KR102012109B1 - 이유 전 돼지 생식기 호흡기 증후군(prrs) 바이러스에 대한 효과적인 백신접종 - Google Patents

이유 전 돼지 생식기 호흡기 증후군(prrs) 바이러스에 대한 효과적인 백신접종 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 변형된 북미 PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 서열을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자, 상기 분자 및 관련된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 다양한 성분의 제조방법을 제공한다. 유전자 변형된 바이러스 및 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신 및 자연적으로 감염된 동물과 백신접종된 동물을 구별하는 진단 키트가 또한 제공된다.

Description

이유 전 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스에 대한 효과적인 백신접종{EFFECTIVE VACCINATION AGAINST PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME (PRRS) VIRUS PRIOR TO WEANING}
본 발명은 동물 건강분야에 관한 것이며, 양성 극성(positive polarity) RNA 바이러스, 신규한 RNA 바이러스 및 이들의 변형된 살아있는 형태의 감염성 cDNA 클론, 그리고 이러한 cDNA 클론을 사용하는 백신, 특히 돼지 백신의 구성에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 또한 항상 선택적으로 다가 조합 돼지 백신, 예컨대, 2가 PRRSV/마이코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 백신, 2가 PRRSV/돼지 써코바이러스 2형(Porcine Circovirus type 2: PCV2) 백신 및 3가 PRRSV/마이코플라스마 하이오뉴모니애/PCV2 백신, 또는 단순히 1가 PRRSV 백신과 병용하여, 출생 후 즉시(즉, 단지 1일령 이하)로부터 2주령까지를 포함하는 이유(weaning) 전의 새끼 돼지에게 안전하면서 조기의 백신접종을 제공한다. 이러한 조건 하에서 돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine reproductive and respiratory syndrome: PRRS)에 대한 조기 백신접종은 늦어도 백신접종 후 약 14일까지, 즉, 출생 제1일에 백신접종 후 제15일에, 출생 제7일에 백신접종 후 제21일에, 그리고 늦어도 출생 제14일에 백신접종 후 약 제28일에 생기는 방어 면역의 조기 개시를 제공한다. 본 명세서는 이러한 조기의 안전한 사용을 위한 것을 비롯하여 백신으로서 고도로 유효한 북미 PRRS 바이러스의 "P129 균주"의 수많은 구축물을 제공하지만(PCT/IB2011/055003 및 미국 특허 제6,500,662호 참조), 방어 면역의 이러한 조기 개시(즉, 출생 후 제1일에 일찌감치 제공된 면역화 백신접종 후 약 2주)는 또한, 미국 특허 제5,476,778호, 미국 특허 제5,846,805호, 미국 특허 제6,380,376호, 미국 특허 제6,982,160호 및 미국 특허 제6,197,310호에 기재된 것들과 같이, 다른 북미 및 유럽 PRRS 균주의 사용에 적용 가능한 것으로 밝혀졌다.
PRRS는 암퇘지 및 미경산 암퇘지에서의 유산, 사산, 및 다른 번식 문제뿐만 아니라 어린 돼지에서의 호흡기 질병을 특징으로 한다. 병인은 아테리비리대과(Arteriviridae) 및 니도비랄레스목(Nidovirales)의 일원인 PRRS 바이러스(PRRSV)이다. 니도바이러스는 단일 가닥의 양성 극성 RNA로 이루어진 게놈을 갖는 외막형 바이러스이다. 양성 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA는 유전적 정보의 저장과 발현 둘 다에서 이중적 역할을 충족시킨다. 어떠한 DNA도 니도바이러스에서의 복제 또는 전사에 관여하지 않는다. 비구조적 단백질은 거대 폴리단백질(polyprotein)로서 니도바이러스의 게놈 RNA로부터 직접 번역되고, 후속적으로 바이러스 프로테아제에 의해 분별력 있는 기능성 단백질로 절단된다. 서브게놈 RNA(subgenomic RNA: sgRNA)의 3'-공동 말단 내포 세트(coterminal nested set)는 게놈으로부터 합성되고, 구조적 단백질의 번역을 위한 메신저 RNA로서 사용된다. 따라서 니도바이러스 게놈 RNA의 번식은 게놈 복제 및 sgRNA 합성의 조합된 과정이다.
1980년대 후기에, 두 가지 별개의 유전자형의 바이러스가 하나는 북미에서 그리고 다른 하나는 유럽에서 거의 동시에 출현하였다. PRRS 바이러스는 거의 모든 돼지 생산국에서 현재 고질적이며, 전세계의 양돈 산업에 영향을 미치는 가장 경제적으로 중요한 질병인 것으로 여겨진다. 추가적으로, 고도로 악성인 유전자형은 중국 및 주변국가에서 단리되었고, 이러한 유전자형은 일반적으로 북미 유전자형에 관련된다.
PRRSV의 생물학의 이해에서의 상당한 진보에도 불구하고, 바이러스의 제어는 여전히 어렵다. 해당 분야에서 동물의 백신접종은 대체로 비효과적인 것으로 증명되었다. PRRS는 보통 면역화된 무리(herd)에서 재출현하며, 대부분의 농장 PRRSV 백신접종 캠페인은 궁극적으로 질병을 제어하지 못한다.
이론에 제한되는 일 없이, 야생형 PRRSV를 지니는 돼지의 감염 또는 이 병원균의 생 약독화 형태(live attenuated form)에 의한 이들의 백신접종은 불행하게도 단지 비중화 항체의 풍부한 생성을 유발하였다. 이 시간 간격 동안, 예를 들어, 단지 제한된 양의 인터페론(IFN)-γ(분비 세포)가 만들어진다. 따라서, PRRSV는 지속적으로 풍부한 체액성(항체 기반) 면역, 및 가변적이고 제한되지만 잠재적으로 보호성인 T 헬퍼(Th) 1-유사 IFN-γ 반응에 의해 구별되는 불균형 면역 반응을 본질적으로 자극하는 것으로 여겨진다. 적응 면역의 불균형 발생에 기여할 것 같은 PRRSV 감염의 한 가지 특징은 적절한 선천적 면역 반응의 결여이다. 보통, 바이러스 감염 세포는, 이웃하는 세포를 감염으로부터 보호하는 I형 인터페론 "IFN"(IFN-α 및 IFN-β를 포함)을 분비한다. 추가로, 방출된 I형 IFN은 미경험(
Figure 112017009324662-pat00001
) T 세포의 서브세트와 상호작용하여 바이러스-특이적 II형 IFN(IFN-γ) 분비 세포로의 그들의 전환을 촉진시킨다. 대조적으로, PRRSV 노출에 대한 돼지의 IFN-α 반응은 거의 존재하지 않는다. 병원균에 의한 IFN-α 생산의 이러한 비효율적인 자극은 숙주의 적응 면역 반응의 특성에 대해 상당한 영향을 미칠 것으로 예상되었는데, 그 이유는 IFN-α가 IFN-γ 유전자 발현을 상향조절하기 때문이다. 따라서, 전자의 사이토카인은 적응 면역의 발달, 즉, T 세포-매개 IFN-γ 반응 및 최대 항바이러스 면역 방어를 촉진시키는 주된 경로를 제어한다.
