CN113462659B - 一种重组病毒及其应用 - Google Patents

一种重组病毒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113462659B
CN113462659B CN202110708904.XA CN202110708904A CN113462659B CN 113462659 B CN113462659 B CN 113462659B CN 202110708904 A CN202110708904 A CN 202110708904A CN 113462659 B CN113462659 B CN 113462659B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mspb
gene
recombinant
nadh
rfpv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110708904.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113462659A (zh
Inventor
徐婧祎
何生虎
司朵朵
郭磊
魏晓明
陈秀红
杨萌萌
安于
闫背背
孙佳琳
李明哲
黄伟
张小梅
蒋晨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NINGXIA XIAOMING AGRICULTURE ANIMAL HUSBANDRY CO Ltd
Ningxia University
Original Assignee
NINGXIA XIAOMING AGRICULTURE ANIMAL HUSBANDRY CO Ltd
Ningxia University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NINGXIA XIAOMING AGRICULTURE ANIMAL HUSBANDRY CO Ltd, Ningxia University filed Critical NINGXIA XIAOMING AGRICULTURE ANIMAL HUSBANDRY CO Ltd
Priority to CN202110708904.XA priority Critical patent/CN113462659B/zh
Publication of CN113462659A publication Critical patent/CN113462659A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113462659B publication Critical patent/CN113462659B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本申请提供一种重组病毒及其应用，其中重组病毒以鸡痘病毒为载体，在鸡痘病毒的SbfⅠ与AscⅠ酶切位点之间插入鸡滑液囊支原体基因。其中，所述鸡滑液囊支原体基因为MSPB或NADH中的任意一种；其中，所述鸡滑液囊支原体基因MSPB的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述鸡滑液囊支原体基因NADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本申请的两株重组病毒株rFPV/MS‑MSPB，rFPV/MS‑NADH均可使机体产生抗体，且rFPV/MS‑MSPB免疫保护率为83.3％，rFPV/MS‑NADH免疫保护率为66.7％，rFPV/MS‑MSPB抗体水平更高，可用于我国及其周边国家鸡痘病毒的预防和控制。

Description

一种重组病毒及其应用
技术领域
本申请涉及重组病毒技术领域，尤其涉及一种重组病毒及其应用。
背景技术
鸡滑液囊支原体(Mycoplasma Synoviae，MS)是引起禽类滑膜炎症，关节肿大的病原微生物，在世界范围内流行。MS一旦感染禽类，发展缓慢，病程长，感染病禽终身带毒。鸡滑液囊支原体病本病可以水平传播和垂直传播，很难根除，发病率高，死亡率低，但易和其他致病菌混合感染，从而病情加重，造成死亡率增高，对养禽业危害极大。鸡滑液囊支原体病是近年来发展较快对禽类危害较大的一种支原体引起的传染病，被世界卫生组织归为B类传染病，由1954年美国发现第一例开始，迅速在英国、挪威、德国、美国、中国等全球范围内传播开，呈世界性分布。我国首例确诊是在1989年的广西地区，随后，全国范围内迅速传播开来，据不完全统计，我国不同省份检测该病，阳性率不低于15％，最高可达55.7％。禽类养殖业是我国农产品的一个重要组成部分，该病严重影响到养禽业的发展。
药物对鸡滑液囊支原体的治疗存在一定效果，但不会完全消除病原菌，并且在治疗过程中，MS易产生耐药性，没有试验表明单一的抗生素可以完全治愈鸡滑液囊支原体病。不同的致病菌株对抗生素的灵敏度不同，目前认为最好的临床治疗的方法是通过对病原菌进行分离后，药敏试验确定需要用于治疗的抗生素的种类。在治疗的过程中，要注意的是耐药性的产生及药物残留。临床治疗显示，在该病发病早期，抗生素治疗效果较好，但是由于该病的不可逆性，对生产造成的影响相比其他传染病要更大。
目前，全球对鸡滑液囊支原体疫苗的试验进展较慢，以药物预防为主。据报道，国际上，以澳大利亚疫苗商品化最为正规，以MS-H菌株为母本的活疫苗，其次包括灭活苗、弱毒苗虽有相关产品但是效果有待考证。我国对鸡滑液囊支原体的试验发展相对缓慢，大多以药物预防为主，对发病鸡群主要以抗生素治疗为主，长期使用会出现明显的耐药性和药物残留，因此疫苗的使用就成为该病防控的重要方法。目前，仅有澳大利亚的一株通过基因突变筛选出的温度敏感性弱毒苗(MS-H)，灭活苗与基因工程苗目前都处于研发阶段。现有的灭活疫苗在实际生产中存在价格高，免疫持续期短等不足之处。
发明内容
本申请提供了一种重组病毒及其应用，以解决现有的灭活疫苗在实际生产中存在价格高，免疫持续期短等不足的问题。
第一方面，本申请提供一种重组病毒，以鸡痘病毒为载体，在鸡痘病毒的SbfⅠ与AscⅠ酶切位点之间插入鸡滑液囊支原体基因。
可选的，所述鸡滑液囊支原体基因为MSPB或NADH中的任意一种；其中，所述鸡滑液囊支原体基因MSPB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述鸡滑液囊支原体基因NADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本申请提供上述的重组病毒在制备用于预防由鸡滑液囊支原体引起的禽类滑膜炎症的药物中的应用。
