CN111925996A - 一种非洲猪瘟基因缺失减毒及其活疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种非洲猪瘟基因缺失减毒，本发明还进一步提供利用该减毒制备的非洲猪瘟基因缺失活疫苗，提供了一类新的减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒；通过对L7L、L8L、L9R、L10L、L11L部分或全部基因功能进行缺失，所得的重组毒株与亲本毒株相比，在感染猪后，发热和病毒血症未出现或显著减轻，试验猪均健活；该类基因缺失活病毒制备的疫苗可保护易感猪免受ASFV强毒感染或人为攻毒，可用于非洲猪瘟的预防。

Description

一种非洲猪瘟基因缺失减毒及其活疫苗
技术领域
本发明公开一种非洲猪瘟基因缺失减毒，本发明还进一步提供利用该减毒制备的非洲猪瘟基因缺失活疫苗，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
非洲猪瘟是非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的家猪的高度传染性出血性疾病，死亡率接近100％，给养猪业带来重大损失；针对非洲猪瘟的防控过去主要采取扑杀和清除的方法，到目前为止尚无研制成功的疫苗。非洲猪瘟病毒基因组全长170-190kb,其中间125kb为恒定区，左端35kb和右端15kb为可变区。在可变区内存在着包括多基因家族基因等在内的大量与病毒毒力、免疫抑制、抑制凋亡等相关的基因，包括毒力因子如9GL、UK等(Lewis etal., 2000) (Zsak et al., 1998)，免疫抑制因子如MGF360、MGF505等(Afonso et al.,2004)、血吸附因子如CD2v等(Rodriguez et al., 1993)。
近年来针对ASFV MGF360、MGF505、EP402R等基因进行缺失的减毒疫苗株，以及在自然界中分离的自然弱毒株，在猪体内证实有一定的免疫效果，但在田间试验中发现，这些自然弱毒和人工缺失株疫苗使用后可产生慢性病变，如皮肤溃疡、发热、关节肿胀等不良反应（King et al.，2011；Leitao et al.，2001；Revilla et al.，1992）。因此，阐明更多未知基因功能进而探索更为安全有效的新的疫苗一直是非洲猪瘟防控的重要课题。
发明内容：
本发明提供了一种减毒的非洲猪瘟病毒，即缺失了L7L、L8L、L9R、L10L、L11L部分或全部功能的非洲猪瘟活病毒；在此基础上进一步缺失其他致病基因可提高其安全性。该类基因缺失活病毒可保护易感猪免受ASFV强毒感染或人为攻毒，可用于非洲猪瘟的预防。
本发明公开的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，基因序列如：SEQ No.1所示，缺失以下基因的功能：基因组右末端L7L，L8L，L9R，L10L，L11L。
其中，基因组右末端的L7L，L8L，L9R，L10L，L11L 1-5个基因的缺失；基因组右末端的L7L，L8L，L9R，L10L，L11L每个基因部分缺失或完全缺失。
基因组右末端L7L基因序列如：SEQ No.2所示；
基因组右末端L8L基因序列如：SEQ No.3所示；
基因组右末端L9R基因序列如：SEQ No.4所示；
基因组右末端L10L基因序列如：SEQ No.5所示；
基因组右末端L11L基因序列如：SEQ No.6所示。
本发明所示的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，其特征在于：构建的联合缺失ASFV其他致病基因，如EP402R、MGF360、MGF505、A238L、A224L、EP153R、A276R、DP96R、DP71L、B119L等的重组病毒。
本发明所示的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，其特征在于：其涉及的基因组包括所有非洲猪瘟病毒（不同基因型）的毒力分离株。
本发明所述的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1）L7L-L11L 1个或多个基因缺失病毒的构建
以pUC-EGFP质粒为载体，以L7L，L8L，L9R，L10L，L11L中1个或多个基因为目标（X），分别构建含目的基因（X）左右同源臂的重组质粒，与亲本毒株共转染BMDM细胞，筛选并纯化得到缺失目的基因的重组病毒△X；
2）L7L，L8L，L9R，L10L，L11L中1个或多个基因与ASFV其他基因联合缺失毒株的构建
以pUC-EGFP质粒为载体，构建含目的基因（Y）左右同源臂的重组质粒，与△X共转染BMDM细胞，筛选并纯化得到同时缺失L7L-L11L中1个或多个基因与ASFV其他基因的联合缺失病毒；
3) 疫苗的制备
将步骤1）或2）中构建的病毒接种原代肺泡巨噬细胞，扩大培养，收获病毒液并测定滴度；以102 TCID50以上的病毒液直接或配合佐剂/免疫增强剂等成分制成疫苗。
本发明所述的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒疫苗，可与任何形式的佐剂、免疫调节剂同时使用；也可与其他猪用疫苗联合制备使用。
本发明所述的上述非洲猪瘟基因缺失病毒制备的疫苗免疫试验猪后，未出现明显发热、厌食等临床症状，并在攻毒后28天100%健活，无病毒血症、发热、厌食等症状。证明该类基因缺失疫苗株是一种安全有效的减毒活疫苗。
本发明的积极效果在于：
公开了一类新的减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒；通过对L7L、L8L、L9R、L10L、L11L部分或全部基因功能进行缺失，所得的重组毒株与亲本毒株相比，在感染猪后，发热和病毒血症未出现或显著减轻，试验猪均健活；该类基因缺失活病毒制备的疫苗可保护易感猪免受ASFV强毒感染或人为攻毒，可用于非洲猪瘟的预防。
附图说明
图1为本发明p△L7L-EGFP质粒构建示意图；
图2为本发明p△L8L-EGFP质粒构建示意图；
图3为本发明p△L9R-EGFP质粒构建示意图；
图4为本发明p△L10L-EGFP质粒构建示意图；
图5为本发明p△L11L-EGFP质粒构建示意图；
图6为本发明 p△L7L-8L-EGFP质粒构建示意图；
图7为本发明p△L7L-9R-EGFP质粒构建示意图；
图8为本发明p△L7L-10L-EGFP质粒构建示意图；
图9为本发明p△L7L-11L-EGFP质粒构建示意图；
图10为本发明p△CD2v-mCherry质粒构建示意图；
图11为本发明 p△MGF360-mCherry质粒构建示意图。
具体实施方式：
以下结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但不得以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。同时本发明所用实验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1
缺失L7L基因毒株ASFV△L7L的构建
Figure DEST_PATH_IMAGE001
