CN112280753A - 一种伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株及其制备方法和应用 - Google Patents

一种伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株及其制备方法和应用。CRISPR/Cas9介导的同源重组技术具体为以CRISPR/Cas9为媒介将DNA双链断裂，后使用同源重组的方法，将转入细胞的同源序列补在缺口上，进行DNA双链修复，完成基因组的编辑，此技术可以按照研究者的意愿进行精确的定点编辑，大幅提高基因编辑的效率，缩短疫苗的研发周期。本发明采用此技术对伪狂犬病毒流行毒株的毒力相关基因TK、gE、gI以及免疫抑制相关基因gG的部分序列进行缺失得到TK、gE、gI和gG基因缺失株，该基因缺失株的疫苗具有安全性高、遗传稳定性和免疫保护效果好等优势。

Description

一种伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株及其制备方法和应用。
背景技术
伪狂犬病(pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病，其主要特征为发热、奇痒、脑脊髓炎、呼吸系统和神经系统障碍等。猪是PRV的天然宿主和最主要传染源，PRV可通过呼吸道与消化道水平传播，也可通过精液、交配或者胎盘垂直传播。各种年龄阶段的猪只均可感染PRV，给养猪业造成了巨大的经济损失。
目前，疫苗免疫接种仍是防制和根除PR的主要手段之一。早期的PR疫苗主要是灭活疫苗和传统弱毒活疫苗，这两种疫苗在防制方面起到了一定作用。但灭活疫苗免疫效率低，用量大；弱毒活疫苗安全性差，有恢复毒力的潜在危险。为此，现有技术在对分子生物学不断深人研究的基础上开展了基因工程疫苗的研制，如基因工程亚单位疫苗、核酸疫苗、基因缺失弱毒疫苗和基因重组活载体疫苗。
基因缺失弱毒疫苗主要是通过分子生物学的手段，对PRV基因组中毒力基因的若干碱基进行删除，以达到彻底失活该基因的目的。PRV基因组为双链线状DNA，大小约为145kb，G+C含量高达73％。该病毒基因组分为4个部分，分别是独特长区(UL)、独特短区(US)以及位于US两侧的内部重复序列(IR)和末端反向重复序列(TR)。PRV具有多个毒力相关基因，分别是UL区的gC、gM、UL13、UL21、TK、UL39/40、UL50基因和US区的gI、gE、US3基因。这些基因共同控制着PRV的毒力，缺失其中一个或多个基因均可导致PRV毒力的减弱。
CRISPR/Cas9技术是最近几年在研究领域中极其热门的技术，被广泛应用于病毒编辑、疫苗研制等方面。2016年，汤艳东等利用CRISPR/Cas9技术成功构建了TK、gE和gI基因缺失的伪狂犬病病毒。CRISPR/Cas9虽然具有同时敲除多个基因，或者多个sgRNA靶向一个基因的优势，但是仍存在脱靶、精准修复率低、以及后期需要在蛋白水平上多次验证的问题。相比，本发明使用的CRISPR/Cas9介导的同源重组技术可对TK、gE、gI和gG基因进行精确编辑。
CRISPR/Cas9介导的同源重组技术是利用CRISPR/Cas9将DNA双链断裂，然后利用细胞内同源重组基因修复系统，将转入细胞的序列补在缺口上，从而完成基因组的编辑。CRISPR/Cas9介导的同源重组技术可避免单一CRISPR/Cas9的精准修复率低或同源重组技术的重组效率低的缺陷，大幅提高基因编辑的效率，缩短疫苗的研发周期，使疫苗更好的预防当前流行毒株，达到更佳的免疫效果。
发明内容
为了至少解决一种现有技术存在的问题，本发明提供一种伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株及其制备方法和应用，通过CRISPR/Cas9介导的同源重组技术缺失伪狂犬病毒株的TK、gE、gI和gG基因片段得到一种毒性更低但免疫原性不变的伪狂犬病毒基因缺失株。
第一方面，本发明提供一种伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株，并对其进行了生物保藏，其保藏信息如下：
保藏编号为：CCTCC NO：V202057；分类命名为：伪狂犬病病毒CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：中国武汉，武汉大学，邮编430072；保藏日期为：2020年9月11日。
本发明进一步对该伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株的生长特性进行鉴定，结果如下：伪狂犬病病毒基因缺失株具有良好的遗传稳定性，生长规律与亲本毒株CH16相似。
本发明进一步提供所述伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株在对于伪狂犬病的免疫防护中的应用。
本发明进一步提供所述伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株在制备用于免疫猪伪狂犬病的药物中的应用。例如将所述伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株应用于疫苗制备。
第二方面，本发明进一步提供用于编辑伪狂犬病毒株的sgRNA组合，所述sgRNA组合包含靶序列为伪狂犬病毒株的TK、gE、gI和gG基因片段的sgRNA；所述伪狂犬病毒株优选为PRV CH16，PRV CH16为武汉科前生物股份有限公司研发中心在湖北某猪场分离所得。