第三方面，本申请提供上述的重组病毒制备的疫苗。
由以上技术方案可知，本申请提供一种重组病毒，以鸡痘病毒为载体，在鸡痘病毒的SbfⅠ与AscⅠ酶切位点之间插入鸡滑液囊支原体基因。其中，所述鸡滑液囊支原体基因为MSPB或NADH中的任意一种；其中，所述鸡滑液囊支原体基因MSPB的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述鸡滑液囊支原体基因NADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。根据本申请通过TK基因同源重组后，重组基因能够稳定表达，通过PCR扩增试验进一步证实外源目的基因的存在，经Western blot鉴定，两株重组病毒的外源蛋白MSPB、NADH符合试验二结果，即具有免疫原性，抗原基因所表达的蛋白产物的活性，没有受到病毒重组的影响。通过验证MSPB与NADH的抗原性，并且通过转移载体合成新的质粒。在质粒与同源重组的作用下，构建性的重组病毒株并且经过实验验证了新重组的两株病毒株的活性及外源基因的表达结果。应用抗原作用，作用于集体，使实验动物能够获得免疫性抗原。本申请的两株重组病毒株rFPV/MS-MSPB，rFPV/MS-NADH均可使机体产生抗体，且rFPV/MS-MSPB免疫保护率为83.3％，rFPV/MS-NADH免疫保护率为66.7％，rFPV/MS-MSPB抗体水平更高，可用于我国及其周边国家鸡痘病毒的预防和控制。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请的MS抗原基因重组痘苗病毒的构建方法流程图；
图2为重组转移载体PTKF-TK-PTKR构建过程示意图；
图3为重组质粒外源基因插入位点示意图；
图4为TK基因加入相应酶切位点后PCR电泳结果图；
图5为TK基因酶切后电泳凝胶回收后电泳图；
图6为PTKF及PTKR PCR电泳结果图；
图7为PTKF-TK-PTKR单酶切电泳结果图；
图8为TOP10克隆菌提取PTKF-TK-PTKR质粒(BamH I)原始酶切位点单酶切电泳结果图；
图9为MSPB两端分别插入SbfⅠ与AscⅠ两个酶切位点图；
图10为NADH两端分别插入SbfⅠ与AscⅠ两个酶切位点图；
图11为单酶切后PCR电泳图；
图12为原始毒株转染细胞后，细胞的形态学变化图；
图13为重组病毒rFPV/MS-MSPB与鸡痘病毒转染细胞后绿色荧光反应图；
图14为重组病毒rFPV/MS-NADH与鸡痘病毒转染细胞后绿色荧光反应图；
图15为重组鸡痘病毒目的基因片段MSPB、NADH图；
图16为重组病毒MSPB与NADH蛋白的间接免疫荧光试验图；
图17为重组病毒的Western blot鉴定结果图；
图18为接种后试验动物体温变化图；
图19为接种后试验动物体重变化图；
图20为接种后抗体水平的变化图；
图21为接种后试验动物发病情况图。
具体实施方式
下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的系统和方法的示例。
实施例
本实施例中使用到的试剂和菌株如下所示：
原始质粒(PTKF-TK-PTK本试验室构建)；大肠杆菌DH5α、PET30a、DNA Marker(天根生化科技(北京)有限公司)；PureYieldTM Plasmid Maxiprep System试剂盒(promega)；大肠杆菌DH5α、Pet-30a(+)、DNA Marker(天根生化科技(北京)有限公司)；限制性核酸内切酶SbfⅠ、AscⅠ、MfeⅠ、SacⅠ、XmaⅠ、T4DNA连接酶(美国NEB公司)；一抗(MS阳性血清)；二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鸡(IgG)；四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)二抗羊抗兔(博士德)；胎牛血清、0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)(Gibco)；成纤维完全培养基(赛百慷(上海)生物技术股份有限公司)；鸡胚成纤维细胞(细胞永生化产物)；PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。
一、重组病毒的构建
参见图1，为本申请的MS抗原基因重组痘苗病毒的构建方法流程图。
S1：构建重组表达载体
S11:根据NCBI基因库中启动子p7.5、启动子p11和TK基因序列构建质粒：选取以TK基因为中心的3000bp基因序列，设计引物，将TK基因分为两段进行扩增，扩增后每段长度分别为1500bp左右,引物两端分别加酶切位点，MfeⅠ，SacⅠ，AscⅠ，XmaⅠ(用横线标注)。其中涉及引物序列如表1-1。
表1-1引物序列
PCR扩增后，获得TKF，TKR两段基因片段，分别进行双酶切，酶切位点为MfeⅠ，SacⅠ与AscⅠ，XmaⅠ。酶切体系为50微升，目的基因片段25微升；限制性核酸内切酶分别1微升；NEBuffer 10微升；dd H2O，13微升。37℃水浴酶切3小时。将酶切体系分别进行1％凝胶琼脂糖电泳，110V，90mA，60分钟。凝胶电泳产物回收，纯化。
将凝胶产物在紫外灯下，用高压后手术刀切下，凝胶称重后加相应溶解液，56℃水浴，10分钟；将溶液转移至预先处理后的吸附柱集中管中，12000转，高速离心机离心1分钟，倒掉废液；加入600微升已处理过的WB溶液，12000转，高速离心机离心1分钟，倒掉废液；重复上一步；接着12000转，高速离心机离心2分钟，倒掉废液；室温静置5分钟，使乙醇完全挥发；将吸附柱放入高压过的离心管中，加入70℃dd H2O 70微升，室温静置2分钟后12000转，高速离心机离心2分钟，得到回收产物。将回收产物各取3微升进行凝胶琼脂糖电泳进行产物鉴定。进一步确定产物准确性，-20℃保存备用。其中表1-2,1-3,1-4,1-5分别是反应程序探索后条件。
表1-2以TKF基因为模板反应体系
表1-3反应条件
表1-4以TKR基因为模板反应体系
表1-5反应条件
本实施例中使用的原始质粒根据现有技术制备得到：
以Pvax1载体为模板，利用PCR方法扩增含有pUC ori序列和卡那霉素抗性基因的DNA目的片段。将PCR获得的目的片段回收，与含有DNA合成片段的质粒Puc19-tkpp分别用内切酶AvrⅡ和HindⅢ双酶切，酶切产物回收，并用T4 DNA ligase连接幻化，转化大肠杆菌DH5α，鉴定阳性克隆并测序。