细胞、毒株和质粒 猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）及原代骨髓巨噬细胞（BMDM）取自2-3月龄仔猪，分离后的PAM细胞于含10%FBS（TBD）的1640完全培养基（gibco）培养，BMDM需在含终浓度为10ng/ml的GM-CSF，10%FBS的1640完全培养基诱导培养。非洲猪瘟病毒SY-18株，Genebank登录号：MH766894.1，由军事兽医研究所流行病学研究室于18年分离，本研究所使用毒株为PAM细胞第四代扩繁毒，于-80℃分装保存。表达载体pUC-EGFP和pUC-mCherry为分别携带有绿色荧光EGFP和红色荧光mCherry的质粒，且荧光基因均在p72启动子的控制下表达；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
同源重组载体的构建 利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即L7L基因的左同源臂（L7L基因左侧约1200bp，L7L-Larm）和L7L的右同源臂（L7L基因右侧约1200bp,L7L-Rarm），依次克隆至pUC-EGFP载体，如图1所示；获得重组质粒p△L7L-EGFP；
Figure DEST_PATH_IMAGE003
重组病毒的筛选、纯化和鉴定 将重组质粒 p△L7L-EGFP转染BMDM细胞，4h后，按照1MOI感染量加入SY-18病毒液，于37℃培养48h后，显微镜下可见约50-100个散在绿色荧光细胞，挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的BMDM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔细胞并保存。提取核酸，使用鉴定引物进行纯度鉴定。所得纯化后的毒株即命名为ASFV△L7L。
实施例2
缺失L8L基因毒株ASFV△L8L的构建
Figure 558193DEST_PATH_IMAGE001
细胞、毒株和质粒 猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）及原代骨髓巨噬细胞（BMDM）取自2-3月龄仔猪，分离后的PAM细胞于含10%FBS（TBD）的1640完全培养基（gibco）培养，BMDM需在含终浓度为10ng/ml的GM-CSF，10%FBS的1640完全培养基诱导培养。非洲猪瘟病毒SY-18株，Genebank登录号：MH766894.1，由军事兽医研究所流行病学研究室于18年分离，本研究所使用毒株为PAM细胞第四代扩繁毒，于-80℃分装保存。表达载体pUC-EGFP和pUC-mCherry为分别携带有绿色荧光EGFP和红色荧光mCherry的质粒，且荧光基因均在p72启动子的控制下表达；
Figure 537651DEST_PATH_IMAGE002
同源重组载体的构建 利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即L8L基因的左同源臂（L8L基因左侧约1200bp，L8L-Larm）和L8L的右同源臂（L8L基因右侧约1200bp,L8L-Rarm），依次克隆至pUC-EGFP载体，如图2所示。获得重组质粒p△L8L-EGFP；
Figure 832235DEST_PATH_IMAGE003
重组病毒的筛选、纯化和鉴定 将重组质粒 p△L8L-EGFP转染BMDM细胞，4h后，按照1MOI感染量加入SY-18病毒液，于37℃培养48h后，显微镜下可见约50-100个散在绿色荧光细胞，挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的BMDM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔细胞并保存。提取核酸，使用鉴定引物进行纯度鉴定。所得纯化后的毒株即命名为ASFV△L8L。
实施例3
缺失L9R基因毒株ASFV△L9R的构建
Figure 555340DEST_PATH_IMAGE001
细胞、毒株和质粒 猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）及原代骨髓巨噬细胞（BMDM）取自2-3月龄仔猪，分离后的PAM细胞于含10%FBS（TBD）的1640完全培养基（gibco）培养，BMDM需在含终浓度为10ng/ml的GM-CSF，10%FBS的1640完全培养基诱导培养。非洲猪瘟病毒SY-18株，Genebank登录号：MH766894.1，由军事兽医研究所流行病学研究室于18年分离，本研究所使用毒株为PAM细胞第四代扩繁毒，于-80℃分装保存。表达载体pUC-EGFP和pUC-mCherry为分别携带有绿色荧光EGFP和红色荧光mCherry的质粒，且荧光基因均在p72启动子的控制下表达；
Figure 510658DEST_PATH_IMAGE002
同源重组载体的构建 利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即L9R基因的左同源臂（L9R基因左侧约1200bp，L9R-Larm）和L9R的右同源臂（L9R基因右侧约1200bp,L9R-Rarm），依次克隆至pUC-EGFP载体，如图3所示。获得重组质粒p△L9R-EGFP；
Figure 644705DEST_PATH_IMAGE003
重组病毒的筛选、纯化和鉴定 将重组质粒 p△L9R-EGFP转染BMDM细胞，4h后，按照1MOI感染量加入SY-18病毒液，于37℃培养48h后，显微镜下可见约50-100个散在绿色荧光细胞，挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的BMDM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔细胞并保存。提取核酸，使用鉴定引物进行纯度鉴定。所得纯化后的毒株即命名为ASFV△L9R。
实施例4
缺失L10L基因毒株ASFV△L10L的构建
Figure 239634DEST_PATH_IMAGE001
细胞、毒株和质粒 猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）及原代骨髓巨噬细胞（BMDM）取自2-3月龄仔猪，分离后的PAM细胞于含10%FBS（TBD）的1640完全培养基（gibco）培养，BMDM需在含终浓度为10ng/ml的GM-CSF，10%FBS的1640完全培养基诱导培养。非洲猪瘟病毒SY-18株，Genebank登录号：MH766894.1，由军事兽医研究所流行病学研究室于18年分离，本研究所使用毒株为PAM细胞第四代扩繁毒，于-80℃分装保存。表达载体pUC-EGFP和pUC-mCherry为分别携带有绿色荧光EGFP和红色荧光mCherry的质粒，且荧光基因均在p72启动子的控制下表达；
Figure 454846DEST_PATH_IMAGE002
同源重组载体的构建 利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即L10L基因的左同源臂（L10L基因左侧约1200bp，L10L-Larm）和L10L的右同源臂（L10L基因右侧约1200bp,L10L-Rarm），依次克隆至pUC-EGFP载体，如图4所示。获得重组质粒p△L10L-EGFP；
Figure 294364DEST_PATH_IMAGE003
