CN106267176B - 鸡传染性鼻炎疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鸡传染性鼻炎疫苗组合物，其中，该疫苗组合物含有免疫量的副鸡禽杆菌A型抗原和/或副鸡禽杆菌C型抗原以及载体。本发明还提供了该疫苗组合物的制备方法和应用。本发明疫苗组合物免疫效果优于现有菌株制备的疫苗免疫效果，其抗原含量可以大大降低，仍具有良好的免疫效果，生产成本大大降低。

Description

鸡传染性鼻炎疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及副鸡禽杆菌，该副鸡禽杆菌的疫苗组合物及其制备方法和应用，属于生物制品领域。

背景技术

副鸡禽杆菌(Haemophilus paragallinarum)是一种引起鸡急性上呼吸道疾病的致病菌，分为A、B、C三个血清型。该病首先发现于波兰和美国，以后在其他各国经常发生。1980年以来，我国也屡有本病的报道，主要以A型和C型为主。该呼吸道疾病俗称鸡传染性鼻炎，临床上以面部水肿、鼻窦炎、流泪为主要特征，可引起产蛋鸡的产蛋量下降，育成鸡的生长受阻、开产期推迟，肉鸡增重下降，给养禽业造成巨大的经济损失。虽然此病可采用抗生素及磺胺类药物进行治疗，但会造成药物残留，并且，采用抗生素会造成耐药菌株的出现，导致副鸡禽杆菌在同一鸡群中复发。因此，副鸡禽杆菌疫苗的研究成为热点，但目前按照《兽用生物制品规程》进行生产所制备得到的灭活疫苗的培养菌数一般都在2×10⁹CFU/ml～3×10⁹CFU/ml，按照《兽用生物制品规程》5×10⁹CFU/ml配苗要求，需要对菌液进行浓缩处理。所以，现有的鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备存在工艺复杂，生产成本高，产量低等缺陷。而且，目前的副鸡禽杆菌疫苗对部分患病鸡预防效果较差。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物，该疫苗组合物能对流行副鸡禽杆菌提供有效的保护，显示出显著的免疫特性。

为此，本发明的一个目的在于提供一种副鸡禽杆菌，所述副鸡禽杆菌为副鸡禽杆菌A型HN3株(Avibacterium Paragallinarum Serotype A Strain HN3)，已于2015年01月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号：CCTCC NO：M2015051；保藏地址：中国武汉·武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供另外一种副鸡禽杆菌，所述副鸡禽杆菌为副鸡禽杆菌C型SD3株(Avibacterium Paragallinarum Serotype C Strain SD3)，已于2015年01月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号：CCTCC NO：M2015052；保藏地址：中国武汉·武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌A型HN3株抗原和/或副鸡禽杆菌C型SD3株抗原以及载体。

本发明所用术语“疫苗组合物”系指有副鸡禽杆菌免疫原性的药物组合物。该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对副鸡禽杆菌的免疫反应。疫苗组合物包括免疫量的副鸡禽杆菌A型HN3株和/或副鸡禽杆菌C型SD3株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗。

本发明所用的术语“活疫苗”指的是以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复制的菌体制备的疫苗。本发明所用的术语“减毒”用于指以使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力减弱。

本发明所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活菌体的混悬液。灭活疫苗的例子包括全菌疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理菌体可获得全菌灭活疫苗。例如用本发明的强毒株HN3或SD3可以通过灭活的方法制备成灭活疫苗。

本发明所用的术语“亚单位疫苗”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。它比全菌疫苗引起副反应的可能性小。

本发明所用的术语“合成肽疫苗”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的疫苗。

优选地，所述疫苗组合物包括免疫量的副鸡禽杆菌A型HN3株和/或副鸡禽杆菌C型SD3株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗或合成肽疫苗。

优选地，所述疫苗组合物包括免疫量的副鸡禽杆菌A型HN3株和/或副鸡禽杆菌C型SD3株的灭活疫苗。

本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

优选地，本发明所述的鸡传染性鼻炎灭活疫苗中，所述副鸡禽杆菌A型HN3株抗原含量为灭活前活菌数≥1×10⁸CFU/ml。

优选地，本发明所述的鸡传染性鼻炎灭活疫苗中，所述副鸡禽杆菌A型HN3株抗原含量为灭活前活菌数5×10⁸CFU/ml～1×10⁹CFU/ml。

优选地，本发明所述的鸡传染性鼻炎灭活疫苗中，所述副鸡禽杆菌C型SD3株抗原含量为灭活前活菌数≥1×10⁸CFU/ml。

优选地，本发明所述的鸡传染性鼻炎灭活疫苗中，所述副鸡禽杆菌C型SD3株抗原含量为灭活前活菌数5×10⁸CFU/ml～4×10⁹CFU/ml。

本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为兽医药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。因此，本发明中，所述可药用疫苗佐剂包括油佐剂，其选自白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(Drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油。上述油佐剂既可以是来源，也可以是经过人工合成获得的。本发明中，所述疫苗组合物为水包油乳液、油包水乳液或双重乳液，所述双重乳液通常表现为水包油包水乳液。

在本发明的一个实施方式中，所述疫苗组合物还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。所述助悬剂可包括，例如，硬脂酸铝，以及所属技术领域可用的其他助悬剂。所述表面活性剂可包括，例如，脱水山犁醇单油酸酯(TWEEN系列)，司本(SPAN)，以及所属技术领域可用的其他表面活性剂。所述抗原灭活剂包括(但不限于)，例如福尔马林、β－丙内酯等等。所述防腐剂包括，例如硫柳汞。上述物质的使用方法及用量均为本领域技术人员所熟知。

基于油佐剂会对动物体带来一定的副反应，还可以选择本领域的其它佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐，来制备混悬液，减少免疫刺激。

优选地，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括油佐剂，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂；进一步优选地，所述佐剂包括铝盐佐剂。

术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：油佐剂，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂。

本发明所用术语“油佐剂”又称“油性佐剂”或“油乳佐剂”，是由包括植物油、动物油、矿物油中的一种或几种组成，用于延缓免疫原在机体内的存留时间，使之持续缓慢释放，增强巨噬细胞的吞噬与杀菌能力。

本发明所用术语“水溶性佐剂”又称“水基佐剂”或“水佐剂”，是一种聚合物水溶性分散体，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物组成。

本发明所用术语“铝盐佐剂”，又称“铝胶佐剂”或“铝佐剂”，包括氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂，其主要功能为缓释，但同时具有对免疫细胞的激活作用。将抗原和氢氧化铝或磷酸铝混合注射，能够使抗原保存在注射部位，具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。

本发明所用术语“细胞因子佐剂”，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF-γ、GM-CSF、TNF-α、TNF-β、TCA-3等，又称“细胞因子”或“细胞素”，是活体宿主细胞分泌的通过扩散、细胞间接触或血液循环到达宿主其他细胞，在体液中以极低浓度发挥作用的一类非免疫球蛋白、局部天然蛋白或糖蛋白，也是一类由机体活化的免疫细胞和某些非免疫细胞产生、分泌，能调节细胞生长、分化，与造血、炎症反应、免疫应答反应和创伤愈合等密切相关的高活性多功能小分子蛋白的统称，可以刺激或抑制免疫功能，在免疫应答中促进细胞发育分化、调节细胞生理功能和细胞间信息传递，在免疫系统中起着非常重要的调控作用。

适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌A型HN3株灭活抗原和氢氧化铝胶佐剂，所述疫苗组合物中，副鸡禽杆菌A型HN3株抗原含量为灭活前活菌数1×10⁸CFU/ml，氢氧化铝胶佐剂的含量为20％V/V。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌A型HN3株灭活抗原和氢氧化铝胶佐剂，所述疫苗组合物中，副鸡禽杆菌A型HN3株抗原含量为灭活前活菌数5×10⁸CFU/ml，氢氧化铝胶佐剂的含量为20％V/V。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌A型HN3株灭活抗原和氢氧化铝胶佐剂，所述疫苗组合物中，副鸡禽杆菌A型HN3株抗原含量为灭活前活菌数1×10⁹CFU/ml，氢氧化铝胶佐剂的含量为20％V/V。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌C型SD3株灭活抗原和氢氧化铝胶佐剂，所述疫苗组合物中，副鸡禽杆菌C型SD3株抗原含量为灭活前活菌数1×10⁸CFU/ml，氢氧化铝胶佐剂的含量为20％V/V。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌C型SD3株灭活抗原和氢氧化铝胶佐剂，所述疫苗组合物中，副鸡禽杆菌C型SD3株抗原含量为灭活前活菌数5×10⁸CFU/ml，氢氧化铝胶佐剂的含量为20％V/V。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌C型SD3株灭活抗原和氢氧化铝胶佐剂，所述疫苗组合物中，副鸡禽杆菌C型SD3株抗原含量为灭活前活菌数4×10⁹CFU/ml，氢氧化铝胶佐剂的含量为20％V/V。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌A型HN3株灭活抗原、副鸡禽杆菌C型SD3株灭活抗原和氢氧化铝胶佐剂，所述疫苗组合物中，副鸡禽杆菌A型HN3株抗原含量为灭活前活菌数1×10⁸CFU/ml，副鸡禽杆菌C型SD3株抗原含量为灭活前活菌数1×10⁸CFU/ml，氢氧化铝胶佐剂的含量为20％V/V。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌A型HN3株灭活抗原、副鸡禽杆菌C型SD3株灭活抗原和氢氧化铝胶佐剂，所述疫苗组合物中，副鸡禽杆菌A型HN3株抗原含量为灭活前活菌数5×10⁸CFU/ml，副鸡禽杆菌C型SD3株抗原含量为灭活前活菌数5×10⁸CFU/ml，氢氧化铝胶佐剂的含量为20％V/V。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌A型HN3株灭活抗原、副鸡禽杆菌C型SD3株灭活抗原和氢氧化铝胶佐剂，所述疫苗组合物中，副鸡禽杆菌A型HN3株抗原含量为灭活前活菌数1×10⁹CFU/ml，副鸡禽杆菌C型SD3株抗原含量为灭活前活菌数4×10⁹CFU/ml，氢氧化铝胶佐剂的含量为20％V/V。

优选地，本发明所述疫苗组合物进一步包含免疫量的新城疫抗原、鸡毒支原体抗原、鸡滑液囊支原体抗原、传染性支气管炎抗原、禽流感抗原、减蛋综合征抗原或传染性法氏囊抗原任意一种或几种。

优选地，本发明所述疫苗组合物进一步包含免疫量的新城疫抗原，所述新城疫抗原为新城疫La Sota株灭活抗原。

优选地，本发明所述疫苗组合物进一步包含的新城疫La Sota株灭活抗原含量≥10^8.0EID₅₀/0.1ml。

优选地，本发明所述疫苗组合物进一步包含的新城疫La Sota株灭活抗原含量为10^8.0EID₅₀/0.1ml～10^9.0EID₅₀/0.1ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供的疫苗组合物包含免疫量的副鸡禽杆菌A型HN3株灭活抗原、副鸡禽杆菌C型SD3株灭活抗原、新城疫La Sota株灭活抗原和氢氧化铝胶佐剂，所述疫苗组合物中，副鸡禽杆菌A型HN3株抗原含量为灭活前活菌数5×10⁸CFU/ml，副鸡禽杆菌C型SD3株抗原含量为灭活前活菌数4×10⁹CFU/ml，新城疫La Sota株灭活抗原含量为10^8.0EID₅₀/0.1ml，氢氧化铝胶佐剂的含量为20％V/V。

本发明的另一个目的是提供一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法，包括：

(1)增殖副鸡禽杆菌；

(2)灭活，加入佐剂，乳化。

本发明的另一个目的在于提供上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗副鸡禽杆菌相关疾病的药物中的应用。

本发明可以应用的副鸡禽杆菌相关疾病的非穷举性列表包括，如面部水肿、鼻窦炎、流泪、产蛋量下降，育成鸡的生长受阻、蛋鸡开产期推迟，肉鸡增重下降等。

本发明所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制鸡传染性鼻炎或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使副鸡禽杆菌感染引起的症状减轻或好转的所有行为。

发明优点：

(1)本发明的菌株具有良好的免疫原性，能够刺激机体快速地产生免疫力，且抗体持续维持在一个较高水平，能够有效保护流行株的攻击，具有很好的保护作用。

(2)本发明的菌株生长特性良好，增值速度快，易于培养，大大降低了生产成本。

(3)本发明的菌株制备的疫苗组合物免疫原性良好，能以较低的抗原含量达到较好的免疫保护作用，进一步降低生产成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例以副鸡禽杆菌A型HN3株、副鸡禽杆菌C型SD3株和鸡新城疫病毒LaSota株为例说明本发明。

实施例1副鸡禽杆菌菌种的选择

1.菌种的来源

副鸡禽杆菌A型HN3株及副鸡禽杆菌C型SD3株均为实验室自行分离鉴定。

2.培养特性

在无NADH的血琼脂平板与金黄色葡萄球菌交叉划线，在含5％～10％CO₂的条件下，37℃培养24小时，在葡萄球菌周围会长出卫星菌落。

接种鸡肉汤琼脂平板上，在含5％～10％CO₂的条件下，37℃培养24小时，形成直径0.3mm左右、圆形、光滑、灰白色、半透明露珠样菌落，用低倍镜以45度折光观察具有较强的荧光。

3.毒力

分别将副鸡禽杆菌HN3株和SD3株的鸡肉汤12小时培养物用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)做10⁵倍稀释，卵黄囊接种6～7日龄SPF鸡胚各10个，每胚0.2ml，置37℃继续孵化，应在30小时内死亡；另分别取60日龄的SPF鸡5只，每只眶下窦内注射鸡肉汤培养物稀释液0.2ml(含2万个活菌)，观察7日，全部发病。

实施例2副鸡禽杆菌菌液的增殖

1.一级种子繁殖

取菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在含5％～10％CO₂环境中37℃培养18～24小时后，选符合标准的5个典型菌落接种于6～7日龄鸡胚卵黄内，在37℃继续孵育，收集30小时内死亡的鸡胚卵黄液，经纯检合格后，作为一级种子。在20℃以下保存，应不超过1个月，否则要再通过鸡胚复壮，但不应超过5代。

2.二级种子繁殖

取感染的鸡胚卵黄液，划线接种鸡肉汤琼脂平板，在含5％～10％CO₂环境中37℃培养18～24小时，选荧光性强的典型菌落接种于肉汤培养基中，置37℃，180rpm培养10～12小时，经纯检合格后，即为二级种子。在2～8℃保存，不得超过6～8小时。

3.半合成培养基配方

取多蛋白胨5g、酪蛋白胨5g、谷氨酸钠5g、葡萄糖1g、氯化钠5g、酵母粉3g、加蒸馏水1000ml充分溶解，以氢氧化钠溶液(2mol/L)调pH值至7.2～7.4，115℃灭菌30min。临用前加入灭活鸡血清100ml和1％NADH溶液3ml。

4.制苗用菌液的制备

A型菌和C型菌分别单独培养。按发酵罐容积装入适量不含葡萄糖的半合成培养基和0.004％消泡剂，灭菌后，按培养基量加入1％过滤除菌的葡萄糖、10％鸡血清和0.03％过滤除菌的NADH，校正pH值7.2、DO值100和温度37℃。将种子液以2％的比例接种于半合成培养基中，通过自动补酸补碱控制pH值，根据DO值(溶氧值)调整通气量和转速，并采用手动流加补料的方式进行补料。A型HN3株在发酵至7小时收获菌液，C型SD3株在发酵至9小时收获菌液。经计数A型HN3株为1×10¹¹CFU/ml，C型SD3株为1.2×10¹¹CFU/ml，远高于目前按照《兽用生物制品规程》进行生产所制备得到的灭活疫苗的培养菌数2×10⁹CFU/ml～3×10⁹CFU/ml，说明了本发明分离的菌株具有良好的生长特性。

实施例3鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备

1.菌液灭活及检验

将实施例2制备的副鸡禽杆菌A型HN3株菌液和副鸡禽杆菌C型SD3株菌液分别按菌液量加入终浓度为0.01％硫柳汞，在2～8℃灭活5日，用鸡肉汤斜面2支，各接种0.2ml，置37℃培养7日，均无菌生长。

2.佐剂灭菌

取氢氧化铝胶佐剂，121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温备用。

3.配苗

将A型抗原和C型抗原按照灭活前活菌计数的结果，用pH7.2的PBS进行稀释，将A型和C型抗原液按比例混合后，与佐剂混合，800rpm搅拌40min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度不超过0.01％。疫苗具体配方如表1。

表1 鸡传染性鼻炎灭活疫苗成分及含量

实施例4鸡传染性鼻炎灭活疫苗的免疫原性试验

将6-8周龄的SPF鸡150只随机分成15组，10只/组，免疫实施例3制备的鸡传染性鼻炎灭活疫苗。第1组免疫疫苗1，第2组免疫疫苗2，第3组免疫疫苗3，第4组免疫疫苗4，第5组免疫疫苗5，第6组免疫疫苗6，第7组和第10组免疫疫苗7，第8组和第11组免疫疫苗8，第9组和第12组免疫疫苗9，第13组、第14组及第15组为对照组。各免疫组注射疫苗0.5ml，免疫后28天，第1组、第2组、第3组、第7组、第8组、第9组和对照组第13组，眶下窦注射HN3菌株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)；第4组、第5组、第6组、第10组、第11组、第12组和对照组第14组，眶下窦注射SD3菌株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)。观察7日，攻毒对照组鸡全部发病(面部肿胀或流鼻涕)，免疫组鸡全部保护。具体结果见表2。

表2 鸡传染性鼻炎灭活疫苗的免疫原性试验结果

结果显示，采用实施例3制备的鸡传染性鼻炎灭活疫苗免疫鸡只后，可阻断细菌感染(不出现临床症状)，能为鸡只提供100％(10/10)保护，而对照组鸡只攻毒后3日全部发病。

证明了疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6、疫苗7、疫苗8、疫苗9具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性。

实施例5鸡传染性鼻炎灭活疫苗(C-Hpg-8+Hpg-668)的制备

参照实施例2的菌液增殖方式，制备副鸡禽杆菌A型C-Hpg-8株(购自中国兽医药品监察所)及C型Hpg-668株(购自中国兽医药品监察所)菌液，按照实施例3的方法进行灭活疫苗配制。具体配方如表3。

表3 鸡传染性鼻炎灭活疫苗(C-Hpg-8+Hpg-668)成分及含量

实施例6鸡传染性鼻炎灭活疫苗的免疫原性对比试验

将6-8周龄的SPF鸡90只随机分成9组，10只/组，免疫鸡传染性鼻炎灭活疫苗。第1组、第2组免疫实施例5制备的疫苗A，第3组、第4组免疫实施例5制备的疫苗B，第5组、第6组免疫实施例3制备的疫苗7，第7组、第8组及第9组为对照组。各免疫组注射疫苗0.5ml，免疫后28天，第1组、第3组、第5组和对照组第7组，眶下窦注射HN3菌株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)；第2组、第4组、第6组和对照组第8组，眶下窦注射SD3菌株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)。观察7日，攻毒对照组鸡全部发病(面部肿胀或流鼻涕)，疫苗A免疫组获得80％以上的保护，疫苗B只有30％～40％的保护，疫苗7免疫组获得完全的保护。具体结果见表4。

表4 鸡传染性鼻炎灭活疫苗的免疫原性对比试验结果

证明了本发明疫苗组合物能以较低的抗原含量获得良好的保护效果，而现有菌株制备的鸡传染性鼻炎灭活疫苗则需要较高的抗原含量，再次印证了本发明所分离的菌株具有很好的免疫原性。

实施例7鸡传染性鼻炎灭活疫苗的免疫持续期对比试验

将6-8周龄的SPF鸡15只随机分成3组，5只/组，免疫鸡传染性鼻炎灭活疫苗。第1组免疫实施例5制备的疫苗A，第2组免疫实施例3制备的疫苗7，第3组为为对照组。各免疫组注射疫苗0.5ml，分别在免疫后不同时间段采血分离血清，检测血清HI抗体效价，以完全抑制4HA单位抗原的血清最大稀释倍数定位血清的抗体效价。结果见表5、表6。

表5 疫苗免疫后免疫鸡血清抗体的检测比较结果(A型)

表6 疫苗免疫后免疫鸡血清抗体的检测比较结果(C型)

从试验鸡免疫后抗体消长规律来看，疫苗7免疫后7d即能产生保护性抗体，在42d～56d期间抗体效价达到顶峰，后抗体开始逐步下降，直到196d，抗体效价仍高于4；疫苗B免疫后21天可以产生保护性抗体，在41d左右抗体效价达到顶峰，后抗体开始逐步下降，在140d以后抗体消失。

证明本发明疫苗组合物较现有菌种制备的疫苗组合物，抗体产生更快，抗体产生持续期更长，能有效对鸡只产生免疫保护作用。

实施例8鸡传染性鼻炎灭活疫苗的应用对比试验

此试验中包括536只开产蛋鸡，将这些鸡随机分为两组，即疫苗接种组A(276只)，对照疫苗接种组B(260只)。

A组：在试验开始当天(第0天)，接种实施例3制备的疫苗7，剂量为0.5ml/只。

B组：在试验开始当天(第0天)，接种实施例5制备的疫苗A，剂量为0.5ml/只。

记录产蛋率，第12周终止试验。

根据饲养及鸡场的发病史，鸡只在免疫疫苗时即已感染了副鸡禽杆菌病原，有鸡传染性鼻炎症状。在试验初期，两个疫苗组产蛋率相当，无差异。从第二周开始两组鸡只产蛋率已经出现显著的差异，直至试验结束。A组试验鸡只在免疫后，其产蛋率逐渐恢复，第8周恢复至正常水平，而B组在免疫疫苗后，产蛋率无明显提升。记录结果见表7。

表7 鸡传染性鼻炎灭活疫苗在产蛋鸡的应用对比试验(产蛋率)

^*表示组间比较t检验之p值，ns表示差异不显著，p≤0.01表示差异极显著。

证明了本发明鸡传染性鼻炎灭活疫苗对感染鸡群有着良好的免疫保护作用，而现有菌株制备的鸡传染性鼻炎灭活疫苗对感染鸡群则不能提供有效的预防和保护作用。

实施例9鸡传染性鼻炎、新城疫二联灭活疫苗的制备

1.新城疫抗原的制备

取鸡新城疫病毒La Sota株(购自中国兽医药品监察所)，用无菌生理盐水稀释至10^-3，经尿囊腔接种10日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后封闭针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。每日照蛋1次，将48小时前死亡的鸡胚弃去，此后，每8～12小时照蛋1次，随时取出死亡鸡胚，直至120小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。将冷却后的鸡胚取出，先以碘酊，后以酒精消毒后，逐胚收获鸡胚液，即为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液。

2.鸡传染性鼻炎、新城疫二联灭活疫苗的制备

将收获的病毒液经终浓度为0.01％硫柳汞，在2～8℃灭活5日，灭活完全后与实施例2制备的副鸡禽杆菌抗原灭活后混合，按照实施例3的方法制备鸡传染性鼻炎、新城疫二联灭活疫苗，具体配方见表8。

表8 鸡传染性鼻炎、新城疫二联灭活疫苗成分及含量

成分	疫苗H
		HN3株(CFU/ml)	5×10<sup>8.0</sup>
SD3株(CFU/ml)	4×10<sup>9.0</sup>
		La Sota株(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	10<sup>8.0</sup>
氢氧化铝胶佐剂(V/V)	20％

实施例10鸡传染性鼻炎、新城疫二联灭活疫苗的效力试验

1.鸡新城疫部分

用30日龄SPF鸡15只，分两组。10只各免疫实施例9制备的鸡传染性鼻炎、新城疫二联灭活疫苗H，每只0.5ml，另5只作为对照。免疫后21日，每只鸡各采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。免疫鸡、对照鸡HI抗体效价如表9。可见，免疫鸡HI抗体效价的几何平均值均不低于4log2，对照鸡HI抗体效价均不高于2log2，符合效检标准。

表9 鸡新城疫HI效价

2.鸡传染性鼻炎部分

将6-8周龄的SPF鸡40只随机分成4组，10只/组，免疫鸡传染性鼻炎、新城疫二联灭活疫苗。第1组、第2组免疫实施例9制备的疫苗H，第3组、第4组为对照组。各免疫组注射疫苗0.5ml，免疫后28天，第1组、第3组眶下窦注射HN3菌株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)；第2组、第4组眶下窦注射SD3菌株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)。观察7日，攻毒对照组鸡全部发病(面部肿胀或流鼻涕)，免疫组鸡全部保护。具体结果见表10。

表10 鸡传染性鼻炎、新城疫二联灭活疫苗鸡传染性鼻炎部分效力试验结果

证明本发明的鸡传染性鼻炎、新城疫二联灭活疫苗符合制品要求，具有良好的免疫保护效果，能有效防止两种疫病的爆发。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种副鸡禽杆菌，其特征在于，所述副鸡禽杆菌为副鸡禽杆菌A型HN3株，保藏号为CCTCC NO.M2015051。

2.一种副鸡禽杆菌，其特征在于，所述副鸡禽杆菌为副鸡禽杆菌C型SD3株，保藏号为CCTCC NO.M2015052。

3.一种预防和/或治疗鸡传染性鼻炎的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含免疫量的权利要求1所述的副鸡禽杆菌A型HN3株灭活抗原和权利要求2所述的副鸡禽杆菌C型SD3株灭活抗原以及载体。

4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述副鸡禽杆菌A型HN3株抗原含量为灭活前活菌数5×10⁸～1×10⁹/ml。

5.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述副鸡禽杆菌C型SD3株抗原含量为灭活前活菌数5×10⁸～4×10⁹/ml。

6.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括油佐剂，水性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂。

7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂包括铝盐佐剂。

8.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物进一步包含免疫量的新城疫抗原、鸡毒支原体抗原、鸡滑液囊支原体抗原、传染性支气管炎抗原、禽流感抗原、减蛋综合征抗原或传染性法氏囊抗原任意一种或几种。

9.一种制备权利要求3～7所述的疫苗组合物的方法，其特征在于，包括：

1)增殖副鸡禽杆菌；

2)灭活，加入佐剂，乳化。

10.根据权利要求3～8所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗副鸡禽杆菌相关疾病的药物中的应用。