提取羊痘病毒弱毒株AV41基因组DNA，利用PCR方法扩增含有TK基因的同源臂序列，用于替换上述质粒中的TK基因同源臂，将扩增获得的同源臂序列利用酶切位点插入替换质粒中的tk L和tk R，得到含有TK基因及其侧翼序列同源臂的重组质粒。
以载体Pires2-AcGFP1为模板，利用PCR方法扩增含有GFP和IRES序列的片段：以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增gpt基因。扩增后得到GFP-IRES片段和gpt基因，插入到上述重组质粒的多克隆位点(MCS A)，置于p11启动子后，形成p11-gpt-GFP表达盒，构建成原始质粒。
S12：根据原始质粒全基因序列设计一对引物序列，引物序列如表2-1所示。
表2-1引物设计
扩增PTKF基因片段，目的是替换相应的酶切位点，反应体系目的基因片段长度5889bp，将PCR扩增产物，进行双酶切，与TKR基因片段根据酶切位点进行链接。酶链接体系为20微升，PTKF 13微升；TKR片段4微升；10X T4 DNA Ligase Buffer 2微升；T4 DNALigase 1微升，16℃恒温过夜。其中表2-2，2-3分别是反应程序探索后条件。
表2-2以PTKF基因为模板反应体系
过夜后将产物转化至TOP10克隆菌株。从-80℃超低温冰箱取出TOP10克隆菌株后迅速放置事先准备好的碎冰保温盒中；将过夜连接产物分别加入感受态细胞中，静置30分钟；迅速取出后放入42℃水浴90秒，取出快速放入碎冰保温盒静置2分钟；分别将反应体系完全转移至700微升无添加肉汤培养基中，震荡室温培养50分钟；观察菌液有无浑浊，若有则12000转高速离心1分钟，吸取上清液600微升，弃掉；将剩余100微升液体与沉淀震荡混匀；吸取5微升菌液均匀涂布于含有卡那霉素的肉汤固体培养基，封口，倒置37℃恒温培养箱过夜，并将剩余菌液封口-20℃保存；从培养基中挑取培养基中5个单个菌落放入1.5毫升含卡那霉素肉汤培养基中编号1-5，37℃恒温震荡过夜培养12小时，得到PTKF-TKR质粒。利用质粒提取试剂盒，提取5管菌液中质粒，用双酶切方法鉴定质粒的链接情况。
表2-3反应条件
S13：根据PTKF-TKR质粒全基因序列设计引物。所述设计引物见表3-1。
表3-1引物设计
扩增PTKR基因片段，反应体系目的基因片段长度5888bp，将PCR扩增产物双酶切后与所述TKF基因片段根据酶切位点进行链接后转至大肠杆菌TOP10克隆菌株培养，之后进行表达载体构建得到PTKF-TK-PTKR质粒。其中，图2为重组转移载体PTKF-TK-PTKR构建过程示意图。表3-2，3-3为酶切反应体系以及反应条件。
表3-2以PTKR基因为模板反应体系
将PTKF-TK-PTKR通过单酶切进行初步鉴定。酶切位点为MfeⅠ，酶切体系为25，目的基因片段12.5微升；限制性核酸内切酶1微升；NEBuffer 0.5微升；dd H2O，6.5微升。37℃水浴酶切3小时。将酶切产物进行凝胶琼脂电泳后，跑图。
表3-3反应条件
将重组质粒PTKF-TK-PTKR转化至大肠杆菌TOP10克隆菌株，从-80℃超低温冰箱取出TOP10克隆菌株迅速放置事先准备好的碎冰保温盒中，将PTKF-TK-PTKR加入感受态细胞中，静置30分钟；迅速取出后放入42℃水浴90秒，取出快速放入碎冰保温盒静置2分钟；分别将反应体系完全转移至700微升无添加肉汤培养基中，震荡室温培养50分钟；观察菌液有无浑浊，若有则12000转高速离心1分钟，吸取上清液600微升，弃掉；将剩余100微升液体与沉淀震荡混匀；吸取5微升菌液均匀涂布于含有卡那霉素的肉汤固体培养基，封口，倒置37℃恒温培养箱过夜，并将剩余菌液封口-20℃保存；从培养基中挑取培养基中5个单个菌落放入1.5毫升含卡那霉素肉汤培养基中编号1-5，37℃恒温震荡过夜培养12小时。
利用质粒提取试剂盒，提取5管菌液中质粒，用双酶切方法鉴定质粒的链接情况，选取已构成的重组质粒PTKF-TK-PTKR的TOP10受体菌液。将PTKF-TK-PTKR通过原始酶切位点，单酶切进行再次鉴定，酶切位点为BamH I酶切体系为25，目的基因片段12.5微升；限制性核酸内切酶BamH I 1微升；NEBuffer 0.5微升；dd H2O 6.5微升。37℃水浴酶切3小时。将酶切产物进行凝胶琼脂电泳后，跑图后测序，待用。
S2：重组转移质粒的构建；
通过MSPB与NADH两端基因序列，设计两对引物(见表4-1)，两端分别插入SbfⅠ与AscⅠ两个酶切位点，这两对基因序列均可扩增目的基因全长并插入预设酶切位点。
将PCR反应产物，与转移载体PTKF-TK-PTKR分别进行双酶切，酶切位点均为SbfⅠ与AscⅠ酶切体系为50，目的基因片段25微升；酶切反应体系见表4-2，4-3，4-4以及表4-5。限制性核酸内切酶分别1微升；NEBuffer 10微升；dd H2O，13微升。37℃水浴酶切3小时。将酶切后的MSPB与NADH两段外源基因分别与转移载体PTKF-TK-PTKR酶联，酶链接体系为20，PTKF13微升；TKR片段4微升；10X T4 DNA Ligase Buffer 2微升；T4 DNA Ligase 1微升，16℃恒温过夜。得到重组质粒PTKF-TK-PTKR-M，PTKF-TK-PTKR-N。
将重组质粒PTKF-TK-PTKR-M，PTKF-TK-PTKR-N转化至大肠杆菌TOP10克隆菌株，从-80℃超低温冰箱取出TOP10克隆菌株迅速放置事先准备好的碎冰保温盒中；分别将PTKF-TK-PTKR-M，PTKF-TK-PTKR-N加入感受态细胞中，静置30分钟；迅速取出后放入42℃水浴90秒，取出快速放入碎冰保温盒静置2分钟；分别将反应体系完全转移至700微升无添加肉汤培养基中，震荡室温培养50分钟；观察菌液有无浑浊，若有则12000转高速离心1分钟，吸取上清液600微升，弃掉；将剩余100微升液体与沉淀震荡混匀；吸取5微升菌液均匀涂布于含有卡那霉素的肉汤固体培养基，封口，倒置37℃恒温培养箱过夜，并将剩余菌液封口-20℃保存；从固体培养基上挑取各取5个疑似菌落放入1.5毫升含卡那霉素肉汤培养基中编号1-10，37℃恒温震荡过夜培养12小时。利用质粒提取试剂盒，提取10管菌液中质粒，用双酶切方法鉴定质粒，选取已构成的重组质粒PTKF-TK-PTKR-M，PTKF-TK-PTKR-N。其中，图3为重组质粒外源基因插入位点。
表4-1引物设计
表4-2以MSPB基因为模板反应体系
表4-3反应条件
表4-4以NADH基因为模板反应体系
表4-5反应条件
S3：重组病毒的转染与纯化