重组病毒的筛选、纯化和鉴定 将重组质粒 p△L10L-EGFP转染BMDM细胞，4h后，按照1MOI感染量加入SY-18病毒液，于37℃培养48h后，显微镜下可见约50-100个散在绿色荧光细胞，挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的BMDM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔细胞并保存。提取核酸，使用鉴定引物进行纯度鉴定。所得纯化后的毒株即命名为ASFV△L10L。
实施例5
缺失L11L基因毒株ASFV△L11L的构建
Figure 396050DEST_PATH_IMAGE001
细胞、毒株和质粒 猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）及原代骨髓巨噬细胞（BMDM）取自2-3月龄仔猪，分离后的PAM细胞于含10%FBS（TBD）的1640完全培养基（gibco）培养，BMDM需在含终浓度为10ng/ml的GM-CSF，10%FBS的1640完全培养基诱导培养。非洲猪瘟病毒SY-18株，Genebank登录号：MH766894.1，由军事兽医研究所流行病学研究室于18年分离，本研究所使用毒株为PAM细胞第四代扩繁毒，于-80℃分装保存。表达载体pUC-EGFP和pUC-mCherry为分别携带有绿色荧光EGFP和红色荧光mCherry的质粒，且荧光基因均在p72启动子的控制下表达；
Figure 947117DEST_PATH_IMAGE002
同源重组载体的构建 利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即L11L基因的左同源臂（L11L基因左侧约1200bp，L11L-Larm）和L11L的右同源臂（L11L基因右侧约1200bp,L11L-Rarm），依次克隆至pUC-EGFP载体，如图5所示。获得重组质粒p△L11L-EGFP；
Figure 323609DEST_PATH_IMAGE003
重组病毒的筛选、纯化和鉴定 将重组质粒 p△L11L-EGFP转染BMDM细胞，4h后，按照1MOI感染量加入SY-18病毒液，于37℃培养48h后，显微镜下可见约50-100个散在绿色荧光细胞，挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的BMDM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔细胞并保存。提取核酸，使用鉴定引物进行纯度鉴定。所得纯化后的毒株即命名为ASFV△L11L。
缺失L7L，L8L，L9R，L10L，L11L两个或多个基因联合缺失毒株的构建：
实施例6
缺失L7L和L8L基因毒株ASFV△L7L-8L的构建
①细胞、毒株和质粒 猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）及原代骨髓巨噬细胞（BMDM）取自2-3月龄仔猪，分离后的PAM细胞于含10%FBS（TBD）的1640完全培养基（gibco）培养，BMDM需在含终浓度为10ng/ml的GM-CSF，10%FBS的1640完全培养基诱导培养。非洲猪瘟病毒SY-18株，Genebank登录号：MH766894.1，由军事兽医研究所流行病学研究室于18年分离，本研究所使用毒株为PAM细胞第四代扩繁毒，于-80℃分装保存。表达载体pUC-EGFP和pUC-mCherry为分别携带有绿色荧光EGFP和红色荧光mCherry的质粒，且荧光基因均在p72启动子的控制下表达；
②同源重组载体的构建 利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即L7L基因的左同源臂（L7L基因左侧约1200bp，L7L-Larm）和L8L的右同源臂（L8L基因右侧约1200bp,L8L-Rarm），依次克隆至pUC-EGFP载体，如图6所示。获得重组质粒p△L7L-8L-EGFP;
③重组病毒的筛选、纯化和鉴定 将重组质粒 p△L7L-8L-EGFP转染BMDM细胞，4h后，按照1MOI感染量加入SY-18病毒液，于37℃培养48h后，显微镜下可见约50-100个散在绿色荧光细胞，挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的BMDM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔细胞并保存。提取核酸，使用鉴定引物进行纯度鉴定。所得纯化后的毒株即命名为ASFV△L7L-8L。
实施例7
缺失L7L、L8L、L9R基因毒株ASFV△L7L-9R的构建
①细胞、毒株和质粒 猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）及原代骨髓巨噬细胞（BMDM）取自2-3月龄仔猪，分离后的PAM细胞于含10%FBS（TBD）的1640完全培养基（gibco）培养，BMDM需在含终浓度为10ng/ml的GM-CSF，10%FBS的1640完全培养基诱导培养。非洲猪瘟病毒SY-18株，Genebank登录号：MH766894.1，由军事兽医研究所流行病学研究室于18年分离，本研究所使用毒株为PAM细胞第四代扩繁毒，于-80℃分装保存。表达载体pUC-EGFP和pUC-mCherry为分别携带有绿色荧光EGFP和红色荧光mCherry的质粒，且荧光基因均在p72启动子的控制下表达；
②同源重组载体的构建 利用同源重组的方法，将L7L基因的左同源臂（L7L基因左侧约1200bp，L7L-Larm）和L9R的右同源臂（L9R基因右侧约1200bp,L9R-Rarm），依次克隆至pUC-EGFP载体，如图7所示。获得重组质粒p△L7L-9R-EGFP;
③重组病毒的筛选、纯化和鉴定 将重组质粒 p△L7L-9R-EGFP转染BMDM细胞，4h后，按照1MOI感染量加入SY-18病毒液，于37℃培养48h后，显微镜下可见约50-100个散在绿色荧光细胞，挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的BMDM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔细胞并保存。提取核酸，使用鉴定引物进行纯度鉴定。所得纯化后的毒株即命名为ASFV△L7L-9R。
实施例8
缺失L7L，L8L，L9R，L10L基因毒株ASFV△L7L-10L的构建
①细胞、毒株和质粒 猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）及原代骨髓巨噬细胞（BMDM）取自2-3月龄仔猪，分离后的PAM细胞于含10%FBS（TBD）的1640完全培养基（gibco）培养，BMDM需在含终浓度为10ng/ml的GM-CSF，10%FBS的1640完全培养基诱导培养。非洲猪瘟病毒SY-18株，Genebank登录号：MH766894.1，由军事兽医研究所流行病学研究室于18年分离，本研究所使用毒株为PAM细胞第四代扩繁毒，于-80℃分装保存。表达载体pUC-EGFP和pUC-mCherry为分别携带有绿色荧光EGFP和红色荧光mCherry的质粒，且荧光基因均在p72启动子的控制下表达；
②同源重组载体的构建 利用同源重组的方法，将L7L基因的左同源臂（L7L基因左侧约1200bp，L7L-Larm）和L10L的右同源臂（L10L基因右侧约1200bp,L10L-Rarm），依次克隆至pUC-EGFP载体，如图8所示。获得重组质粒p△L7L-10L-EGFP;
③重组病毒的筛选、纯化和鉴定 将重组质粒 p△L7L-10L-EGFP转染BMDM细胞，4h后，按照1MOI感染量加入SY-18病毒液，于37℃培养48h后，显微镜下可见约50-100个散在绿色荧光细胞，挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的BMDM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔细胞并保存。提取核酸，使用鉴定引物进行纯度鉴定。所得纯化后的毒株即命名为ASFV△L7L-10L。
实施例9
缺失L7L，L8L，L9R，L10L,L11L基因毒株ASFV△L7L-11L的构建
①细胞、毒株和质粒 猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）及原代骨髓巨噬细胞（BMDM）取自2-3月龄仔猪，分离后的PAM细胞于含10%FBS（TBD）的1640完全培养基（gibco）培养，BMDM需在含终浓度为10ng/ml的GM-CSF，10%FBS的1640完全培养基诱导培养。非洲猪瘟病毒SY-18株，Genebank登录号：MH766894.1，由军事兽医研究所流行病学研究室于18年分离，本研究所使用毒株为PAM细胞第四代扩繁毒，于-80℃分装保存。表达载体pUC-EGFP和pUC-mCherry为分别携带有绿色荧光EGFP和红色荧光mCherry的质粒，且荧光基因均在p72启动子的控制下表达；
②同源重组载体的构建 利用同源重组的方法，将L7L基因的左同源臂（L7L基因左侧约1200bp，L7L-Larm）和L11L的右同源臂（L11L基因右侧约1200bp,L11L-Rarm），依次克隆至pUC-EGFP载体，如图9所示。获得重组质粒p△L7L-11L-EGFP;
③重组病毒的筛选、纯化和鉴定 将重组质粒 p△L7L-11L-EGFP转染BMDM细胞，4h后，按照1MOI感染量加入SY-18病毒液，于37℃培养48h后，显微镜下可见约50-100个散在绿色荧光细胞，挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的BMDM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔细胞并保存。提取核酸，使用鉴定引物进行纯度鉴定。所得纯化后的毒株即命名为ASFV△L7L-11L。
缺失L7L，L8L，L9R，L10L，L11L一个或多个基因与ASFV其他基因联合缺失毒株的构建：以L7L，L8L，L9R，L10L，L11L与CD2v、MGF360基因联合缺失毒株的构建为例，CD2v、MGF360以外的其他基因类同。
实施例10
缺失L7L与CD2v基因联合缺失毒株的构建
因ASFV△L7L携带绿色荧光，为便于纯化，选择以mCherry红色荧光替换目的基因CD2v。以pUC-mCherry质粒为载体，分别将CD2v的左同源臂（CD2v基因左侧约1200bp,CD2v-Larm）和右同源臂（CD2v基因右侧约1200bp,CD2v-Rarm）克隆至图10所示位置，构建得到重组质粒p△CD2v-mCherry。将重组质粒转染BMDM，4h后以1MOI感染ASFV△L7；培养48h后，挑取同时有红色和绿色荧光的细胞，至新鲜的正常BMDM细胞，完成一轮纯化；以此步骤纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔荧光细胞并保存。使用鉴定引物进行纯度鉴定；所得纯化后的毒株即命名为ASFV△L7L△CD2v。
实施例11
L7L、L8L、L9R、L10L、L11L（△L7L-11L）与CD2v基因联合缺失毒株的构建
因ASFV△L7L-11L携带绿色荧光，为便于纯化，选择以mCherry红色荧光替换目的基因CD2v。以pUC-mCherry质粒为载体，分别将CD2v的左同源臂（CD2v基因左侧约1200bp,CD2v-Larm）和右同源臂（CD2v基因右侧约1200bp,CD2v-Rarm）克隆至图10所示位置，构建得到重组质粒p△CD2v-mCherry。将重组质粒转染BMDM，4h后以1MOI感染ASFV△L7L-11L；培养48h后，挑取同时有红色和绿色荧光的细胞，至新鲜的正常BMDM细胞，完成一轮纯化；以此步骤纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔荧光细胞并保存。使用鉴定引物进行纯度鉴定；所得纯化后的毒株即命名为ASFV△L7L-11L△CD2v。
实施例12
L7L、L8L、L9R、L10L、L11L（△L7L-11L）与MGF360基因联合缺失毒株的构建
因ASFV△L7L-11L为绿色荧光，为便于纯化，选择以mCherry红色荧光替换目的基因CD2v。以pUC-mCherry质粒为载体，分别将MGF360的左同源臂（MGF360基因左侧约1200bp,MGF360-Larm）和右同源臂（MGF360基因右侧约1200bp, MGF360-Rarm）克隆至图11所示位置，构建得到重组质粒p△MGF360-mCherry。将重组质粒转染BMDM，4h后以1MOI感染ASFV△L7L-11L；培养48h后，挑取同时有红色和绿色荧光的细胞，至新鲜的正常BMDM细胞，完成一轮纯化；以此步骤纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔荧光细胞并保存。使用鉴定引物进行纯度鉴定；所得纯化后的毒株即命名为ASFV△L7L-11L△MGF360。
实施例13
本发明涉及的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒疫苗的制备及其安全性和免疫原性评价
将实施例1~11中构建的病毒接种原代肺泡巨噬细胞，扩大培养，收获病毒液并测定滴度；以102 TCID50以上的病毒液直接或配合佐剂/免疫增强剂等成分制成疫苗：
1）L7L缺失的ASFV疫苗（ASFV△L7L）
Figure 660044DEST_PATH_IMAGE001
毒株培养和滴度测定
将实施例1中构建的病毒ASFV△L7L接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
Figure 417784DEST_PATH_IMAGE002
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将
Figure 197694DEST_PATH_IMAGE001
中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50。观察28日；
Figure 800714DEST_PATH_IMAGE003
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为106.75TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表1：
表1 ASFV△L7L免疫猪后安全性结果
Figure DEST_PATH_IMAGE004
免疫后攻毒结果如表2：
表2 ASFV△L7L免疫猪攻毒结果
Figure DEST_PATH_IMAGE005
2） L8L缺失的ASFV疫苗（ASFV△L8L）
Figure 224611DEST_PATH_IMAGE001
毒株培养和滴度测定
将实施例2中构建的病毒ASFV△L8L接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
Figure 576089DEST_PATH_IMAGE002
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将
Figure 367327DEST_PATH_IMAGE001
中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50。观察28日；
Figure 23305DEST_PATH_IMAGE003
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为106.25TCID50/mL。
免疫后的安全性观察和测定结果如表3：
表3 ASFV△L8L免疫猪后安全性结果
Figure DEST_PATH_IMAGE006
免疫攻毒结果如表4：
表4 ASFV△L8L免疫猪攻毒结果
Figure DEST_PATH_IMAGE007
3） L9R缺失的ASFV疫苗（ASFV△L9R）
Figure 504971DEST_PATH_IMAGE001
毒株培养和滴度测定
将实施例3中构建的病毒ASFV△L9R接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
Figure 683143DEST_PATH_IMAGE002
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将
Figure 961677DEST_PATH_IMAGE001
中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50。观察28日；
Figure 359029DEST_PATH_IMAGE003
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为107.5TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表5：
表5 ASFV△L9R免疫猪后安全性结果
Figure DEST_PATH_IMAGE008
免疫攻毒结果如表6：
表6 ASFV△L9R免疫猪攻毒结果
Figure DEST_PATH_IMAGE009
4）L10L缺失的ASFV疫苗（ASFV△L10L）
Figure 491939DEST_PATH_IMAGE001
毒株培养和滴度测定
将实施例4中构建的病毒ASFV△L10L接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
Figure 762384DEST_PATH_IMAGE002
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将
Figure 13367DEST_PATH_IMAGE001
中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50。观察28日；
Figure 699564DEST_PATH_IMAGE003
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为107.0TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表7：
表7 ASFV△L10L免疫猪后安全性结果
Figure DEST_PATH_IMAGE010
免疫攻毒结果如表8：
表8 ASFV△L10L免疫猪攻毒结果
Figure 890243DEST_PATH_IMAGE007
5）L11L缺失的ASFV疫苗（ASFV△L11L）
Figure 331588DEST_PATH_IMAGE001
毒株培养和滴度测定
将实施例5中构建的病毒ASFV△L11L接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
Figure 771666DEST_PATH_IMAGE002
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将
Figure 323870DEST_PATH_IMAGE001
中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50。观察28日；
Figure 198416DEST_PATH_IMAGE003
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为107.375TCID50/mL。
免疫后的安全性观察和测定结果如表9：
表9 ASFV△L11L免疫猪后安全性结果
Figure DEST_PATH_IMAGE011
免疫攻毒结果如表10：
表10 ASFV△L11L免疫猪攻毒结果
Figure DEST_PATH_IMAGE012
6）L7L、L8L缺失的ASFV疫苗（ASFV△L7L-8L）
Figure 466455DEST_PATH_IMAGE001
毒株培养和滴度测定
将实施例6中构建的病毒ASFV△L7L-8L接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
Figure 206878DEST_PATH_IMAGE002
疫苗制备及安全性和免疫原性评价
以生理盐水或RPMI1640培养基，将
Figure 874357DEST_PATH_IMAGE001
中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50。观察28日；
Figure 134569DEST_PATH_IMAGE003
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为107.125TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表11：
表11 ASFV△L7L-8L免疫猪后安全性结果
Figure DEST_PATH_IMAGE013
免疫攻毒结果如表12：
表12 ASFV△L7L-L8L免疫猪攻毒结果
Figure DEST_PATH_IMAGE014
7） L7L、L8L、L9R缺失的ASFV疫苗（ASFV△L7L-9R）
Figure 229301DEST_PATH_IMAGE001
毒株培养和滴度测定
将实施例7中构建的病毒ASFV△L7L-9R接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
Figure 270070DEST_PATH_IMAGE002
疫苗制备及安全性和免疫原性评价
以生理盐水或RPMI1640培养基，将
Figure 147765DEST_PATH_IMAGE001
中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50。观察28日；
Figure 777329DEST_PATH_IMAGE003
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为107.0TCID50/m L；
免疫后的安全性观察和测定结果如表13：
表13 ASFV△L7L-9R免疫猪后安全性结果
Figure DEST_PATH_IMAGE015
免疫攻毒结果如表14：
表14 ASFV△L7L-9R免疫猪攻毒结果
Figure 216532DEST_PATH_IMAGE007
8）L7L、L8L、L9R、L10L缺失的ASFV疫苗（ASFV△L7L-10L）
Figure 180815DEST_PATH_IMAGE001
毒株培养和滴度测定
将实施例8中构建的病毒ASFV△L7L-10L接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
Figure 691561DEST_PATH_IMAGE002
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将
Figure 910053DEST_PATH_IMAGE001
中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL ，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50。观察28日；
Figure 487534DEST_PATH_IMAGE003
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为106.875TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表15：
表15 ASFV△L7L-10L免疫猪后安全性结果
Figure DEST_PATH_IMAGE016
免疫攻毒结果如表16：
表16 ASFV△L7L-10L免疫猪攻毒结果
Figure DEST_PATH_IMAGE017
9） L7L、L8L、L9R、L10L、L11L缺失的ASFV疫苗（ASFV△L7L-11L）
Figure 5626DEST_PATH_IMAGE001
毒株培养和滴度测定
将实施例9中构建的病毒ASFV△L7L-11L接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
Figure 507014DEST_PATH_IMAGE002
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将
Figure 829280DEST_PATH_IMAGE001
中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL ，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50。观察28日；
Figure 62815DEST_PATH_IMAGE003
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为106.875TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表17：
表17 ASFV△L7LL-11L免疫猪后安全性结果
Figure DEST_PATH_IMAGE018
免疫攻毒结果如表18：
表18 ASFV△L7L-11L免疫猪攻毒结果
Figure DEST_PATH_IMAGE019
10）L7L与CD2v基因联合缺失的疫苗（ASFV△L7L△CD2v株）
Figure 939373DEST_PATH_IMAGE001
毒株培养和滴度测定
将实施例10中构建的病毒ASFV△L7L△CD2v接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
Figure 464027DEST_PATH_IMAGE002
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将
Figure 657111DEST_PATH_IMAGE001
中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50。观察28日；
Figure 310815DEST_PATH_IMAGE003
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为107.5TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表19：
表19 ASFV△L7L△CD2v免疫猪后安全性结果
Figure DEST_PATH_IMAGE020
免疫攻毒结果如表20：
表20 ASFV△L7L△CD2v免疫猪攻毒结果
Figure DEST_PATH_IMAGE021
11）L7L、L8L、L9R、L10L、L11L和CD2v联合缺失的ASFV疫苗（ASFV△L7L-11L△CD2v）
Figure 674669DEST_PATH_IMAGE001
毒株培养和滴度测定
将实施例11中构建的病毒ASFV△L7L-11L△CD2v接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
Figure 252281DEST_PATH_IMAGE002
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将
Figure 50604DEST_PATH_IMAGE001
中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50。观察28日；
Figure 625941DEST_PATH_IMAGE003
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为107.75TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表21：
表21 ASFV△L7L-11L△CD2v免疫猪后安全性结果
Figure DEST_PATH_IMAGE022
免疫攻毒结果如表22：
表22 ASFV△L7L-11L△CD2v免疫猪攻毒结果
Figure 414775DEST_PATH_IMAGE019
12）L7L、L8L、L9R、L10L、L11L（△L7L-11L）与MGF360基因联合缺失的疫苗（ASFV△L7L-11L△MGF360株）
Figure 530498DEST_PATH_IMAGE001
毒株培养和滴度测定
将实施例12中构建的病毒ASFV△L7L-11L△MGF360接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
Figure 947442DEST_PATH_IMAGE002
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将
Figure 693681DEST_PATH_IMAGE001
中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50。观察28日；
Figure 64751DEST_PATH_IMAGE003
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为107.75TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表23：
表23 ASFV△L7L-11L△MGF360免疫猪后安全性结果
Figure DEST_PATH_IMAGE023
免疫攻毒结果如表24：
表24 ASFV△L7L-11L△MGF360免疫猪攻毒结果
Figure DEST_PATH_IMAGE024
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
<120> 一种非洲猪瘟基因缺失减毒及其活疫苗
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2427
<212> DNA
<213> 猪(swine)
<400> 1
ttatggttta tagcggtata gaggccgata aaaggtatcc gggtagtctc ctatgatatc 60
gtcaattttg gtataataac agttgttatg gtagtattgt ccaaaccgag tatgtatgcg 120
ccggtgaagc gtccgcccgc taatggtaca gttccaggtt aagacaatca tatcacaccc 180
aaaaagagag gaaacagcat aggtgcccaa aggttcatta tataacatac gccgcatata 240
ttttagtttt ttttctccat ggtaataatc acaggttttc atgtcctgct taataggatg 300
attccccatg tatgataata tataataaat ttagttttta gctttttcaa aaaattgggc 360
gctcgaaact aaattttcct tatcacagcg tttggagaaa gcgtatttaa agatatatct 420
tcttctaaca agactgcaaa aaaaatctta ccccttattt ttataatgtt catcatagcg 480
tttgaagata tcagaaggtg ccaggtttta taaaaatatc ctttaggatt tataacgata 540
caagggtcta taaaatatat gcgggtataa tcttataaaa tcatcgattt tttcataata 600
ttctccgttt atacaataaa gatcataaca gatattgatg cgtagatgca ttattcgcgt 660
gttcgttggg cagctaaagg atatcacaac gtagtttttt ttaagaaaag acgaaactac 720
ataagtccct aagggttcat tgaatagtaa acgccatatt tgttttaaat tttgttgttc 780
accatagtag tattcgcact ttttcaagtc ttttttaata agcctattcc ccatgtatgc 840
ttataaataa aaatttagaa atgtgctata ttatttgttg atgaatcatg aacacgtctt 900
atatgttgat atgttacttt aaaaacattt gtattttcaa cagacgcgtt ctattcttat 960
taagaatgat gccgtcttta ttttaaacct tggtttaaaa tttaaagaag tatttataaa 1020
ctataatcat gggaactttt tcagtaactg cctctgcaaa aagtgacgat gctgtttgta 1080
agtatttaga agaaccaata gatgaaaatt acagaaacat attaagaaat gagcatgtta 1140
aaaaaaattt aaatgaggct ctgaatcgac atattactac ctataatcca gtagttgatt 1200
ggtgtaataa ctattcaaca ttttcatctc aggatttcga tgaatataaa atttatatac 1260
atagcgatct tatggatgga cgacctcgtc caaaaaaaac atggtgtgtc atcatgtaat 1320
gtttgttagt tttatataaa cgcaaaaata ttcttctagg agatgttgat atactaccta 1380
ttgaattcaa tatattaaag tacatttctg gctattccca ttacggtatt attattacta 1440
tttttaagag ctagatgtgg atttaagtaa taataacatt ctcccgttcc tcctagagac 1500
acctcatcaa attcccatcc tatgcaacct ttatgttgta aacataatga ttgacagcat 1560
tcatcttctt ttgaccaagt cgtccaaatc ctaccaagat ctatacgtgt ttttccaaat 1620
ggagattgaa gatcagcagt agtggcatta aacctataaa aaccaggtgc ataatcacat 1680
gaacggatcg taggatctaa tttaatatct tttatatctt gttttactgc ttctagacaa 1740
cttttatcag tacatgttcc acgtacacag tggtgtcctt tatccttaca atccgtatct 1800
gtcttacatt tttttttcgg cggtttatgt ttcagatggt aaaaacccag tattaaaata 1860
atcacaagaa taattcctat aagtacttga acaacaggat aaaacatttt aatattaaat 1920
atatttttta attaaatgaa tagatttaat ccaagtagta ttaaaatttt ttagaaatag 1980
tgttctacaa ataatgaaat gaatggtcca aaaaaaataa ggtgtacaat aatgtaatat 2040
attgttaggc taagtaaatt taatatttta aagtatttgg aaaaatattt tttaacatat 2100
gatgtctagg aatatttttt agacatttaa aaccatatag ttactttatt tattacactg 2160
aacttgaaaa gacttattac ctaaaatatt aatagatgaa gtaatattgt gtaattgagt 2220
ccataacatg ggtgggaaac aaaaatctcg taatatgaaa aataaacatc ctaaaaagag 2280
tgcaattgtt ataagtttat gtaactttat tttaaagtaa gaatataaaa atatgagtac 2340
aagaggaata ggggccatta ctaacattgg ctccaacatc ctgttgtcta caaaaaaaaa 2400
tatttttttt agcaaaaaaa aatccat 2427
<210> 2
<211> 309
<212> DNA
<213> 猪(swine)
<400> 2
ttatggttta tagcggtata gaggccgata aaaggtatcc gggtagtctc ctatgatatc 60
gtcaattttg gtataataac agttgttatg gtagtattgt ccaaaccgag tatgtatgcg 120
ccggtgaagc gtccgcccgc taatggtaca gttccaggtt aagacaatca tatcacaccc 180
aaaaagagag gaaacagcat aggtgcccaa aggttcatta tataacatac gccgcatata 240
ttttagtttt ttttctccat ggtaataatc acaggttttc atgtcctgct taataggatg 300
