CN113215192B - 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法 - Google Patents

猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113215192B
CN113215192B CN202110165215.9A CN202110165215A CN113215192B CN 113215192 B CN113215192 B CN 113215192B CN 202110165215 A CN202110165215 A CN 202110165215A CN 113215192 B CN113215192 B CN 113215192B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pgx
nsp2
gfp
rfp
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110165215.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113215192A (zh
Inventor
韦祖樟
王豪
谢欣
任同伟
王玉旭
贺微
陈樱
欧阳康
黄伟坚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi University
Original Assignee
Guangxi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi University filed Critical Guangxi University
Publication of CN113215192A publication Critical patent/CN113215192A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113215192B publication Critical patent/CN113215192B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法，将猪繁殖与呼吸综合征病毒传代致弱株GXNN1396‑P96作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域465个核苷酸并在缺失位置插入红色荧光蛋白基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入绿色荧光蛋白基因，获得插入双荧光蛋白基因标记的重组PRRSV病毒。测序表明重组病毒遗传稳定，在细胞内连续传至20代内未发现插入的标记基因的荧光丰富度降低。综上，本发明建立了一套猪繁殖与呼吸综合征活病毒载体系统，可同时插入多种外源基因，较一般的活病毒载体系统更加高效，且遗传稳定，为研制重组猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗奠定了基础。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建 方法
技术领域
本发明属于猪繁殖与呼吸综合征病毒技术领域，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又名“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的猪的一种高度接触性传染性疾病，以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸障碍为特征，猪是唯一的感染宿主，自1987年在美国首次发现PRRSV感染至今，PRRSV已经经历了多次爆发，给世界的养猪业带来了巨大的经济损失。
PRRSV属套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的成员，基因组为单股正链RNA，全长约15.6kb，含有至少10个开放阅读框，5＇端含有帽子结构，3＇端含有PolyA。ORF1a和ORF1b约占据了基因组3/4，它们编码病毒复制酶蛋白pp1a和pp1b。pp1a和pp1b复制酶蛋白通过自剪切形成了14个非结构蛋白。ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7编码病毒的结构蛋白，其中ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4和ORF5a编码的病毒的次要结构蛋白GP2a、2b、GP3、GP4和GP5a，ORF5、ORF6和ORF7编码病毒的主要结构蛋白GP5、M和N。
PRRSV反向遗传系统的快速发展为PRRSV作为活病毒载体疫苗的研发打下了坚实的基础。NSP2是PRRSV编码的所有蛋白中变异最大的,在NSP2高变区(HVR)经常发生氨基酸的缺失和插入.截止到目前为止，国内外多名学者都将NSP2的HVR区域作为外源基因插入的靶点，但是获得的重组病毒遗传不稳定，大多插入的外源基因在连续传代的过程中逐渐丢失。除此之外，还有另外一种策略是通过插入额外的独立转录单元来产生额外的亚基因组mRMA(sg mRNA)来表达外源基因。由于PRRSV大多数的开放阅读框之间都存在交叉重叠，故这种策略所能选择的靶点有限。到目前为止，ORF1b和ORF2a、ORF7和3’UTR是人们研究较多的外源基因插入位点。该策略在外源基因后插入一个转录调控序列(TRS)，插入的外源基因的sg mRNA由外源基因上游基因组TRS调控合成，而人工插入的TRS调控下游病毒结构蛋白的sg mRNA的产生，利用这种策略，国内外学者拯救出多种重组病毒，且部分重组病毒在连续传代的过程中保持稳定。
目前为止，以PRRSV表达外源基因的研究主要为单一位点且部分重组病毒遗传不稳定，暂没有多个位点同时稳定表达外源基因的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株的构建方法，将猪繁殖与呼吸综合征病毒GXNN1396-P96作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域465个核苷酸(3049-3513nt)并在缺失位置插入一标记基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入另一标记基因，获得插入双基因标记的重组PRRSV病毒。
猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法，将猪繁殖与呼吸综合征病毒传代致弱株GXNN1396-P96作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域465个核苷酸(3049-3513nt)并在缺失位置插入红色荧光蛋白基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入绿色荧光蛋白基因，获得插入双荧光蛋白基因标记的重组PRRSV病毒。
所述重组PRRSV病毒为rGX-RFP-GFP。
上述构建方法，包括以下步骤：
(1)表达红色荧光蛋白的PRRSV NSP2缺失突变体pGX-NSP2-RFP的构建