S31：通过PureYieldTM Plasmid Maxiprep System试剂盒，提取所述重组质粒(PTKF-TK-PTKR-M，PTKF-TK-PTKR-N)，并且在提取过程中，去除质粒内毒素；
通过PureYieldTM Plasmid Maxiprep System试剂盒，提取质粒，并且在提取过程中，去除质粒内毒素，以备下一步细胞转染使用，具体过程：
1)将菌株分别接种5毫升肉汤培养基，过夜培养，12000转离心19分钟，尽量吸取上清后弃废液；
2)加入250毫升重悬液震荡重悬；
3)加入250微升细胞裂解液，轻晃混匀，室温静置5分钟；
4)加入350微升中和液，轻晃混匀，终止反应；
5)将混合液12000转4℃离心15分钟，尽量吸取上清液并移至新的离心管，重复操作，收上清；
6)去内毒素树脂混匀，于50微升离心管室温静置9分钟，并且每3分钟高频振荡5秒；
7)将离心管置于磁珠分离架直至溶液澄清，颠倒静置架与离心管，除去管壁液体，静置30秒，收取上清液；
8)向加入上清液的离心管中加200微升GTC(5M/L)振荡混匀；
9)加150微升彻底重悬磁珠，混匀室温静置3分钟；
10)将离心管置于磁珠分离架直至溶液澄清，颠倒静置架与离心管，除去管壁液体，静置30秒至溶液澄清，尽量吸取上清弃掉，静置离心管3分钟，吸取上清弃掉；
11)向离心管中加入200微升4/40洗脱液，振荡器15秒，重悬磁珠(此步主要除去多于蛋白)；
12)将离心管放置磁珠分离架直至溶液澄清，颠倒静置架与离心管，除去管壁液体，静置30秒，尽量吸取上清弃掉，静置离心管3分钟，吸取上清弃掉；
13)向离心管中加入1毫升80％乙醇溶液。振荡器10秒，离心管放置磁珠分离架直至溶液澄清，颠倒静置架与离心管，除去管壁液体，静置30秒，尽量吸取上清弃掉，静置离心管3分钟，吸取上清弃掉；
14)重复上一步；
15)打开离心管后，静置磁珠分离架10分钟，弃掉上清；
16)将离心管从静置架上取出加入240微升dd H2O，震荡10秒，室温静置1分钟，将离心管放置磁珠分离架直至溶液澄清，颠倒静置架与离心管，除去管壁液体，静置30秒，室温放置3分钟，收集上清至新的离心管，14000转离心10分钟，收取上清并计算体积；
17)根据体积比例加入醋酸铵(0.5：17)5M/L和乙醇(2.5：1)95％震荡混匀，14000转离心15分钟，尽量吸取上清弃掉，加1毫升70％酒精震荡混匀，14000转离心5分钟，吸取上清，弃掉，打开盖子，室温静置5分钟使酒精彻底挥发，每管加入30微升dd H2O，溶解，收集质粒。
18)分别取1微升，2微升，3微升产物，经行凝胶电泳，估计产物浓度，用分光光度计检测OD值。
S32：按照Lipofectamine PlusTM Reagent试剂盒将去除毒素的质粒与病毒株在细胞中进行转染，经过多轮噬斑筛选获得纯的表达绿色荧光的噬斑进行纯化后得到两株重组病毒rFPV/MS-MSPB以及rFPV/MS-NADH。放-20℃冰箱保存备用。
复苏鸡胚成纤维细胞，将细胞接种于六孔细胞培养板中，待细胞单层覆盖率达80％-90％时，倒出培养液，加PBS轻轻洗涤后倒出，加入已鉴定过的宁夏本地分离鸡痘病毒培养基0.5毫升，二氧化碳培养箱37℃感作2小时，期间观察细胞接种后的变化，倒出病毒液，加1毫升PBS轻晃后倒出。按照Lipofectamine PlusTM Reagent试剂盒将质粒与病毒株在细胞中进行转染，具体操作如下：
1)分别将已去内毒素的质粒，1.5微克与100微升DMEM混匀，加入10微升Plus，细胞间室温静置15分钟，加入8微升Lipofectamine溶液(加PBS)混匀，细胞间室温静置15分钟；
2)将混合液加入已用PBS清洗过的细胞中，二氧化碳培养箱，37℃感作2小时，倒出多余液体后加入不含抗生素的细胞培养液，培养至细胞产生病变；
3)反复冻融3次后离心收集病毒-20℃保存备用。
4)将已经处理后的病毒溶液，接种于已单层覆盖率在80％-90％的鸡胚成纤维细胞，二氧化碳培养箱感作2小时，轻轻倒出多于液体，加入DMEM(含1％低熔点琼脂糖)，37℃，二氧化碳培养箱培养每24小时观察细胞病变情况，72小时时检测是否出现绿色荧光(荧光显微镜观察)，若出现反应，筛选后绿色噬斑，加入1毫升无血清DMEM，反复冻融三次，重复上一步操作，直至绿色荧光大量出现，重组病毒纯化，收集最后一步的病毒液，-80℃冻存，命名为rFPV/MS-MSPB，rFPV/MS-NADH两株重组病毒株。
二、重组病毒的鉴定
1、外源基因PCR鉴定
1.1重组病毒基因组DNA提取
1)将重组后病毒分别接种于单层鸡胚成纤维细胞，通过显微镜观察，当细胞病变达到80％以上，弃上清，加入清洗液PBS，轻轻晃动后倒掉，终止反应；
2)每瓶加入2毫升胰蛋白消化酶，37℃消化150秒，到处消化液后，加入清洗液PBS用吸管吹打细胞，直至细胞完全脱落，4000转离心10分钟后弃上清，收集沉淀；
3)细胞裂解，向沉淀中加入1.5毫升细胞裂解液(胰蛋白酶，1％SDS，100mM Nacl，10nM Tris-Cl ph：8.0，1mM EDTA)，37℃水域反应3.5小时；向裂解产物中加入抽提液(饱和酚：氯仿＝1：1)经行第一次抽提，加氯仿经行第二次抽提后，加两倍体积的无水乙醇，-20℃，30分钟；
4)12000转离心15分钟后，收集沉淀，70％乙醇洗涤后，置于室温数分钟，待沉淀干燥后，溶于TE溶液中，-20℃保存待用。
1.2目的基因片段的PCR扩增
分别用MSPB-F、MSPB-R与NADH-F、NADH-R为引物，对提取的重组病毒基因组经行扩增，反应条件见上部分。
2、重组病毒MSPB与NADH蛋白的间接免疫荧光试验
将分离得到的原始鸡痘病毒株与重组后两株病毒分别接种于已生长单层覆盖率在80％以上鸡胚成纤维细胞六孔板，通过显微镜观察，当细胞病变达到80％以上，弃上清，加入清洗液PBS，轻轻晃动后倒掉，终止反应；根据IF具体操作流程经行操作。
1)固定：室温下，三个培养板中分别加4％多聚甲醛(溶于PBS中，pH 7.4)，孵育细胞10分钟。用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟；
2)通透：PBS(含0.1–0.25％Triton X-100或100μM Digitonin或0.5％Saponin)孵育样品10分钟，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟(试验室常用Triton X-100，但由于TritonX-100会破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜抗原)；
3)封闭：用1％BSA、22.52mg/mL甘氨酸的PBST(PBS+0.1％Tween 20)孵育细胞30分钟；
