CN114836392B - 一种prrsv弱病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种PRRSV弱病毒及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。该PRRSV弱病毒的N蛋白中的第78位点氨基酸突变为丙氨酸。该PRRSV弱病毒有效降低了病毒的复制能力。该PRRSV弱病毒的制备方法利用PCR，通过特定的引物，定点突变目标序列，得到突变序列，再通过与载体的连接、转化、提取阳性载体，以及采用不同的限制性内切酶进行多次酶切，最终得到含有突变序列的病毒全长序列的感染性克隆载体。

Description

一种PRRSV弱病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种PRRSV弱病毒及其制备方法和应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又称蓝耳病，主要会导致母猪早产、流产、产死胎或木乃伊胎，仔猪和育成猪出现呼吸道疾病，且死亡率高。PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的，PRRSV是呈单股正链的RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属。根据抗原性和序列的不同，将全球的PRRSV分为以VR-2332为代表的美洲型(North American，NA)和以Lelystad virus(LV)为代表的欧洲型(European，EU)。我国流行的PRRSV主要属于美洲株(PRRSV-2)。PRRSV对全球养猪业都是巨大的威胁，2005年美国生猪产业因PRRSV造成的经济损失达到5、6亿美元，其中在母猪繁殖阶段损失6700万美元，断奶仔猪损失了2.01亿美元，而生长育肥猪损失最严重，高达2.92亿美元。2013年，Holtkamp等估算PRRSV对美国生猪业造成的经济损失达到了6.63亿美元。2006年，在我国爆发以JXA1为代表的高致病型PRRSV，因其高致病性和高死亡率，引起了社会的广泛关注。近年来，以GM2、NADC30和NADC34为代表的新型PRRSV毒株的出现，进一步加大了我国防控PRRSV的难度。因此，加强对PRRSV的相关研究对于防控PRRSV，减少其带来的损失具有重要意义。
目前，疫苗是防控PRRSV的主要手段，其中，大部分的PRRSV疫苗属于弱毒活疫苗，很多弱毒疫苗均来源于强毒株在Marc-145细胞等上的连续传代后致弱形成的。这种方法所制备的弱毒活疫苗，因其致弱机制不清晰、病毒致弱时间较长、病毒毒力容易返强等缺陷，急需改进。因此，找出一种更加合理、安全的弱病毒及其制备方法对于防控PRRSV有重要作用。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种PRRSV弱病毒，该PRRSV弱病毒的N蛋白中的第78位点氨基酸突变为丙氨酸，有效降低了病毒的复制能力。
为了达到上述目的，本发明提供一种PRRSV弱病毒，该PRRSV弱病毒的N蛋白中的第78位点氨基酸突变为丙氨酸。
PRRSV基因组全长约15.1kb，具有10个开放阅读框(Open reading frames，ORFs)，包括ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b和ORFs3-7以及ORF5a。与复制酶相关的基因ORF1a和ORF1b编码病毒的非结构蛋白(nsps)其余的ORFs编码病毒的结构蛋白，分别为GP2a、E、GP3、GP4、GP5、M、N以及GP5a。而突变某些病毒蛋白的关键氨基酸位点，可以有效的降低病毒的复制能力和致病性，核衣壳(N)蛋白是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的主要蛋白之一，由ORF7编码。在病毒的生命周期中起着重要作用如调节宿主的细胞因子水平，与其他病毒蛋白相连并与病毒的RNA结合。这表明，该蛋白在病毒的生命活动中起到重要的作用。为此，本发明人从N蛋白出发，通过一系列实验发现N蛋白的78位点能够抑制N蛋白诱导宿主细胞表达IL-10mRNA的能力，因此，突变N蛋白的第78位点的丝氨酸能有效降低病毒的复制能力。
本发明还提供了所述PRRSV弱病毒的制备方法，包括以下步骤：构建PRRSV病毒的N蛋白的serine78突变的反向遗传系统，使N蛋白的第78位点氨基酸突变为丙氨酸。
传统的弱病毒活疫苗存在致弱机制不清晰、病毒致弱时间较长、病毒毒力容易返强等缺陷，而采用上述构建反向遗传系统的方法更加合理、安全。
在其中一个实施例中，所述构建PRRSV病毒的N蛋白的serine78突变的反向遗传系统，包括以下步骤：
PCR扩增纯化：PRRSV病毒的全基因组序列包括目标序列和结构序列，将所述目标序列合成至载体，得到第一载体，以所述第一载体为模板，采用预定引物进行PCR扩增，得到扩增产物，电泳，回收含有突变序列的凝胶，纯化，得到突变序列；所述目标序列包括PRRSV病毒的ORF7基因；所述预定引物包括预定内切酶的引物和目标序列的引物；
突变序列与载体的连接：采用预定内切酶分别对突变序列和第一载体进行酶切，纯化回收，采用DNA连接酶进行连接，得到连接产物；
连接产物的转化和鉴定：将连接产物加入感受态细胞，转化，培养，挑取单菌落，培养，进行PCR鉴定和基因测序，得到含有突变序列的菌液；
提取阳性载体：培养含有突变序列的菌液，进行提取，得到含有突变序列的阳性载体；
构建感染性克隆载体：将结构序列和阳性载体连接，得到感染性克隆载体，所述感染性克隆载体包括具有突变序列的PRRSV病毒的全基因组序列。
采用上述方法，能够利用PCR，通过特定的引物，定点突变目标序列，得到突变序列，再通过与载体的连接、转化、提取含有突变序列的阳性载体，本领域技术人员根据含有突变序列的阳性载体和结构序列，能够通过常规的技术知识制备得到含有突变序列的病毒全长序列的感染性克隆载体。
在其中一个实施例中，所述预定内切酶为XmaI限制性内切酶和BvbcI限制性内切酶。
上述限制性内切酶，具有单一的酶切位点，能够实现精准、快速的酶切。
在其中一个实施例中，所述预定内切酶的引物序列如下所示：
XmaI-F：CACGTCGAAAGTGCCGCG(SEQ ID NO:1)
BvbcI-R：TTTTTTAATTDCGGCCGCATGG(SEQ ID NO:2)。在其中一个实施例中，将所述目标序列命名为A78，所述目标序列的引物如下所示：
ORF7-A78A-F：GGCAATTGTGTCTGTCGGCGATCCAGACTG(SEQ ID NO:3)
ORF7-A78A-R：CTGATTGAAGGCAGTCTGGATCGCCGACAG(SEQ ID NO:4)。
采用上述引物，能够使目标序列定点突变为丙氨酸。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增纯化步骤中，所述PCR扩增的反应体系如下所示：
组分 体积
ExTaq酶 25μL
上游引物 1μL
下游引物 1μL
模板 2μL
ddH2O 21μL
总计 50μL。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增纯化步骤中，所述PCR扩增的反应条件如下所示：
首先预变性步骤的反应温度和时间为：94℃、5min；然后变性步骤的反应温度和时间为：94℃、30s，退火步骤的反应温度和时间为：55℃、30s，延伸步骤的反应温度和时间为：72℃、30s，循环35次；最后终延伸步骤的反应温度和时间为：72℃、10min。
本发明还提供了所述PRRSV弱病毒在PRRSV疫苗制备中的应用。
可以理解的，上述PRRSV弱病毒不改变病毒N蛋白及其他蛋白的免疫原性，能够有效刺激机体产生免疫反应，本领域技术人员能够利用上述PRRSV弱病毒制备PRRSV疫苗。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种PRRSV弱病毒，该PRRSV弱病毒通过突变N蛋白中的第78位点氨基酸，有效降低了病毒的复制能力，且通过IFA实验验证了突变后的PRRSV弱病毒不影响拯救，且该突变能够在PRRSV病毒的基因组中稳定存在。
附图说明
图1为实施例1中对PRRSV-2的N蛋白的序列分析图，其中，从下至上条带标记的依次为非保守的丝氨酸位点36、非保守的丝氨酸位点70、非保守的丝氨酸位点77、保守的丝氨酸位点78、保守的丝氨酸位点93、保守的丝氨酸位点95、保守的丝氨酸位点99、保守的丝氨酸位点105、非保守的丝氨酸位点120、非保守的丝氨酸位点122；
图2为实施例2中A78的PCR结果图，其中M：1000bp DNA Marker，1为含有突变序列的扩增产物，2为阴性对照；
图3为实施例2中菌液的PCR结果图，其中M：1000bp DNA Marker，1-5分别对应1-5个单菌落，6为阴性对照；
图4为实施例2中反向遗传系统构建示意图；
图5为实施例3中单一丝氨酸位点突变的IFA结果图；
图6为实施例4中突变病毒的生长曲线图；
图7为实施例4中突变病毒的gRNA的qPCR结果；
图8为实施例4中突变病毒的蛋白表达量结果图；
图9为实施例4中突变病毒的蛋白表达量结果图；
图10为实施例5中突变病毒的生长曲线图；
图11为实施例5中突变毒株经Marc-145细胞传代蛋白序列分析图；
图12为实施例6中免疫原性实验的结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
定义：
反向遗传系统：指通过克隆病毒的全长基因组cDNA至载体上并在细胞中复制出经过修饰过的子代病毒，从而达到能改造病毒遗传特性的目的。
N蛋白：指核衣壳蛋白，是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的主要蛋白之一。