在PRRSV感染性克隆中，采用SOE-PCR方法缺失NSP2高变区第624位氨基酸-778位氨基酸位点区域，同时在缺失的区域引入了BstZ17I和SbfI两个酶切位点，先构建NSP2155aa缺失突变体pGX-NSP2-D465，然后，插入红色荧光蛋白(RFP)基因，获得在NSP2的插入RFP重组克隆pGX-NSP2-RFP。
(2)在PRRSV ORF1b和ORF2a间表达绿色荧光重组克隆pGX-12BS-GFP的构建
在PRRSV感染性克隆中，利用SOE-PCR方法在ORF1b和ORF2a间引入Bstb I和Sbf I两个限制性酶切位点，并将SOE-PCR产物克隆到ZeroPCR载体上，获得pTOPO-12BS；利用突变PCR将将转录调控序列TRS(序列表SEQ.NO.ID.16)克隆到Sbf I酶切位点之后，获得pTOPO-12BS-TRS，通过Asc I和Mlu I将含有酶切位点和TRS的相应片段克隆进入pGXAM，获得重组克隆pGX-12BS-TRS；在此基础上，使用人为引入的酶切位点Bstb I和Sbf I将GFP克隆进入pGX-12BS-TRS，获得重组质粒pGX-12BS-GFP。
(3)同时表达红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的重组质粒pGX-RFP-GFP的构建
使用Asc I和Mlu I两个限制性酶切位点同时酶切pGX-12BS-GFP和pGX-NSP2-RFP，回收酶切产物后使用T4酶进行连接，获得pGX-RFP-GFP。
步骤(1)具体按以下进行操作：以PRRSV的全长感染性克隆pGXAM为模板，使用JX451F和JX6463R扩增，PCR产物克隆到ZeroPCR载体，获得穿梭质粒pTOPO-P2；以pTOPO-P2为模板，使用突变引物NSP2 D155 BstZ17IF和NSP2 D155 SbfI R以及外侧引物GX2350F和GX3921R扩增得到PCR产物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI；以PCR产物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI为模板，使用外侧引物GX2350F和GX3921R进行第二轮融合PCR扩增，将PCR产物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI进行融合，将融合PCR产物和pTOPO-P2同时使用Afe I和Bbs I限制性酶切位点进行消化，T4连接后获得缺失155aa和引入Bstz 17I和Sbf I限制性酶切位点pTOPO-P2-D465，使用SpeⅠ和Afl II同时酶切pTOPO-P2-D465和pGXAM，进行相应区域的等段替换，获得pGX-NSP2-D465；在此基础上，使用引物RFP BstZ17I F和RFP SbfI R扩增红色荧光蛋白基因，使用BstZ17I和SbfI酶切pGX-NSP2-D465，获得在NSP2缺失区域插入RFP基因的重组克隆pGX-NSP2-RFP。
步骤(2)具体按以下进行操作：以PRRSV的全长感染性克隆pGXAM为模板，使用突变引物12BS F和12BS R以及外侧引物GF11706和JX14402Mlu I扩增出包含有Bstb I和Sbf I限制性酶切位点的两段PCR产物，以两段PCR产物为模板，使用外侧引物GF11706和JX14402Mlu I进行第二轮融合PCR扩增，将融合PCR产物克隆到ZeroPCR载体，获得穿梭质粒pTOPO-12BS；以pTOPO-12BS为模板，使用引物SbfI-TRS-F和JX14402MluI利用突变PCR获得含有TRS的PCR产物，将PCR产物和pTOPO-12BS使用Sbf I和Mlu I同时酶切，T4连接后获得pTOPO-12BS-TRS；然后，使用Asc I和Mlu I同时酶切pTOPO-12BS-TRS和pGXAM，将含有酶切位点和TRS的酶切片段插入pGXAM中，获得重组质粒pGX-12BS-TRS；使用GFP基因的扩增引物GFP-Bstb I-F和GFP-Sbf I-R扩增GFP基因，然后使用Bstb I和Sbf I同时酶切PCR产物和pGX-12BS-TRS，将GFP基因插入pGX-12BS-TRS中，获得重组质粒pGX-12BS-GFP。
步骤(3)具体按以下进行操作：使用Asc I和Mlu I两个限制性酶切位点同时酶切pGX-12BS-GFP和pGX-NSP2-RFP，进行对应区域的等段替换，获得重组质粒pGX-RFP-GFP。
病毒GXNN1396-P96为保藏编号为CCTCC NO：V 202020，分类命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒GXNN1396-P96。
上述方法所得的猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株。
重组毒株在制备基因工程疫苗方面的应用。
NSP2是PRRSV中变化最大的非结构蛋白，其高变区经常发生缺失，发明人在临床检测中发现一株PRRSV毒株NSP2区域自然缺失465个核苷酸。据此，发明人建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法，将猪繁殖与呼吸综合征病毒传代致弱株GXNN1396-P96作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域465个核苷酸并在缺失位置插入红色荧光蛋白基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入绿色荧光蛋白基因，获得插入双荧光蛋白基因标记的重组PRRSV病毒。测序表明重组病毒遗传稳定，在细胞内连续传至20代内未发现插入的标记基因的荧光丰富度降低。综上，本发明建立了一套猪繁殖与呼吸综合征活病毒载体系统，可同时插入多种外源基因，较一般的活病毒载体系统更加高效，且遗传稳定，为研制重组猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗奠定了基础。
附图说明
图1是以亲本毒株GXNN1396-P96为模板PRRSV感染性克隆pGXAM的构建示意图
图2是重组质粒rGX-NSP2-RFP、rGX-12BS-GFP和rGX-RFP-GFP的构建示意图。
图3重组病毒rGX-NSP2-D465、rGX-NSP2-RFP、rGX-12BS-TRS、rGX-12BS-GFP和亲本毒株rGXAM的第6代病变图，图中：a1-a4为rGXAM、rGX-NSP2-D465、rGX-NSP2-RFP和Mock，b1-b4为rGXAM、rGX-12BS-TRS、rGX-12BS-GFP和Mock。
图4是rGX-NSP2-RFP、rGX-12BS-GFP、rGX-RFP-GFP不同时间点荧光图，图中：crGX-NSP2-RFP、d rGX-12BS-GFP、g rGX-RFP-GFP，从左到右分别为12h、24h、48h和72h。
图5是重组病毒rGX-NSP2-D465、rGX-NSP2-RFP、rGX-12BS-TRS、rGX-12BS-GFP和亲本毒株rGXAM的间接免疫荧光图，图中：e1-e4为rGXAM、rGX-NSP2-D465、rGX-NSP2-RFP和Mock，f1-f4为rGXAM、rGX-12BS-TRS、rGX-12BS-GFP和Mock。