4)抗体结合：倒出封闭液，加一抗(溶于1％BSA的PBST中稀释)，室温下孵育1小时，倒出一抗，用PBS洗涤细胞3次；加二抗(溶于1％BSA中，TRITC荧光标记)，室温下孵育1小时，倒出二抗，用PBS避光洗涤细胞3次，每次5分钟，避光室温下待液体完全挥发，荧光显微镜观察结果。
3、重组病毒的Western blot鉴定
1)将重组后两株病毒分别接种于已生长单层覆盖率在80％以上鸡胚成纤维细胞六孔板，通过显微镜观察，当细胞病变达到80％以上，弃上清，加入清洗液PBS，轻轻晃动后倒掉，终止反应；
2)胰蛋白酶消化后，加入PBS，经吹打后使细胞完全脱落，4000转，15分钟，收集细胞作为待测样品；加入细胞裂解液，置于碎冰上反应30分钟，加入两倍体积的SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶上样缓冲液)，经行SDS-PAGE电泳，转膜；
3)将膜转入已加入封闭液(5％脱脂乳，0.02％叠氨钠，0.02％Tween-20)的培养皿中，室温反应2小时；将膜转移至稀释后的一抗中，室温反应1小时，用PBS洗涤细胞3次每次10分钟；用洗涤液(150mmol/LNacl，50mmol/L Tris-Hcl pH 7.5)洗膜3次，每次10分钟；
4)将膜转移至稀释后二抗(HRP标记羊抗鸡)(1％BSA，150mmol/L Nacl，50mmol/LTris-Hcl pH 7.5)溶液中,室温下缓慢震荡反应1小时；
5)洗涤液清洗3次，每次10分钟；
6)最后用DAB染色后观察结果。
其中，图4为TK基因加入相应酶切位点后PCR电泳结果图，图5为TK基因酶切后电泳凝胶回收后电泳图，根据图4和图5，得到TK基因PCR电泳结果，图4中M为Marker；1为TKF段约1500bp；1为TKR段约1500bp；右部分为marker条带图；图5中M为Marker；1，2，3为TKF段约1500bp(酶切位点为MfeⅠ，SacⅠ)；4，5为TKR段约1500bp(酶切位点为AscⅠ，XmaⅠ)；右部分为marker条带图；
其中，图6为PTKF及PTKR PCR电泳结果图，图6中M为Marker；1，2为PTKF段约5889bp；3为PTKR段约5888bp；右部分为marker条带图；图7为PTKF-TK-PTKR单酶(MfeⅠ)切电泳结果图，图7中，M为Marker；1，2为PTKF-TK-PTKR约7388bp(鉴定新插入酶切位点)；右部分为marker条带图。图8为TOP10克隆菌提取PTKF-TK-PTKR质粒(BamH I)原始酶切位点单酶切电泳结果图，图8中M：Marker；1:酶切前质粒；2：酶切后质粒(约7388bp)；右图为marker条带图。
本申请采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，将获得的重组质粒PTKF-TK-PTKR改造后转入Top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果与预期相符。
其中，图9为MSPB两端分别插入SbfⅠ与AscⅠ两个酶切位点图(1422bp)，图9中M：Marker；MSPB；右部分为marker条带图；图10为NADH两端分别插入SbfⅠ与AscⅠ两个酶切位点图(620bp)，图10中M：Marker；DNAK；右部分为marker条带图。
其中，图11为单酶切后PCR电泳图，图11中M为Marker,1,2为PTKF-TK-PTKR-M；3为PTKF-TK-PTKR-N；右部分为marker条带图；两段单酶切片段预测基因长度在9000bp左右，且PTKF-TK-PTKR-M片段长度大于PTKF-TK-PTKR-N，电泳结果均与预期相符。
其中，图12为原始毒株转染细胞后，细胞的形态学变化图，从图12中可以看出，从左向右，一开始典型的纤维细胞结构，逐渐转染病变。
图13为重组病毒rFPV/MS-MSPB与鸡痘病毒转染细胞后绿色荧光反应图，从图13中可以看出，从一开始的散状分布，随着逐渐繁殖筛选，后期出现大量绿色荧光。
图14为重组病毒rFPV/MS-NADH与鸡痘病毒转染细胞后绿色荧光反应图，从图14中可以看出，从一开始的散状分布，随着逐渐繁殖筛选，后期出现大量绿色荧光。
图15为重组鸡痘病毒目的基因片段MSPB、NADH图，MSPB(1421bp)，NADH(620bp)，图中M：Marker；MSPB；NADH；左图为marker条带图；
图16为重组病毒MSPB与NADH蛋白的间接免疫荧光试验图，图中M：野毒株阴性对照；1:重组病毒MSPB蛋白；2：重组病毒DANK蛋白。由结果可看出，重组蛋白均能表达。
图17为重组病毒的Western blot鉴定结果图，图中M：Marker；1：重组病毒MSPB蛋白；2：重组病毒NADH蛋白，预测MSPB45-66；NADH40-55之间由结果可看出均在预测范围之内。
通过对原始质粒改造后，得到以GFP为报告基因，作为重组同源臂的鸡痘TK基因，启动子p7.5和p11，Kanr作为抗性基因，并且通过改造获取所需酶切位点MfeⅠ，XmaⅠ的重组质粒PTK-TK-PTKR。在此基础上，通过TK基因作为同源替换基因，构建两株新的重组病毒rFPV/MS-MSPB，rFPV/MS-NADH，经细胞克隆后荧光标记筛选，从一代的松散几个到最后一代的高密度绿色荧光，由此可见，在通过TK基因同源重组后，重组基因能够稳定表达，通过PCR扩增试验进一步证实外源目的基因的存在，经Western blot鉴定，两株重组病毒的外源蛋白MSPB、NADH符合试验二结果，即具有免疫原性，抗原基因所表达的蛋白产物的活性，没有受到病毒重组的影响。
三、重组鸡痘病毒免疫效果
将MS具有抗原作用的基因片段MSPB，NADH插入到痘病毒基因组中，构建重组痘病毒疫苗，经过以上试验，首先证明了两段抗原基因的原核蛋白表达及纯化情况，在此基础上构建重组鸡痘病毒并且通过试验验证重组痘病毒的外源基因插入情况和抗原的活性，最后通过动物试验，对重组痘病毒疫苗的抗原产生情况进行试验。
使用的试剂为rFPV/MS-MSPB，rFPV/MS-NADH重组病毒；1日龄雏鸡由晓明农牧提供；胎牛血清、0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)(Gibco)；成纤维完全培养基(赛百慷(上海)生物技术股份有限公司)；鸡胚成纤维细胞(细胞永生化产物)；生理盐水(歌美研，赣樟药监械生产厂)。
1、两株重组病毒株半数细胞培养物感染力(TCID50)的测定