来源：
T4 DNA连接酶(Thermo公司)
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
实施例1
对2型PRRSV的N蛋白进行序列分析。
在NCBI数据库选取16个毒株作为代表。对N蛋白进行序列分析，其中保守的丝氨酸位点为78、93、95、99和105，非保守的丝氨酸位点为36、70、77、120和122，如图1所示。
对上述十个丝氨酸位点分别构建反向遗传系统，进行单一位点突变，并进行间接免疫荧光实验测试突变后病毒是否可以拯救。
下述实施例以丝氨酸位点78为例进行本技术方案的说明。
实施例2
构建PRRSV病毒的N蛋白的serine78突变的反向遗传系统。
一、引物的合成与设计。
根据NCBI上已公布的PRRSV序列，将PRRSV XH-GD株的全基因组序列分成4段，分别为A段约长7187bp、B段约长2836bp、C段约长3285b、D段约长3096bp，将D、C、B和A片段依次亚克隆入pOKq载体，分别命名为pOK D、pOK CD、pOK BCD和pOK ABCD。在基因组2端分别加上CMV启动子序列和BGH终止信号肽。
采用预定引物扩增目标序列，所述包括XH-GD的ORF7基因，目标序列命名为ORF7-A78，ORF7-A78约长730bp，按照本领域常规技术设计、合成引物序列，引物序列如下所示：
XmaI-F：CACGTCGAAAGTGCCGCG(SEQ ID NO:1)
BvbcI-R：TTTTTTAATTDCGGCCGCATGG(SEQ ID NO:2)
ORF7-A78A-F：GGCAATTGTGTCTGTCGGCGATCCAGACTG(SEQ ID NO:3)
ORF7-A78A-R：CTGATTGAAGGCAGTCTGGATCGCCGACAG(SEQ ID NO:4)
二、目标序列的PCR扩增以及纯化。
使用引物(10μM)，以pOK D为模板对目标序列进行扩增，常规PCR反应体系如下表所示。
表1 PCR反应体系
反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35cycles；72℃10min。
PCR扩增结束后，把全部PCR扩增产物加入到含Goldview的1％琼脂糖凝胶中，电泳30min，随后置于凝胶成像系统成像，结果如图2所示。
在紫外灯的照射下，切下目的条带，使用Omega胶回收试剂盒进行胶回收。具体步骤如下：
1、将单一目的DNA条带(即含有突变序列的条带)从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)，放入干净的离心管中，称量计算凝胶重量(提前记录离心管重量)。
2、向胶块中加入1倍体积XP2 Binding Buffer(如凝胶重为100mg，其体积可视为100μL，以此类推)。
3、50℃水浴温浴，其间每隔2-3min温和地上下颠倒离心管，待溶胶液为黄色，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟直至胶块完全溶解。
4、将第三部获得的DNA/熔胶液全部转移至已装入收集管中的吸附柱中，13000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5、加入300μL XP2 Binding Buffer至柱子中，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入700μL SPW Buffer，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、重复步骤6。
8、13000rpm离心2分钟，弃去收集管，将吸附柱装在干净的1.5mL离心管中。
向吸附膜中间位置悬空滴加30μL Elution Buffer，室温放置2分钟。13000rpm离心1min。收集突变序列的溶液，-20℃保存突变序列的溶液。
三、突变序列与载体的连接。
用Xma I和Bvbc I内切酶对回收的突变序列和pOK D载体进行酶切，反应体系如下表所示。将酶切过的pOK D和突变序列进行纯化回收，随后使用T4 DNA连接酶16℃过夜连接，得到连接产物。反应体系如下表所示。
表2突变序列的酶切体系
表3 pOK D的酶切体系
表4连接反应体系
四、连接产物的转化。
1、将连接产物加入50μL DH5α感受态细胞中。
2、将连接产物和感受态细胞轻轻混匀后，立即冰浴30min，然后42℃热激90s，然后立即冰浴3min。
3、加入700μL新鲜LB液体培养基，在37℃恒温箱中缓慢摇动培养1h。
4、取100μL菌液涂布于含Kan(100μg/mL)的1.5％(W/V)LB琼脂平板中，37℃倒置培养12～16h。
五、菌液的筛选和鉴定。