图6是重组病毒和亲本毒株rGXAM的生长曲线图，图中：A重组病毒rGX-NSP2-D465、rGX-NSP2-RFP和亲本毒株rGXAM，B重组病毒rGX-12BS-TRS、rGX-12BS-GFP和亲本毒株，C重组病毒rGX-RFP-GFP和亲本毒株rGXAM。
图7是重组病毒rGX-RFP-GFP的共聚焦拍摄图。
保藏信息说明
猪繁殖与呼吸综合征病毒GXNN1396-P96，保藏编号为CCTCC NO：V 202020，保藏日期：2020年01月16日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
具体实施方式
以下是实施例中TOPO载体用于克隆测序及中间克隆的构建，构自invitrogen公司，含GFP和RFP基因的载体由专利申请人实验室保存。
以下实施例所用引物序列：
(1)SOE-PCR缺失NSP2区域155aa和引入Bstz17 I和Sbf I两个限制性酶切位点。
GX2530F TTCCCCGCCGAGCGCTGCGGACGCTTC(序列表SEQ.NO.ID.1)
GX3921R CACACGCCGAGAAGACCCAGAAAATA(序列表SEQ.NO.ID.2)
NSP2 D155 BstZ17I F AATGACACCAACCCTGCAGTATACAAACCTGCAGGAGCGCCCTCCAAGGGAGAA(序列表SEQ.NO.ID.3)
NSP2 D155 SbfI R TTCTCCCTTGGAGGGCGCTCCTGCAGGTTTGTATACTGCAGGGTTGGTGTCATT(序列表SEQ.NO.ID.4)
(2)扩增RFP基因
RFP BstZ17I F GACACCAACCCTGCAGTATACATGGTGAGCAAGGGCGAGG(序列表SEQ.NO.ID.5)
RFP Sbf I-R TCCCTTGGAGGGCGCTCCTGCAGGCTAGTTTCCGGACTTGTACAGCTCG(序列表SEQ.NO.ID.6)
(3)SOE-PCR在ORF1b和ORF2a间插入Bstb I和Sbf I两个限制性酶切位点
GF11706 gcgtttcgggcgcgccagaaagg(序列表SEQ.NO.ID.7)
12BS R AGGCTTTGCATAGACCCCATTTCATCCTGCAGGTACCTTCGAATTCAATTCAGGCCTAAAGTTGTTC(序列表SEQ.NO.ID.8)
12BS F GAACCAACTTAGGCCTGAATTGAATTCGAAGGTACCTGCAGGATGAAATGGGTCTATGCAAAGCCT(序列表SEQ.NO.ID.9)
JX14402Mlu I acgccggacgacaaacgcgtggttatca(序列表SEQ.NO.ID.10)
(4)扩增TRS基因
Sbf I-TRS-F ACGCCTGCAGGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATATGAAATGGGGTCTATGCAAAGCCTCT(序列表SEQ.NO.ID.11)
(5)扩增GFP基因
GFP-Bstb I-F GAGTTCGAAATGCCCGCCATGAAGATC(序列表SEQ.NO.ID.12)
GFP-Sbf I-R ATATCCTGCAGGCTAGGCGAATGCGATCGGGGTCTTGAA(序列表SEQ.NO.ID.13)
(6)扩增PRRSV P2段
JX451F tgcacgaatgactagtgaaaacc(序列表SEQ.NO.ID.14)
JX6463R gggcggccgcgaaggcataggtgcttaagtt(序列表SEQ.NO.ID.15)
实施例1表达红色荧光蛋白的PRRSV NSP2缺失突变体pGX-NSP2-RFP的构建
以PRRSV的全长感染性克隆pGXAM为模板，使用JX451F和JX6463R扩增，PCR产物克隆到ZeroPCR载体，获得穿梭质粒pTOPO-P2；以pTOPO-P2为模板，使用突变引物NSP2D155 BstZ17IF和NSP2 D155 SbfI R以及外侧引物GX2350F和GX3921R扩增得到PCR产物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI；以PCR产物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI为模板，使用外侧引物GX2350F和GX3921R进行第二轮融合PCR扩增，将PCR产物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI进行融合，将融合PCR产物和pTOPO-P2同时使用Afe I和Bbs I限制性酶切位点进行消化，T4连接后获得缺失155aa和引入Bstz17I和Sbf I限制性酶切位点pTOPO-P2-D465，使用SpeⅠ和Afl II同时酶切pTOPO-P2-D465和pGXAM，进行相应区域的等段替换，获得pGX-NSP2-D465；在此基础上，使用引物RFP BstZ17I F和RFP SbfI R扩增红色荧光蛋白基因(序列表SEQ.NO.ID.18)，使用BstZ17I和SbfI酶切pGX-NSP2-D465，获得在NSP2缺失区域插入RFP基因的重组克隆pGX-NSP2-RFP。
实施例2在PRRSV ORF1b和ORF2a间表达绿色荧光重组克隆pGX-12BS-GFP的构建
以PRRSV的全长感染性克隆pGXAM为模板，使用突变引物12BS F和12BS R以及外侧引物GF11706和JX14402Mlu I扩增出包含有Bstb I和Sbf I限制性酶切位点的两段PCR产物，以两段PCR产物为模板，使用外侧引物GF11706和JX14402Mlu I进行第二轮融合PCR扩增，将融合PCR产物克隆到ZeroPCR载体，获得穿梭质粒pTOPO-12BS；以pTOPO-12BS为模板，使用引物SbfI-TRS-F和JX14402MluI利用突变PCR获得含有TRS的PCR产物，将PCR产物和pTOPO-12BS使用Sbf I和Mlu I同时酶切，T4连接后获得pTOPO-12BS-TRS；然后，使用AscI和Mlu I同时酶切pTOPO-12BS-TRS和pGXAM，将含有酶切位点和TRS的酶切片段插入pGXAM中，获得重组质粒pGX-12BS-TRS；使用GFP基因(序列表SEQ.NO.ID.17)的扩增引物GFP-BstbI-F和GFP-Sbf I-R扩增GFP基因，然后使用Bstb I和Sbf I同时酶切PCR产物和pGX-12BS-TRS，将GFP基因插入pGX-12BS-TRS中，获得重组质粒pGX-12BS-GFP。
实施例3同时表达红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的重组质粒pGX-RFP-GFP的构建
使用Asc I和Mlu I两个限制性酶切位点同时酶切pGX-12BS-GFP和pGX-NSP2-RFP，回收酶切产物后使用T4酶进行连接，获得pGX-RFP-GFP。
实施例4重组病毒的拯救
将构建好的重组质粒按照lipfectamine 2000说明书转染到生长良好的BHK-21(乳仓鼠肾细胞)细胞6孔板上，转染剂量为2μg，6孔板中更换为含有2％胎牛血清的MEM维持液，并将转染的细胞板放置于含有5％CO2的37℃培养箱中培养，48h后收取上清，取收取的上清300μL重新接种到生长良好的Marc-145(非洲绿猴肾细胞)细胞上，将6孔板放置于含有5％CO2的37℃培养箱中培养，12h观察一次细胞病变。24h时观察到明显的细胞病变，细胞脱落60％时收取上清，保存于-80℃。
重组病毒的持续传代
将拯救出的病毒100倍稀释后取300μL接种到生长良好的Marc-145细胞上，待细胞脱落60％时收取细胞上清，将收取的上清以同样的办法再次接种到生长良好的Marc-145细胞上，依次循环，持续传代10代，收取的细胞上清全部保存于-80℃。
重组病毒的鉴定
(1)间接免疫荧光(IFA)鉴定重组病毒
将P3代的细胞上清100倍稀释后。取300μL接种于生长良好的Marc-145细胞6孔板上，将细胞板在37℃5％二氧化碳的培养箱中培养24h后，弃去上清，使用PBS洗涤3次后，使用冰甲醇4℃30min固定细胞。固定完成后，再次PBS洗涤3次，每孔中加入500μL的1.0％BSA，室温30min进行封闭，封闭完成后，使用PBS洗涤3次，每孔加入500μL PRRSV的单克隆抗体SDOW(1:2000稀释)，室温孵育2h，孵育完成后，使用PBS洗涤3次，每孔加入500μL 1:500稀释的二抗，室温避光孵育1h，完成后使用PBS洗涤3次,放置于荧光倒置显微镜下观察荧。在荧光倒置显微镜下可观察到明显的红色荧光或绿色荧光。
(2)重组病毒的遗传稳定性
将获得的重组病毒在Marc-145细胞上持续传代10代，绿色荧光和红色荧光均能稳定表达，通过PCR鉴定P6代收取的细胞上清，可检测到插入的GFP基因和RFP基因及插入位点两测的病毒序列，表明本实验所获得的的重组PRRSV病毒rGX-NSP2-RFP、rGX-12BS-GFP和rGX-RFP-GFP至少6代内稳定，且在P10代时仍未观察到荧光丰度减弱的迹象。
(3)重组病毒的增殖特性鉴定
将拯救出的重组病毒和亲本病毒按照MOI＝0.01剂量感染6孔板的Marc-145细胞，并在感染后12h、24h、48h、72h、96h和120h后收取细胞上清，并测定出各个时间点收取的细胞上清的TCID50，在此基础上，根据测定的TCID50绘制多步生长曲线(图5)。获得的重组病毒rGX-NSP2-RFP、rGX-12BS-GFP拥有和亲本毒株rGXAM相似的病毒增殖特性，但是rGX-RFP-GFP的病毒增殖特性与亲本毒株rGXAM相比略弱。
序列表
<110> 广西大学
<120> 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法
<150> 202010081916X
<151> 2020-02-06
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctagccaaca cacaggcaac ttca 24
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacacgccga gaagacccag aaaata 26
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatgacacca accctgcagt atacaaacct gcaggagcgc cctccaaggg agaa 54
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttctcccttg gagggcgctc ctgcaggttt gtatactgca gggttggtgt catt 54
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacaccaacc ctgcagtata catggtgagc aagggcgagg 40
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcccttggag ggcgctcctg caggctagtt tccggacttg tacagctcg 49
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcgtttcggg cgcgccagaa agg 23
<210> 8
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aggctttgca tagaccccat ttcatcctgc aggtaccttc gaattcaatt caggcctaaa 60
gttgttc 67
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaaccaactt aggcctgaat tgaattcgaa ggtacctgca ggatgaaatg ggtctatgca 60
aagcct 66
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgccggacg acaaacgcgt ggttatca 28
<210> 11
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgcctgcag gatggttccg cggcaacccc tttaaccaga gtttcagcgg aacaatatga 60
aatggggtct atgcaaagcc tct 83
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gagttcgaaa tgcccgccat gaagatc 27
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atatcctgca ggctaggcga atgcgatcgg ggtcttgaa 39
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgcacgaatg actagtgaaa acc 23
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gggcggccgc gaaggcatag gtgcttaagt t 31
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atggttccgc ggcaacccct ttaaccagag tttcagcgga acaatatgaa 50
<210> 17
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgcccgcca tgaagatcga gtgccgcatc accggcaccc tgaacggcgt ggagttcgag 60
ctggtgggcg gcggagaggg cacccccgag cagggccgca tgaccaacaa gatgaagagc 120
accaagggcg ccctgacctt cagcccctac ctgctgagcc acgtgatggg ctacggcttc 180
taccacttcg gcacctaccc cagcggctac gagaacccct tcctgcacgc catcaacaac 240
ggcggctaca ccaacacccg catcgagaag tacgaggacg gcggcgtgct gcacgtgagc 300
ttcagctacc gctacgaggc cggccgcgtg atcggcgact tcaaggtggt gggcaccggc 360
ttccccgagg acagcgtgat cttcaccgac aagatcatcc gcagcaacgc caccgtggag 420
cacctgcacc ccatgggcga taacgtgctg gtgggcagct tcgcccgcac cttcagcctg 480
cgcgacggcg gctactacag cttcgtggtg gacagccaca tgcacttcaa gagcgccatc 540
caccccagca tcctgcagaa cgggggcccc atgttcgcct tccgccgcgt ggaggagctg 600
cacagcaaca ccgagctggg catcgtggag taccagcacg ccttcaagac cccgatcgca 660
ttcgcc 666
<210> 18
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagtc cggaaactag 720

Claims (8)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株的构建方法，其特征在于：将猪繁殖与呼吸综合征病毒GXNN1396-P96作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域3049-3513nt的465个核苷酸并在缺失位置插入一标记基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入另一标记基因，获得插入双基因标记的重组PRRSV病毒；所述病毒GXNN1396-P96为保藏编号为CCTCC NO：V 202020，分类命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒GXNN1396-P96。
2.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法，其特征在于：将猪繁殖与呼吸综合征病毒传代致弱株GXNN1396-P96Gxnn作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域3049-3513nt的465个核苷酸并在缺失位置插入红色荧光蛋白基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入绿色荧光蛋白基因，获得插入双荧光蛋白基因标记的重组PRRSV病毒；所述病毒GXNN1396-P96为保藏编号为CCTCC NO：V202020，分类命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒GXNN1396-P96。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)表达红色荧光蛋白的PRRSV NSP2缺失突变体pGX-NSP2-RFP的构建
在PRRSV感染性克隆中，采用SOE-PCR方法缺失NSP2高变区第624位氨基酸-778位氨基酸位点区域，同时在缺失区域引入了BstZ17I和SbfI两个酶切位点，先构建pGXAM的缺失突变体pGX-NSP2-D465，然后，插入红色荧光蛋白RFP基因，获得重组质粒pGX-NSP2-RFP；
(2)在PRRSV ORF1b和ORF2a间表达绿色荧光重组蛋白克隆pGX-12BS-GFP的构建
在PRRSV感染性克隆中，利用SOE-PCR方法在ORF1b和ORF2a间引入Bstb I和Sbf I两个限制性酶切位点，并将SOE-PCR产物克隆到Zero PCR载体上，获得穿梭质粒pTOPO-12BS；利用突变PCR将转录调控序列TRS克隆到Sbf I酶切位点之后，获得pTO PO-12BS-TRS，通过将Asc I和Mlu I酶切pTOPO-12BS-TRS获得的相应片段克隆进入pGX AM，获得重组克隆pGX-12BS-TRS；在此基础上，通过人为引入的酶切位点Bstb I和Sbf I将GFP插入pGX-12BS-TRS中，获得重组质粒pGX-12BS-GFP；
(3)同时表达红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的重组质粒pGX-RFP-GFP的构建
使用Asc I和Mlu I两个限制性酶切位点同时酶切pGX-12BS-GFP和pGX-NSP2-RFP，回收相应酶切产物后，通过T4酶进行连接，获得重组质粒pGX-RFP-GFP。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于步骤(1)具体按以下进行操作：以PRRSV的全长感染性克隆pGXAM为模板，使用JX451F和JX6463R扩增，PCR产物克隆到ZeroPCR载体，获得穿梭质粒pTOPO-P2；以pTOPO-P2为模板，使用突变引物NSP2 D155BstZ17IF和NSP2 D155 SbfI R以及外侧引物GX2350F和GX3921R扩增得到PCR产物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI；以PCR产物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI为模板，使用外侧引物GX2350F和GX3921R进行第二轮融合PCR扩增，将PCR产物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI进行融合，将融合PCR产物和pTOPO-P2同时使用Afe I和Bbs I限制性酶切位点进行酶切，T4连接后获得缺失155aa和引入Bstz 17I和Sbf I限制性酶切位点的克隆pTOPO-P2-D465，使用SpeⅠ和Afl II同时酶切pTOPO-P2-D465和pGXAM，进行相应区域的等段替换，获得pGX-NSP2-D465；在此基础上，使用引物RFP BstZ17I F和RFP SbfI R扩增红色荧光蛋白基因，使用BstZ17I和SbfI同时酶切pGX-NSP2-D465和PCR扩增产物，将RFP基因插入到pGX-NSP2-D465中，获得在NSP2缺失区域插入RFP基因的重组克隆pGX-NSP2-RFP。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于步骤(2)具体按以下进行操作：以PRRSV的全长感染性克隆pGXAM为模板，使用突变引物12BS F和12BS R以及外侧引物GF11706和JX14402Mlu I扩增出包含有Bstb I和Sbf I限制性酶切位点的两段PCR产物，以两段PCR产物为模板，使用外侧引物GF11706和JX14402Mlu I进行第二轮融合PCR扩增，将融合PCR产物克隆到Zero PCR载体，获得穿梭质粒pTOPO-12BS；以pTOPO-12BS为模板，使用引物SbfI-TRS-F和JX14402MluI利用突变PCR获得含有TRS的PCR产物，将PCR产物和pTOPO-12BS使用Sbf I和Mlu I同时酶切，T4连接后获得pTOPO-12BS-TRS；然后，使用Asc I和Mlu I同时酶切pTOPO-12BS-TRS和pGXAM，将含有酶切位点和TRS的酶切片段插入pGXAM中，获得重组质粒pGX-12BS-TRS；使用GFP基因的扩增引物GFP-Bstb I-F和GFP-Sbf I-R扩增GFP基因，然后使用Bstb I和Sbf I同时酶切PCR产物和pGX-12BS-TRS，将GFP基因插入pGX-12BS-TRS中，获得重组质粒pGX-12BS-GFP。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于步骤(3)具体按以下进行操作：使用AscI和Mlu I两个限制性酶切位点同时酶切pGX-12BS-GFP和pGX-NSP2-RFP，进行对应区域的等段替换，获得重组质粒pGX-RFP-GFP。
7.权利要求2至6任一方法所得的猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株。
8.权利要求7所述重组毒株在制备基因工程疫苗方面的应用。
CN202110165215.9A 2020-02-06 2021-02-06 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法 Active CN113215192B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010081916X 2020-02-06
CN202010081916.XA CN111996213A (zh) 2020-02-06 2020-02-06 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113215192A CN113215192A (zh) 2021-08-06
CN113215192B true CN113215192B (zh) 2023-08-11

Family

ID=73461455

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010081916.XA Pending CN111996213A (zh) 2020-02-06 2020-02-06 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法
CN202110165215.9A Active CN113215192B (zh) 2020-02-06 2021-02-06 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010081916.XA Pending CN111996213A (zh) 2020-02-06 2020-02-06 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN111996213A (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111996213A (zh) * 2020-02-06 2020-11-27 广西大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法
CN111996174A (zh) * 2020-02-06 2020-11-27 广西大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法
CN112029781B (zh) * 2020-08-14 2023-01-03 中山大学 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的安全型复制子系统及其应用
CN115161287B (zh) * 2021-04-06 2024-03-01 中国农业大学 一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其构建方法和应用
CN114940978B (zh) * 2022-04-08 2023-12-29 广西大学 表达盖他病毒e2蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法
CN115433741A (zh) * 2022-06-23 2022-12-06 广西大学 盖他病毒为载体表达报告蛋白的重组病毒的构建方法

Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9509392D0 (en) * 1994-05-13 1995-06-28 Iberica Cyanamid Recombinant prrsv proteins,diagnostic kits and vaccines containing such recombinant prrsv proteins
EP1792996A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
EP2181189A1 (en) * 2007-06-25 2010-05-05 South Dakota State University Recombinant north american type 1 porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of use
CN102250843A (zh) * 2011-06-01 2011-11-23 中国农业科学院上海兽医研究所 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程标记弱毒疫苗株及应用
EP2520310A1 (en) * 2004-04-23 2012-11-07 Pharmacia & Upjohn Company LLC Cellular permissivity factor for viruses, and uses thereof
WO2012163263A1 (en) * 2011-05-27 2012-12-06 Sinovet (Beijing) Biotechnology Co., Ltd Reagents and methods for prrsv detection
CN103087996A (zh) * 2013-01-18 2013-05-08 中国农业大学 重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其制备方法与应用
EP2797625A1 (en) * 2011-12-30 2014-11-05 United Biomedical, Inc. Synthetic peptide-based marker vaccine and diagnostic system for effective control of porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs)
EP2804000A1 (en) * 2013-05-15 2014-11-19 Prionics AG Method for the detection and classification of PRRSV-infections in swine herds and diagnostic antigen compositions for such methods
WO2016012406A2 (en) * 2014-07-21 2016-01-28 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Della Lombardia E Dell'emilia Romagna "Bruno Ubertini" (Izsler) Attenuated strain of prrs and potential use in immunising preparations
CN106399313A (zh) * 2016-09-29 2017-02-15 西北农林科技大学 一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列及其用途和检测方法
CN106834348A (zh) * 2017-03-20 2017-06-13 西北农林科技大学 一种带有荧光标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒及其构建方法和应用
CN107475459A (zh) * 2017-09-30 2017-12-15 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 同时鉴别美洲型prrsv经典毒株、变异毒株及新型病毒类nadc30毒株的检测方法
CN108103099A (zh) * 2017-12-18 2018-06-01 中山大学 一种抗蓝耳病Marc-145细胞系及其制备方法和应用
CN109679952A (zh) * 2018-12-24 2019-04-26 西北农林科技大学 一种抗PRRSV感染的猪源miR-c89及其应用
CN111218427A (zh) * 2018-11-26 2020-06-02 中国农业大学 重组prrs病毒hv-nsp2（500-596）及其应用
WO2020138761A1 (ko) * 2018-12-27 2020-07-02 주식회사 바이오포아 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스의 키메라 바이러스 및 이를 이용한 백신
CN111996213A (zh) * 2020-02-06 2020-11-27 广西大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法
CN111996174A (zh) * 2020-02-06 2020-11-27 广西大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法
JP2021511318A (ja) * 2018-01-19 2021-05-06 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 組換えレプリコン系を使用する免疫応答の誘導および増強

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA108902C2 (uk) * 2010-11-10 2015-06-25 Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (prrs) та його застосування
KR102012109B1 (ko) * 2012-05-17 2019-08-19 조에티스 엘엘씨 이유 전 돼지 생식기 호흡기 증후군(prrs) 바이러스에 대한 효과적인 백신접종
EP2968513A2 (en) * 2013-03-15 2016-01-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use

Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9509392D0 (en) * 1994-05-13 1995-06-28 Iberica Cyanamid Recombinant prrsv proteins,diagnostic kits and vaccines containing such recombinant prrsv proteins
EP2520310A1 (en) * 2004-04-23 2012-11-07 Pharmacia & Upjohn Company LLC Cellular permissivity factor for viruses, and uses thereof
EP1792996A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
EP2181189A1 (en) * 2007-06-25 2010-05-05 South Dakota State University Recombinant north american type 1 porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of use
WO2012163263A1 (en) * 2011-05-27 2012-12-06 Sinovet (Beijing) Biotechnology Co., Ltd Reagents and methods for prrsv detection
CN102250843A (zh) * 2011-06-01 2011-11-23 中国农业科学院上海兽医研究所 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程标记弱毒疫苗株及应用
EP2797625A1 (en) * 2011-12-30 2014-11-05 United Biomedical, Inc. Synthetic peptide-based marker vaccine and diagnostic system for effective control of porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs)
CN103087996A (zh) * 2013-01-18 2013-05-08 中国农业大学 重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其制备方法与应用
EP2804000A1 (en) * 2013-05-15 2014-11-19 Prionics AG Method for the detection and classification of PRRSV-infections in swine herds and diagnostic antigen compositions for such methods
WO2016012406A2 (en) * 2014-07-21 2016-01-28 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Della Lombardia E Dell'emilia Romagna "Bruno Ubertini" (Izsler) Attenuated strain of prrs and potential use in immunising preparations
CN106399313A (zh) * 2016-09-29 2017-02-15 西北农林科技大学 一种抗PRRSV的microRNA样病毒小RNA序列及其用途和检测方法
CN106834348A (zh) * 2017-03-20 2017-06-13 西北农林科技大学 一种带有荧光标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒及其构建方法和应用
CN107475459A (zh) * 2017-09-30 2017-12-15 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 同时鉴别美洲型prrsv经典毒株、变异毒株及新型病毒类nadc30毒株的检测方法
CN108103099A (zh) * 2017-12-18 2018-06-01 中山大学 一种抗蓝耳病Marc-145细胞系及其制备方法和应用
JP2021511318A (ja) * 2018-01-19 2021-05-06 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 組換えレプリコン系を使用する免疫応答の誘導および増強
CN111218427A (zh) * 2018-11-26 2020-06-02 中国农业大学 重组prrs病毒hv-nsp2（500-596）及其应用
CN109679952A (zh) * 2018-12-24 2019-04-26 西北农林科技大学 一种抗PRRSV感染的猪源miR-c89及其应用
WO2020138761A1 (ko) * 2018-12-27 2020-07-02 주식회사 바이오포아 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스의 키메라 바이러스 및 이를 이용한 백신
CN111996213A (zh) * 2020-02-06 2020-11-27 广西大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法
CN111996174A (zh) * 2020-02-06 2020-11-27 广西大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法
CN113215192A (zh) * 2020-02-06 2021-08-06 广西大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法
CN113215108A (zh) * 2020-02-06 2021-08-06 广西大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《黑龙江畜牧兽医》2017年(上半月)1～12期总目次;《黑龙江畜牧兽医》;20171210(第23期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111996213A (zh) 2020-11-27
CN113215192A (zh) 2021-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113215192B (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法
EP0278667B1 (en) Hybrid RNA virus
KR100437254B1 (ko) 알엔에이 바이러스의 감염성 클론과 이들로부터 유도된 백신 및 진단 분석 방법
CN109762792B (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合毒株及其应用
CN107190022B (zh) 一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法
CN111996174A (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法
CN107267532B (zh) PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用
CN110628817A (zh) 表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用
CN111662885A (zh) 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用
CN113061586A (zh) 表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒以及制备方法
CN111676247A (zh) 一株猪繁殖与呼吸综合征病毒1型分离株感染性克隆构建、拯救与应用
CN116463297A (zh) 一种表达鸡传染性贫血病病毒vp1蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法
CN117511888A (zh) 一种基于CRISPR-Cas9技术的表达鸡传染性贫血病病毒T1P6毒株VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法
CN110904055B (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株prrsv-sp及其制备方法与应用
CN110117579B (zh) 表达16型蓝舌病病毒vp2基因的重组病毒及其构建方法和应用
CN113736799B (zh) 山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用
CN115433741A (zh) 盖他病毒为载体表达报告蛋白的重组病毒的构建方法
CN113046329B (zh) 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56
CN116445528B (zh) 重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法及其感染性克隆和应用
CN114836392B (zh) 一种prrsv弱病毒及其制备方法和应用
CN118086229A (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征复制缺陷型病毒株、制备方法及应用
CN114606207B (zh) 一种不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株及其构建与应用
CN116426489A (zh) 一种基于CRISPR-Cas9技术的表达新型鹅星状病毒ORF2蛋白C端的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法
CN109609550B (zh) 一种鸭瘟病毒UL41基因无痕缺失株DPV CHv-ΔUL41及其构建方法
CN115612693A (zh) 一种表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组PRRSV载体、PRRS重组病毒及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant