤(1)中所述含有猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的重组表达载体为重组pET28a质粒，所述步骤(2)中所述分子伴侣的表达载体为pG-Tf2，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；所述步骤(3)中非离子表面活性剂为Triton X-114。

11.根据权利要求1～8所述的免疫原性组合物在制备预防猪圆环病毒3型相关疾病的药物中的应用。

12.一种猪圆环病毒3型Cap蛋白，其蛋白序列为SEQ.ID No.1所编码。