CN112080521A

CN112080521A - 一种表达外源蛋白的重组伪狂犬病毒载体构建及重组伪狂犬病毒制备方法

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Publication number: CN112080521A
Application number: CN202010927271.7A
Authority: CN
Inventors: 商营利; 刘振; 孔正杰
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-09-07
Filing date: 2020-09-07
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2040-09-07
Also published as: CN112080521B

Abstract

本发明提供一种利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建伪狂犬病毒复制非必需基因插入突变，并获得表达外源基因的重组伪狂犬病毒的方法。本发明将CRISPR/Cas9基因编辑系统导入细胞后，通过预先筛选的靶序列识别病毒基因组，对感染细胞的伪狂犬病毒基因进行编辑和重组。该方法构建的重组伪狂犬病毒在特定基因部位插入目的外源基因，而不影响病毒自身的复制，且构建过程中利用标记正向或反向筛选重组病毒，显著提高了重组病毒的获得效率，为构建表达外源基因的重组伪狂犬病毒疫苗奠定了基础。本发明基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建的重组伪狂犬病毒的方法可用来快速构建重组病毒活载体疫苗，具有重要的应用价值。

Description

一种表达外源蛋白的重组伪狂犬病毒载体构建及重组伪狂犬病毒制备方法

技术领域

本发明涉及一种表达外源蛋白的重组伪狂犬病毒载体构建及重组伪狂犬病毒制备方法。

背景技术

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科。病毒基因组为双链DNA，全长约150kb，编码约70种蛋白质。伪狂犬病毒的胸苷激酶(Thymidinekinase，TK)等基因是伪狂犬病毒的复制非必需基因，同时也是病毒的重要毒力基因，这些基因的缺失能显著降低病毒毒力，且不影响伪狂犬病毒增殖和免疫原性。伪狂犬病毒遗传稳定性强，在非必需基因中插入外源抗原基因也不影响病毒的增殖，具有广泛的宿主范围，可以感染猪、犬、牛、羊等多种家畜和野生动物。伪狂犬病毒作为一种嗜神经病毒，在体内感染时优先感染神经系统，并能建立长期稳定的隐性感染。伪狂犬病毒的众多特性使其可以作为病毒活载体，为构建二价或多价基因工程活疫苗提供分子操作基础。

利用基因工程技术改造病毒基因组是构建重组病毒活载体疫苗的关键步骤。细菌人工染色体(BAC)系统是最常用于构建重组病毒的方法，前期需要将病毒基因组克隆到BAC质粒中。但这一克隆过程对于基因庞大的病毒(如疱疹病毒)来说费时、费力且成功率较低。CRISPR/Cas9系统是新近发展起来的基因编辑技术，将CRISPR/Cas9系统导入细胞后，通过对特定靶序列识别，可实现对感染细胞病毒基因组的高效率编辑和改造。与BAC系统相比，CRISPR/Cas9系统无需克隆亲本病毒基因组，该方法操作简单、编辑效率高、价格低廉、应用范围广泛，是一种构建重组病毒的高效方法。

发明内容

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建伪狂犬病毒TK基因插入突变并表达外源基因的重组病毒，本发明所要解决的技术问题是如何降低伪狂犬病毒的毒力，并在其增殖能力不受影响的情况下表达外源基因，为构建二价或多价基因工程疫苗提供分子操作基础。

本发明提供了一种构建重组伪狂犬病毒的方法，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统降低或抑制目的伪狂犬病毒中TK的活性、降低或抑制所述目的伪狂犬病毒中TK的含量或/和降低或抑制所述目的伪狂犬病毒中所述TK的表达量，并在所述目的伪狂犬病毒中表达目的外源基因，得到重组伪狂犬病毒。

上述方法中，所述TK为如下A1)或A2)的蛋白质：

A1)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白质；

A2)与A1)具有98％以上同一性且来源于伪狂犬病毒的同源蛋白质。

所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。所述98％以上的同一性可为至少98％、99％或100％的同一性。

上述方法中，所得重组伪狂犬病毒的TK活性、含量或/和表达量低于所述目的伪狂犬病毒，并表达所述目的外源基因，且复制能力与所述目的伪狂犬病毒没有显著差异。

上述方法中，所述重组伪狂犬病毒通过敲除所述目的伪狂犬病毒中所述TK基因及插入目的外源基因实现的。

上述方法中，所述降低或抑制目的伪狂犬病毒中TK的活性、降低或抑制目的伪狂犬病毒中TK的含量或/和降低或抑制目的伪狂犬病毒中所述TK的表达量，是通过敲除所述目的伪狂犬病毒中所述TK基因实现的；在所述目的伪狂犬病毒中表达目的外源基因，是通过在所述目的伪狂犬病毒中插入所述目的外源基因实现的；所述敲除所述目的伪狂犬病毒中所述TK的基因利用CRISPR/Cas9系统实现，所述插入所述目的外源基因是通过导入目的外源基因插入DNA片段1实现，所述目的外源基因插入DNA片段1是由所述TK基因的上游同源臂、所述目的外源基因的表达盒和所述TK基因的下游同源臂连接而成的双链DNA分子。

上述方法中，所述目的外源基因为标记基因或非标记基因。

上述方法中，所述标记基因能够起着特异性标记的作用，例如具有颜色标记(表达具有颜色变化的酶或发光化合物，如EGFP的编码基因、GUS基因、萤光素酶基因等)。

上述方法中，所述方法为方法A或方法B：

所述方法A中所述目的外源基因为标记基因，所述方法A包括如下X1-X3的步骤：

X1、构建用于敲除所述目的伪狂犬病毒中所述TK基因的包含双sgRNA和Cas9的重组质粒；

X2、构建含有所述TK基因同源臂和所述标记基因的供体质粒，所述供体质粒含有所述目的外源基因插入DNA片段1；

X3、将X1构建的质粒和X2构建的质粒共转染细胞后，接种所述目的伪狂犬病毒后，利用标记进行筛选，得到所述TK基因插入突变并表达所述目的外源基因的重组伪狂犬毒株，该重组伪狂犬毒株即为所述重组伪狂犬病毒；

所述方法B中，所述目的外源基因为非标记基因，所述方法B包括如下X1-X6的步骤:

X1、构建用于敲除所述目的伪狂犬病毒中所述TK基因的包含双sgRNA和Cas9的重组质粒；所述双sgRNA为gRNA1和gRNA2；

X2、构建含有所述TK基因同源臂和标记基因的供体质粒，所述供体质粒含有插入DNA片段1-1，所述插入DNA片段1-1是由所述TK基因的上游同源臂、标记基因的表达盒和所述TK基因的下游同源臂连接而成的双链DNA分子；

X3、将X1构建的质粒和X2构建的质粒共转染细胞后，接种所述目的伪狂犬病毒后，利用标记进行筛选，得到TK基因插入突变并表达所述标记基因的重组伪狂犬毒株；

X4、构建用于敲除所述TK基因插入突变并表达所述标记基因的重组伪狂犬毒株中所述TK基因的双sgRNA和Cas9重组质粒；所述双sgRNA为gRNA3和gRNA4；

X5、构建含有所述TK基因同源臂和所述目的外源基因的供体质粒；所述供体质粒含有名称为所述目的外源基因插入DNA片段1-2，所述目的外源基因插入DNA片段1-2是由所述TK基因的上游同源臂、所述目的外源基因的表达盒和所述TK基因的下游同源臂连接而成的双链DNA分子；

X6、将X4构建的质粒和X5构建的质粒共转染细胞后，接种所述TK基因插入突变并表达所述标记基因的重组伪狂犬毒株后，利用标记进行反向筛选，得到TK基因插入突变并表达目的外源基因的重组伪狂犬毒株，该重组伪狂犬毒株即为所述重组伪狂犬病毒；

所述sgRNA，sgRNA1的靶序列和sgRNA2的靶序列均位于TK基因上sgRNA3的靶序列和sgRNA4的靶序列之间的一段DNA片段上。

所述双sgRNA是以拟敲除基因中符合5’-N₂₀-NGG-3’或5’-CCN-N₂₀-3’序列排列规则的两个片段作为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，N₂₀表示20个连续的脱氧核糖核苷酸；

所述方法A和所述方法B中，步骤X1中的所述双sgRNA是以所述目的伪狂犬病毒中所述TK基因为拟敲除基因，步骤X4中的所述双sgRNA是以所述TK基因插入突变并表达标记基因的重组伪狂犬毒株中的所述TK基因片段和其内包含的标记基因为拟敲除基因。

进一步地，所述标记基因为EGFP的编码基因；所述EGFP为如下B1)或B2)的蛋白质：

B1)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示；

B2)与B1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

进一步地，所述步骤X1中所述双sgRNA以核糖核苷酸序列分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的两个片段作为靶序列，所述sgRNA的序列是核苷酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.5的两个单链DNA；所述步骤X4中所述双sgRNA以核糖核苷酸序列分别为SEQID No.8和SEQ ID No.10的两个片段作为靶序列，所述sgRNA的序列是核苷酸序列分别为SEQ ID No.9和SEQ ID No.11的两个单链DNA。

上述方法中，所述目的伪狂犬病毒为伪狂犬病毒Bartha-K61株。

由上述的方法构建的重组伪狂犬病毒也属于本发明的保护范围。

所述重组伪狂犬病毒可作为病毒活载体进行应用，所述应用也属于本发明的保护范围。

本发明所述重组伪狂犬病毒理解为不仅包含第一代到第二代重组病毒，也包括其子代。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了物质在构建重组伪狂犬病毒中的应用，所述物质为C1-C5中的任一种：

C1)sgRNA，所述sgRNA为名称分别为sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4这4个sgRNA中的至少一种；sgRNA1的靶点为核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA，sgRNA2的靶点为核苷酸序列是SEQ ID No.4的DNA，sgRNA3的靶点为核苷酸序列是SEQ ID No.8的DNA，sgRNA4的靶点为核苷酸序列是SEQ ID No.10的DNA；

C2)编码所述sgRNA的核酸分子；

C3)含有C2)所述核苷酸分子的表达盒；

C4)含有C2)所述核酸分子的重组质粒、或含有C3)所述表达盒的重组质粒；

C5)含有C2)所述核酸分子的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组质粒的重组微生物。

所述重组微生物为重组伪狂犬病毒。

本发明还提供下述任一种应用：

P1、上述的方法、上述的重组伪狂犬病毒或上述的应用在制备伪狂犬病毒载体中的应用；

P2、上述的物质在制备伪狂犬病毒载体中的应用。

本发明的一个具体实施方式中，以伪狂犬病毒Bartha-K61为骨架，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，将EGFP基因表达盒插入伪狂犬病毒复制非必需TK基因中，获得一种表达绿色荧光的重组伪狂犬病毒，利用绿色荧光噬斑筛选纯化获得通用活疫苗载体；利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，将外源基因表达盒替换插入通用活疫苗载体EGFP基因区域，获得一种表达外源基因的重组伪狂犬病毒，该重组伪狂犬病毒能够直接感染动物或真核细胞，从而实现了外源基因蛋白在真核细胞中表达的目的，为构建表达外源基因的重组伪狂犬病毒疫苗奠定了基础。

本方法利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建伪狂犬病毒TK基因插入突变并表达外源基因的重组病毒，所述目的外源基因为标记基因或非标记基因。当所述目的外源基因为标记基因时，在敲除目的伪狂犬病毒中的TK基因的同时导入标记基因，利用标记进行筛选，获得伪狂犬病毒TK基因插入突变并表达标记基因的重组病毒。当所述目的外源基因为非标记基因时，先在敲除目的伪狂犬病毒中的TK基因的同时导入标记基因，利用标记进行筛选，获得伪狂犬病毒TK基因插入突变并表达标记基因的重组病毒；再敲除伪狂犬病毒TK基因插入突变并表达标记基因中的标记基因的同时导入目的外源基因，利用标记进行反向筛选，获得伪狂犬病毒TK基因插入突变并表达目的外源基因的重组病毒。该方法利用CRISPR/Cas9基因编辑系统可快速构建伪狂犬病毒TK基因插入突变并表达外源基因的重组病毒，获得的重组病毒毒力较弱而病毒自身的复制无显著差异，且利用标记正向或反向筛选重组病毒，显著提高新毒株的获得效率。因此，本发明基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建伪狂犬病毒TK基因插入突变并表达外源基因的重组伪狂犬病毒的方法可用来构建病毒活载体，具有重要的潜在应用价值。

附图说明

图1为表达外源蛋白的重组伪狂犬病毒构建及重组伪狂犬病毒制备方法示意图。

图2为实施例1中重组质粒pX459M-gRNA1/2构建及敲除TK基因鉴定结果。图2中的a图为实施例1中转化重组质粒pX459M-gRNA1后菌落的PCR鉴定结果，1为菌落单克隆1号样品，2为菌落单克隆2号样品，3为阴性对照；图2中的b图为转化重组质粒pEZ-gRNA2后菌落的PCR鉴定结果，1为菌落单克隆①号样品，2为菌落单克隆②号样品，3为阴性对照；图2中的c图为转化重组质粒pX459M-gRNA1/2后菌落的PCR鉴定结果，1为菌落单克隆I号样品，2为菌落单克隆II号样品，3为阴性对照；图2中的d图为重组质粒pX459M-gRNA1/2敲除TK基因鉴定结果，1为伪狂犬病毒Bartha-K61 TK基因PCR结果，2为重组质粒pX459M-gRNA1/2敲除TK基因PCR鉴定结果，3为阴性对照。图中M均为DNA分子量标准(DL2000 DNA marker)。

图3为实施例1中荧光显微镜下观察到的病毒噬斑。图3中的a图为白光视野下重组病毒噬斑，图3中的b图为同一视野绿色荧光通道下病毒噬斑。

图4为实施例1中TK基因敲除并表达EGFP病毒噬斑的单克隆病毒的DNA PCR鉴定结果；图中M为DNA分子量标准(DL5000 DNA marker)，1为野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株样品，2为噬斑单克隆1号病毒样品，3为噬斑单克隆2号病毒样品，4为阴性对照。

图5为实施例1中TK基因插入突变并表达EGFP的单克隆病毒的DNA序列测序结果；图中Bartha-K61-WT为野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株，Bartha-K61-ΔTK-EGFP为TK基因插入突变并表达EGFP重组伪狂犬病毒Bartha-K61株。

图6为实施例1中TK基因插入突变并表达EGFP重组伪狂犬病毒复制结果；图中Bartha-K61为野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株，Bartha-K61-ΔTK-EGFP为TK基因插入突变并表达EGFP重组伪狂犬病毒Bartha-K61株。

图7为实施例2中TK基因插入突变并表达外源蛋白的单克隆病毒的DNA PCR结果。图中1为TK基因插入突变并表达EGFP重组伪狂犬病毒株，2为TK基因插入突变并表达非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)蛋白K205R(ASFV-K205R)噬斑单克隆1号病毒样品，3为TK基因插入突变并表达外源蛋白K205R噬斑单克隆2号病毒样品。

图8为实施例2中重组伪狂犬病毒Bartha-K61-ΔTK-K205R外源蛋白K205R表达鉴定结果。图中Bartha-K61-ΔTK-EGFP重组病毒感染细胞和Bartha-K61-ΔTK-K205R两个重组病毒(1，2)感染细胞后外源蛋白表达鉴定结果(K205R带HA标签)。

图9为实施例2中TK基因插入突变并表达K205R基因的重组伪狂犬病毒复制结果。图中Bartha-K61为野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株，Bartha-K61-ΔTK-K205R为Bartha-K61株TK基因插入突变并表达K205R的重组病毒。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。

1分子生物学试剂

Bbs I酶(NEB#R3539)为NEB产品。

Lipofectamine 2000(11668019)为ThermoFisher公司产品。

2质粒与细胞株、病毒株

pX459M质粒(Addgene#62988)为Addgene质粒库产品。

pEZ-GuideXH质粒(淼灵#P4206)为淼灵质粒平台产品。

pEGFP-C1质粒(Addgene#13390)为Addgene质粒库产品。

pCAGGS-HA质粒(淼灵#P0166)为淼灵质粒平台产品。

JM109大肠杆菌(9052)为大连宝生物公司产品。

HEK-293T细胞(

ACS-4500)，BHK-21细胞(

CCL-10)、PK-15细胞(

CCL-33)均为ATCC产品。

伪狂犬病毒Bartha-K61株为青岛易邦生物工程有限公司产品。

3溶液和培养基

下述实施例中所用的溶液和培养基的配制方法如下：

含氨苄抗性的LB培养基的配制方法为(以200mL为例)：固体LB培养基(200mL):酵母提取物1g，胰蛋白胨2g，氯化钠2g，琼脂粉3g，溶解于200mL去离子水中，120℃高压灭菌20min，在培养基将至50℃时，在超净台中加入200μL氨苄抗生素(100mg/mL)，混匀后倒入培养皿中，凝固后4℃保存。

含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基的配制方法为(以500mL为例)：将50mL的FBS和5mL青链霉素双抗(5000U/mL)加入到445mL DMEM培养基中，充分混匀。

Opti-MEM培养基(31985088)为Gibco产品，青链霉素(5000U/mL)(15070063)和DMEM培养基(11995065)为Gibco产品，FBS(1752054)为Biological Industries产品。

实施例1、伪狂犬病毒胸苷激酶TK基因插入突变并表达天然型绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒毒株的构建

本实施例采用CRISPR/Cas9基因编辑系统，对伪狂犬病毒Bartha-K61株的TK基因进行特异性插入，并导入EGFP基因。伪狂犬病毒载体基因编辑示意图见图1，具体操作如下：

1、TK基因敲除质粒的构建与鉴定

1.1伪狂犬病毒Bartha-K61株TK蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。伪狂犬病毒Bartha-K61株TK基因的基因序列参考Genbank中Bartha-K61(Suidherpesvirus 1stain Bartha)的基因序列(Genbank Accession No.JF797217.1，02-NOV-2011)。

为敲除TK基因，选取了位于TK基因序列中两段符合5’-N₂₀-NGG-3’或5’-CCN-N₂₀-3’序列排列规则的片段为靶序列，N表示A、G、C和T中的任一种，N₂₀表示20个连续的脱氧核糖核苷酸。两段靶序列分别记为靶序列1和靶序列2。根据http://crispr.mit.edu/网站，针对可能的靶序列1和靶序列2设计gRNA序列。

本实施例中靶序列1的序列为5’-(TGCCCGAGCCGATGGCGTACTGG)-3’(SEQ IDNo.2)，针对靶序列1的gRNA命名为gRNA1，gRNA1的序列为：5’-(TGCCCGAGCCGATGGCGTAC)-3’(SEQ ID No.3)。靶序列2的序列为：5’-(GCGCAACGTCTACGCCATGCTGG)-3’(SEQ ID No.4)，针对靶序列2的gRNA命名为gRNA2，gRNA2的序列为：5’-(GCGCAACGTCTACGCCATGC)-3’(SEQ IDNo.5)。

1.2引物的磷酸化与退火

针对上述TK基因的gRNA基因，设计DNA引物F和R(针对gRNA1的引物具体称为F1和R1，针对gRNA2的引物具体称为F2和R2)，并合成。

F1：5’-CACC-

-3’(下划线指示的序列为BbsI粘性末端序列，双下划线指示的序列为与R1反向互补的序列)；

R1：5’-AAAC-

-3’(下划线指示的序列为BbsI粘性末端序列，双下划线指示的序列为与F1反向互补的序列)。

F2：5’-CACC-

-3’(下划线指示的序列为BbsI粘性末端序列，双下划线指示的序列为与R2反向互补的序列)；

R2：5’-AAAC-

-3’(下划线指示的序列为BbsI粘性末端序列，双下划线指示的序列为与F2反向互补的序列)。

合成的F和R通过退火获得双链互补序列，引物退火反应体系：前向引物F(100μM)1μL、反向引物R(100μM)1μL、10×T₄ ligase buffer 1μL、T4 DNA连接酶(T₄ ligase)1μL、H₂O6μL，总体积为10μL。反应在PCR仪中进行，37℃,30min，95℃,5min，PCR梯度降温到25℃，速度为每秒降低0.1℃，得到退火引物。放置在冰上或者保存在-20℃冰箱备用。得到F1和R1退火形成的双链互补DNA，以下简称F1-R1；F2和R2退火形成的双链互补DNA，以下简称F2-R2。

1.3重组质粒的构建

1)pX459M-gRNA1的构建和鉴定

将纯化的pX459M质粒以Bbs I酶消化，反应体系为：pX459M质粒6-10μg；Bbs I酶2μL；10×buffer 5μL；H₂O补足至50μL。37℃反应2h后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化pX459M质粒骨架。然后将F1-R1分别与切胶纯化的pX459M质粒骨架进行连接，反应体系如下：F1-R12μL，pX459M质粒骨架100ng，10×T4 ligase buffer 1μL，T4 DNA连接酶(T4ligase)1μL，加超纯水补足至10μL，置于16℃恒温金属连接仪中过夜连接。连接后转化JM109大肠杆菌感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行阳性菌筛选。37℃培养12h后，用灭菌枪头挑取2个单菌落(菌落单克隆1号和菌落单克隆2号)至含氨苄抗性的LB培养基中37℃、220rpm过夜培养，提取重组质粒用于PCR鉴定。重组质粒用gRNA1的前向引物F1和CAG-R(5’-GTACTGGGCACAATGCCAG-3’)作为鉴定上、下游引物，PCR产物大小为490bp。反应体系和PCR条件：模板DNA 1μL，上、下游引物各0.5μL，10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2μL，rTaq 0.125μL，加超纯水至总体积25μL。反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定结果见图2中的a图。鉴定好的阳性克隆应测序确认，pX459M插入gRNA1的克隆用CAG-R引物测序，测序正确的重组质粒命名为pX459M-gRNA1。pX459M-gRNA1是在pX459M的Bbs I识别位点插入gRNA1编码序列，保持pX459M的其它核苷酸不变得到的gRNA1基因表达质粒。

2)pEZ-gRNA2的构建和鉴定

将纯化pEZ-GuideXH质粒以Bbs I酶消化，反应体系为：pEZ-GuideXH质粒6-10μg；Bbs I酶2μL；10×buffer 5μL；H₂O补足至50μL。37℃反应2h后，将酶切后质粒产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化质粒骨架。然后将F2-R2与切胶纯化的pEZ-GuideXH质粒骨架进行连接，反应体系如下：F2-R22μL，pEZ-GuideXH质粒骨架100ng，10×T4 ligase buffer 1μL，T4DNA连接酶(T4 ligase)1μL，加超纯水补足至10μL，置于16℃恒温金属连接仪中过夜连接。连接后转化JM109大肠杆菌感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行阳性菌筛选。37℃培养12h后，用灭菌枪头挑取2个单菌落(菌落单克隆①号和菌落单克隆②号)至含氨苄抗性的LB培养基中37℃、220rpm过夜培养，提取重组质粒用于PCR鉴定。重组质粒用gRNA2的前向引物F2和M13F(5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)作为鉴定引物，PCR产物大小为200bp。反应体系和PCR条件：模板DNA 1μL，上、下游引物各0.5μL，10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2μL，rTaq0.125μL，加超纯水至总体积25μL。反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定结果见图2中的b图。鉴定好的阳性克隆应测序确认，pEZ-GuideXH插入gRNA2的克隆用M13F引物测序，测序正确的重组质粒命名为pEZ-gRNA2。pEZ-gRNA2是在pEZ-GuideXH的Bbs I识别位点插入gRNA2编码序列，保持pEZ-GuideXH的其它核苷酸不变得到的gRNA2基因表达质粒。

3)质粒pX459M-gRNA1/2的构建和鉴定

将1.3构建好的重组质粒pX459M-gRNA1用Xho I和Hind III双酶切。反应体系为：pX459M-gRNA16-10μg；Xho I酶2μL；Hind III酶2μL；10×buffer 5μL；H₂O补足至50μL。37℃反应2h后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳。选取3300bp大小的条带回收，得到pX459M-gRNA1片段。

将1.3构建好的重组质粒pEZ-gRNA2用Xho I和Hind III双酶切。反应体系为：pEZ-gRNA26-10μg；Xho I酶2μL；HindIII酶2μL；10×buffer 5μL；H₂O补足至50μL。37℃反应2h后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳。选取360bp条带回收，得到pEZ-gRNA2片段。

将pX459M-gRNA1片段和pEZ-gRNA2片段进行过夜连接，连接后转化JM109大肠杆菌感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行阳性菌筛选。37℃培养12h后，用灭菌枪头挑取2个单菌落(菌落单克隆I号和菌落单克隆II号)至含氨苄抗性的LB培养基中37℃、220rpm过夜培养，提取重组质粒用于PCR鉴定。以gRNA1前向引物F1作为上游引物，gRNA2反向引物R2作为下游引物，按照下列反应体系和条件进行PCR扩增：模板DNA 1μL，上、下游引物各0.5μL，10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2μL，rTaq 0.125μL，加超纯水至总体积25μL。反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图2中的c图，阳性质粒PCR产物大小为480bp。结果显示质粒构建成功。将质粒进一步测序验证，将测序验证正确的重组质粒命名为pX459M-gRNA1/2。pX459M-gRNA1/2是将pX459M-gRNA1的Xho I识别位点和Hind III识别位点之间的小片段替换为含gRNA2基因片段(用Xho I和Hind III双酶切pEZ-gRNA2得到的含gRNA2编码序列的片段)，保持pX459M-gRNA1的其它核苷酸不变得到的gRNA1基因gRNA2基因共表达质粒。

质粒pX459M-gRNA1/2敲除效果鉴定结果见图2中的d图。

2、伪狂犬病毒TK基因插入突变处EGFP表达盒供体质粒的构建

伪狂犬病毒Bartha-K61株TK基因的基因序列参考Genbank中Bartha-K61(Suidherpesvirus 1stain Bartha)的基因序列(Genbank Accession No.JF797217.1，02-NOV-2011)。根据TK基因序列，以及gRNA1的序列(SEQ ID No.3)和gRNA2的序列(SEQ ID No.5)，用Oligo 6.0软件设计了多条引物(见表1)。

表1引物序列

引物名称	引物序列
		TK-LF1	CCGGAATTCCGCCGCCTTATCATCCC
TK-LR1	GCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGGTGGCGGTCAAAGACGA
		TK-RF2	TGTCCAAACTCATCAATGTATCTTACTGGCGCGCTTCATCGT
TK-RR2	GGAAGATCTCGAGCTGGAAGACGAACCA
		EGFP-F	CGTTACATAACTTACGGT
EGFP-R	TAAGATACATTGATGAGT

其中：TK-LF1和TK-LR1用于扩增TK同源重组左臂，在重组左臂的前端加EcoR I酶切位点，扩增的片段大小为898bp；TK-RF2和TK-RR2用于扩增TK同源重组右臂，在重组右臂的末端加Bgl II酶切位点，扩增的片段大小为952bp；EGFP-F和EGFP-R用于扩增EGFP表达盒CMV-EGFP-SV40 polyA，扩增的片段大小为1475bp。具体步骤如下：

用引物TK-LF1和TK-LR1通过PCR的方法扩增出位于伪狂犬病毒Bartha-K61基因组中58116至59013位碱基的片段，用作TK同源重组左臂；用TK-RF2和TK-RR2通过PCR的方法扩增出位于伪狂犬病毒Bartha-K61基因组中59041至59992位碱基的片段，用作TK同源重组右臂。同时，用引物EGFP-F和EGFP-R，以pEGFP-C1的DNA为模板通过PCR的方法扩增EGFP表达盒CMV-EGFP-SV40 polyA。用引物TK-LF1与TK-RR2通过Overlap PCR的方法将TK同源重组左臂、EGFP表达盒、TK同源重组右臂依序连接并扩增，命名为TK-L-EGFP-R。利用EcoR I、BglII内切酶酶切，将TK-L-EGFP-R克隆至pCAGGS质粒，获得EGFP同源供体质粒，命名pCAGGS-TK-L-EGFP-R。

3、伪狂犬病毒TK基因插入突变并表达EGFP的重组病毒的构建

将重组质粒pX459M-gRNA1/2、pCAGGS-TK-L-EGFP-R按照1:1的比例共转染HEK-293T细胞，转染体系如表2所示。

表2 Lip2000转染HEK-293T细胞的反应体系(12孔板)

序号	试剂(每孔)	加入量
			A1	Opti-MEM培养基	50μL
A2	Lipofectamine 2000	2μL
			B1	Opti-MEM培养基	50μL
B2	重组质粒	1μg

操作方法：首先将表2中A1和A2试剂混合均匀得到A组液体，再将B1和B2试剂混匀得到B组液体，室温静置5分钟；然后将A组液体和B组液体均匀混合在一起，室温静置15分钟。将反应产物均匀加入以含10％FBS的DMEM培养基培养的HEK-293T细胞上，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后，感染疫苗株伪狂犬病毒Bartha-K61株，病毒的接种量为MOI＝1，24h后收取病毒液，-80℃保存。

4、伪狂犬病毒TK基因插入突变并表达EGFP的重组病毒的筛选

将收取的病毒液用BHK-21细胞进行噬斑纯化，挑取单克隆病毒。

具体操作方法为：将BHK-21细胞铺于细胞板(12孔板或6孔板均可)，细胞生长成单层方可进行实验。将收取的病毒液用DMEM进行倍比稀释(通常使用10^-2至10^-5稀释度)。弃掉细胞板中原有的营养液，用PBS洗涤细胞表面2-3次，加入稀释好的病毒(100μL/孔)。将细胞板不同角度倾斜混匀后，放置于37℃培养箱进行孵育1h，在此期间每隔15min要将细胞板取出倾斜混匀，以保证病毒分布均匀。孵育后，弃掉病毒液，将含10％胎牛血清(FBS)的DMEM及灭菌的2％低熔点琼脂1:1混合均匀后，加入细胞板孔中。将细胞板放入4℃冰箱5分钟，使琼脂完全凝固，凝固后将细胞板放入37℃培养箱倒置培养数天(通常4-5天)。荧光显微镜下可以看到清晰可见的绿色荧光噬斑，噬斑图见图3。挑取2个噬斑(噬斑单克隆1号和噬斑单克隆2号)，提取病毒DNA，获得噬斑单克隆1号病毒DNA、噬斑单克隆2号病毒DNA，进行PCR鉴定。

分别以提取的噬斑单克隆1号病毒DNA和噬斑单克隆2号病毒DNA为模板，以野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株DNA为阳性对照，以去离子水为阴性对照。TK全长引物(F：GCGTTCGTAGAAGCGGTTGTG，R：TCACACCCCCATCTCCGACGT)进行PCR扩增：模板DNA 2μL；上、下游引物各1μL；2×GC buffer 5μL，2.5mM dNTP 4μL；rTaq 0.25μL；加超纯水至总体积50μL。反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸2min 50s，共30个循环；最后72℃延伸10min。产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，目标PCR片段长度为2516bp，切胶回收，将回收产物进行DNA测序。电泳结果见图4，插入突变病毒TK基因测序结果见图5，确定TK基因的敲除和绿色荧光蛋白EGFP基因插入效果。结果表明成功获得了TK基因插入突变并表达EGFP的单克隆伪狂犬病毒Bartha-K61株，命名为Bartha-K61-ΔTK-EGFP。

5、TK基因插入并表达EGFP的重组伪狂犬病毒复制的检测

以提取的伪狂犬病毒DNA为模板，以gD基因引物(gD F：5’-CACGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’；gD R：5’-GTCCACGCCCCGCCTGAAGCT-3’)进行PCR扩增：模板DNA2μL；上、下游引物各1μL；2×PrimeSTAR GC buffer 25μL，2.5mM dNTP 4μL；PrimeSTAR0.25μL；加超纯水至总体积50μL。反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，PCR片段长度为217bp，切胶回收，测定产物DNA浓度，根据DNA浓度和核酸拷贝数计算公式得出核酸拷贝数，dsDNA：(6.02x 10²³次拷贝数/摩尔)×(浓度g/ml)/(MW g/mol)＝copies/ml。将回收产物作为标准品，进行倍比稀释，以稀释后的标准品作为模板，gD基因上下游引物进行荧光定量PCR扩增。系统自动得出标准曲线y＝-4.844x+52.141，R²＝0.994，其中y值为CT值，x值为拷贝数log10的指数。

猪肾细胞(PK-15)细胞以1.5×10⁵个细胞/孔铺于12板中，于37℃、5％CO₂的培养箱中过夜培养，将实施例1的TK基因插入突变并表达EGFP的伪狂犬病毒Bartha-K61-ΔTK-EGFP株和野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株分别以MOI＝0.1感染PK-15细胞，于感染后0h、12h、24h、36h、48h收取DNA细胞样品，提取样品总DNA，荧光定量PCR检测伪狂犬病毒的复制情况。将荧光定量PCR检测伪狂犬病毒的CT值带入标准曲线中，计算得到病毒拷贝数。结果见图6，与野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株相比，TK基因插入突变并表达EGFP的重组伪狂犬病毒Bartha-K61-ΔTK-EGFP株和野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株复制无显著差异。

实施例2、伪狂犬病毒胸苷激酶TK基因插入突变并表达外源基因的重组伪狂犬病毒毒株的构建

本实施例采用CRISPR/Cas9基因编辑系统，对实施例1获得的TK基因插入突变并表达EGFP的单克隆伪狂犬病毒Bartha-K61株(Bartha-K61-ΔTK-EGFP)的EGFP基因进行特异性插入突变。具体操作如下：

1、EGFP基因敲除质粒的构建与鉴定

1.1为敲除Bartha-K61-ΔTK-EGFP毒株EGFP基因，选取了位于TK基因序列中两段符合5’-N₂₀-NGG-3’或5’-CCN-N₂₀-3’序列排列规则的片段为靶序列，N表示A、G、C和T中的任一种，N₂₀表示20个连续的脱氧核糖核苷酸。两段靶序列分别记为靶序列3和靶序列4。根据http://crispr.mit.edu/网站，针对可能的靶序列3和靶序列4设计gRNA序列。要求实施例1中sgRNA1的靶序列和sgRNA2的靶序列，均位于TK基因上本实施例sgRNA3的靶序列和sgRNA4的靶序列之间的一段DNA片段上。

本实施例中靶序列3的序列为5’-(CGCCGTCGAGGTAGATCCGGAGG)-3’(SEQ IDNo.8)，针对靶序列3的gRNA命名为gRNA3，gRNA3的序列为：5’-(CGCCGTCGAGGTAGATCCGG)-3’(SEQ ID No.9)。靶序列4的序列为：5’-(CGCCTTGTACGCGCCGAAGAGGG)-3’(SEQ ID No.10)，针对靶序列4的gRNA命名为gRNA4，gRNA4的序列为：5’-(CGCCTTGTACGCGCCGAAGA)-3’(SEQID No.11)。

1.2引物的磷酸化与退火

针对上述TK基因的gRNA基因，设计DNA引物F和R(针对gRNA3的引物具体称为F3和R3，针对gRNA4的引物具体称为F4和R4)，并合成。

F3：5’-CACC-

-3’(下划线指示的序列为BbsI粘性末端序列，双下划线指示的序列为与R3反向互补的序列)；

R3：5’-AAAC-

-3’(下划线指示的序列为BbsI粘性末端序列，双下划线指示的序列为与F3反向互补的序列)。

F4：5’-CACC-

-3’(下划线指示的序列为BbsI粘性末端序列，双下划线指示的序列为与R4反向互补的序列)；

R4：5’-AAAC-

-3’(下划线指示的序列为BbsI粘性末端序列，双下划线指示的序列为与F4反向互补的序列)。

合成的F和R通过退火获得双链互补序列，引物退火反应体系及方法参考实例1中操作方法1.2。

1.3重组质粒的构建

1)pX459M-gRNA3的构建和鉴定

参考实例1中操作方法1.3.1。

2)pEZ-gRNA4的构建和鉴定

参考实例1中操作方法1.3.2。

3)质粒pX459M-gRNA3/4的构建和鉴定

参考实例1中操作方法1.3.3。

2、外源基因供体质粒的构建

根据TK基因序列，以及gRNA3的编码序列(SEQ ID No.9)和gRNA4的编码序列(SEQID No.11)，用Oligo 6.0软件设计了多条引物(见表3)。

表3引物序列

引物名称	引物序列
		TK-LF3	ACGCGTCGACGCTGCTCGTCCACCTCGG
TK-LR3	ACGCGTCGACAGTACGCCATCGGCTCGG
		TK-RF4	CCCAAGCTTCTGGCGCGCTTCATCGT
TK-RR4	CCCAAGCTTCGAGCTGGAAGACGAACCA

其中：TK-LF3和TK-LR3用于扩增TK同源重组左臂，在重组左臂的两端加Sal I酶切位点，扩增的片段大小为942bp；TK-RF4和TK-RR4用于扩增TK同源重组右臂，在重组右臂的两端加HindIII酶切位点，扩增的片段大小为952bp。通过分步单酶切的方式将TK同源重组左臂和TK同源重组右臂连接入pCAGGS质粒，获得通用供体质粒命名为pCAGGS-TK-L-R。外源基因可通过酶切连接方式构建至通用供体质粒pCAGGS-TK-L-R。具体步骤如下：

用引物TK-LF3和TK-LR3通过PCR的方法扩增出位于伪狂犬病毒Bartha-K61基因组中(57854)至(58795)位碱基的片段，用作TK同源重组左臂；用TK-RF4和TK-RR4通过PCR的方法扩增出位于伪狂犬病毒Bartha-K61基因组中(59041)至(59992)位碱基的片段，用作TK同源重组右臂。通过分步单酶切的方式将TK同源重组左臂和TK同源重组右臂连接入pCAGGS质粒，获得通用供体质粒命名为pCAGGS-TK-L-R。利用EcoRⅠ、NheⅠ内切酶酶切pCAGGS-TK-L-R与本实施例中外源质粒pCAGGS-K205R(ASFV-K205R氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.7)，将外源基因K205R克隆至pCAGGS-TK-L-R质粒，获得外源基因同源供体质粒，命名pCAGGS-TK-L-K205R-R。

3、伪狂犬病毒TK基因插入突变并表达外源基因K205R的重组病毒的构建

构建方法参考实例1中操作方法3。

4、伪狂犬病毒TK基因插入突变并表达外源基因K205R的重组病毒的筛选

将收取的病毒液用BHK-21细胞进行噬斑纯化，利用绿色荧光反向挑取单克隆病毒。

具体操作方法为：将BHK-21细胞铺于细胞板(12孔板或6孔板均可)，细胞生长成单层方可进行实验。将收取的病毒液用DMEM进行倍比稀释(通常使用10^-2至10^-5稀释度)。弃掉细胞板中原有的营养液，用PBS洗涤细胞表面2-3次，加入稀释好的病毒(100μL/孔)。将细胞板不同角度倾斜混匀后，放置于37℃培养箱进行孵育1h，在此期间每隔15min要将细胞板取出倾斜混匀，以保证病毒分布均匀。孵育完后，弃掉病毒液，将含10％胎牛血清(FBS)的DMEM及灭菌的2％低熔点琼脂1:1混合均匀后，加入细胞板孔中。将细胞板放入4℃冰箱5分钟，使琼脂完全凝固，凝固后将细胞板放入37℃培养箱倒置培养数天(通常4-5天)。荧光显微镜下观察无绿色荧光噬斑，挑取噬斑感染PK-15细胞，提取病毒DNA，以提取的噬斑单克隆病毒DNA为模板，以TK基因插入突变并表达EGFP的单克隆伪狂犬病毒Bartha-K61株(即Bartha-K61-ΔTK-EGFP)株DNA为阳性对照，以去离子水为阴性对照。TK全长引物(F：GCGTTCGTAGAAGCGGTTGTG，R：TCACACCCCCATCTCCGACGT)进行PCR扩增：模板DNA 2μL；上、下游引物各1μL；2×GC buffer 5μL，2.5mM dNTP 4μL；rTaq 0.25μL；加超纯水至总体积50μL。反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1m 50s，共30个循环；最后72℃延伸10min。产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，目标PCR片段长度为3300bp，切胶回收，将回收产物进行DNA测序，确定TK基因的敲除和外源基因K205R插入效果。插入突变病毒TK基因DNA片段PCR结果见图7，确定TK基因的敲除和外源基因K205R插入效果。裂解病毒蛋白，进行Western Blot鉴定，外源基因K205R蛋白表达结果见图8(两个重复)。表明成功获得了TK基因插入突变并表达外源基因K205R的单克隆伪狂犬病毒Bartha-K61株，命名为Bartha-K61-ΔTK-K205R。

5、TK基因插入并表达K205R的重组伪狂犬病毒复制的检测

检测方法参考实例1中操作方法5，检测结果见图9，与野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株相比，TK基因插入突变并表达K205R的重组伪狂犬病毒Bartha-K61-ΔTK-K205R株和野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株复制无显著差异。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种表达外源蛋白的重组伪狂犬病毒载体构建及重组伪狂犬病毒制备方法

<130> GNCSY201216

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 320

<212> PRT

<213> 伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 1

Met Arg Ile Leu Arg Ile Tyr Leu Asp Gly Ala Tyr Gly Thr Gly Lys

1 5 10 15

Ser Thr Thr Ala Arg Val Met Ala Leu Gly Gly Ala Leu Tyr Val Pro

20 25 30

Glu Pro Met Ala Tyr Trp Arg Thr Leu Phe Asp Thr Asp Thr Val Ala

35 40 45

Gly Ile Tyr Asp Ala Gln Thr Arg Lys Gln Asn Gly Ser Leu Ser Glu

50 55 60

Glu Asp Ala Ala Leu Val Thr Ala Gln His Gln Ala Ala Phe Ala Thr

65 70 75 80

Pro Tyr Leu Leu Leu His Thr Arg Leu Val Pro Leu Phe Gly Pro Ala

85 90 95

Val Glu Gly Pro Pro Glu Met Thr Val Val Phe Asp Arg His Pro Val

100 105 110

Ala Ala Thr Val Cys Phe Pro Leu Ala Arg Phe Ile Val Gly Asp Ile

115 120 125

Ser Ala Ala Ala Phe Val Gly Leu Ala Ala Thr Leu Pro Gly Glu Pro

130 135 140

Pro Gly Gly Asn Leu Val Val Ala Ser Leu Asp Pro Asp Glu His Leu

145 150 155 160

Arg Arg Leu Arg Ala Arg Ala Arg Ala Gly Glu His Val Asp Ala Arg

165 170 175

Leu Leu Thr Ala Leu Arg Asn Val Tyr Ala Met Leu Val Asn Thr Ser

180 185 190

Arg Tyr Leu Ser Ser Gly Arg Arg Trp Arg Asp Asp Trp Gly Arg Ala

195 200 205

Pro Arg Phe Asp Gln Thr Thr Arg Asp Cys Leu Ala Leu Asn Glu Leu

210 215 220

Cys Arg Pro Arg Asp Asp Pro Glu Leu Gln Asp Thr Leu Phe Gly Ala

225 230 235 240

Tyr Lys Ala Pro Glu Leu Cys Asp Arg Arg Gly Arg Pro Leu Glu Val

245 250 255

His Ala Trp Ala Met Asp Ala Leu Val Ala Lys Leu Leu Pro Leu Arg

260 265 270

Val Ser Thr Val Asp Leu Gly Pro Ser Pro Arg Ala Cys Ala Ala Ala

275 280 285

Val Ala Ala Gln Ala Arg Gly Met Glu Val Thr Glu Ser Ala Tyr Gly

290 295 300

Asp His Ile Arg Gln Cys Val Cys Ala Phe Thr Ser Glu Met Gly Val

305 310 315 320

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcccgagcc gatggcgtac tgg 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcccgagcc gatggcgtac 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgcaacgtc tacgccatgc tgg 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgcaacgtc tacgccatgc 20

<210> 6

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 7

<211> 208

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 7

Glu Phe Val Glu Pro Arg Glu Gln Phe Phe Gln Asp Leu Leu Ser Ala

1 5 10 15

Val Asp Gln Gln Met Asp Thr Val Lys Asn Asp Ile Lys Asp Ile Met

20 25 30

Lys Glu Lys Thr Ser Phe Met Val Ser Phe Glu Asn Phe Ile Glu Arg

35 40 45

Tyr Asp Thr Met Glu Lys Asn Ile Gln Asp Leu Gln Asn Lys Tyr Glu

50 55 60

Glu Met Ala Ala Asn Leu Met Thr Val Met Thr Asp Thr Lys Ile Gln

65 70 75 80

Leu Gly Ala Ile Ile Ala Gln Leu Glu Ile Leu Met Ile Asn Gly Thr

85 90 95

Pro Leu Pro Ala Lys Lys Thr Thr Ile Lys Glu Ala Met Pro Leu Pro

100 105 110

Ser Ser Asn Thr Asn Asn Glu Gln Thr Ser Pro Pro Ala Ser Gly Lys

115 120 125

Thr Ser Glu Thr Pro Lys Lys Asn Pro Thr Asn Ala Met Phe Phe Thr

130 135 140

Arg Ser Glu Trp Ala Ser Ser Asn Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr

145 150 155 160

Pro Glu Ile Gln Ala Ile Leu Asp Glu Gln Phe Ala Asn Lys Thr Gly

165 170 175

Ile Glu Arg Leu His Ala Glu Gly Leu Tyr Met Trp Arg Thr Gln Phe

180 185 190

Ser Asp Glu Gln Lys Lys Met Val Lys Glu Met Met Lys Lys Ala Ser

195 200 205

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgccgtcgag gtagatccgg agg 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgccgtcgag gtagatccgg 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgccttgtac gcgccgaaga ggg 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgccttgtac gcgccgaaga 20

Claims

1.一种构建重组伪狂犬病毒的方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9基因编辑系统降低或抑制目的伪狂犬病毒中TK的活性、降低或抑制所述目的伪狂犬病毒中TK的含量或/和降低或抑制所述目的伪狂犬病毒中所述TK的表达量，并在所述目的伪狂犬病毒中表达目的外源基因，得到重组伪狂犬病毒；所述TK为如下A1)或A2)的蛋白质：

A1)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白质；

2.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述降低或抑制目的伪狂犬病毒中TK的活性、降低或抑制目的伪狂犬病毒中TK的含量或/和降低或抑制目的伪狂犬病毒中所述TK的表达量，是通过敲除所述目的伪狂犬病毒中所述TK基因实现的；在所述目的伪狂犬病毒中表达目的外源基因，是通过在所述目的伪狂犬病毒中插入所述目的外源基因实现的；所述敲除所述目的伪狂犬病毒中所述TK的基因利用CRISPR/Cas9系统实现，所述插入所述目的外源基因是通过导入目的外源基因插入DNA片段1实现，所述目的外源基因插入DNA片段1是由所述TK基因的上游同源臂、所述目的外源基因的表达盒和所述TK基因的下游同源臂连接而成的双链DNA分子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法为方法A或方法B：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述双sgRNA是以拟敲除基因中符合5’-N₂₀-NGG-3’或5’-CCN-N₂₀-3’序列排列规则的两个片段作为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，N₂₀表示20个连续的脱氧核糖核苷酸；

所述方法A和所述方法B中，步骤X1中的所述双sgRNA是以所述目的伪狂犬病毒中所述TK基因为拟敲除基因，步骤X4中的所述双sgRNA是以所述TK基因插入突变并所述表达标记基因的重组伪狂犬毒株中的所述标记基因为拟敲除基因。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述标记基因为EGFP的编码基因；所述EGFP为如下B1)或B2)的蛋白质：

B1)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示；

B2)与B1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤X1中所述双sgRNA以核苷酸序列分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的两个片段作为靶序列，所述步骤X4中所述双sgRNA以核苷酸序列分别为SEQ ID No.8和SEQ ID No.10的两个片段作为靶序列。

7.由权利要求1-6中任一项所述的方法构建的重组伪狂犬病毒。

8.权利要求7所述的重组伪狂犬病毒在作为病毒活载体中的应用。

9.物质在构建重组伪狂犬病毒中的应用，其特征在于：所述物质为C1-C5中的任一种：

C2)编码所述sgRNA的核酸分子；

C3)含有C2)所述核酸分子的表达盒；

C5)含有C2)所述核酸分子的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组质粒的重组微生物。

10.下述任一种应用：

P1、权利要求1-6中任一项所述的方法、权利要求7所述的重组伪狂犬病毒、或权利要求8-9中任一项所述的应用在制备伪狂犬病毒载体中的应用；

P2、权利要求9中所述的物质在制备伪狂犬病毒载体中的应用。