挑取生长良好的5个单菌落，分别加入500μL含卡娜霉素(Kan)的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中振荡培养4～6h，取菌液作为模板进行PCR鉴定，PCR反应体系如下表所示。
表5 PCR反应体系
反应条件：94℃，10min；94℃，30s，63℃，30s，72℃，40s，35cycles；72℃，10min。结果如图3所示。
将PCR鉴定符合要求的菌液按照本领域常规基因测序技术进行测序，得到含有突变序列的菌液。
六、阳性质粒的提取。
将含有突变序列的菌液进行扩大培养，使用Omega质粒提取试剂盒进行质粒提取，得到阳性质粒。具体步骤如下：
1、大肠杆菌的培养。从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4ml的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养(培养12-16小时，培养超过16小时细胞将难以裂解，质粒收量也会随之降低)。
2、取1～4ml的过夜培养菌液，12000rpm离心2min，弃上清。
3、用250μL的SolutionⅠ(含RNase A)充分悬浮细菌沉淀。
4、加入250μL的SolutionⅡ轻轻上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。
5、加入350μL的4℃预冷的SolutionⅢ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2min。
6、室温12000rpm离心10min，取上清。
7、将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
8、将操作步骤6的上清液转移至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液。
9、将500μL的HB Buffer加入Spin Column中，12000rpm离心30s，弃滤液。
10、将700μL的DNA Wash Buffer加入Spin Column中，12000rpm离心30s，弃滤液。
11、重复操作步骤10。
12、重新将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm离心1min，除尽残留洗液。
13、将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50μL的灭菌水或Elution Buffer，室温静置1min。
14、12000rpm离心1min洗脱DNA。
七、构建含病毒全长的感染性克隆载体。
将步骤六得到的阳性质粒和pOK CD质粒分别用限制性内切酶BamH I、Hind III双酶切然后进行连接，提取阳性质粒，然后再与pOK BCD分别用限制性内切酶BamH I、AfI I双酶切，然后进行连接，提取阳性质粒，再与pOK ABCD分别用限制性内切酶Not I、AfI I双酶切，然后进行连接，构建出含有突变序列的PRRSV全长的感染性克隆载体。上述构建策略如图4所示，所述构建含病毒全长的感染性克隆载体中的酶切体系和连接反应体系，均和实施例2中的pOK D的酶切体系、连接反应体系相同。
实施例3
间接免疫荧光实验。
将实施例2构建的serine78突变的PRRSV病毒感染性克隆载体转染Marc-145细胞，并在Marc-145细胞中经三次传代，用N蛋白抗体和间接免疫荧光实验检验突变的病毒是否可以被拯救。结果如图5所示，可知serine78突变不影响病毒的拯救。
实施例4
突变毒生物学特性的比较。
一、病毒的生长曲线测定及荧光定量实验。
用MOI为0.1的突变PRRSV病毒感染Marc-145细胞。在不同的时间点收集上清液并进行滴定，然后用Reed-Muench方法计算病毒滴度。可以看出突变serine78可以降低病毒的复制能力(见图6)。通过提取单一位点突变的病毒RNA并进行qPCR分析可以看出突变serine78可以降低病毒的gRNA水平(见图7)。两个实验双向验证了突变serine78可以降低病毒的复制能力。
二、突变毒株的蛋白表达量实验。
通过Western Bolt实验可以看出突变serine78毒株比起XH-GD毒株N蛋白表达量明显下降。结果如图8、图9所示。
经过对实施例1中的10个丝氨酸位点，进行单一位点突变后，发现丝氨酸第78位点可以降低病毒的复制能力和毒力。
实施例5
突变位点稳定性的实验。
一、突变毒株的稳定性实验。
将A78和XH-GD在Marc-145细胞中进行连续传代。然后将0.1MOI的PRRSV(P1,P3,P5和P10)在Marc-145细胞中进行培养。在48hpi时收集样本以比较病毒的滴度。结果如图10所示，结果显示，A78的滴度总是低于XH-GD。
二、serine78突变毒株经连续传代的稳定性分析。
将A78毒株在Marc-145细胞中经10次传代，序列显示serine78突变可以稳定地存在于PRRSV基因组中。如图11所示。
实施例6
免疫原性实验。
将突变serine78毒株、XH-GD毒株分别转染原代PAMs细胞，检测其产生的IL-10mRNA的量，进行对比，突变毒株与亲本毒株无明显差异，结果如图12所示，可见实施例2得到的突变serine78毒株具有免疫原性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 佛山科学技术学院
<120> 一种PRRSV弱病毒及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacgtcgaaa gtgccgcg 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttttttaatt dcggccgcat gg 22
<210> 3
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcaattgtg tctgtcggcg atccagactg 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgattgaag gcagtctgga tcgccgacag 30

Claims (9)

1.一种PRRSV弱病毒，其特征在于，该PRRSV弱病毒的N蛋白中的第78位点氨基酸突变为丙氨酸。
2.权利要求1所述的PRRSV弱病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：构建PRRSV病毒的N蛋白的serine78突变的反向遗传系统，使N蛋白的第78位点氨基酸突变为丙氨酸。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述构建PRRSV病毒的N蛋白的serine78突变的反向遗传系统，包括以下步骤：
PCR扩增纯化：PRRSV病毒的全基因组序列包括目标序列和结构序列，将所述目标序列合成至载体，得到第一载体，以所述第一载体为模板，采用预定引物进行PCR扩增，得到扩增产物，电泳，回收含有突变序列的凝胶，纯化，得到突变序列；所述目标序列包括PRRSV病毒的ORF7基因；所述预定引物包括预定内切酶的引物和目标序列的引物；
突变序列与载体的连接：采用预定内切酶分别对突变序列和第一载体进行酶切，纯化回收，采用DNA连接酶进行连接，得到连接产物；
连接产物的转化和鉴定：将连接产物加入感受态细胞，转化，培养，挑取单菌落，培养，进行PCR鉴定和基因测序，得到含有突变序列的菌液；
提取阳性载体：培养含有突变序列的菌液，进行提取，得到含有突变序列的阳性载体；
构建感染性克隆载体：将结构序列和阳性载体连接，得到感染性克隆载体，所述感染性克隆载体包括具有突变序列的PRRSV病毒的全基因组序列。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述预定内切酶为XmaI限制性内切酶和BvbcI限制性内切酶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述预定内切酶的引物序列如下所示：
XmaI-F：CACGTCGAAAGTGCCGCG(SEQ ID NO:1)
BvbcI-R：TTTTTTAATTDCGGCCGCATGG(SEQ ID NO:2)。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将所述目标序列命名为A78，所述目标序列的引物如下所示：
ORF7-A78A-F：GGCAATTGTGTCTGTCGGCGATCCAGACTG(SEQ ID NO:3)
ORF7-A78A-R：CTGATTGAAGGCAGTCTGGATCGCCGACAG(SEQ ID NO:4)。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增纯化步骤中，所述PCR扩增的反应体系如下所示：
组分 体积 ExTaq酶 25μL 上游引物 1μL 下游引物 1μL 模板 2μL ddH2O 21μL 总计 50μL。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增纯化步骤中，所述PCR扩增的反应条件如下所示：
首先预变性步骤的反应温度和时间为：94℃、5min；然后变性步骤的反应温度和时间为：94℃、30s，退火步骤的反应温度和时间为：55℃、30s，延伸步骤的反应温度和时间为：72℃、30s，循环35次；最后终延伸步骤的反应温度和时间为：72℃、10min。
9.权利要求1所述的PRRSV弱病毒在PRRSV疫苗制备中的应用。
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