进一步地，所述sgRNA组合包括如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的sgRNA。
本发明进一步提供包含所述sgRNA组合的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
第三方面，本发明提供一种伪狂犬病毒基因缺失株的制备方法，包括：
缺失伪狂犬病毒株的TK、gE、gI和gG基因片段。
进一步地，通过CRISPR/Cas9介导的同源重组技术缺失所述伪狂犬病毒株的TK、gE、gI和gG基因片段。
进一步地，所述CRISPR/Cas9系统优选使用pX335载体。
进一步地，所述伪狂犬病毒株优选为伪狂犬病毒株PRV CH16。
作为一种优选的实施方式，本发明提供一种伪狂犬病毒基因缺失株的制备方法，包括：
(1)根据PRV的基因序列设计用于特异性靶向目的基因的sgRNA；选择脱靶率低的sgRNA将其克隆至pX335质粒上，构建sgRNA表达载体；
(2)构建含有缺失部分碱基或和插入部分外源终止子的同源重组片段的转移质粒；
(3)提取转染用PRV基因组；
(4)利用脂质体转染法获取重组病毒；
(5)重组病毒的纯化与鉴定；
(6)重组病毒生长特性的测定。
本发明具备如下有益效果：
(1)本发明针对目前流行的亲本毒株PRV CH16进行基因编辑，缺失其TK、gE、gI和gG基因片段，在保留了其免疫原性的同时大幅度降低了其毒性，可以有效地进行伪狂犬病的预防。
(2)本发明采用的CRISPR/Cas9介导的同源重组技术可弥补单一CRISPR/Cas9技术精确修复率低和同源重组技术重组效率低等缺陷，大幅提高基因编辑的效率，缩短疫苗的研发周期，使疫苗更好的预防当前流行毒株。
(3)本发明缺失gG基因能够消除gG糖蛋白的免疫抑制效果，提高宿主对疫苗的免疫反应，并且PRV gG基因的缺失可用于疫苗免疫和自然感染动物的鉴别诊断。
附图说明
图1为本发明实施例提供的重组病毒的PCR鉴定结果；其中，A、B和C分别为为重组病毒TK基因、gE/gI基因和gG基因的鉴定结果，A、和C的泳道M为DNA Marker DL2000，B的泳道M为DNA Marker DL5000，泳道1为含有相应基因sgRNA序列的质粒，泳道2为亲本毒株PRVCH16，泳道3为重组病毒CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株，泳道4为阴性对照；
图2为本发明实施例提供的间接免疫荧光鉴定结果；其中，gB和gE分别为PRV gB和gE的单克隆抗体，Mock为背景，CH16为亲本毒株PRV CH16的检测结果，CH16ΔTKΔgE/gIΔgG为重组病毒CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株；
图3为本发明实施例提供的PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG在PK-15中的遗传稳定性检测结果；其中，A、B和C分别为重组病毒TK基因、gE/gI基因和gG基因的鉴定结果，A和C的泳道M为DNA Marker DL2000，B的泳道M为DNA Marker DL5000，泳道1为亲本毒株PRV CH16；泳道2～7为PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG在PK-15中传代至5、10、15、20、25和30代收获的病毒；泳道8为阴性对照；
图4为本发明实施例提供的PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG和CH16在PK-15细胞中的生长曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1sgRNA表达载体的构建
本实施例将病毒基因组序列输入sgRNA在线设计网站(http：//crispr.mit.edu)，寻找有PAM(NGG)的sgRNA序列，选择脱靶率较低的sgRNA，采用张峰实验室的构建方法将其克隆至pX335载体，sgRNA序列如表1所示。
表1用于靶向病毒相关基因的sgRNA序列
Figure BDA0002740072100000051
Figure BDA0002740072100000061
实施例2转移质粒pcDNA3.1-ΔTK、pSK-ΔgE/gI和pSK-ΔgG的构建
本实施例以PRV CH16株基因组为模板扩增TK、gE/gI和gG基因部分序列，随后分别酶切连接到pcDNA3.1(+)或pBluescript II-SK(+)载体上，用以构建转移质粒pcDNA3.1-ΔTK、pSK-ΔgE/gI和pSK-ΔgG。其中，TK左右同源序列间插入猴空泡病毒40(sv40)poly A序列(SEQ ID NO：1)；gG左右同源序列间插入兔的球蛋白终止子(Rabbit globinterminator)序列(SEQ ID NO：2)。扩增引物序列如表2所示。
表2与转移质粒构建相关的引物序列
Figure BDA0002740072100000062
实施例3 PRV基因组的提取
本实施例将PK-15细胞传代于T25细胞培养瓶中，24h后将病毒按1MOI(multiplicity of infection,MOI)接种于细胞，待细胞出现80％病变时，弃去细胞培养液，加1mL的细胞裂解液，均匀晃动使所有细胞裂解，冰中放置20min，倾倒至2mL EP管中。逐滴加入660μL的5M NaCl，轻轻混匀后，置于冰上5h或置于4℃冰箱过夜。4℃12000rpm离心30min。用剪去尖端的枪头吸取上清于新的2mL EP管中，加入等体积的DNA抽提液，轻轻上下颠倒EP管5min，4℃12000rpm离心10min，重复利用DNA抽提液抽提蛋白3次。换1.5mL的EP管，最后的上清液加入预冷的2倍体积的无水乙醇，轻柔混匀，-20℃静置2h或过夜。4℃12000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入预冷的75％的无水乙醇，4℃12000rpm离心10min洗涤2遍。弃上清，4℃12000rpm离心1min，吸取残余液体，风干后加入15μL的去离子水溶解基因组，4℃保存备用。
实施例4重组病毒的构建
本实施例将PK-15细胞传代于6孔细胞板中，细胞汇合度达80～90％时进行转染。将2μg含同源臂的转移质粒、2μg sgRNA和病毒基因组(约2μg)加入到150μL Opti-MEM中，轻轻混匀，与此同时，将12μL LiP2000 DNA转染试剂加入到150μL Opti-MEM中，轻轻混匀，5min内将转染试剂混合液加入到质粒混合液，轻轻混匀，室温孵育20min，在此期间，将待转染的细胞用不含血清的DMEM洗涤2次，加1.7mL不含血清的DMEM，随后，将转染复合物均匀地滴加到6孔细胞板中。转染12h后更换成含5％FBS的DMEM，将培养板继续放于37℃细胞培养箱中培养48～96h。PRV基因缺失顺序依次为TK、gI/gE和gG基因，即先构建PRVΔTK株，然后在PRVΔTK株的基础上构建PRVΔTKΔgE/gI株，然后在PRVΔTKΔgE/gI的基础上构建PRVΔTKΔgE/gIΔgG株。
实施例5重组病毒的纯化与鉴定
5.1重组病毒的纯化(蚀斑实验)
首先，将PK-15细胞传代于六孔细胞板，待细胞汇合度达到100％时，弃掉原细胞培养液并用PBS洗涤2次；与此同时，将病毒原液用DMEM进行倍比稀释，将稀释好的病毒以10-2-10-6均匀接种于细胞板上(通常接种量固定为1mL)，在37℃温箱中孵育2h，期间每隔30min摇晃一次；在孵育期间，用水浴锅(70-85℃)将2％的低熔点琼脂糖进行融化，完全融化后将2％的琼脂糖溶液和2×DMEM 1：1混合后置于37℃温箱待用；孵育2h后弃掉培养液，用DMEM洗涤1-2次；取上述配制好的2mL溶液缓慢加入到每一个孔中，室温静置20min或4℃静置3min，待琼脂糖凝胶凝固后置于37℃恒温箱中培养；培养24-72h后将细胞板置于显微镜下观察，待形成单个空斑后用200μL的移液枪吸取单个空斑，扩大培养后置于负80℃冰箱备用；
5.2重组病毒的PCR鉴定
5.2.1试验方法：利用病毒核酸DNA/RNA提取试剂盒提取重组病毒的基因组，根据病毒基因缺失位置，利用Primer 5.0软件设计引物，然后以重组病毒的基因组为模板进行PCR扩增，核酸电泳及测序后进行比较与鉴定，引物序列如表3所示。
表3重组病毒PCR鉴定引物
Figure BDA0002740072100000081
5.2.2试验结果：结果显示，使用TK鉴定引物TK_ide对重组病毒进行鉴定时，亲本毒株PRV CH16扩增产物大小为433bp，CH16ΔTKΔgE/gIΔgG毒株和pcDNA3.1-ΔTK质粒扩增产物大小一致，为583bp(图1中的A)；使用gE/gI鉴定引物gE/gI_ide对重组病毒进行鉴定时，亲本毒株PRV CH16扩增产物大小为2971bp，CH16ΔTKΔgE/gIΔgG毒株和pSK-ΔgE/gI质粒扩增产物大小一致，为663bp(图1中的B)；使用gG鉴定引物gG_ide对重组病毒进行鉴定时，亲本毒株PRV CH16扩增产物大小为604bp，CH16ΔTKΔgE/gIΔgG毒株和pSK-ΔgG质粒扩增产物大小一致，为772bp(图1中的C)。
5.3重组病毒的间接免疫荧光鉴定
5.3.1试验方法：将PK-15细胞接种于96孔细胞板中，分为3组，每组10个孔，待细胞长满单层后，其中1组以0.01MOI的剂量接种重组病毒PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株，另外1组接种亲本毒株PRV CH16株，第3组加入DMEM作为对照组(Mock)。待80％的细胞出现病变时，弃去培养基，PBS洗涤3遍后，丙酮4℃固定30min，2％BSA 37℃封闭1h，然后用PBS洗涤3遍。随后3组细胞中的5个孔加入100μL gB单克隆抗体(1：500稀释)，另外5个孔加入100μLgE单克隆抗体(1：500稀释)，37℃孵育1h；PBS洗涤3遍后，加入50μL羊抗鼠IgG(1：300稀释)，37℃孵育45min；PBS洗涤3遍后，置于荧光显微镜下观察。
5.3.2试验结果：结果显示，用gB单克隆抗体孵育后，接种重组病毒CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株和亲本病毒株CH16的细胞均可观察到绿色荧光，然而用gE单克隆抗体孵育后，只有接种亲本毒株CH16的细胞可观察到绿色荧光(图2)，表明重组病毒中gE基因已被有效缺失。以上结果表明，获得了TK、gE、gI和gG基因缺失的PRV基因缺失毒株PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株。
本实施例进一步将PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株进行了生物保藏，保藏信息如下：
保藏编号为：CCTCC NO：V202057；分类命名为：伪狂犬病病毒CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：中国武汉，武汉大学，邮编430072；保藏日期为：2020年9月11日。
实施例6重组病毒生长特性的测定
6.1重组病毒遗传稳定性测定
6.1.1试验方法：重组病毒PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株在PK-15细胞上连续传代，选取第5代、10代、15代、20代、25代和30代病毒，使用鉴定引物TK_ide-F/R、gE/gI_ide-F/R和gG_ide-F/R对缺失基因进行PCR扩增，并将PCR产物送至武汉擎科生物公司测序。
6.1.2试验结果：结果显示PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株在TK(图3中的A)、gE/gI(图3中的B)和gG(图3C)基因缺失部分非常稳定，不能恢复。
6.2重组病毒一步生长曲线绘制
6.2.1试验方法：将PK-15细胞以2×105个/孔传代于24孔细胞板中，待细胞贴壁后将病毒以0.1MOI的感染剂量接种细胞，吸附2h后换成含2％FBS的DMEM培养基继续培养。感染后每隔6h收集一次，将细胞培养板置于-80℃冰箱冻融3次后收获病毒。采用蚀斑实验和Reed-Muench法在ST细胞上测定并计算其TCID50，绘制一步生长曲线。
6.2.2试验结果：结果显示PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株在6～30h的病毒滴度略低于其亲本毒PRV CH16，随后在36～48h两者无明显差别且进入平台期(图4)。
实施例7重组病毒的安全性评价
7.1试验方法：选取21日龄的伪狂犬病病毒阴性仔猪(gB抗体和gE抗体均为阴性)15头；随机分为3组，每组5头仔猪，其中一组的仔猪滴鼻接种PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株(107.0TCID50/头)，另一组的仔猪滴鼻接种PRV CH16株(107.0TCID50/头)，第3组滴鼻接种1mL的DMEM作为对照组。接种后观察21天，每天测量体温，观察和记录临床症状。
7.2试验结果：如表4所示，PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株接种仔猪后，仔猪体温正常，未出现打喷嚏、厌食、颤抖、共济失调等发病症状，而PRV CH16接种仔猪后则出现持续高热、打喷嚏、死亡，表明缺失TK、gI、gE和gG基因后的PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG已充分致弱，对仔猪不致病。
表4重组病毒对仔猪的安全性试验结果
Figure BDA0002740072100000111
实施例8重组病毒的免疫保护力测定
8.1试验方法：选取21日龄的伪狂犬病病毒阴性仔猪15头(gB抗体和gE抗体均为阴性)，随机分为3组，每组5头，隔离饲养。2个免疫组分别肌注PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株1.0×105.0TCID50/头份或1.0×106.0TCID50/头份，对照组注射1mL DMEM。免疫后第28d，采集血液做中和实验，与此同时使用PRV CH16株对2个免疫组和对照组进行滴鼻攻毒，攻毒剂量为1.0×107.0TCID50/头，攻毒后观察21d，每天观察两次，测量体温，记录症状。
8.2试验结果：免疫组在试验第1d接种PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株后未出现发病症状，在第28d接种PRV CH16后也未出现发病症状；对照组在试验第28d接种PRV CH16后第3d出现厌食、高热、打喷嚏或神经症状，并在攻毒后第7d出现死亡；仔猪中和实验结果和发病情况见表5，表明PRV CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株对仔猪具有良好的保护能力。
表5重组病毒对仔猪免疫保护力的试验结果
Figure BDA0002740072100000112
Figure BDA0002740072100000121
注：“+”表示出现神经症状或呼吸症状，其中神经症。其中神经症状包括角弓反张、共济失调、倒地划水、极度烦躁等典型神经症状；呼吸症状包括呼吸困难、频繁打喷嚏。“-”表示无神经症状或呼吸症状。“/”表示未死亡。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 武汉科前生物股份有限公司
<120> 一种伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株及其制备方法和应用
<130> KHP201115090.9
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgttaagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct 60
ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac 120
aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg 180
ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtatggc tgattatgat cagttatcta 240
gatccggtgg atcccgggcc cgcggtaccg tcgactgcag aattcgaagc tt 292
<210> 2
<211> 386
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcatgaagcc ccttgagcat ctgacttctg gctaataaag gaaatttatt ttcattgcaa 60
tagtgtgttg gaattttttg tgtctctcac tcggaaggac atatgggagg gcaaatcatt 120
taaaacatca gaatgagtat ttggtttaga gtttggcaac atatgcccat atgctggctg 180
ccatgaacaa aggttggcta taaagaggtc atcagtatat gaaacagccc cctgctgtcc 240
attccttatt ccatagaaaa gccttgactt gaggttagat tttttttata ttttgttttg 300
tgttattttt ttctttaaca tccctaaaat tttccttaca tgttttacta gccagatttt 360
tcctcctctc ctgactactc ccagtc 386
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccgcgcct tgtacgcgcc gaaga 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaactcttcg gcgcgtacaa ggcgc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccgcgcct tgtacgcgcc aaaga 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaactctttg gcgcgtacaa ggcgc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccggggca ggaacgtcca gatcc 25
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaacggatct ggacgttcct gccc 24
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caccgtcgtg ccacgatccg acgac 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaacgtcgtc ggatcgtggc acgac 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caccggcgag agtagtccgt cccgg 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaacccggga cggactactc tcgcc 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caccgaccgg gacggactac tctcg 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaaccgagag tagtccgtcc cggtc 25
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cccaagcttc ggcagagcac cacggcccgg gtg 33
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccctcgagcc agcatggcgt agacgttgcg cag 33
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccgctcgagg tgcacgcgtg ggcgatggac gcgc 34
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccctctagac ctccagcggc aggaaggagc gcag 34
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cctcgagcgt taagatacat tgatgag 27
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gctcgagcca gcatggcgta ga 22
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccgctcgagc gtcgacgcgt gaacatcctc acc 33
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cccaagcttc cagggccgtc agcacaaaga ggtcc 35
<210> 23
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cccaagcttg gacgacgggc tgtacgtgcg ccccgag 37
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cggaattcgg tcggcggcgc ccaggatcca caggt 35
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cccaagctta aaggagtccg gggaatgtgt tcc 33
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggaattcacg ttgcccactt cattgttgag c 31
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgggatccgt gaccgtcgcc tggttc 26
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gctctagatt ctgctgggcc tcgcgc 26
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggaattctca tgaagcccct tgagcatctg 30
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgggatccga ctgggagtag tcag 24
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gcttcatcgt cggggacatc ag 22
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gccacgagcg cgtccatc 18
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gatagacggg acgctgctgt t 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcgttgtcgc tctcgctgta 20
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cacacctttg cgcatctcca ca 22
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gtgagcccgt gcttcatgcc 20

Claims (10)

1.一种伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株，其特征在于，所述伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株的保藏名称为：伪狂犬病病毒CH16ΔTKΔgE/gIΔgG株；保藏编号为：CCTCC NO：V202057。
2.权利要求1所述伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株在对于伪狂犬病的免疫防护中的应用。
3.权利要求1所述伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株在制备用于免疫猪伪狂犬病的药物中的应用。
4.一种伪狂犬病疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株和冻干保护剂。
5.根据权利要求4所述伪狂犬病疫苗，其特征在于，所述冻干保护剂为明胶和蔗糖；
优选地，所述冻干保护剂含有明胶8g/L，蔗糖48g/L，其余为超纯水。
6.一种用于编辑伪狂犬病毒株的sgRNA组合，其特征在于，所述sgRNA组合包含靶序列为伪狂犬病毒株的TK、gE、gI和gG基因片段的sgRNA；
所述伪狂犬病毒株优选为伪狂犬病毒株PRV CH16。
7.根据权利要求6所述的sgRNA组合，其特征在于，所述sgRNA组合包括如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的sgRNA。
8.一种生物材料，其特征在于，包括权利要求6或7所述sgRNA组合，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
9.一种伪狂犬病毒基因缺失株的制备方法，其特征在于，包括：
缺失伪狂犬病毒株的TK、gE、gI和gG基因片段。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，通过CRISPR/Cas9介导的同源重组技术缺失所述伪狂犬病毒株的TK、gE、gI和gG基因片段；
所述CRISPR/Cas9系统优选使用pX335载体，和/或，所述伪狂犬病毒株优选为伪狂犬病毒株PRV CH16。
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