96孔板培养鸡胚成纤维细胞，待细胞单层覆盖率达80％以上，弃去培养液后，PBS轻轻冲洗后，弃去液体，将两株重组病毒株，按10倍比(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6)，用DMEM稀释后，分别加入细胞中，每孔加100微升，每个浓度接8孔。设置一不接病毒的细胞孔为阴性对照。培养5天，每天观察细胞病变情况并记录后按照Reed-Muench两氏法计算。
2、重组病毒的扩大培养
通过鸡胚成纤维细胞接种，大量培养rFPV/MS-MSPB，rFPV/MS-NADH重组病毒，接种后，观察细胞病变达80％以上，完全消化后，离心收集细胞沉淀，用PBS重悬清洗1次后，取少量沉淀SDS-PAGE电泳确定产物，剩余沉淀PBS重悬。
3、动物分组免疫过程
用rFPV/MS-MSPB，rFPV/MS-NADH重组病毒表达蛋白分别包被96孔板待用。使用方法参照间接ELISA检测方法。
选取48只一日龄雏鸡(无疫苗接种的白来航蛋鸡)，公母各半，试验室饲养一周；公母各半分为四组，编号①、②、③、④，每组分别标注1-12号。三周龄采血后确定无母源抗体后，分别①组为阳性对照组，皮下注射MS菌液；②组为阴性对照组皮下注射生理盐水；③组皮下注射接种rFPV/MS-MSPB；④组皮下注射接种rFPV/MS-NADH，每只0.2毫升。首次免疫后每七天进行一次采血，体温测定，称重，收集数据。七周龄，加强免疫一次。第一天，第七天，分别采血，检测抗体变化，人工攻毒完成当天记为0天。
加强免疫一周后，进行攻毒，①组为阳性对照组，MS菌液滴鼻；②组为阴性对照MS菌液滴鼻；③组MS菌液滴鼻；④组MS菌液滴鼻，每只0.2毫升。每三天攻毒一次，共攻毒三次。观察发病情况，攻毒后，每组分别在第7天、第14天、第21天、第28天、第35天采血，检测抗体变化。
4、结果分析
4.1两株重组病毒株半数细胞培养物感染力(TCID50)
表5-1和5-2为PTK-MSPB重组病毒TCID50以及PTK-NADH重组病毒TCID50。其中，TCID50＝10-3.74/0.1ml(将PTK-MSPB重组病毒稀释103.74接种100μl可使50％的细胞发生病变)。
TCID50＝10-3.69/0.1ml(将PTK-NADH重组病毒稀释103.69接种100μl可使50％的细胞发生病变)。
表5-1 PTK-MSPB重组病毒TCID50
表5-2 PTK-NADH重组病毒TCID50
4.2试验动物体温变化
接种后，①、②、③、④的体温变化，通过图18可见，由于应急，接种后第二天会有不同程度的体温变化，免疫接种后第一天由于应激会有不同程度体温的的变化，第七天测试时趋于正常。各组体温的变化在1.3℃以内，阳性对照组①体温变化最为明显，在第28天加强免疫后，体温出现第二个小高峰，但是在正常范围之内。除阴性对照组②基本无特异性体温变化外，①，③，④组的体温变化趋势相近。在攻毒后，体温变化有小幅度波动，但是变化趋势基本相同。阳性对照组与试验组③、④三组之间差异不显著(P＞0.05)，阴性对照组与①、③、④三组攻毒前极显著(P＜0.01)，攻毒后从51天开始差异不显著(P＞0.05)。备注图18中从左至右柱状分别为编号①、②、③、④，下同。
4.3试验动物体重的变化
从图19，可看出从0天开始到72天，各组试验对象的个体平均体重增长在1.2kg，蛋鸡的体重一般在45天左右增长减慢。阳性对照组②的体重增长最小，但是各组的体重变化趋势并无特别大的差异，各组相互之间差异不显著(P＞0.05)。
4.4试验动物抗体水平
通过图20可看出各组抗体水平的变化。在接种后，第七天①、③、④组抗体变化趋势基本相同。通过数据分析可得到结果，接种后，从第七天开始，各组抗体开始增长，到21天趋于稳定，但是阳性对照组①明显高于其他各组，试验组③、④基本相同，rFPV/MS-MSPB，rFPV/MS-NADH两株重组病毒株均可使机体产生抗体且rFPV/MS-MSPB抗体水平更高但是差异不显著(P＞0.05)。阴性对照组的抗体水平始终保持相对稳定，攻毒前较低，攻毒后平稳升高。
4.5试验动物攻毒后发病结果
接种后，首先根据临床症状精神萎靡、呼吸困难、声音嘶哑，关节肿胀和跛行等做初步临床症状诊断，再采取关节液与血液进行支原体分离培养，以验证试验动物的病情况，通过图21可直观看出，接毒后，阴性对照组②直至试验结束，通过病原分离，12只试验动物全部获取MS病原菌。阳性对照组①35天时，12只试验动物全部都可通过病原分离，获得MS病原菌。试验组③、④在28天攻毒后，第51天分别有1只、2只试验动物可分离得到病原菌MS。72天时试验组③发病程度为16.7％，试验组④发病情况为33.3％，说明，通过人工攻毒四周后可以从未免疫的试验动物体内100％分离得到菌MS，rFPV/MS-MSPB，rFPV/MS-NADH两株重组病毒株均可预防MS，且rFPV/MS-MSPB效果更好。
从本试验的结果能够看出，在接种痘病毒重组疫苗后，机体可以产生抗体，接种后，机体的温度，体重及变化不明显，抗体水平相对比较稳定，rFPV/MS-MSPB，rFPV/MS-NADH两株重组病毒株均可预防MS，rFPV/MS-MSPB免疫保护率为83.3％，rFPV/MS-NADH免疫保护率为66.7％，rFPV/MS-MSPB效果更好。
本发明具有以下优点：
1.通过同源重组技术得到rFPV/MS-MSPB，rFPV/MS-NADH两株重组病毒株，通过酶切位点鉴定，PCR扩增及WB鉴定，外源基因正常扩增。
2.两株重组病毒接种鸡后，试验动物体温、体重等与阴、阳性对照组基本相同，rFPV/MS-MSPB，rFPV/MS-NADH两株重组病毒株均可使机体产生抗体且rFPV/MS-MSPB免疫保护率为83.3％，rFPV/MS-NADH免疫保护率为66.7％，rFPV/MS-MSPB抗体水平更高。
本申请提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本申请总的构思下的几个示例，并不构成本申请保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本申请方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本申请的保护范围。
序列表
<110> 宁夏大学
宁夏晓鸣农牧股份有限公司
<120> 一种重组病毒及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaaata aaaaaattaa attactatta gcagctagtg cagtggccat tgctcctgct 60
gttatagcaa tttcatgtgg tgatcaaact ccagcacctg ctccaacacc tggaaaccca 120
aatactaata atcctcaaaa cccaaatcca ggaaacccag aaaacccagg tactgataat 180
actcaaaact caaatccagg aaacccaggg ggtggtacag ttgaccctgt agaggctgct 240
aaaacagaag ctaaaactgc tattgatgct gcagcagaat tatcagattc agttaaagaa 300
gcattaaaaa gacaagttga agcaactaca acagaatctg cagccagaga tttaaaagct 360
aaagcagaag ctcttgtttc agctgtaaaa gcattaagcg gatcggttac tgctgctaaa 420
acagttaaag atgatgctga atactcaaaa gtaacagata ctcttagaac tgatttagaa 480
gcaaaattaa cagcagcagc atcattacta gaaggtgaaa caaaacttgc aaatctaaat 540
gctgatggaa ctttagcaac tactcaaagt gatctagaat ctgcaaaaac agctcttgat 600
gcagcagttg cagcagttaa accaaatctt gaattccaaa aaacaaaaac tagcgctgca 660
gctaaagtta cagaacttga atctcttgtt aatacagctt taaaagatga attacaaaga 720
caagttacag ctttagataa agatcatgca actgaagcta caacaatgtt agttaaccta 780
acatctttaa aagaatcact agaatctctt caaactttag tatcagatgg cctaaaaatg 840
caagtggatt atccacaaaa atactacgat gctgacaata aagaagcatt cgatgcagcg 900
ctacttaaag cttcatcagt atttccagca ttccaatgga cagatgaatc aattatggtt 960
cctgctccaa caaatggtgc tttaccaaac cctagagctt ggaccaaagc tagagaaaaa 1020
ttagaatttg tactacaaaa ctttataatg gcaccagctc aagcagctac tccaacaaca 1080
gtgcaaactt cacctagcgc ggcagcatca gctacagtta gagttgcaat gtcagaagaa 1140
gctgcagcag aagcagaaac tcaaacacca gcaccaacac cagcagctga tttagcatca 1200
acagcatctt atctaaaatc attaaatgac actttaaaag ctgaaaccga taagttaaat 1260
ggtgatacaa ccgaaaataa aacagcttac tataaagctg atactactcg tacactatac 1320
tgggacgggt ttatgcctaa aatagttgta gaaggttatg aagcagatgg tgaaggaaat 1380
ggtaaagcaa ctcacgaaga t 1401
<210> 2
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcaaaag tattagtatt aagtggtggc cttagcgaaa aagaaaagtc atattcaagt 60
caaatgcttg atttatttgt taaaacatat aaaaaagttc atcctaatga tgaacttgaa 120
tttgtggatt tgaataccac aaaacatgca gaggtgtttt taagtagaaa tacatttgct 180
acatattgga aagatgtaga aagtgataaa tggatcgata aattaaaagc agctgataaa 240
gttattttaa gttgttcaat gacaaacttt ggaccaactg cagttgttaa aaacttcatc 300
gattcagtgg cggtggctaa caaaacattt agctataaat attctaaaaa aggtgatgca 360
gttggacttc ttgatcatct aagagttatg attgtaacca ctcaaggtgc tccaaaagat 420
tggtatctat ggggaagtca tacaaattgg ttgattggaa cttggaaatt tttaggtgct 480
aaatatgttg atacatttga actaaatgga actaaattat cagtatttgc tgataaaaaa 540
ccatacgatg tagttcagga attcagacaa gatgctttag aaaaagcaaa acaattctaa 600

Claims (3)

1.一种重组病毒，其特征在于，以鸡痘病毒为载体，在鸡痘病毒的SbfⅠ与AscⅠ酶切位点之间插入鸡滑液囊支原体基因；所述鸡滑液囊支原体基因为NADH；其中，所述鸡滑液囊支原体基因NADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的重组病毒在制备用于预防由鸡滑液囊支原体引起的禽类滑膜炎症的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的重组病毒制备的疫苗。
CN202110708904.XA 2021-06-25 2021-06-25 一种重组病毒及其应用 Active CN113462659B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110708904.XA CN113462659B (zh) 2021-06-25 2021-06-25 一种重组病毒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110708904.XA CN113462659B (zh) 2021-06-25 2021-06-25 一种重组病毒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113462659A CN113462659A (zh) 2021-10-01