attccccat 309
<210> 3
<211> 312
<212> DNA
<213> 猪(swine)
<400> 3
ttaggattta taacgataca agggtctata aaatatatgc gggtataatc ttataaaatc 60
atcgattttt tcataatatt ctccgtttat acaataaaga tcataacaga tattgatgcg 120
tagatgcatt attcgcgtgt tcgttgggca gctaaaggat atcacaacgt agtttttttt 180
aagaaaagac gaaactacat aagtccctaa gggttcattg aatagtaaac gccatatttg 240
ttttaaattt tgttgttcac catagtagta ttcgcacttt ttcaagtctt ttttaataag 300
cctattcccc at 312
<210> 4
<211> 291
<212> DNA
<213> 猪(swine)
<400> 4
atgggaactt tttcagtaac tgcctctgca aaaagtgacg atgctgtttg taagtattta 60
gaagaaccaa tagatgaaaa ttacagaaac atattaagaa atgagcatgt taaaaaaaat 120
ttaaatgagg ctctgaatcg acatattact acctataatc cagtagttga ttggtgtaat 180
aactattcaa cattttcatc tcaggatttc gatgaatata aaatttatat acatagcgat 240
cttatggatg gacgacctcg tccaaaaaaa acatggtgtg tcatcatgta a 291
<210> 5
<211> 513
<212> DNA
<213> 猪(swine)
<400> 5
ttaaagtaca tttctggcta ttcccattac ggtattatta ttactatttt taagagctag 60
atgtggattt aagtaataat aacattctcc cgttcctcct agagacacct catcaaattc 120
ccatcctatg caacctttat gttgtaaaca taatgattga cagcattcat cttcttttga 180
ccaagtcgtc caaatcctac caagatctat acgtgttttt ccaaatggag attgaagatc 240
agcagtagtg gcattaaacc tataaaaacc aggtgcataa tcacatgaac ggatcgtagg 300
atctaattta atatctttta tatcttgttt tactgcttct agacaacttt tatcagtaca 360
tgttccacgt acacagtggt gtcctttatc cttacaatcc gtatctgtct tacatttttt 420
tttcggcggt ttatgtttca gatggtaaaa acccagtatt aaaataatca caagaataat 480
tcctataagt acttgaacaa caggataaaa cat 513
<210> 6
<211> 282
<212> DNA
<213> 猪(swine)
<400> 6
ttatttatta cactgaactt gaaaagactt attacctaaa atattaatag atgaagtaat 60
attgtgtaat tgagtccata acatgggtgg gaaacaaaaa tctcgtaata tgaaaaataa 120
acatcctaaa aagagtgcaa ttgttataag tttatgtaac tttattttaa agtaagaata 180
taaaaatatg agtacaagag gaataggggc cattactaac attggctcca acatcctgtt 240
gtctacaaaa aaaaatattt tttttagcaa aaaaaaatcc at 282

Claims (9)

1.一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，基因序列如：SEQ No.1所示，缺失以下基因：基因组右末端L7L，L8L，L9R，L10L，L11L；
基因组右末端L7L基因序列如：SEQ No.2所示；
基因组右末端L8L基因序列如：SEQ No.3所示；
基因组右末端L9R基因序列如：SEQ No.4所示；
基因组右末端L10L基因序列如：SEQ No.5所示；
基因组右末端L11L基因序列如：SEQ No.6所示。
2. 根据权利要求1所示的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，其特征在于：基因组右末端的L7L，L8L，L9R，L10L，L11L 1-5个基因的缺失。
3.根据权利要求1或2所示的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，其特征在于：基因组右末端的L7L，L8L，L9R，L10L，L11L每个基因部分缺失或完全缺失。
4.在权利要求1、2、3所示的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，其特征在于：构建的联合缺失ASFV其他致病基因，如EP402R、MGF360、MGF505、A238L、A224L、EP153R、A276R、DP96R、DP71L、B119L等的重组病毒。
5.根据权利要求1所示的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，其特征在于：其涉及的基因组包括所有非洲猪瘟病毒（不同基因型）的毒力分离株。
6.根据权利要求1~权利要求5中任一项的减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒制备的疫苗。
7. 一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1）L7L-L11L1个或多个基因缺失病毒的构建
以pUC-EGFP质粒为载体，以L7L，L8L，L9R，L10L，L11L中1个或多个基因为目标（X），分别构建含目的基因（X）左右同源臂的重组质粒，与亲本毒株共转染BMDM细胞，筛选并纯化得到缺失目的基因的重组病毒△X；
2）L7L，L8L，L9R，L10L，L11L中1个或多个基因与ASFV其他基因联合缺失毒株的构建
以pUC-EGFP质粒为载体，构建含目的基因（Y）左右同源臂的重组质粒，与△X共转染BMDM细胞，筛选并纯化得到同时缺失L7-L11L中1个或多个基因与ASFV其他基因的联合缺失病毒；
3) 疫苗的制备
将步骤1）或2）中构建的病毒接种原代肺泡巨噬细胞，扩大培养，收获病毒液并测定滴度；以102 TCID50以上的病毒液直接或配合佐剂/免疫增强剂等成分制成疫苗。
8.根据权利要求7制备的疫苗，其特征在于可与任何形式的佐剂、免疫调节剂同时使用。
9.根据权利要求7制备的疫苗，其特征在于可与其他猪用疫苗联合制备使用。
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