CN108624522B - 一种副鸡禽杆菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及副鸡禽杆菌B型HN5株及其制备的疫苗组合物、应用。副鸡禽杆菌B型HN5株具有良好的免疫原性,其制备的单苗、联苗能有效预防现在临床流行的野毒株,具有较现有技术中的商用疫苗更优的免疫效力。
Description
技术领域
本发明属于兽药领域,具体涉及一种副鸡禽杆菌菌株及其制备的疫苗组合物和应用。
背景技术
副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)是一种引起鸡急性上呼吸道疾病的致病菌,分为A、B、C三个血清型。该病首先发现于波兰和美国,以后在其他各国经常发生。1980年以来,我国也屡有本病的报道,主要以A型和C型为主。该呼吸道疾病俗称鸡传染性鼻炎,临床上以面部水肿、鼻窦炎、流泪为主要特征,可引起产蛋鸡的产蛋量下降,育成鸡的生长受阻、开产期推迟,肉鸡增重下降,给养禽业造成巨大的经济损失。虽然此病可采用抗生素及磺胺类药物进行治疗,但会造成药物残留,并且,采用抗生素会造成耐药菌株的出现,导致副鸡禽杆菌在同一鸡群中复发。而针对副鸡禽杆菌的疫苗则能避免该问题,因此,副鸡禽杆菌疫苗的研究成为热点。
国内的鸡传染性鼻炎流行血清型虽然以A型为主,但近年来很多地区也有B型、C型的报道,尤其是B型病原菌分离率高达50%以上,并且现有疫苗时常发生免疫保护失败的现象。所以研究针对现阶段临床上出现的免疫保护失败的鸡传染性鼻炎B型疫苗以及针对A、B、C型三价疫苗,对于我国鸡传染性鼻炎的防治及安全性方面尤为重要。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明提供了一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物,该疫苗组合物能对流行副鸡禽杆菌提供有效的保护,显示出显著的免疫特性。
为此,本发明的一个目的在于提供一种副鸡禽杆菌,所述副鸡禽杆菌为副鸡禽杆菌B型HN5株。
本发明的另一个目的在于提供一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物,所述疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌B型HN5株抗原以及载体。
本发明的另一个目的在于提供一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物,所述疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌A型HN3株抗原、副鸡禽杆菌B型HN5株抗原和副鸡禽杆菌C型SD3株抗原以及载体。
本发明的另一个目的在于提供一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物,所述疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌A型HN3株抗原、副鸡禽杆菌B型HN5株抗原、副鸡禽杆菌C型SD3株抗原和新城疫N7a株抗原以及载体。
本发明的另一个目的是提供一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法,包括:
步骤(1)增殖副鸡禽杆菌;
步骤(2)使用柳硫汞灭活所述步骤(1)增殖的副鸡禽杆菌,加入佐剂,乳化。
本发明的另一个目的在于提供上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗副鸡禽杆菌相关疾病的药物中的应用。
发明优点:
(1)本发明的菌株具有良好的免疫原性,能够刺激机体快速地产生免疫力,且抗体持续维持在一个较高水平,能够有效保护流行株的攻击,具有很好的保护作用。
(2)本发明的菌株生长特性良好,增殖速度快,易于培养,大大降低了生产成本。
(3)本发明的菌株制备的疫苗组合物免疫原性良好,能以较低的抗原含量达到较好的免疫保护作用,进一步降低生产成本。
具体实施方式
以下,对本发明的实施方式进行说明。
为此,本发明的一个目的在于提供一种副鸡禽杆菌,所述副鸡禽杆菌为副鸡禽杆菌B型HN5株(Avibacterium Paragallinarum Serotype B Strain HN5),已于2017年2月22日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号:CCTCC NO:M2017056;保藏地址:中国武汉·武汉大学。
本发明涉及一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物包含所述的副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原和药学上可以接受的载体,所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前≥107.0CFU/ml。
“疫苗组合物”指含有副鸡禽杆菌免疫原性的药物组合物,该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对副鸡禽杆菌的免疫反应。所述疫苗组合物包括免疫量的副鸡禽杆菌的灭活疫苗。
本发明所用的术语“灭活疫苗”,也称作失活疫苗,指的是用作抗原以产生免疫力的灭活菌体的混悬液。灭活疫苗的例子包括全菌疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如,通过用甲醛溶液处理菌体可获得全菌灭活疫苗。例如用本发明的副鸡禽杆菌B型HN5株可以通过灭活的方法制备成灭活疫苗。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型,待治疗的动物的类型和年龄,施用的方式,以及组合物中的其它成分而变化。当副鸡禽杆菌以灭活前少于107.0CFU/ml的量使用时,疫苗不能有效刺激抗体产生。另一方面,超过的量可能是不经济的。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前107.0CFU/ml~109.0CFU/ml。
作为本发明的一种优选实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前3×107.0CFU/ml~108.0CFU/ml。
本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量范围还可以是107.0CFU/ml~3×107.0CFU/ml,或107.0~108.0CFU/ml,或3×107.0CFU/ml~109.0CFU/ml,或者是108.0~109.0CFU/ml。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述药学上可接受的载体包括佐剂,所述佐剂包括(1)氢氧化铝、皂苷、阿夫立定、DDA,(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物,或(3)水包油乳剂、油包水乳剂或水包油包水乳剂。
作为本发明的一种优选实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述佐剂包括(1)皂苷QuilA;(2)丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物与糖或多元醇的聚链烯基醚交联产物卡波姆;或(3)所述佐剂包括基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油的乳剂,例如角鲨烷或角鲨烯;烯烃,特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油,带直链烷基的酸或醇形成的酯,更特别是植物油,油酸乙基酯,丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯),甘油三(辛酸酯/癸酸酯),丙二醇二油酸酯;分支脂肪酸酯或醇的酯,特别是异硬脂酸酯、油与乳化剂一起使用形成乳剂,乳化剂优选非离子表面活性剂;特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸),脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯,脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚,聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物,特别是PluronicR,尤其是L121。
优选地,所述佐剂为氢氧化铝,所述佐剂用量为体积比15%。
术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括,但不限于:(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA,(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物,或(3)疫苗可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成。
尤其是,乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油,例如角鲨烷或角鲨烯;烯烃,特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油,带直链烷基的酸或醇形成的酯,更特别是植物油,油酸乙基酯,丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯),甘油三(辛酸酯/癸酸酯),丙二醇二油酸酯;分支脂肪酸酯或醇的酯,特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂,特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸),脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯,脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚,聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物,特别是PluronicR,尤其是L121(参照Hunter等,1995,“The Theory and Practical ApplicationofAdjuvants”(Steward-Tull,D.E.S主编)John Wiley andSons,NY,51-94;Todd等,Vaccine,1997,15,564-570)。
特别地,丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。
优选地,本发明选用的佐剂为氢氧化铝。
适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型,待治疗的动物的类型和年龄,施用的方式,以及组合物中的其它成分而变化。
本发明还涉及一种制备所述疫苗组合物的方法,其中,所述方法包括:步骤(1)培养所述副鸡禽杆菌B型HN5株;步骤(2)使用柳硫汞灭活所述步骤(1)培养的副鸡禽杆菌B型HN5株培养物,柳硫汞浓度为0.01wt%,在2~8℃灭活5日,在所述灭活后的副鸡禽杆菌B型HN5株培养物中加入佐剂,乳化。
本发明还涉及一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物包含所述的副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原,副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原,副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原,以及药学上可以接受的载体;其中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前≥108.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前≥107.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前≥108.0CFU/ml。
副鸡禽杆菌A型HN3株、副鸡禽杆菌C型SD3株公开于中国专利申请CN106267176A,副鸡禽杆菌A型HN3株保藏号为CCTCC No.M2015051,副鸡禽杆菌C型SD3株保藏号为CCTCCNo.M2015052。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml~109.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前107.0CFU/ml~109.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml~4×109.0CFU/ml。
作为本发明的一种优选实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前5×108.0CFU/ml~109.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前3×107.0CFU/ml~109.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前5×108.0CFU/ml~4×109.0CFU/ml。
本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量范围还可以是108.0CFU/ml~5×108.0CFU/ml。
本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量范围还可以是107.0CFU/ml~3×107.0CFU/ml,或107.0~108.0CFU/ml,或3×107.0CFU/ml~108.0CFU/ml,或者是108.0~109.0CFU/ml。
本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量范围还可以是108.0CFU/ml~5×108.0CFU/ml。
本发明所述疫苗组合物中,三种灭活全菌抗原含量范围可以是上述各自含量范围之间的组合。
作为本发明的一种最优选实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前107.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml。
作为本发明的一种最优选实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前5×108.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前5×108.0CFU/ml。
作为本发明的一种最优选实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前109.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前109.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前4×109.0CFU/ml。
本发明所述的三价疫苗组合物中,药学上可接受的载体可以包括佐剂,所述佐剂可以具有本发明所述单价疫苗组合物同样的选择范围。
优选地,所述佐剂为氢氧化铝,所述佐剂用量为体积比15%。
本发明疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物。例如,本发明的组合物还可以包含试剂,如:药物,免疫刺激剂(如:α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物,可以使用本领域公知的方法。
本发明的疫苗组合物还可以进一步包含其它病原组合使用以制备抵抗包括副鸡禽杆菌感染的各种疾病的复合疫苗。术语“复合疫苗”指细菌和病毒抗原制备的疫苗。例如,本发明的副鸡禽杆菌抗原可与新城疫病毒抗原组合。作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述新城疫病毒抗原为基因Ⅶ型新城疫病毒灭活全病毒抗原、亚单位抗原或合成肽抗原。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述新城疫病毒抗原为基因Ⅶ型新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原。
新城疫病毒株(基因Ⅶ型)N7a株(Newcastle Disease Virus(genotype Ⅶ),strain N7a),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:V201545,保藏日期为2015年10月19日,保藏地址为中国武汉·武汉大学。
本发明还涉及一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物包括所述的副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原,副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原,副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原,基因Ⅶ型新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原以及药学上可以接受的载体;所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml~109.0CFU/ml,所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前107.0CFU/ml~109.0CFU/ml,所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml~4×109.0CFU/ml,所述基因Ⅶ型新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml~109.0EID50/0.1ml。
作为本发明的一种优选实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前5×108.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前3×107.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前5×108.0CFU/ml;所述基因Ⅶ型新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml。
本发明所述的联苗疫苗组合物中,药学上可接受的载体可以包括佐剂,所述佐剂可以具有本发明所述单价疫苗组合物同样选择范围。
优选地,所述佐剂为氢氧化铝,所述佐剂用量为体积比15%。
本发明还涉及上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗副鸡禽杆菌相关疾病的药物中的应用。本发明可以应用的副鸡禽杆菌相关疾病的非穷举性列表包括,如面部水肿、鼻窦炎、流泪、产蛋量下降,育成鸡的生长受阻、蛋鸡开产期推迟,肉鸡增重下降等。
本发明所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制鸡传染性鼻炎或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使副鸡禽杆菌感染引起的症状减轻或好转的所有行为。
实施例1副鸡禽杆菌B型HN5株的分离鉴定
1、病料来源
正常免疫副鸡禽杆菌三价灭活疫苗的养鸡场,出现产蛋率明显下降的情况,且伴随有部分鸡只面部肿胀、流鼻涕和结膜炎等症状发生。随后用抗生素紧急进行治疗,症状无明显改善。为进一步查清原因,选取产蛋下降明显的鸡只进行病原分离。
2、菌株的分离与培养
处死发病鸡,剪下鸡头,放在超净台内,用烧红的刀片烧烙眶下窦外表面,用无菌刀片切开眶下窦,用灭菌棉拭子沾取眶下窦内容物,于鸡肉汤琼脂平板进行划线,37℃、5%CO2培养24~48小时,挑取直径0.3mm左右、圆形、光滑、灰白色、半透明露珠样菌落划线接种于鸡肉汤琼脂平板37℃、5%CO2培养24~48小时,进行纯化培养。
3、菌落种属PCR鉴定及测序分析
取疑似菌株的纯培养物,用核酸提取试剂盒提取样品核酸,使用副鸡禽杆菌种属特异性引物进行PCR扩增鉴定,结果显示,PCR扩增出500bp目的条带。PCR产物送测序公司进行核苷酸序列测定,测定结果进行遗传进化分析。结果显示该菌株属于副鸡禽杆菌。
4、副鸡禽杆菌分离株生物学特性
4.1培养特性
取分离菌株的纯培养物在无NADH的血琼脂平板与金黄色葡萄球菌交叉划线,在含5%~10%CO2的条件下,37℃培养24小时,在葡萄球菌周围会长出卫星菌落。接种鸡肉汤琼脂平板上,在含5%~10%CO2的条件下,37℃培养24小时,形成直径0.3mm左右、圆形、光滑、灰白色、半透明露珠样菌落,用低倍镜以45度折光观察具有较强的荧光。本菌革兰氏染色镜检为革兰氏阴性,两级浓染的短杆菌或球杆菌。
4.2生化特性
取分离菌株的纯培养物,挑取菌落,接种于添加了辅酶的生化鉴定管,进行硝酸盐还原试验,葡萄糖、蔗糖、乳糖发酵试验,过氧化氢酶试验,硫化氢试验,靛基质试验和尿素酶试验,结果见表1。
表1 Apg HN5株生化试验结果
注:+阳性,-阴性。
5、副鸡禽杆菌分离株的致病性
将副鸡禽杆菌分离株的鸡肉汤12小时培养物用PBS(0.01mol/L,pH值7.2)做105倍稀释,卵黄囊接种6~7日龄SPF鸡胚10个,每胚0.2ml,置37℃继续孵化,在30小时内全部死亡;另取60日龄的SPF鸡5只,每只眶下窦内注射鸡肉汤培养物稀释液0.2ml(含2万个活菌),观察7日,所有鸡只在24~48小时内均出现面部一侧或两侧眶下窦及周围肿胀或流鼻涕的症状。且从发病鸡的眶下窦中可再次分离到副鸡禽杆菌。
6、副鸡禽杆菌分离株的血清型鉴定
参考文献(Patrick J,Blackall P.J.,Lorraine E.,Denis G.Proposal of aNew Serovar and Altered Nomenclature for Haemophilus paragallinarum in theKume Hemagglutinin Scheme)中的方法制备抗原进行HA效价测定,根据HA效价制备4单位抗原再用A、B、C型阳性血清进行HI试验后鉴定血清型。HI试验中所用阳性血清是用中监所购买副鸡禽杆菌Page A、B、C型菌株制备疫苗免疫日本大耳白兔后所得,各型阳性血清分别作200、400、800倍稀释。分离菌株的HI血清分型鉴定结果见表2。
表2 Apg HN5株HI血清分型鉴定结果
注:“++++”、“+++”、“++”分别表示100%、75%、50%的凝集抑制,“﹣”表示不产生凝集抑制(100%凝集)。
本发明分离到副鸡禽杆菌,经各项鉴定符合副鸡禽杆菌的特性,生长特性、生化特性、PCR鉴定及测序结果表明该微生物属于副鸡禽杆菌,血清型鉴定为B型,命名为副鸡禽杆菌B型HN5株。该菌株对6~7日龄鸡胚及健康SPF鸡具有较强的毒力,可致鸡胚死亡,SPF鸡面部一侧或两侧眶下窦及周围肿胀或流鼻涕等鸡传染性鼻炎典型的临床症状。
实施例2副鸡禽杆菌B型HN5株菌液的增殖
1、一级种子繁殖
取菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上,在含5%~10%CO2环境中37℃培养18~24小时后,挑典型菌落接种于鸡肉汤琼脂斜面,37℃、5%CO2培养24小时,保存于2~8℃,经纯粹检验合格后,作为一级种子。
2、二级种子繁殖
取一级种子接种于鸡肉汤培养基中,置摇床37℃,180r/min培养10~12小时,作为二级种子。
3、半合成培养基配方
取多价蛋白胨5g、酪蛋白胨5g、谷氨酸钠5g、氯化钠5g、酵母粉3g、加蒸馏水1000ml充分溶解,以2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.2~7.4,121℃灭菌30min。临用前加入25%葡萄糖溶液4ml、灭活鸡血清100ml和1%NADH溶液3ml。
4、制苗用菌液的制备
按发酵罐容积装入适量不含葡萄糖的半合成培养基和0.004%消泡剂,灭菌后,按培养基量加入1%过滤除菌的葡萄糖、10%鸡血清和0.03%过滤除菌的NADH,校正pH值为7.2、DO值100和温度37℃。将种子液以2%的比例接种于半合成培养基中,通过自动补酸补碱控制pH值,根据DO值(溶氧值)调整通气量和转速,并采用手动流加补料的方式进行补料。B型HN5株在发酵至6小时收获菌液。经活菌计数B型HN5株为3×1011CFU/ml。
实施例3鸡传染性鼻炎B型灭活疫苗的制备
1、菌液灭活及灭活检验
将实施例2制备的副鸡禽杆菌B型HN5株发酵菌液经纯粹检验合格后按菌液量加入终浓度为0.01%硫柳汞,在2~8℃灭活5日。用鸡肉汤平板2块,各接种0.2ml,置37℃培养7日,均无菌生长。
2、佐剂灭菌
取氢氧化铝胶佐剂,121℃高压灭菌30分钟,冷却至室温备用。
3、疫苗配制
将B型HN5株抗原按照灭活前活菌计数的结果,用pH7.2的PBS进行稀释,与佐剂混合,800rpm搅拌40min,在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液,使其终浓度不超过0.01%。疫苗具体配方如表3。
表3鸡传染性鼻炎灭活疫苗配方及含量
灭活前HN5株抗原含量(CFU/ml) | 氢氧化铝胶佐剂(V/V) | |
疫苗1 | 10<sup>7.0</sup> | 15% |
疫苗2 | 3×10<sup>7.0</sup> | 15% |
疫苗3 | 10<sup>8.0</sup> | 15% |
疫苗4 | 10<sup>9.0</sup> | 15% |
实施例4鸡传染性鼻炎B型灭活疫苗的检验
1、性状检验
疫苗静置后,上层为无色澄明液体,下层为灰白色沉淀物,振摇后呈均匀混悬液。
2、无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验,应无菌生长。
3、安全检验
取56日龄的SPF鸡40只,分为4组,10只/组,免疫实施例3制备的鸡传染性鼻炎灭活疫苗。各组腿部肌肉注射疫苗1.0ml/只,连续观察14日,应不出现因疫苗引起的任何局部和全身不良反应,包括精神、采食、饮水、行为状况等有无异常,同时观察疫苗注射部位有无红肿等异常,14日后剖检注射部位取样制作组织切片,观察有无炎症、疫苗残留、肉芽肿等。结果显示上述各疫苗免疫SPF鸡观察14日均未见不良反应,精神状态良好,采食、饮水正常,无死亡情况。疫苗注射部位剖检可见部分疫苗残留,组织切片观察未见炎症、肉芽肿、坏死等异常情况。证明本发明鸡传染性鼻炎灭活疫苗对SPF鸡具有较好的安全性。
4、效力检验
取56日龄的SPF鸡50只随机分成5组,10只/组,免疫实施例3制备的鸡传染性鼻炎灭活疫苗。第1~4组分别免疫疫苗1~4,第5组不免疫作为对照组。各免疫组注射疫苗0.5ml/只,免疫后28天,第1组、第2组、第3组、第4组和对照组第5组,眶下窦注射HN5株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)。观察7日,攻毒保护结果见表4。
表4鸡传染性鼻炎灭活疫苗的免疫保护结果
结果表明,采用实施例3制备的鸡传染性鼻炎灭活疫苗免疫鸡只后,可阻断细菌感染(不出现临床症状),能为鸡只提供100%(10/10)保护,而对照组鸡只攻毒后3日全部发病。
疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4免疫组与攻毒对照组相比,免疫组与对照组保护率存在极显著差异,证明了疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4具有很好的保护力,显示出很好的免疫保护和安全性。
实施例5鸡传染性鼻炎B型HN5株灭活疫苗的免疫持续期试验
取56日龄的SPF鸡20只随机分成5组,5只/组,免疫实施例2制备的鸡传染性鼻炎灭活疫苗。第6~9组分别免疫疫苗1~4,第10组不免疫作为对照组。各免疫组注射疫苗0.5ml/只,分别在免疫后不同时间段采血分离血清,检测血清中B型HI抗体效价,以完全抑制4HA单位抗原的血清最大稀释倍数定为血清的抗体效价。结果见表5。
表5疫苗免疫后不同时间各组鸡血清B型抗体的检测结果
从试验鸡免疫后抗体消长规律来看,疫苗1~4免疫后7d即能产生特异性HI抗体,在42d~56d期间抗体效价达到高峰,之后抗体效价开始逐步下降,直到196d,大部分免疫鸡只抗体效价仍高于4。证明本发明的新分离B型菌种制备的疫苗,抗体产生较快,持续期较长,能有效对鸡只产生免疫保护作用。
实施例6鸡传染性鼻炎B型HN5株灭活疫苗与进口苗对SPF鸡的效力比较
取实施例2中制备的疫苗1免疫56日龄SPF鸡10只,0.5ml/只,鸡传染性鼻炎进口灭活苗疫苗5(含B型Spross株,含量为灭活前≥6×108CFU/ml)免疫56日龄SPF鸡10只,0.5ml/只,同时设置10只不免疫作为攻毒对照组。免后28日,所有鸡只眶下窦注射HN5株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)。观察7日,攻毒保护结果见表6。
表6 SPF鸡免疫保护结果
结果表明,疫苗1、进口苗免疫组与攻毒对照组相比,免疫组与对照组保护率存在极显著差异,疫苗1免疫组保护效果好于进口苗。然而,本发明达到上述效果所用的抗原含量低于对照疫苗组,进一步说明本发明的疫苗株具有良好的免疫原性。
实施例7鸡传染性鼻炎B型HN5株灭活疫苗与进口苗对产蛋高峰期蛋鸡的效力比较
取175日龄的产蛋高峰期海兰褐蛋鸡150只随机分成3组,50只/组,第14组、第15组分别免疫实施例2制备的疫苗1及鸡传染性鼻炎进口灭活疫苗5(含B型Spross株,含量为灭活前≥6×108CFU/ml),第16组不免疫作为对照组。各免疫组注射疫苗0.5ml/只,免后28日,所有鸡只眶下窦注射HN5株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)。记录各组在免疫前1周~攻毒后4周的产蛋率,攻毒后4周终止试验,记录结果见表7。
表7产蛋率统计结果
*上标a表示第14组与第16组间比较t检验之P值,上标b表示第15组与第16组间比较t检验之P值,上标c表示第14组与第15组间比较t检验之P值,ns表示差异不显著,p≤0.01表示差异极显著。
结果为疫苗1、进口苗免疫组与对照组相比,免疫前至免疫后4周免疫组与对照组的周平均产蛋率差异不显著,表明疫苗免疫对产蛋鸡的产蛋性能无不良影响;攻毒后1~4周攻毒对照组因多数鸡只发病导致周平均产蛋率下降30%左右;疫苗1免疫组保护效果较好,产蛋率未有明显下降,与攻毒对照组相比差异极显著;进口苗免疫组产蛋率下降10%左右,与攻毒对照组相比差异极显著;疫苗1免疫组较进口苗免疫组产蛋率下降差异极显著。说明本发明的疫苗株免疫原性更好,对蛋鸡具有较好的保护效果。
实施例8副鸡禽杆菌A型HN3株、C型SD3株抗原的制备
按照实施例2方法制备副鸡禽杆菌A型HN3株、C型SD3株抗原,A型HN3株在发酵至7小时收获菌液,C型SD3株在发酵至9小时收获菌液。经计数A型HN3株为1×1011CFU/ml,C型SD3株为1.2×1011CFU/ml。
实施例9鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗的制备
取实施例2、8制备的副鸡禽杆菌A型HN3株抗原、B型HN5株抗原、C型SD3株抗原制备疫苗6~8,将三种抗原液根据联苗最终的抗原含量制备成混合抗原液,然后将抗原液与氢氧化铝胶佐剂混合,800rpm搅拌40min,在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液,使其终浓度不超过0.01%。疫苗6~8具体配方如表8。
表8鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗成分及含量
成分 | 疫苗6 | 疫苗7 | 疫苗8 |
HN3株(CFU/ml) | 10<sup>8.0</sup> | 5×10<sup>8.0</sup> | 10<sup>9.0</sup> |
HN5株(CFU/ml) | 10<sup>7.0</sup> | 10<sup>8.0</sup> | 10<sup>9.0</sup> |
SD3株(CFU/ml) | 10<sup>8.0</sup> | 5×10<sup>8.0</sup> | 4×10<sup>9.0</sup> |
氢氧化铝胶佐剂(V/V) | 15% | 15% | 15% |
实施例10鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗的免疫原性试验
取56日龄的SPF鸡120只随机分成12组,10只/组,免疫实施例9制备的鸡传染性鼻炎灭活疫苗。第17~19组分别免疫疫苗6,第20~22组分别免疫疫苗7,第23~25组分别免疫疫苗8,第26~28组不免疫作为对照组。各免疫组注射疫苗0.5ml/只,免疫后28天,第17组、第20组、第23组和对照组第26组,眶下窦注射HN3株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌);第18组、第21组、第24组和对照组第27组,眶下窦注射HN5株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌);第19组、第22组、第25组和对照组第28组,眶下窦注射SD3株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)。观察7日,攻毒保护结果见表9。
表9鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗的免疫原性试验结果
结果显示,采用实施例9制备的鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗免疫鸡只后,可阻断细菌感染(不出现临床症状),能为鸡只提供100%(10/10)保护,而对照组鸡只攻毒后3日全部发病。证明了疫苗6、疫苗7、疫苗8具有很好的保护力,显示出很好的免疫保护和安全性。
实施例11新城疫基因Ⅶ型N7a株抗原的制备
NDV N7a株毒种用灭菌生理盐水稀释10,000倍,接种10日龄SPF鸡胚20枚,每胚接种0.1ml,置37℃继续孵育。将接种后24h内死胚弃去,24h~120h死胚及时放4℃,120h收混合样,测定制苗毒的HA和EID50分别为9.6和109.5EID50/0.1ml。将测定好效价的新城疫病毒液导入灭活罐内,计量加入10%甲醛溶液,开启搅拌机搅拌,使其充分混合,甲醛的最终浓度为0.1%,37℃灭活16小时。
实施例12鸡传染性鼻炎、新城疫基因Ⅶ型二联灭活疫苗的制备
取实施例2、8、11制备的副鸡禽杆菌A型HN3株抗原、B型HN5株抗原、C型SD3株抗原及新城疫基因Ⅶ型N7a株抗原制备疫苗9,将四种抗原液根据联苗最终的抗原含量制备成混合抗原液,然后将抗原液与氢氧化铝胶佐剂混合,800rpm搅拌40min,在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液,使其终浓度不超过0.01%。疫苗9具体配方如表10。
表10鸡传染性鼻炎、新城疫基因Ⅶ型二联灭活疫苗成分及含量
成分 | 疫苗9 |
HN3株(CFU/ml) | 5×10<sup>8.0</sup> |
HN5株(CFU/ml) | 3×10<sup>7.0</sup> |
SD3株(CFU/ml) | 5×10<sup>8.0</sup> |
N7a株(EID<sub>50</sub>/0.1ml) | 10<sup>8.0</sup> |
氢氧化铝胶佐剂(V/V) | 15% |
实施例13鸡传染性鼻炎、新城疫基因Ⅶ型二联灭活疫苗的免疫效果试验
1、新城疫部分
选取30日龄SPF鸡20只,分成两组,10只/组。第29组免疫实施例12制备的疫苗9,20μl/只,第30组作为对照组。免疫后21日,每只鸡采血,分离血清,测定HI抗体效价。同时免疫组和对照用HN1101株105EID50/只的剂量肌肉注射攻击,观察14日,记录发病数、死亡数及保护率,结果见表11。可见,免疫鸡HI抗体效价的几何平均值均≥4log2,对照鸡HI抗体效价的几何平均值均≤2log2,符合效检标准。
表11鸡传染性鼻炎、新城疫基因Ⅶ型二联灭活疫苗新城疫部分效力试验结果
注:HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数,标示为X±SD,X代表平均数,SD代表标准差。
结果显示,疫苗9免疫组在免疫后21天能产生较高的抗体,与对照相比,可以完全保护新城疫强毒的攻击。
证明了疫苗9能保护致死剂量的新城疫强毒攻击,疫苗含量不小于108.0EID50/0.1ml即可提供对鸡群的完全保护。
2、鸡传染性鼻炎部分
选取56日龄SPF鸡60只随机分成6组,10只/组,第31~33组免疫实施例12制备的疫苗9,第34~36组为对照组。各免疫组注射疫苗0.5ml/只,免疫后28天,第31组、第34组眶下窦注射HN3株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌);第32组、第35组眶下窦注射HN5株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌);第33组、第36组眶下窦注射SD3株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)。观察7日,攻毒保护结果见表12。攻毒对照组鸡只全部发病(面部肿胀或流鼻涕),免疫组鸡只全部保护。
表12鸡传染性鼻炎、新城疫基因Ⅶ型二联灭活疫苗鸡传染性鼻炎部分效力试验结果
上述结果证明本发明的鸡传染性鼻炎、新城疫基因Ⅶ型二联灭活疫苗符合制品要求,具有良好的免疫保护效果,能有效防止两种疫病的暴发。
实施例14鸡传染性鼻炎、新城疫基因Ⅶ型二联灭活疫苗鸡传染性鼻炎部分免疫持续期试验
取56日龄的SPF鸡10只随机分成2组,5只/组,第1组免疫实施例9制备的疫苗9,0.5ml/只,第2组不免疫作为空白对照组。分别在免疫后不同时间段采血分离血清,分别检测血清中A、B、C型HI抗体效价,以完全抑制4HA单位抗原的血清最大稀释倍数定为血清的抗体效价。结果见表13~表15。
表13疫苗免疫后不同时间各组鸡血清A型抗体检测结果
表14疫苗免疫后不同时间各组鸡血清B型抗体检测结果
表15疫苗免疫后不同时间各组鸡血清C型抗体检测结果
从试验鸡免疫后抗体消长规律来看,疫苗9免疫后7d即能产生分别针对A、B、C型的特异性HI抗体,免后42d~56d抗体效价达到高峰,之后抗体效价开始逐步下降,直到196d,抗体效价仍高于4。与鸡传染性鼻炎B型单价灭活疫苗免疫持续期抗体检测结果相比,鸡传染性鼻炎、新城疫基因Ⅶ型二联灭活疫苗免疫后鸡传染性鼻炎部分A、B、C型特异性HI抗体产生更快、抗体水平更高,且持续期较长,表明该联苗的保护效果优于单价苗。
实施例15鸡传染性鼻炎、新城疫基因Ⅶ型二联灭活疫苗对蛋鸡的应用试验
从有鸡传染性鼻炎发病的鸡场选取1000只开产蛋鸡,鸡群中鸡只临床表现为开产期明显推迟,且伴随有部分鸡只面部肿胀、流鼻涕和结膜炎等症状发生,虽经抗生素紧急进行治疗,症状无明显改善,说明鸡群中感染的菌株为耐药菌株,后对发病鸡进行病原分离,可分离到副鸡禽杆菌病原,随机分为两组,500只/组,A组为疫苗接种组,B组为空白对照组。A组在试验开始当天(第0天),接种实施例12制备的疫苗9,剂量为0.5ml/只。B组不接种疫苗作为空白对照。记录产蛋率,免疫后第12周终止试验。在试验初期,两组产蛋率相当,无差异。从第2周开始两组鸡只产蛋率已经出现显著差异,直至试验结束。与空白对照组相比,A组试验鸡只在免疫后,其产蛋率逐渐恢复,第8周左右恢复至正常水平。产蛋率统计结果见表16。
表16鸡只产蛋率统计结果
试验周数 | A组(平均值) | B组(平均值) | 差值 | P值* |
1 | 65.1% | 64.6% | 0.5% | 0.34ns |
2 | 69.2% | 62.3% | 6.9% | <0.01 |
3 | 72.3% | 60.3% | 12% | <0.01 |
4 | 75% | 59.3% | 15.7% | <0.01 |
5 | 79% | 61% | 18% | <0.01 |
6 | 82.9% | 60.3% | 22.6% | <0.01 |
7 | 87.1% | 61.8% | 25.3% | <0.01 |
8 | 89.4% | 65.1% | 24.3% | <0.01 |
9 | 88.6% | 64.1% | 24.5% | <0.01 |
10 | 90% | 61% | 29% | <0.01 |
11 | 91% | 60% | 31% | <0.01 |
12 | 91% | 61.9% | 29.1% | <0.01 |
*表示组间比较t检验之P值,ns表示差异不显著,p≤0.01表示差异极显著。
证明了本发明鸡传染性鼻炎、新城疫基因Ⅶ型二联灭活疫苗对感染鸡传染性鼻炎的鸡群有着良好的免疫保护作用,能够缩短病程,减少损失。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已,并非对本发明做任何形式上的限制,虽然本发明已以优选实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案的范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (13)
1.副鸡禽杆菌B型HN5株,已于2017年2月22日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号:CCTCC NO:M2017056;保藏地址:中国武汉·武汉大学。
2.一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物包含权利要求1所述的副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原和药学上可以接受的载体,所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前≥107.0CFU/ml。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物,其中,所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前107.0CFU/ml~109.0CFU/ml。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物,其中,所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前3×107.0CFU/ml~108.0CFU/ml。
5.根据权利要求2所述的疫苗组合物,其中,所述药学上可以接受的载体包括佐剂,所述佐剂为氢氧化铝,所述佐剂用量为体积比15%。
6.一种制备权利要求2所述疫苗组合物的方法,其中,所述方法包括:
步骤(1)培养所述副鸡禽杆菌B型HN5株;
步骤(2)使用柳硫汞灭活所述步骤(1)培养的副鸡禽杆菌B型HN5株培养物,柳硫汞浓度为wt0.01%,在2~8℃灭活5日,在所述灭活后的副鸡禽杆菌B型HN5株培养物中加入佐剂,乳化。
7.一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物包含权利要求1所述的副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原,副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原,副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原,以及药学上可以接受的载体;
其中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前≥108.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前≥107.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前≥108.0CFU/ml。
8.根据权利要求7所述疫苗组合物,其中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml~109.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前107.0CFU/ml~109.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml~4×109.0CFU/ml。
9.根据权利要求7所述疫苗组合物,其中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前5×108.0CFU/ml~109.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前3×107.0CFU/ml~109.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前5×108.0CFU/ml~4×109.0CFU/ml。
10.根据权利要求8所述的疫苗组合物,其中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前107.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml;或
所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前5×108.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前5×108.0CFU/ml;或
所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前109.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前109.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前4×109.0CFU/ml。
11.一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物包括权利要求1所述的副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原,副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原,副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原,基因Ⅶ型新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原以及药学上可以接受的载体;
所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml~109.0CFU/ml,所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前107.0CFU/ml~109.0CFU/ml,所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前108.0CFU/ml~4×109.0CFU/ml,所述基因Ⅶ型新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml~109.0EID50/0.1ml。
12.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株灭活全菌抗原含量为灭活前5×108.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌B型HN5株灭活全菌抗原含量为灭活前3×107.0CFU/ml;所述副鸡禽杆菌C型SD3株灭活全菌抗原含量为灭活前5×108.0CFU/ml;所述基因Ⅶ型新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml。
13.权利要求2~5、7~12所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗副鸡禽杆菌相关疾病的药物中的应用。
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CN105198991A (zh) * | 2015-10-16 | 2015-12-30 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种鸡传染性鼻炎单克隆抗体制备方法 |
CN106190909A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-12-07 | 山东滨州沃华生物工程有限公司 | 副鸡嗜血杆菌b型株发酵培养基、其制备方法及其应用 |
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2017
- 2017-03-24 CN CN201710183187.7A patent/CN108624522B/zh active Active
Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (1)
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2株B型副鸡禽杆菌的分离鉴定;杨国良等;《中国兽药杂志》;20130320;第47卷(第3期);第15-17页 * |
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