CN113462659B true CN113462659B (zh) 2023-10-20

Family

ID=77872895

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110708904.XA Active CN113462659B (zh) 2021-06-25 2021-06-25 一种重组病毒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113462659B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101067140A (zh) * 2007-05-25 2007-11-07 扬州大学 鸡痘病毒表达载体p12－18及其构建方法
CN106267176A (zh) * 2015-05-12 2017-01-04 普莱柯生物工程股份有限公司 鸡传染性鼻炎疫苗组合物及其制备方法和应用
CN110025778A (zh) * 2019-04-15 2019-07-19 苏州世诺生物技术有限公司 鸡滑液囊支原体新型基因工程亚单位疫苗

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007022151A2 (en) * 2005-08-15 2007-02-22 Vaxin, Inc. Immunization of avians by administration of non-replicating vectored vaccines

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101067140A (zh) * 2007-05-25 2007-11-07 扬州大学 鸡痘病毒表达载体p12－18及其构建方法
CN106267176A (zh) * 2015-05-12 2017-01-04 普莱柯生物工程股份有限公司 鸡传染性鼻炎疫苗组合物及其制备方法和应用
CN110025778A (zh) * 2019-04-15 2019-07-19 苏州世诺生物技术有限公司 鸡滑液囊支原体新型基因工程亚单位疫苗

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Vaccines for Mycoplasma Diseases in Animals and Man;R. A. J. Nicholas et al.,;《J. Comp. Path.》;20091231;第140卷;第85-96页 *
鸡滑液囊支原体疫苗研究进展;田亚琴等;《中国家禽》;20201231;第42卷(第9期);第96-102页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113462659A (zh) 2021-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103937835A (zh) 一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法
CN110951699A (zh) 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用
CN111925996A (zh) 一种非洲猪瘟基因缺失减毒及其活疫苗
CN114164184A (zh) 一种新城疫病毒基因ⅵ型疫苗株及其应用
CN116059333A (zh) 一种牛源a型多杀性巴氏杆菌基因缺失菌株及其应用
CN110184287B (zh) 一种制备重组病毒的方法及其应用
CN113462659B (zh) 一种重组病毒及其应用
CN108130340B (zh) 表达鸭源禽流感病毒ns1蛋白的方法以及该方法的应用
CN109943576A (zh) 一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒及其应用
CN113151354B (zh) 一种用于条件性敲除目的基因的载体及条件性敲除目的基因的方法
CN113481172A (zh) 一种ms抗原基因重组痘苗病毒的构建方法
CN110484515B (zh) 一种预防FAdV-4和NDV的疫苗载体及其制备方法及应用
CN114107176A (zh) 一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系及其构建方法和应用
CN105385666A (zh) 伪狂犬病病毒双荧光标记5基因缺失株的构建
CN116904406B (zh) 表达h9亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒
CN115772502B (zh) 唾液酸转移酶基因缺失的mdck细胞株及构建方法和应用
CN111925449B (zh) 一种表达鸡vp2和鸡gal-1融合蛋白的重组cho细胞株及其构建方法和应用
CN114164213B (zh) 一种敲除mic3基因的重组球虫载体及其检测方法
CN114457078B (zh) 一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源mlkl基因缺失细胞株及其应用
CN113151193B (zh) 血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rR188I及其构建方法和应用
CN116836939B (zh) 一种抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂或试剂盒及其应用
CN111254123B (zh) 一种表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用
CN107475452B (zh) 一种检测鸭瘟病毒icp4基因的引物以及rt-pcr和荧光定量pcr检测方法
CN117802116A (zh) 一种表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒及制备方法和应用
CN117717611A (zh) 一种布鲁氏菌Bp26基因重组腺病毒载体疫苗及其制备和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant