CN109306360B - 一种利用杆状病毒表达外源蛋白的方法及其应用 - Google Patents
一种利用杆状病毒表达外源蛋白的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种杆状病毒高效表达外源蛋白的方法的方法，该方法通过在病毒吸附后使用D‑氨基葡萄糖细胞孵育细胞，能显著提高外源蛋白的表达量，表达量能提高一倍。该方法适应性广，能针对多种外源蛋白进行高效表达。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及利用杆状病毒表达外源蛋白的方法。
背景技术
杆状病毒是一类双链DNA病毒，自然界中主要感染鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫。杆状病毒基因组可以插入较大片段外源基因、表达外源蛋白，表达的外源蛋白具有较好的修饰加工，具有良好的生物学活性，至今已用杆状病毒表达的蛋白有千种，杆状病毒表达系统已被公认为是优良的表达系统。
然而，如何提高杆状病毒表达系统表达外源蛋白的表达量一直是国内外学者研究的方向，多数是通过改造杆状病毒来实现提高外源蛋白表达量。虽然经过改造的杆状病毒在一定程度上提高了外源蛋白的表达量，但是杆状病毒的改造都是针对具体外源基因来进行的特定改造，不适合其他的外源蛋白的高效表达，为此，本发明提供一种应用范围更广、针对不同蛋白的杆状病毒高效表达的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种针对不同外源蛋白的利用杆状病毒高效表达的方法。
本发明通过对培养昆虫细胞的孵育，使得细胞能对杆状病毒携带的外源蛋白高效表达，能显著提高外源蛋白的表达量，表达量能提高一倍或以上。且本发明方法可应用到多种外源蛋白的高效表达，具有广泛的适用范围。
本发明使用的表达体系对表达的蛋白在安全性、免疫原性和免疫效力、对动物的生长发育无不良反应，能应用于制备疫苗。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明提供一种杆状病毒表达外源蛋白的方法，包括如下步骤：步骤(1)细胞的培养：将昆虫细胞经传代、加入培养基培养所述昆虫细胞，形成生长良好的细胞单层；步骤(2)病毒接种与吸附：将重组有外源蛋白基因的重组杆状病毒接种于所述步骤(1)中所述的细胞单层，进行病毒吸附；步骤(3)细胞的孵育：待所述步骤(2)所述的重组杆状病毒吸附完成后，加入D-氨基葡萄糖进行细胞孵育；步骤(4)外源蛋白的表达：待所述步骤(3)所述细胞孵育完成后，将D-氨基葡萄糖洗去，加入培养基培养细胞以扩增重组杆状病毒、表达外源蛋白；以及步骤(5)收获所述表达的外源蛋白：收集培养基中所述表达的外源蛋白。本发明的杆状病毒表达外源蛋白的方法能显著提高外源蛋白的表达量，表达量能提高一倍以上。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的杆状病毒表达外源蛋白的方法中，所述步骤(1)中所述昆虫细胞为sf21、sf9、或High five细胞。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的杆状病毒表达外源蛋白的方法中，所述昆虫细胞为High five细胞。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的杆状病毒表达外源蛋白的方法中，所述步骤(3)中所述D-氨基葡萄糖细胞孵育时间为40～80分钟。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的杆状病毒表达外源蛋白的方法中，所述D-氨基葡萄糖细胞孵育时间为60分钟。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的杆状病毒表达外源蛋白的方法中，所述步骤(3)中所述细胞孵育中D-氨基葡萄糖浓度为30mM～80mM。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的杆状病毒表达外源蛋白的方法中，所述步骤(3)中所述细胞孵育中D-氨基葡萄糖浓度为40mM～70mM。
本发明所述的杆状病毒表达外源蛋白的方法中，当D-氨基葡萄糖浓度为40mM～70mM范围时，能更显著地提高外源蛋白的表达量。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的杆状病毒表达外源蛋白的方法中，所述步骤(1)和步骤(4)中所述培养基为IB905SFM pro、Sf-900ⅡSFM、或Insect-XPRESSTM培养基。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的杆状病毒表达外源蛋白的方法中，所述步骤(2)中所述外源蛋白包括禽腺病毒Penton蛋白、禽腺病毒Fiber-2蛋白、禽减蛋综合征病毒Penton蛋白、禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白、猪圆环病毒3型Cap蛋白、猪圆环病毒2型Cap蛋白、猪伪狂犬病病毒gB蛋白、猪伪狂犬病病毒gD蛋白、猪细小病毒VP2蛋白、猪瘟病毒E2蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白、口蹄疫病毒VP0蛋白、口蹄疫病毒VP3蛋白、口蹄疫病毒VP1蛋白、兔瘟病毒VP60蛋白。
本发明还涉及所述方法在制备外源蛋白中的应用。
本发明还涉及所述制备的外源蛋白制备的疫苗组合物，使用本发明上述方法制备的外源蛋白，加入药学上可接受的载体，制备亚单位疫苗组合物。
本发明制备方法制备的外源蛋白，在生物安全性上、免疫原性和免疫效力、对动物的生长发育无不良反应，可以制备亚单位疫苗。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括白油、德雷克油，以及动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及金属盐；或MontanideTM Gel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。
本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。油佐剂既可以是自然来源，也可以是经过人工合成获得的。术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，(3)疫苗可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成，或(4)MontanideTMGel。
尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical ApplicationofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley andSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。
特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。
适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
本发明的亚单位疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物中。例如，本发明的组合物还可以包含以下试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
可以根据本发明的亚单位疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。
优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1 不同孵育剂对杆状病毒表达的影响
本实施例选用D-氨基葡萄糖、NH4Cl、ConA、精氨酸、亮氨酸孵育昆虫细胞，来验证杆状病毒表达外源基因的效率。
在75cm2细胞瓶中各接种4×106的Hi5细胞，贴壁后，去除培养基，用MOI＝0.1的禽腺病毒Fiber-2基因重组杆状病毒感染细胞，禽腺病毒Fiber-2基因序列如SEQ.ID NO.1所示；同步加入配制好的D-氨基葡萄糖、NH4Cl、ConA、精氨酸、亮氨酸孵育液，具体添加终浓度见表1。孵育60分钟后去除孵育液，用培养基冲洗细胞3次，添加培养基，放置于27℃培养箱培养48小时后，收获细胞，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量。结果见表2。
表1 各孵育剂不同浓度添加分组情况
表2 不同孵育剂不同含量对蛋白表达的影响结果
结果显示，当添加不同孵育剂时，只有D-氨基葡萄糖处理细胞，才能对蛋白表达量有显著的增加，而其他的孵育剂：NH4Cl、ConA、精氨酸、亮氨酸孵育细胞，不能增加蛋白的表达量或对蛋白的表达有负面的影响。
本实施例说明了孵育剂D-氨基葡萄糖能增加杆状病毒表达外源蛋白的表达量。
实施例2 不同浓度的D-氨基葡萄糖对杆状病毒表达的影响
为进一步弄清楚D-氨基葡萄糖浓度的不同对杆状病毒表达外源基因的表达量的影响，在实施例1试验的基础上，进一步细化不同浓度范围D-氨基葡萄糖孵育昆虫细胞，来验证在不同浓度的D-氨基葡萄糖孵育下杆状病毒表达外源基因的效率。
在75cm2细胞瓶中各接种4×106的Hi5细胞，贴壁后，去除培养基，用MOI＝0.1的禽腺病毒Fiber-2基因重组杆状病毒感染细胞，同步加入配制好的D-氨基葡萄糖，具体添加终浓度见表3。孵育60分钟后去除孵育液，用培养基冲洗细胞3次，添加培养基，放置于27℃培养箱培养48小时后，收获细胞，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白禽腺病毒Fiber-2得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量。结果见表4。
表3 D-氨基葡萄糖不同添加浓度分组
| 组别 | F1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 | F7 | F8 | F9 | F10 |
| 浓度(mM) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 | 100 |
表4 不同浓度D-氨基葡萄糖对蛋白表达的影响结果
结果显示，不同浓度D-氨基葡萄糖处理细胞，对蛋白表达量都有显著的增加，尤其是30mM～80mM浓度范围，对蛋白表达量增加60％～100％。在40mM～70mM浓度范围，蛋白表达量能增加100％。
本实施例说明了合适的浓度范围的D-氨基葡萄糖处理细胞，更能显著的增加外源蛋白禽腺病毒Fiber-2蛋白的表达量。
实施例3 禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗的制备
同时按照实施例2中的过程制备未添加D-氨基葡萄糖处理细胞所表达的禽腺病毒Fiber-2蛋白。
将制备的禽腺病毒Fiber-2蛋白缓缓加入到白油佐剂中，同时开动电机，17500r/min搅拌5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。其中疫苗1为未添加D-氨基葡萄糖处理细胞所表达蛋白制备，疫苗2为添加D-氨基葡萄糖处理细胞所表达蛋白制备，具体配比见表5。
表5 禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗配比
| 组分 | 疫苗1 | 疫苗2 |
| Fiber-2蛋白(AGP效价) | 1：4 | 1：4 |
| 白油佐剂(V/V％) | 66％ | 66％ |
实施例4 禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗安全性试验
取21日龄的SPF鸡45只，每组15只，第1组～第2组分别经颈部皮下注射免疫实施例3制备的疫苗1和疫苗2，免疫剂量为0.6ml，第3组皮下注射0.6ml生理盐水，作为空白对照。相同条件下饲养，观察3周临床症状、增重率、死亡率，在3周、4周、5周各解剖5只，观察接种部位是否形成肉眼病变。结果显示(见表6、表7)，疫苗1、疫苗2接种组中未看到临床症状表现和死亡的动物，且两组无差异，此外接种组和对照组的增重率未表现出明显的差异，也未见有肉芽肿形成，表明本发明D-氨基葡萄糖处理细胞所表达蛋白制备的禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗用于免疫鸡是安全的。且在免疫本发明制备方法制备的疫苗组合物后，在体重增加上能保证与空白对照组相同增加的水平。
表6 禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗安全性试验临床症状和死亡情况
表7 禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗安全性试验鸡只体重变化和肉芽肿形成情况
实施例5 禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫原性试验
取21日龄的SPF鸡30只，分成3组，每组10只，第4组～第5组分别经颈部皮下注射免疫实施例3制备的疫苗1和疫苗2，免疫剂量为0.3ml，第6组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，用FAV-HN株(禽腺病毒，FAV-HN株(Fowlaviadenovirus,strain FAV-HN)，保藏号为：CCTCC NO.V201609，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2016年2月29日)病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表8。
表8 两种禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫原性试验结果
结果显示，第6组对照组全部发病死亡，而第4组～第5组免疫组对免疫鸡均产生了较好的免疫保护效果，免疫效果良好。表明本发明D-氨基葡萄糖处理细胞所表达蛋白制备的禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗对免疫原性没有影响，可对鸡群提供有效的免疫保护。
实施例6D-氨基葡萄糖对杆状病毒表达禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白的影响
在75cm2细胞瓶中各接种4×106的Hi5细胞，贴壁后，去除培养基，用MOI＝0.1的禽减蛋综合征病毒Fiber基因重组杆状病毒，感染细胞，禽减蛋综合征病毒Fiber基因序列如SEQ.ID NO 2所示；同步加入配制好的D-氨基葡萄糖，具体添加终浓度见表9。孵育60分钟后去除孵育液，用培养基冲洗细胞3次，添加培养基，放置于27℃培养箱培养48小时后，收获细胞，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量。结果见表10。
表9 禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白表达不同孵育剂含量分组
| 组别 | G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 | G7 | G8 | G9 | G10 |
| 浓度(mM) | 0 | 0.5 | 2 | 10 | 30 | 40 | 70 | 80 | 100 | 200 |
表10 不同孵育剂含量下禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白表达结果
结果显示，不同浓度D-氨基葡萄糖处理细胞，对禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白表达量都有显著的增加，尤其是30mM～80mM浓度范围，对蛋白表达量增加60％～100％。在40mM～70mM浓度范围，蛋白表达量能增加100％。
本实施例说明了合适的浓度范围的D-氨基葡萄糖处理细胞，能更显著的增加外源蛋白禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白的表达量。
实施例7 禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白亚单位疫苗的制备
同时制备未添加D-氨基葡萄糖处理细胞所表达禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白。
将上述实施例制备的禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白缓缓加入到白油佐剂中，同时开动电机，17500r/min搅拌5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。其中疫苗3为未添加D-氨基葡萄糖处理细胞所表达蛋白制备，疫苗4为添加D-氨基葡萄糖处理细胞所表达蛋白制备，具体配比见表11。
表11 禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白亚单位疫苗配比
| 组分 | 疫苗3 | 疫苗4 |
| Fiber蛋白(HA效价) | 1：32 | 1：32 |
| 白油佐剂(V/V％) | 66％ | 66％ |
实施例8 禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白亚单位疫苗安全性试验
取21日龄的SPF鸡45只，每组15只，第7组～第8组分别经颈部皮下注射免疫实施例7制备的疫苗3和疫苗4，免疫剂量为1.0ml，第9组皮下注射1.0ml生理盐水，作为空白对照。相同条件下饲养，观察3周临床症状、增重率、死亡率，在3周、4周、5周各解剖5只，观察接种部位是否形成肉眼病变。结果显示(见表12、表13)，疫苗3、疫苗4接种组中未看到临床症状表现和死亡，且两组无差异，此外接种组和对照组的增重率未表现出明显的差异，也未见有肉芽肿形成，表明本发明D-氨基葡萄糖处理细胞所表达蛋白制备的禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白亚单位疫苗用于免疫鸡是安全的。且在免疫本发明制备方法制备的疫苗组合物后，在体重增加上能保证与空白对照组相同增加的水平。
表12 禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白亚单位疫苗安全性试验临床症状和死亡情况
表13禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白亚单位疫苗安全性试验鸡只体重变化和肉芽肿形成情况
实施例9 禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白亚单位疫苗免疫原性试验
取21日龄的SPF鸡30只，分成3组，每组10只，第10组～第11组分别经颈部皮下注射免疫实施例7制备的疫苗3和疫苗4，免疫剂量为0.5ml，第12组皮下注射0.5ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，每只鸡分别采血，分离血清，测定血清禽减蛋综合征HI抗体效价。结果见表14。
表14 两种禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白亚单位疫苗免疫原性试验结果
结果显示，第12组对照组免后21日HI抗体效价为0，而第10组～第11组免疫组对免疫鸡均产生了较高的HI抗体效价,免疫效果良好。表明本发明D-氨基葡萄糖处理细胞所表达蛋白制备的禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白亚单位疫苗对免疫原性没有影响，可对鸡群提供有效的免疫保护。
实施例10 D-氨基葡萄糖对杆状病毒表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的影响
在75cm2细胞瓶中各接种4×106的Hi5细胞，贴壁后，去除培养基，用MOI＝0.1的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因重组杆状病毒(鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列公开于中国专利申请CN103849631A)感染细胞，同步加入配制好的D-氨基葡萄糖，具体添加终浓度见表15。孵育60分钟后去除孵育液，用培养基冲洗细胞3次，添加培养基，放置于27℃培养箱培养48小时后，收获细胞，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量。结果见表16。
表15 鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白表达不同孵育剂含量分组
| 组别 | H1 | H2 | H3 | H4 | H5 | H6 | H7 | H8 | H9 | H10 |
| 浓度(mM) | 0 | 0.5 | 2 | 10 | 30 | 40 | 70 | 80 | 100 | 200 |
表16 不同孵育剂含量下鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白表达结果
结果显示，不同浓度D-氨基葡萄糖处理细胞，对鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白表达量都有显著的增加，尤其是30mM～80mM浓度范围，对蛋白表达量增加60％～100％。在40mM～70mM浓度范围，蛋白表达量能增加100％。
本实施例说明了合适的浓度范围的D-氨基葡萄糖处理细胞，能更显著的增加外源蛋白鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的表达量。
实施例11 D-氨基葡萄糖对杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的影响
在75cm2细胞瓶中各接种4×106的Hi5细胞，贴壁后，去除培养基，用MOI＝0.1的猪圆环病毒3型Cap基因重组杆状病毒感染细胞，猪圆环病毒3型Cap基因序列如SEQ.ID NO 3所示；同步加入配制好的D-氨基葡萄糖，具体添加终浓度见表17。孵育60分钟后去除孵育液，用培养基冲洗细胞3次，添加培养基，放置于27℃培养箱培养48小时后，收获细胞，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白猪圆环病毒3型Cap蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量。结果见表18。
表17 猪圆环病毒3型Cap蛋白表达不同孵育剂含量分组
| 组别 | I1 | I2 | I3 | I4 | I5 | I6 | I7 | I8 | I9 | I10 |
| 浓度(mM) | 0 | 0.5 | 2 | 10 | 30 | 40 | 70 | 80 | 100 | 200 |
表18 不同孵育剂含量下猪圆环病毒3型Cap蛋白表达结果
结果显示，不同浓度D-氨基葡萄糖处理细胞，对猪圆环病毒3型Cap蛋白表达量都有显著的增加，尤其是30mM～80mM浓度范围，对蛋白表达量增加60％～100％。在40mM～70mM浓度范围，蛋白表达量能增加100％。
本实施例说明了合适的浓度范围的D-氨基葡萄糖处理细胞，能更显著的增加外源蛋白猪圆环病毒3型Cap蛋白的表达量。
实施例12 猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗的制备
同时制备未添加D-氨基葡萄糖处理细胞所表达猪圆环病毒3型Cap蛋白。
将制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白缓缓加入到水溶性佐剂Gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀。其中疫苗5为未添加D-氨基葡萄糖处理细胞所表达蛋白制备，疫苗6为添加D-氨基葡萄糖处理细胞所表达蛋白制备，疫苗具体配方见表19。
表19 猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗配比
| 组分 | 疫苗5 | 疫苗6 |
| Cap蛋白(μg/ml) | 30 | 30 |
| Gel佐剂(V/V％) | 10％ | 10％ |
实施例13 猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗安全性试验
将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪45头随机分成3组，15头/组，第13组～第14组分别经颈部皮下注射免疫实施例12制备的疫苗5和疫苗6，免疫剂量为4ml，第15组皮下注射4ml生理盐水，作为空白对照。相同条件下饲养，观察3周临床症状、增重率、死亡率，在3周、4周、5周各解剖5只，观察接种部位是否形成肉眼病变。结果显示(见表20、表21)，疫苗5、疫苗6接种组中未看到临床症状和死亡，两组无差异，此外接种组和对照组的增重率未表现出明显的差异，也未见有肉芽肿形成，表明本发明D-氨基葡萄糖处理细胞所表达蛋白制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗用于免疫猪是安全的。且在免疫本发明制备方法制备的疫苗组合物后，在体重增加上能保证与空白对照组相同增加的水平。
表20 猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗安全性试验临床症状和死亡情况
表21 猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗安全性试验猪只体重变化和肉芽肿形成情况
实施例14 猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗免疫原性试验
将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪15头随机分成3组，5头/组，免疫实施例12制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗。第16～17组分别免疫疫苗5～6，第18组不免疫作为对照组。各免疫组注射疫苗2ml/头，对照组接种生理盐水2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为SG株猪圆环病毒(猪圆环病毒3型SG株(PorcineCircovirus type 3，strain SG)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201712，保藏日期为2017年3月23日，保藏地址：中国武汉·武汉大学)105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测结果进行判定，具体结果见表22。
表22 两种猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗免疫原性试验结果
结果显示，猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗免疫仔猪后，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照仔猪攻毒后全部发病。表明本发明D-氨基葡萄糖处理细胞所表达蛋白制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗对免疫原性没有影响，具有很好的保护力，可对猪群提供有效的免疫保护。
实施例15 D-氨基葡萄糖对杆状病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的影响
在75cm2细胞瓶中各接种4×106的Hi5细胞，贴壁后，去除培养基，用MOI＝0.1的猪圆环病毒2型Cap基因重组杆状病毒(猪圆环病毒2型Cap基因序列公开于中国专利申请CN101920012A)感染细胞，同步加入配制好的D-氨基葡萄糖，具体添加终浓度见表23。孵育60分钟后去除孵育液，用培养基冲洗细胞3次，添加培养基，放置于27℃培养箱培养48小时后，收获细胞，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白猪圆环病毒2型Cap蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量。结果见表24。
表23 猪圆环病毒2型Cap蛋白表达不同孵育剂含量分组
| 组别 | J1 | J2 | J3 | J4 | J5 | J6 | J7 | J8 | J9 | J10 |
| 浓度(mM) | 0 | 0.5 | 2 | 10 | 30 | 40 | 70 | 80 | 100 | 200 |
表24 不同孵育剂含量下猪圆环病毒2型Cap蛋白表达结果
结果显示，不同浓度D-氨基葡萄糖处理细胞，对猪圆环病毒2型Cap蛋白表达量都有显著的增加，尤其是30mM～80mM浓度范围，对蛋白表达量增加60％～100％。在40mM～70mM浓度范围，蛋白表达量能增加100％。
本实施例说明了合适的浓度范围的D-氨基葡萄糖处理细胞，能更显著的增加外源蛋白猪圆环病毒3型Cap蛋白的表达量。
实施例16 D-氨基葡萄糖对杆状病毒表达猪伪狂犬病病毒gD蛋白的影响
在75cm2细胞瓶中各接种4×106的Hi5细胞，贴壁后，去除培养基，用MOI＝0.1的猪伪狂犬病病毒gD基因重组杆状病毒(猪伪狂犬病病毒gD基因序列公开于中国专利申请CN104004774A)感染细胞，同步加入配制好的D-氨基葡萄糖，具体添加终浓度见表25。孵育60分钟后去除孵育液，用培养基冲洗细胞3次，添加培养基，放置于27℃培养箱培养48小时后，收获细胞，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白猪伪狂犬病病毒gD蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量。结果见表26。
表25 猪伪狂犬病病毒gD蛋白表达不同孵育剂含量分组
| 组别 | K1 | K2 | K3 | K4 | K5 | K6 | K7 | K8 | K9 | K10 |
| 浓度(mM) | 0 | 0.5 | 2 | 10 | 30 | 40 | 70 | 80 | 100 | 200 |
表26 不同孵育剂含量下猪伪狂犬病病毒gD蛋白表达结果
结果显示，不同浓度D-氨基葡萄糖处理细胞，对猪伪狂犬病病毒gD蛋白表达量都有显著的增加，尤其是30mM～80mM浓度范围，对蛋白表达量增加60％～100％。在40mM～70mM浓度范围，蛋白表达量能增加100％。
也进一步说明了合适的浓度范围的D-氨基葡萄糖处理细胞，能更显著的增加外源蛋白猪伪狂犬病病毒gD蛋白的表达量。
实施例17 D-氨基葡萄糖对杆状病毒表达猪细小病毒VP2蛋白的影响
在75cm2细胞瓶中各接种4×106的Hi5细胞，贴壁后，去除培养基，用MOI＝0.1的猪细小病毒VP2基因重组杆状病毒(猪细小病毒VP2基因序列公开于中国专利申请CN103908664A)感染细胞，同步加入配制好的D-氨基葡萄糖，具体添加终浓度见表27。孵育60分钟后去除孵育液，用培养基冲洗细胞3次，添加培养基，放置于27℃培养箱培养48小时后，收获细胞，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白猪细小病毒VP2蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量。结果见表28。
表27 猪细小病毒VP2蛋白表达不同孵育剂含量分组
| 组别 | L1 | L2 | L3 | L4 | L5 | L6 | L7 | L8 | L9 | L10 |
| 浓度(mM) | 0 | 0.5 | 2 | 10 | 30 | 40 | 70 | 80 | 100 | 200 |
表28不同孵育剂含量下猪细小病毒VP2蛋白表达结果
结果显示，不同浓度D-氨基葡萄糖处理细胞，对猪细小病毒VP2蛋白表达量都有显著的增加，尤其是30mM～80mM浓度范围，对蛋白表达量增加60％～100％。在40mM～70mM浓度范围，蛋白表达量能增加100％。
本实施例说明了合适的浓度范围的D-氨基葡萄糖处理细胞，能更显著的增加外源蛋白猪细小病毒VP2蛋白的表达量。
实施例18 D-氨基葡萄糖对杆状病毒表达猪瘟E2蛋白的影响
在75cm2细胞瓶中各接种4×106的Hi5细胞，贴壁后，去除培养基，用MOI＝0.1的猪瘟E2基因重组杆状病毒(猪瘟病毒E2基因序列公开于中国专利申请CN105527442A)感染细胞，同步加入配制好的D-氨基葡萄糖，具体添加终浓度见表29。孵育60分钟后去除孵育液，用培养基冲洗细胞3次，添加培养基，放置于27℃培养箱培养48小时后，收获细胞，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白猪瘟E2蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量。结果见表30。
表29 猪瘟E2蛋白表达不同孵育剂含量分组
| 组别 | M1 | M2 | M3 | M4 | M5 | M6 | M7 | M8 | M9 | M10 |
| 浓度(mM) | 0 | 0.5 | 2 | 10 | 30 | 40 | 70 | 80 | 100 | 200 |
表30 不同孵育剂含量下猪瘟E2蛋白表达结果
结果显示，不同浓度D-氨基葡萄糖处理细胞，对猪瘟E2蛋白表达量都有显著的增加，尤其是30mM～80mM浓度范围，对蛋白表达量增加60％～100％。在40mM～70mM浓度范围，蛋白表达量能增加100％。
本实施例说明了合适的浓度范围的D-氨基葡萄糖处理细胞，能更显著的增加外源蛋白猪瘟E2蛋白的表达量。
上述实施例的实验结果显示，使用杆状病毒表达外源蛋白时，通过使用浓度范围30mM～80mM的D-氨基葡萄糖处理细胞，能显著提高不同外源蛋白的表达，其表达量能提高一倍。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 普莱柯生物工程股份有限公司
<120> 一种利用杆状病毒表达外源蛋白的方法及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> 禽腺病毒
<400> 1
atgctccgag cccctaaaag aagacattcc gaaaacgggc agcccgagac tgaagcggga 60
ccttccccgg ctccaatcaa gcgcgcgaaa cgcatggtga gagcatccca gcttgacctg 120
gtttatcctt tcgattacgt ggccgacccc gtcggagggc tcaacccgcc ttttttgggc 180
ggctccggac ccctagtgga ccagggcggt cagcttacgc tcaacgtcac cgatcccatc 240
atcatcaaga acagatcggt ggacttggcc cacgatccca gtctcgatgt caacgcccaa 300
ggtcaactgg cggtggccgt tgaccccgaa ggggccctgg acatcacccc cgatggactg 360
gacgtcaagg tcgacggagt aaccgtgatg gtcaacgatg actgggaact ggccgtaaaa 420
gtcgacccgt ccggcggatt ggattccact gcgggcggac tgggggtcag cgtggacgac 480
accttgctcg tggatcaggg agaactgggc gtacacctca accaacaagg acccatcact 540
gccgatagca gtggtatcga cctcgagatc aatcctaaca tgttcacggt caacacctcg 600
accggaagcg gagtgctgga actcaaccta aaagcgcagg gaggcatcca agccggcagt 660
tcgggagtgg gcgtttccgt ggatgaaagc ctagagattg tcaacaacac gctggaagtg 720
aaaccggatc ccagcggacc gcttacggtc tccgccaatg gcctagggct gaagtacgac 780
agcaataccc tggcggtgac cgcgggcgct ttgaccgtag taggaggggg aagcgtctcc 840
acacccatcg ctacttttgt ctcgggaagt cccagcctca acacctacaa tgccacgatc 900
gtcaattcca gctcgcaccc cttctcttgt gcctactacc ttcaacagtg gaacgtacaa 960
gggctccttt ttacctccct ctacgtgaaa ctggacagca ccaccatggg gactcgccct 1020
ggggacaaca gctccgccaa tgccaaatgg ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag 1080
caatgcaacc cctccgggat tcaagcggga acggtcagcc cctccaccgc cgccctcgcg 1140
gactttgaac ccatggccaa taggagcgtg tccagcccat ggacgtactc ggccaatgca 1200
tactatcaac catccagcgg agaattccaa gtgttcaccc cggtggtaac gggtgcctgg 1260
aacccgggaa acatagggat ccgcgtcctc ccagtgccgg ttacggcctc tggagaccgc 1320
tacacccttc tatgctacag tttgcagtgc acgaactcga gcatttttaa tccagccaac 1380
agcggaacta tgatcgtggg acccgtgctc tacagctgtc cagcagcctc cgtcccgtaa 1440
<210> 2
<211> 1932
<212> DNA
<213> 禽减蛋综合征病毒
<400> 2
atgaagcgac tacggttgga ccctgatcct gtttatccct tcgggacgag cgagacgatc 60
ccaatgcctc cgttcatcga agctgggtca ggtctagcag taaatggact gcagctttat 120
ataacagctc aagctccggt gggcttcacc aacaaagctg taacattaaa atatggagat 180
ggattggaag taaatgaaaa tggagaactc atagctacgg cttcttcggc agtaaagcca 240
ccactccatt ttgatagggg ttatatagtg ttaaatcttc aggatccatt gggtgttatt 300
gatgggaagc ttggggtcaa gttaggccct ggggttcaca tcaatggtga aggggctgtg 360
gcggtagaat cccctgtgga ccccattaca cttgatacgg ctggtagaat tactttaaat 420
tatggcacag gtttaaatgt gagtgatgga aaattacgac tagtaagtcc tgaaagtccg 480
ctcacacttc ttggaaatgg caaggttgct cttaattttg gtaattcaat ggagcttgtg 540
caagggacct tgcaactgaa agctccgcta aatcctttgt tcatgacccc cgcgggtgcg 600
atcggcttaa gggtggatga catgtttaac atttctgaag gtttactctc cttcaagatg 660
ccatccgatc caatttcgtt taatgctgat ggtatgttgt ctttgaacac aaatgacaca 720
ttgcaaacaa ctggtgggct gttagggttg accgaacctg ccaagccgtt aaaattggcc 780
gatggcaagt taggtgtaaa tgtgggcctt gggttagcgg tttctaatgg gtcattgact 840
gtaaatgcag ggcaggggtt gactattcga aataatgcgg tggcagttaa tgggggcaac 900
acgcttgctt ttaataatta tggagaggtg gaacttaaaa accctagaaa ccccataggc 960
ctgacccaag atggtgaatt ggctttgata atcggttatg gcctaacaac ccttgatgga 1020
cggctcactc tacttaccgc ttcgacctct ccgatagctg tagggccaac cggtgttaca 1080
tttaatgtta caccgagtga tttttacttt ttatctagta aattagctct caatgttgag 1140
acccgtggcg gcttagaaaa aagtgacact ggtttaaaaa ttaaacgtgc ggcccctctc 1200
agtatcacat ctgatggtga gttgactttg gcttatgatt ccacggattt tcaggtgaca 1260
gaaaacggcc tagccctaaa ggtatctccg acgcagaccc ctctcaccag aataatttct 1320
atgggaaata acttgtttga ttctggttat gagatttttg cttcatgtcc gcagaacaaa 1380
gcagcaaagg ttgcagggta tgtgtattta acatcggttg gtgggcttgt acatgggacc 1440
attcagatta aagctactgc ggggtattgg tttacggggg gaaacagcgt gcaggaaagt 1500
atcaggtttg gattggtgtt gtgtcctttt agtgctcgcg accccactgc taacctgtca 1560
ggctggccag cgccagtagt gtggagtggt gatagcaata ctcccctata ttttgcggcc 1620
aatgccatta gttataccaa taaccgtgta aatcttgcag ttaccggtaa cttttacaag 1680
gaggaaaccg aattgccggg ttacactcgt cattctttct gccctaccgg gaccaccgga 1740
atgaatttta cagggggtaa tttgtatgtg tgtccgtgca ctgtaaatac aggggcaacc 1800
acactgaatg ccatttatat ggtgtttgtg attactcaat cagctttggg aactaatttc 1860
tttgcttcta acacccctcc caacacattc tttttaactc cccccattcc ctttacatat 1920
gttggagcac ag 1932
<210> 3
<211> 645
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型
<400> 3
atgagacaca gagctatatt cagaagaaga ccccgcccaa ggagacgacg acgccacaga 60
aggcgctatg ccagaagaaa actattcatt aggaggccca cagctggcac atactacaca 120
aagaaatact ccaccatgaa cgtcatatcc gttggaaccc ctcagaataa caagccctgg 180
cacgccaacc acttcattac ccgcctaaac gaatgggaaa ctgcaatttc ttttgaatat 240
tataagatac taaagatgaa agttacactc agccctgtaa tttctccggc tcagcaaaca 300
aaaactatgt tcgggcacac agccatagat ctagacggcg cctggaccac aaacacttgg 360
ctccaagacg acccttatgc ggaaagttcc actcgtaaag ttatgacttc taaaaaaaaa 420
cacagccgtt acttcacccc caaaccactt ctggcgggaa ctaccagcgc tcacccagga 480
caaagcctct cttttttctc cagacccacc ccatggctca acacatatga ccccaccgtt 540
caatggggag cactgctttg gagcatttat gtcccggaaa aaactggaat gacagacttc 600
tacggcacca aagaagtttg gattcgttac aagtccgttc tctaa 645
Claims (10)
1.一种杆状病毒表达外源蛋白的方法，包括如下步骤：
步骤(1)细胞的培养：将昆虫细胞经传代、加入培养基培养所述昆虫细胞，形成生长良好的细胞单层；
步骤(2)病毒接种与吸附：将重组有外源蛋白基因的重组杆状病毒接种于所述步骤(1)中所述的细胞单层，进行病毒吸附；
步骤(3)细胞的孵育：待所述步骤(2)所述重组杆状病毒吸附完成后，加入D-氨基葡萄糖进行细胞孵育；
步骤(4)外源蛋白的表达：待所述步骤(3)所述细胞孵育完成后，将D-氨基葡萄糖洗去，加入培养基培养细胞以扩增重组杆状病毒、表达外源蛋白；以及
步骤(5)收获所述表达的外源蛋白：收集培养基中所述表达的外源蛋白。
2.根据权利要求1所述方法，其中，所述步骤(1)中所述昆虫细胞为sf21、sf9、或Highfive细胞。
3.根据权利要求1所述方法，其中，所述步骤(1)中所述昆虫细胞为High five细胞。
4.根据权利要求1所述方法，其中，所述步骤(3)中所述D-氨基葡萄糖细胞孵育时间为40～80分钟。
5.根据权利要求1所述方法，其中，所述步骤(3)中所述D-氨基葡萄糖细胞孵育时间为60分钟。
6.根据权利要求1所述方法，其中，所述步骤(3)中所述细胞孵育中D-氨基葡萄糖浓度为30mM～80mM。
7.根据权利要求1所述方法，其中，所述步骤(3)中所述细胞孵育中D-氨基葡萄糖浓度为40mM～70mM。
8.根据权利要求1所述方法，其中，所述步骤(1)和步骤(4)中所述培养基为IB905SFMpro、Sf-900ⅡSFM、或Insect-XPRESSTM培养基。
9.根据权利要求1所述方法，其中，所述步骤(2)中所述外源蛋白包括禽腺病毒Penton蛋白、禽腺病毒Fiber-2蛋白、禽减蛋综合征病毒Penton蛋白、禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白、猪圆环病毒3型Cap蛋白、猪圆环病毒2型Cap蛋白、猪伪狂犬病病毒gB蛋白、猪伪狂犬病病毒gD蛋白、猪细小病毒VP2蛋白、猪瘟病毒E2蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白、口蹄疫病毒VP0蛋白、口蹄疫病毒VP3蛋白、口蹄疫病毒VP1蛋白、兔瘟病毒VP60蛋白。
10.根据权利要求1～9所述方法在制备外源蛋白中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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