이와 관련하여, 바이러스 감염에서 선천적 면역과 적응 면역 간의 가능한 연관은, 다량의 I형 인터페론을 생산하는 능력을 가지고 또한 T 세포 기능의 분극화에서 중요한 역할을 하는 특별한 유형의 수지상 세포를 통해 일어난다는 것이 분명해졌다. 구체적으로는, 드물지만 주목할 만한 유형의 수지상 세포이면서도, 천연 IFN-α/β-생산 세포로서도 알려져 있는, 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cell: PDC)는, 미경험 T 세포를 IFN-γ 분비 세포로 분화시키게 하는 그의 능력에 의해 항바이러스 면역에서 중요한 역할을 한다. 드물지만, PDC는 IFN-α의 엄청나게 강력한 생산자이며, 각각의 세포는 바이러스에 반응하여 IFN-α를 3 내지 10pg 생산할 수 있다. 대조적으로, 단핵구는 세포 기준으로 5- 내지 10-배 더 적은 IFN-α를 생산한다. 돼지 PDC의 표현형 및 일부 생물학적 특성이 기재되어 있다(Summerfield et al., 2003, Immunology 110:440). 최근 연구는 PRRSV가 IFN-α를 분비하는데 돼지 PDC를 자극하지 않는다는 것을 밝혀냈다(Calzada et al., 2010, Veterinary Immunology and Immunopathology 135:20).
이 사실은, 백신접종 당시 외인성으로 첨가한 IFN-α가 PRRSV-특이적 IFN-γ 반응의 강도를 개선시키는 것으로 알려진(W.A. Meier et al., Vet. Immunol. Immunopath. 102, pp 299-314, 2004) 관찰과 결합하여, 이 바이러스에 의한 돼지의 감염 동안 IFN-α가 중요한 역할을 한다는 것을 강조하고 있다. 보호적 면역의 발달에 대한 IFN-α의 명백한 중요한 역할을 고려해 볼 때, IFN-α의 생산을 자극하고/하거나 저해하기 위해 상이한 PRRS 바이러스 저장액(stock)의 능력을 결정하는 것은 중요하다. 따라서, PRRS에 대해 보호하기 위한 새롭고 개선된 변형된 생백신에 대한 절실한 필요가 있다. 이하에 기재하는 바와 같이, 신규한 감염성 cDNA 클론으로부터 유래된 바이러스인 pCMV-S-P129-PK 등이 야생형 P129 바이러스 또는 두 가지의 상업적으로 입수가능한 변형된 생 PRRS 백신 중 하나와는 상이한 표현형을 가진다는 것은 명확하다. 이론에 대하여 제한되는 일 없이, 본 발명은, 바이러스에 대한 세포 기반 면역 반응을 용이하게 하고 PRRS 백신의 새롭고 효과적인 생성을 규정하는 백신을 제공한다.
제1 실시형태에서, 본 발명은, 백신으로서, 돼지 동물에서 PRRS 바이러스에 대해 효과적인 면역보호 반응을 유발하도록 유전자 변형된 PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 혹은 서열번호 6, 또는 이들에 대해 적어도 70% 동일성, 바람직하게는 이들에 대해 80% 동일성, 더 바람직하게는 이들에 대해 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 본 명세서에 제시된 DNA 서열을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본 명세서에 제시된 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자와 적합한 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드 분자를 전사시킬 수 있는 프로모터를 포함하는 플라스미드를 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서의 플라스미드 서열을 암호화하는 북미 또는 중국 PRRS는 하나 이상의 검출가능한 이종성 항원 에피토프를 추가로 암호화한다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 플라스미드를 포함하는 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 동물을 보호하기 위한 백신을 제공한다. 백신은 감염성 RNA 분자에 의해 암호화된 북미 또는 중국 PRRS 바이러스를 포함할 수 있되, 상기 감염성 RNA 분자, 또는 플라스미드의 각각은 본 명세서에 제시한 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 암호화된다. 또 다른 양태에서, 백신은 본 명세서의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다. 본 명세서에 제시된 백신은 선택적으로 수의과적 용도에 허용가능한 백신 담체를 포함할 수 있다. 하나의 중요한 양태에서, 백신은 야생형 P129 PRRS 바이러스에 비해 감소된 인터페론-α 저해 효과를 가진다(ATCC 203488, 203489, 미국 특허 제6,500,662호 참조).
일 실시형태에서, 본 발명은 PRRS 바이러스의 야외 균주로 자연적으로 감염된 돼지 동물과 본 명세서에 제시된 변형된 생백신으로 백신접종된 돼지 동물을 구별하는(소위 DIVA 테스트) 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 진단 키트를 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 제시된 특허청구범위의 백신의 면역원적 보호량을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, PRRS 바이러스의 균주에 의한 감염으로부터 돼지 동물을 보호하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가적이고 바람직한 실시형태는 단리된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRS), 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 여기서, ORF1a에 의해 암호화된 단백질은 다음의 아미노산 서열 중 임의의 것을 함유하는 것들로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이하의 서열에서 밑줄친 잔기는 신규한 것으로 여겨진다: AMANVYD(서열번호 9); IGHNAVM(서열번호 12); TVPDGNC(서열번호 15); CWWYLFD(서열번호 18); HGVHGKY(서열번호 21); AAKVDQY(서열번호 24); PSATDTS(서열번호 27); LNSLLSK(서열번호 30); APMCQDE(서열번호 33); CAPTGMD(서열번호 36); PKVAKVS(서열번호 39); AGEIVGV(서열번호 42); ADFNPEK(서열번호 45); 및 QTPILGR(서열번호 48). 본 발명의 추가로 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 이들 확인된 서열 중 임의의 조합(2, 3, 4… 17까지)을 비롯하여, ORF1a로부터 암호화된 단백질 내에서 상기 확인된 서열 중 임의의 서열을 함유하는 북미 또는 중국 PRRS를 제공한다.
본 발명은 단리된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRS)를 추가로 제공하되, 여기서, ORF1a의 의해 암호화된 그의 단백질은, ANV(서열번호 9 참조); HNA(서열번호 12 참조); PDG(서열번호 15 참조); WYL(서열번호 18 참조); VHG(서열번호 21 참조); KVD(서열번호 24 참조); ATD(서열번호 27 참조); SLL(서열번호 30 참조); MCQ(서열번호 33 참조); PTG(서열번호 36 참조); VAK(서열번호 39 참조); EIV(서열번호 42 참조); FNP(서열번호 45 참조); 및 PIL(서열번호 48 참조) 중 임의의 것(이들 확인된 서열의 임의의 조합(2, 3, 4… 17까지)을 포함)을 함유하는, 해당 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가로 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 단리된 북미 또는 중국 PRRS를 제공하되, 여기서, 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그로부터 암호화된 단백질에서의 임의의 지점에서 임의의 다른 특정 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 위치의 동일성과는 관계없이, ORF1a 바이러스 단백질은 하기를 함유한다:
(a) 하기 명시된 서열의 구체적 아미노산 중 임의의 것,
아미노산 서열 ANV 내의 아미노산 N(서열번호 9 참조);
아미노산 서열 HNA 내의 아미노산 N(서열번호 12 참조);
아미노산 서열 PDG 내의 아미노산 D(서열번호 15 참조);
아미노산 서열 WYL 내의 아미노산 Y(서열번호 18 참조);
아미노산 서열 VHG 내의 아미노산 H(서열번호 21 참조);
아미노산 서열 KVD 내의 아미노산 V(서열번호 24 참조);
아미노산 서열 ATD 내의 아미노산 T(서열번호 27 참조);
아미노산 서열 SLL 내의 아미노산 L(서열번호 30 참조);
아미노산 서열 MCQ 내의 아미노산 C(서열번호 33 참조);
아미노산 서열 PTG 내의 아미노산 T(서열번호 36 참조);
아미노산 서열 VAK 내의 아미노산 A(서열번호 39 참조);
아미노산 서열 EIV 내의 아미노산 I(서열번호 42 참조);
아미노산 서열 FNP 내의 아미노산 N(서열번호 45 참조); 및
아미노산 서열 PIL 내의 아미노산 I(서열번호 48)를 함유하고, 이들 확인된 서열의 임의의 조합(2, 3, 4… 17까지)을 포함하거나, 또는
(b) 위에서 명시된 바와 같은 3-잔기 서열에 대응하는 임의의 다른 북미 또는 중국 PRRS 바이러스의 명시된 3-잔기 ORF1a 펩타이드 서열에서 상기 구체적인 밑줄친 단일 아미노산을 함유하며, 상기 다른 구체적 3-잔기 아미노산 서열은 1 또는 2개의 추가적인 아미노산 서열 변화를 나타낼 수 있지만, 위에서 명시된 서열에 대응하는 것으로서 여전히 인식될 수 있다는 것을 고려한다. 본 발명의 이 실시형태의 목적을 위해, "대응하는"은 상대적 서열이 문헌[Henikoff et al. Proc Natl. Acad. Sci., USA, 89, pp. 10915-10919, 1992]에 기재된 바와 같은 블로섬(BLOSUM) 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시형태에서, 단리된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRS)가 제공되되, 여기서, ORF1a에 의해 암호화된 그의 단백질은 하기 변이(variation) (a), (b), (c) 및 (d) 중 하나 이상을 함유하는 아미노산 서열을 가지고, 각각의 상기 변이는 다음과 같이 정의된다:
변이 (a),
아미노산 서열 ANV 내의 아미노산 N(서열번호 9 참조);
아미노산 서열 HNA 내의 아미노산 N(서열번호 12 참조);
아미노산 서열 PDG 내의 아미노산 D(서열번호 15 참조);
아미노산 서열 WYL 내의 아미노산 Y(서열번호 18 참조);
아미노산 서열 VHG 내의 아미노산 H(서열번호 21 참조), 또는 변이 (a)의 임의의 서브세트;
변이 (b),
아미노산 서열 KVD 내의 아미노산 V(서열번호 24 참조);
아미노산 서열 ATD 내의 아미노산 T(서열번호 27 참조);
아미노산 서열 SLL 내의 아미노산 L(서열번호 30 참조);
아미노산 서열 MCQ 내의 아미노산 C(서열번호 33 참조), 또는 변이 (b)의 임의의 서브세트;
변이 (c),
아미노산 서열 PTG 내의 아미노산 T(서열번호 36 참조);
아미노산 서열 VAK 내의 아미노산 A(서열번호 39 참조), 또는 변이 (c)의 임의의 서브세트; 및
변이 (d),
아미노산 서열 EIV 내의 아미노산 I(서열번호 42 참조);
아미노산 서열 FNP 내의 아미노산 N(서열번호 45 참조);
아미노산 서열 PIL 내의 아미노산 I(서열번호 20 참조), 또는 이들의 변이 (d)의 임의의 서브세트.
이러한 PRRS 바이러스는 변이 (a)에서 확인된 5개의 아미노산 서열 중 2개 이상, 및/또는 변이 (b)에서 확인된 4개의 아미노산 서열 중 2개 이상, 및/또는 변이 (c)에서 확인된 2개의 아미노산 서열, 및/또는 변이 (d)에서 확인된 3개의 아미노산 서열 중 2개 이상을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명은 또한, 적합한 숙주 세포를 직접적으로 형질감염시키고, 이렇게 형질감염된 적합한 숙주 세포로부터 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRS)를 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제공하되, 이때의 플라스미드는 (a) PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열, 및 (b) 상기 감염성 RNA 분자를 전사시킬 수 있는 프로모터를 포함하며, 여기서 상기 바이러스의 ORF1a에 의해 암호화된 단백질은 하기를 함유하는 아미노산 서열을 가진다:
(1) 아미노산 서열 ANV 내의 아미노산 N(서열번호 9 참조);
아미노산 서열 HNA 내의 아미노산 N(서열번호 12 참조);
아미노산 서열 PDG 내의 아미노산 D(서열번호 15 참조);
아미노산 서열 WYL 내의 아미노산 Y(서열번호 18 참조);
아미노산 서열 VHG 내의 아미노산 H(서열번호 21 참조), 또는 이들의 임의의 서브세트; 및/또는
(2) 아미노산 서열 KVD 내의 아미노산 V(서열번호 24 참조);
아미노산 서열 ATD 내의 아미노산 T(서열번호 27 참조);
아미노산 서열 SLL 내의 아미노산 L(서열번호 30 참조);
아미노산 서열 MCQ 내의 아미노산 C(서열번호 33 참조), 또는 이들의 임의의 서브세트;
(3) 아미노산 서열 PTG 내의 아미노산 T(서열번호 36 참조);
아미노산 서열 VAK 내의 아미노산 A(서열번호 39 참조), 또는 이들의 임의의 서브세트; 및/또는
(4) 아미노산 서열 EIV 내의 아미노산 I(서열번호 42 참조);
아미노산 서열 FNP 내의 아미노산 N(서열번호 45 참조);
아미노산 서열 PIL 내의 아미노산 I(서열번호 48 참조), 또는 이들의 임의의 서브세트.
ORF1a는 프로테아제 기능을 포함하는 폴리단백질을 암호화하고, ORF1b는 레플리카제(RNA 폴리머라제) 기능과 헬리카제 기능을 포함하는 폴리단백질을 암호화하는 것으로 인식될 것이다. PRRS의 다양한 ORF(오픈 리딩 프레임(open reading frame))로부터 암호화된 단백질에 대한 기능에 관한 추가적인 정보는, 예를 들어, 미국 특허 제7,132,106호에서 찾을 수 있다. 또한 ORF7 및 다른 오픈 리딩 프레임의 기능에 관해서는 미국 특허 제7,544,362호를 참조한다. 당업계에 인식되는 바와 같이, ORF1-암호화된 단백질은 기지의 및 미지의 추가적인 기능을 가질 것으로 예상되며, 본 발명의 실시에 유용한 신규한 아미노산 변화는 ORF1-암호화된 단백질의 임의의 하나의 특정 기능에 대한 그의 효과를 통해서 제한되지 않는다.
추가 바람직한 실시형태에서, 상기 플라스미드는 표적화된 진핵 세포에서 DNA 개시를 가능하게 하는 진핵 프로모터, 또는 플라스미드의 시험관내 전사를 지시할 수 있는 원핵 또는 파지 프로모터인 프로모터를 함유한다. 본 발명은 마찬가지로 PRRS 바이러스를 생성하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 적합한 숙주 세포를 적절한 플라스미드로 형질감염시키는 단계 및 형질감염된 세포에 의해 생성된 PRRS 바이러스를 얻는 단계를 포함한다.
따라서, 구체적인 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 북미 PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공하되, 상기 DNA 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 서열번호 6;
(b) (a)의 DNA 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열(여기서, 그의 ORF1a에 의해 암호화된 단백질은,
(b)(1)군
아미노산 서열 ANV 내의 아미노산 N(서열번호 9 참조);
아미노산 서열 HNA 내의 아미노산 N(서열번호 12 참조);
아미노산 서열 PDG 내의 아미노산 D(서열번호 15 참조);
아미노산 서열 WYL 내의 아미노산 Y(서열번호 18 참조);
아미노산 서열 VHG 내의 아미노산 H(서열번호 21 참조), 또는 이들의 임의의 서브세트; 및/또는
(b)(2)군
아미노산 서열 KVD 내의 아미노산 V(서열번호 24 참조);
아미노산 서열 ATD 내의 아미노산 T(서열번호 27 참조);
아미노산 서열 SLL 내의 아미노산 L(서열번호 30 참조);
아미노산 서열 MCQ 내의 아미노산 C(서열번호 33 참조), 또는 이들의 임의의 서브세트;
(b)(3)군
아미노산 서열 PTG 내의 아미노산 T(서열번호 36 참조);
아미노산 서열 VAK 내의 아미노산 A(서열번호 39 참조), 또는 이들의 임의의 서브세트; 및/또는
(b)(4)군
아미노산 서열 EIV 내의 아미노산 I(서열번호 42 참조);
아미노산 서열 FNP 내의 아미노산 N(서열번호 45 참조);
아미노산 서열 PIL 내의 아미노산 I(서열번호 20 참조), 또는 이들의 임의의 서브세트를 함유하는 아미노산 서열을 지님); 및
(c) 65℃에서 0.5M NaHPO4, 7% SDS, 1mM EDTA 중에서의 필터 결합된 DNA에 대한 혼성화와, 68℃에서 0.1x SSC/0.1% SDS 중에서의 세척을 포함하는 고도로 엄격한 조건 하에서, (a) 또는 (b)의 DNA 서열의 보체에 혼성화되는 DNA 서열.
본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 형질감염된 숙주 세포를 제공하고, PRRS 바이러스에 의한 감염에 대해 돼지 동물을 보호하기 위한 백신을 제공하며, 이때의 백신은, 감염에 대한 면역보호를 야기시키는데 유효한 양의, (a) 이러한 상기한 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 암호화된 유전자 변형된 북미 PRRS 바이러스, 또는 (b) 상기 감염성 분자, 또는 (c) 플라스미드 형태의 상기 폴리뉴클레오타이드 분자, 또는 (d) 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 바이러스 벡터, 및 수의과적 용도에 적합한 담체를 포함하되, 여기서 PRRS 바이러스는 PRRS 바이러스에 의한 감염에 대해 유효한 면역보호적 반응을 유발할 수 있다.
본 발명은 또한 하기에 대응하는 (즉, 상보적 염기 암호 서열을 가짐으로써) RNA 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다:
(a) 서열번호 6의 DNA 서열;
(b) (a)의 DNA 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 DNA 서열(여기서 그의 ORF1a에 의해 암호화된 단백질은 이하의 것들 중 임의의 하나, 및 이하의 것들 중 어느 것의 임의의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 가진다:
아미노산 서열 ANV 내의 아미노산 N(서열번호 9 참조);
아미노산 서열 HNA 내의 아미노산 N(서열번호 12 참조);
아미노산 서열 PDG 내의 아미노산 D(서열번호 15 참조);
아미노산 서열 WYL 내의 아미노산 Y(서열번호 18 참조);
아미노산 서열 VHG 내의 아미노산 H(서열번호 21 참조);
아미노산 서열 KVD 내의 아미노산 V(서열번호 24 참조);
아미노산 서열 ATD 내의 아미노산 T(서열번호 27 참조);
아미노산 서열 SLL 내의 아미노산 L(서열번호 30 참조);
아미노산 서열 MCQ 내의 아미노산 C(서열번호 33 참조);
아미노산 서열 PTG 내의 아미노산 T(서열번호 36 참조);
아미노산 서열 VAK 내의 아미노산 A(서열번호 39 참조);
아미노산 서열 EIV 내의 아미노산 I(서열번호 42 참조);
아미노산 서열 FNP 내의 아미노산 N(서열번호 45 참조);
아미노산 서열 PIL 내의 아미노산 I(서열번호 20 참조)), 또는
(c) 65℃에서 0.5M NaHPO4, 7% SDS, 1mM EDTA 중에서의 필터 결합된 DNA에 대한 혼성화와, 68℃에서 0.1x SSC/0.1% SDS 중에서의 세척을 포함하는 고도로 엄격한 조건 하에서 (a) 또는 (b)의 DNA 서열의 보체에 혼성화되는 DNA 서열.
따라서, 본 발명은 또한 PRRS 바이러스의 야외 균주에 의해 자연적으로 감염된 돼지 동물과 본 발명의 백신에 의해 백신접종된 돼지 동물을 구별하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 진단 키트를 제공하되, 이때의 백신(바이러스)은 바람직하게는 야생형 P129 PRRS 바이러스(서열번호 5)에 비해 감소된 인터페론-α 저해 효과를 입증한다.
표의 간단한 설명
표 1은 감염성 cDNA 클론 및 PK-9 세포 내로의 형질감염에 의해 유래된 대응하는 바이러스를 나타낸다.
표 2는 세포 배양물에서 성장에 적합한 야생형 PRRS 바이러스 및 유도체의 인터페론-α 저해 효과를 나타낸다.
표 3은 CD163-발현 PK-9 세포에서 성장에 적합한 야생형 PRRS 바이러스 P129 및 그의 유전적으로 조작된 유도체의 인터페론-α 저해 효과를 기술한다.
표 4는 야생형 P129 바이러스 및 PRRS 인겔백(Ingelvac) 백신과 비교하여 P129-PK-FL 바이러스 및 P129-PK-d43/44 바이러스의 감소된 인터페론-α 저해 효과를 나타낸다.
표 5는 백신 바이러스의 안전성 및 효능을 평가하기 위해 수행한 연구 설계를 묘사한다.
표 6은 P129 계대 0과 P129-PK-FL 계대 17 간의, 게놈 위치에 의한, 모든 뉴클레오타이드 차이 및 얻어진 아미노산 차이를 나타낸다.
표 7은 P129 계대 0과 P129-PK-FL 계대 17 간의, 바이러스 단백질에 의한, 뉴클레오타이드 및 아미노산 차이의 요약을 나타낸다.
표 8은 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129 및 pCMV-S-P129-PK17-FL에서 발견되는 PRRSV 게놈들 간의, 게놈 위치에 의한, 모든 뉴클레오타이드 차이 및 얻어진 아미노산 차이를 나타낸다.
표 9 및 표 10은 계대 52 바이러스(서열번호 6)의 표현형에 기여하는 아미노산 차이를 나타낸다.
표 11은 변형된 생 PRRSV 백신으로 1일령에 백신접종 후의 임상적 징후를 지니는 돼지의 수를 나타낸다.
표 12는 변형된 생 PRRSV 백신으로 1일령에 백신접종 후의 혈청 평균 역가를 나타낸다.
표 13은 변형된 생 PRRSV 백신으로 1일령에 미리 백신접종한 7주령 돼지의 시험감염(challenge) 후 폐 병변%를 나타낸다.
표 14는 변형된 생 PRRSV 백신으로 1일령에 미리 백신접종한 18주령 돼지의 시험감염 후 폐 병변%를 나타낸다.
표 15는 변형된 생 PRRSV 백신으로 1일령에 미리 백신접종한 26주령 돼지의 시험감염 후 폐 병변%를 나타낸다.
표 16은 변형된 생 PRRSV 백신으로 미리 백신접종한 5주령 돼지의 시험감염 후 폐 병변%를 나타낸다.
도 1은 백신접종 후의 직장 온도를 도시한 도면이다.
도 2는 악성 PRRSV NADC20으로 시험감염 후의 직장 온도를 도시한 도면이다.
도 3은 백신접종 후 및 시험감염 후의 체중을 도시한 도면이다.
도 4는 PRRS 병변을 지니는 폐의 백분율에 대한 시험감염 후의 데이터를 도시한 도면이다.
도 5는 관찰된 병변의 중증도에 대한 시험감염 후의 폐 평가 스코어(lung assessment score: LAS)를 도시한 도면이다.
도 6은 백신접종 후 및 시험감염 후의 혈청 내 항-PRRSV 항체 수준(ELISA S/P 비)을 도시한 히스토그램을 도시한 도면이다.
도 7은 혈청 중에 장입된 바이러스 시험감염 후의 그래프 도식이다(PAM 세포에 대한 로그 TCID50/㎖).
도 8은 본 명세서에 개시한 바와 같은 서열번호 1 내지 서열번호 6을 포함하는 백신을 얻기 위해 사용한 방법의 그림 표현도이다.
주된 서열의 간단한 설명
서열번호 1은 P129-PK-FL 계대 17 완전 게놈을 제공한다.
서열번호 2는 P129-PK-d43/44 계대 17 완전 게놈을 제공한다.
서열번호 3은 P129-PK-FL 계대 24 완전 게놈을 제공한다.
서열번호 4는 P129-PK-d43/44 계대 34 완전 게놈을 제공한다.
서열번호 5는 P129 계대 0 완전 게놈을 제공한다.
서열번호 6은 P129 계대 52 완전 게놈을 제공한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수의 형태는 문맥에서 달리 명확하게 기술되지 않는다면, 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본 개시내용 등을 읽을 때 당해 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자(이하, "당업자"라고도 약칭함)에게 명백하게 될 본 명세서에 기재된 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동일한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기술된다.
본 발명의 실시는, 이에 반하여 구체적으로 표시되지 않는 한, 기술분야 내에서 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기법의 통상적인 방법을 사용할 것이고, 이들 다수는 예시의 목적을 위해 이하에 기술된다. 이러한 기법은 문헌에서 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)] 참조.
"북미 PRRS 바이러스"란 북미 PRRS 바이러스 단리물과 관련된 유전적 특징을 갖는 임의의 PRRS 바이러스를 의미하며, 예컨대, 대략 1990년대 초에 미국에서 처음 단리된 PRRS 바이러스(예를 들어, 문헌[Collins, J. E., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4:117-126] 참조); 북미 PRRS 바이러스 단리물 MN-1b(Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6:293-296); PRRS의 퀘벡 LAF-exp91 균주(Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140:1405-1418); 및 북미 PRRS 바이러스 단리물 VR 2385(Meng, X.-J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 유전적 특징은 북미 PRRS 바이러스 균주에 의해 공유되는 게놈 뉴클레오타이드 서열 유사성 및 아미노산 서열 유사성을 지칭한다. 중국 PRRS 바이러스 균주는 일반적으로 북미 바이러스 균주와 약 80 내지 93% 뉴클레오타이드 서열 유사성을 입증한다.
"유럽 PRRS 바이러스"는 1991년 즈음에 유럽에서 처음 단리된 PRRS 바이러스와 관련된 유전적 특징을 갖는 PRRS 바이러스의 임의의 균주를 지칭한다(예를 들어, 문헌[Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13:121-130] 참조). "유럽 PRRS 바이러스"는 또한 때때로 당업계에서 "렐리스타트 바이러스"(Lelystad virus)로서 지칭된다.
본 발명의 목적을 위해 "유효한 면역보호적 반응", "면역보호" 등은 백신접종된 동물에서 병원균에 의한 감염에 대해 보호하기 위한 병원균의 하나 이상의 항원성 에피토프에 관련된 면역 반응을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 병원균에 의한 감염에 대한 보호는 감염의 절대적 예방뿐만 아니라, 병원균에 의한 감염 정도 또는 감염 속도에서의 임의의 검출가능한 감소, 또는 백신접종되지 않은 감염 동물에 비해 백신접종된 동물에서 병원균에 의한 감염으로부터 초래된 질병의 중증도 또는 임의의 증상 또는 병태에서의 임의의 검출가능한 감소를 포함한다. 유효한 면역보호 반응은 병원균으로 미리 감염되지 않고/않거나 백신접종 시 병원균으로 감염되지 않는 동물에서 유발될 수 있다. 유효한 면역보호 반응은 또한 백신접종 시 병원균으로 이미 감염된 동물에서 유발될 수 있다.
유전자 변형된 PRRS 바이러스는 그의 비변형 모 균주보다 덜 악성이라면, "약독화"된다. 균주는 질병 중증도를 결정하는 하나 이상의 파라미터에서 통계적으로 유의한 감소를 나타낸다면 "덜 악성"이다. 이러한 파라미터는 바이러스 혈증 수준, 발열, 호흡곤란의 중증도, 생식기 증후군의 중증도, 또는 폐 병변의 수 또는 중증도 등을 포함할 수 있다.
"PRRS 바이러스 복제를 지원할 수 있는 숙주 세포"는 본 발명의 바이러스로 감염될 때 감염성 PRRS를 발생시킬 수 있는 세포를 의미한다. 이러한 세포는 단핵구/대식세포 계통의 돼지 세포, 예컨대, 돼지 폐포 대식세포 및 유도체, MA-104 원숭이 신장 세포 및 유도체, 예컨대, MARC-145 세포, 및 PRRS 바이러스에 대한 수용체로 형질감염된 세포를 포함한다. 용어 "PRRS 바이러스 복제를 지원할 수 있는 숙주 세포"는 또한 살아있는 돼지 내에서 세포를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "오픈 리딩 프레임" 또는 "ORF"는 개재된 정지 코돈 없이 특정 PRRS 바이러스 단백질을 암호화하는데 필요한 최소 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
"돼지(Porcine)" 및 "돼지(swine)"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어, 돼지(pig) 등과 같은 돼지과(Suidae)의 일원인 동물이면 어떠한 것이라도 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "PRRS 바이러스"는, 달리 표시되지 않는 한, 북미 또는 유럽 PRRS 바이러스 중의 임의의 균주를 의미한다.
"PRRS"는 PRRS 바이러스 감염에 의해 야기된 돼지에서의 질병 증상을 포함한다. 이러한 증상의 예는 발열, 임신한 암컷에서의 유산, 호흡곤란, 폐 병변, 식욕 상실 및 어린 돼지의 사망을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용하는 바와 같이, "PRRS를 생산할 수 없는" PRRS 바이러스는, 돼지를 감염시킬 수 있지만 돼지에서 PRRS 감염과 정상적으로 관련된 어떠한 질병 증상도 일으키지 않는 바이러스를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 PRRSV "N 단백질" 또는 "ORF7"은 유럽 및 북미 유전자형 PRRS 바이러스 둘 다의 ORF7에 의해 암호화된 폴리펩타이드로서 정의된다. 현재 알려진 N 단백질의 구체적 아이소타입의 예는 수탁번호 PRU87392에 의해 젠뱅크(Genbank)에 의해 보고된 북미 PRRS 프로토타입 단리물 VR2322의 123 아미노산 폴리펩타이드 및 젠뱅크 수탁번호 A26843으로 보고된 유럽 프로토타입 PRRS 단리물 렐리스타트의 128 잔기 N 단백질이다.
"PRRSV N 단백질 NLS-1 영역" 또는 "PRRSV ORF7 NLS-1 영역"은, 성숙 N 단백질의 처음 15개의 N-말단 잔기 내에 위치된, 4개의 연속적 염기성 아미노산(리신 또는 알기닌), 또는 3개의 염기성 잔기 및 히스티딘 또는 프롤린을 함유하는 "pat4" 또는 "nuc1" 핵 편재화 신호(Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003)를 지칭한다. 예로서, VR2332 NLS-1 영역 서열은 KRKK이고, 잔기 9 내지 12에 위치되는 한편, 렐리스타트 단리물 서열은 KKKK이고, N 단백질의 잔기 10 내지 13에 위치된다.
"PRRSV N 단백질 NLS-2 영역" 또는 "PRRSV ORF7 NLS-2 영역"은 2개의 형태 중 하나를 취할 수 있는 N 단백질 내의 제2 핵 편재화 신호를 지칭한다. 북미 PRRS 바이러스에서, NLS-2는 본 발명자들이 "pat8" 모티프로서 지정한 패턴을 가지는데, 이는 3개의 잔기 내에 프롤린으로 시작해서 5개의 잔기 서열(5개 중 적어도 3개의 염기성 잔기(K 또는 R)를 함유함) 내에서 이어진다(문헌[Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003]에 의해 기재된 "pat7" 또는 "nuc2" 모티프의 약간의 변형). 예로서, 이러한 서열은 북미 PRRSV 단리물 VR2332의 N 단백질 잔기 41 내지 47에 위치되고, 서열 P…K로 표시한다. 유럽 PRRS 바이러스에서, NLS-2는 히스티딘 또는 프롤린과 관련된 4개의 염기성 아미노산 또는 3개의 염기성 잔기의 연속적 신장인 "pat4" 또는 "nuc1" 모티프를 가진다(Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003). 유럽 PRRSV 단리물 렐리스타트의 NLS-2는 잔기 47 내지 50에 위치되며, 서열 K..K로 표시된다.
"PRRSV N 단백질 NoLS 영역" 또는 "PRRSV ORF7 NoLS 영역"은 전체 길이가 약 32개의 아미노산이고, 그의 아미노 말단 근처에서 NLS-2 영역을 포함하는 핵소체(nucleolar) 편재화 신호를 지칭한다. 예로서, VR2332 NoLS 영역 서열은 잔기 41 내지 72에 위치되고, 서열 P…R로 표시되며(Rowland & Yoo, 2003), 대응하는 렐리스타트 단리물 서열은 잔기 42 내지 73에 위치되고, 서열 P..R로 표시된다.
"형질감염된 숙주 세포"는, 사실상 미국 특허 제5,600,662호에 기재된 바와 같이, PRRS 바이러스 RNA로 형질감염되었을 때 PRRS 비리온의 적어도 제1 라운드를 야기시킬 수 있는 숙주 세포라면 어떠한 것이라도 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, "감염성 DNA 분자"는 적합한 숙주 세포로부터 기능성 비리온으로 복제, 전사 및 번역을 지원하는데 필수적인 구성요소를 암호화하는 DNA 분자이다.
마찬가지로, "단리된 폴리뉴클레오타이드 분자"는, 만약에 있다면, 그의 자연적으로 생기는 상태로부터 임의의 검출가능한 정도로 정제된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 물질의 조성물을 지칭한다.
본 발명의 목적을 위해, 제2 폴리뉴클레오타이드 분자(RNA 또는 DNA 중 하나)의 뉴클레오타이드 서열은, 제2 폴리뉴클레오타이드 분자의 뉴클레오타이드 서열이 유전적 암호의 축퇴에 기반한 바와 같이 제1 폴리뉴클레오타이드 분자의 뉴클레오타이드 서열과 동일한 폴리아미노산을 암호화하는 경우, 또는 그것이 본 발명을 실행하는데 유용하도록 제1 폴리뉴클레오타이드 분자의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리아미노산과 충분히 유사한 폴리아미노산을 암호화하는 경우에, 제1 폴리뉴클레오타이드 분자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 "상동성"이거나, 또는 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 분자에 대해 "동일성"을 가진다. 상동성 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 센스 및 안티센스 가닥을 지칭하며, 모든 경우에, 임의의 이러한 가닥의 보체를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 폴리뉴클레오타이드 분자는 본 발명을 실행하는데 유용하며, 따라서, 예를 들어, 표준 혼성화 또는 증폭 기법에 의해, 감염된 돼지의 유체 또는 조직 샘플에서 PRRS 바이러스 또는 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하기 위한 진단 프로브로서 사용될 수 있는 경우, 상동성이거나 또는 동일성을 가진다. 일반적으로, 제2 폴리뉴클레오타이드 분자의 뉴클레오타이드 서열은, BLASTN 알고리즘을 기반으로 하여 제1 폴리뉴클레오타이드 분자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 약 70% 뉴클레오타이드 서열 동일성을 가진다면, 제1 폴리뉴클레오타이드 분자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 상동성이다(미국 국립보건원의 미국 국립생물공학정보센터, 다르게는 NCBI로서 알려짐(미국 메릴랜드주 베데스다에 소재)). 본 발명의 실시에 따른 계산을 위한 구체적 예에서, BLASTP 2.2.6이 언급될 수 있다[Tatusova TA and TL Madden, "BLAST 2 sequences- a new tool for comparing protein and nucleotide sequences." (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250.]. 간략하게는, 두 아미노산 서열은 갭 오프닝 페널티 10, 갭 익스텐션 페널티 0.1, 그리고 헤니코프(Henikoff)의 스코어링 매트릭스 "blosum62"를 사용하여 정렬 스코어를 최적화하도록 정렬된다(Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:10915 10919. 1992). 다음에 동일성%는, 동일한 매칭의 전체 수 × 100/(더 긴 서열의 길이 + 두 서열을 정렬시키기 위해 더 긴 서열 내로 도입된 갭의 수)로서 계산된다.
바람직하게는, 상동성 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 75%의 뉴클레오타이드 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오타이드 서열 동일성을 가진다. 유전적 암호는 축퇴되기 때문에, 상동성 뉴클레오타이드 서열은, 동일한 아미노산을 암호화함에도 불구하고, 많은 "침묵" 염기 변화, 즉, 뉴클레오타이드 치환을 포함한다.
서열이 제1 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리아미노산에 대해 적어도 약 70% 동일하게 남아있거나 또는 다르게는 본 발명을 실행하는데 유용하다면, 상동성 뉴클레오타이드 서열은 비침묵 돌연변이, 즉, 암호화된 폴리아미노산에서 아미노산 차이를 야기하는 염기 치환, 결실 또는 부가를 추가로 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 전반적인 단백질 기능을 불활성화하지 않는 것으로 일반적으로 인식되는 특정 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다; 예컨대, 양으로 하전된 아미노산(반대의 경우도 같음)에 관하여, 라이신, 알기닌 및 히스티딘; 음으로 하전된 아미노산(반대의 경우도 같음)에 관하여, 아스팔트산 및 글루탐산; 및 중성으로 하전된 아미노산(및 모든 경우에, 또한 반대의 경우도 같음)의 특정 군에 관하여, (1) 알라닌 및 세린, (2) 아스파라긴, 글루타민, 및 히스티딘, (3) 시스테인 및 세린, (4) 글라이신 및 프롤린, (5) 아이소류신, 류신 및 발린, (6) 메티오닌, 류신 및 아이소류신, (7) 페닐알라닌, 메티오닌, 류신 및 티로신, (8) 세린 및 트레오닌, (9) 트립토판 및 티로신, (10) 및 예를 들어, 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌. 아미노산은 2차 및 3차 단백질 구조에 대한 기여와 물성에 따라 분류될 수 있다. 보존적 치환은, 하나의 아미노산의, 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로의 치환으로서 당업계에서 인식된다. 예시적인 보존적 치환은 1997년 3월 13일 공개된 WO 97/09433(PCT/GB96/02197, 출원일: 1996년 9월 6일)의 10페이지에서 찾을 수 있다. 대안적으로, 보존적 아미노산은 레닌저(Lehninger)의 문헌(Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp. 71-77)에 기재된 바와 같이 그룹화될 수 있다. 추가적인 적합한 보존적 변화 및 이의 적용은 이하에 기술된다.
상동성 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열의 비교에 의해, 예를 들어, 상기 BLASTN을 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 상동성 뉴클레오타이드 서열은 선택된 조건 하에서 혼성화에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 제2 폴리뉴클레오타이드 분자의 뉴클레오타이드 서열은, 중간 정도의 엄격한 조건, 예를 들어, 65℃에서 0.5M NaHPO4, 7% 도데실 황산나트륨(SDS), 1mM EDTA 중에서의 필터-결합된 DNA에 대한 혼성화, 및 42℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS 중에서의 세척(문헌[Ausubel et al editors, Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1994, pp. 6.0.3 내지 6.4.10] 참조), 또는 다르게는 이하에 규정된 바와 같이 PRRS 바이러스를 암호화하는 서열의 혼성화를 야기할 조건 하에서 서열번호 1의 보체에 대해 혼성화된다면, 서열번호 1(또는 임의의 다른 특정 폴리뉴클레오타이드 서열)에 대해 상동성이다. 혼성화 조건에서의 변형은 경험적으로 결정될 수 있거나 또는 프로브의 구아노신/사이토신(GC) 염기 짝짓기의 백분율과 길이에 기초하여 정확하게 계산될 수 있다. 혼성화 조건은 문헌[Sambrook, et al., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47 내지 9.51]에 기재된 바와 같이 계산될 수 있다.
다른 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은, 당업계에 공지된 바와 같이(Ausebel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1989), 고도로 엄격한 조건, 예를 들어, 65℃에서 0.5M NaHPO4, 7% SDS, 1mM EDTA 중에서의 필터-결합된 DNA에 대한 혼성화 및 68℃에서 0.1x SSC/0.1% SDS 중에서의 세척 하에서 서열번호 1의 보체에 대해 혼성화된다면, 서열번호 1(또는 본 발명의 임의의 다른 서열)에 대해 상동성이다.
더 나아가 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자 및 단리된 RNA 분자는 재조합 기법을 통해, 예컨대, 시험관내 클로닝 및 전사에 의해 얻어진 분자와 합성 분자를 둘 다 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
폴리뉴클레오타이드 분자는, 당업계에 공지된 바와 같이, 부위-지정 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)에 의해, 또는 무작위 돌연변이유발에 의해, 예컨대, 화학적 돌연변이 유발원에 또는 방사선에 노출에 의하는 것을 비롯하여, 당업자에게 공지된 재조합 기법을 사용하여 유전적으로 돌연변이될 수 있다. 돌연변이는 당업계에 공지된 표준 방법, 예를 들어, 기재된 바와 같은 감염성 복제물(예컨대, 문헌[Meulenberg et al., Adv. Exp. Med. Biol., 1998, 440:199-206])의 부위-지정 돌연변이유발(예컨대, 문헌[Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 유전자 변형된 북미 PRRS 바이러스의 제조방법을 추가로 제공하되, 이때의 방법은 상기 기재한 바와 같은 PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 돌연변이시키는 단계, 및 적합한 발현 시스템을 사용하여 유전자 변형된 PRRS 바이러스를 발현시키는 단계를 포함한다. 유전자 변형된 PRRS 바이러스는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 당업계에 일반적으로 공지된 적합한 발현 시스템을 사용하여 발현될 수 있되, 그 예는 본 출원에 기재되어 있다. 예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는, 이하에 더욱 상세하게 기재된 바와 같이, 시험관내 적합한 숙주 세포에서 암호화된 바이러스를 발현시킬 수 있는 플라스미드 형태일 수 있다.
북미 PRRSV N 단백질 서열은 고도로 보존되며, 보고된 서열은 서로에 대해 약 93 내지 100% 동일성을 가진다. 북미 및 유럽 PRRSV N 단백질은 약 57 내지 59% 동일하고, 공통의 구조적 모티프를 공유한다. 일반적으로, 특이적 뉴클레오타이드 또는 암호화된 아미노산에 대해서와 같이 상이하게 번호 매겨질 수 있는 PRRS 암호화 서열과 단리물을 비교할 때, 적절한 영역의 확인은, 관심 대상의 PRRS 균주에서 보존된 특징적 아미노산을 확인하고, 그것을 기준 균주와 정렬시킴으로써 용이하게 달성된다.
재조합 DNA 기법은 DNA 수준에서 핵산을 변형시키는 것을 목적으로 하는 극도로 다양하고 강력한 분자 생물학 기법을 포함하며, 이는 분자 수준에서 게놈을 분석하고 변형시킬 수 있다. 이 점에 있어서, PRRS 바이러스와 같은 바이러스는, 그의 게놈의 적당한 크기 때문에, 특히 이러한 조작이 가능하다. 그러나, 재조합 DNA 기법은 비-레트로바이러스 RNA 바이러스들에 즉시 적용될 수 없는데, 그 이유는 이들 바이러스가 그들의 복제에서 DNA 중간 단계를 포함하지 않기 때문이다. 이러한 바이러스들을 위하여, 감염성 cDNA 클론은 재조합 DNA 기법이 그의 게놈에 적용되어 변형된 바이러스를 생성하기 전에 진화되어야 한다. 감염성 클론은, 연구 하에 바이러스의 전장(게놈 길이) cDNA(여기서 mRNA의 DNA 복제의 엄격한 의미에서뿐만 아니라 RNA의 DNA 복제의 넓은 의미에서 사용됨)의 구축을 통해 유래될 수 있고, 그 후, 감염성 전사체는 전장 cDNA에 의해 형질감염된 세포에서 생체내에서 합성되지만, 감염성 전사체들은, 또한 전사 칵테일의 존재 중에 원핵 프로모터를 갖는 플라스미드 내의 전장 cDNA로부터 시험관내 전사에 의해, 또는 전체 바이러스 게놈을 포함하는 결찰된 부분-길이 cDNA 단편을 사용하여, 재차 시험관내에서 얻어질 수도 있다. 모든 경우에, 전사된 RNA는 cDNA에 도입된 모든 변형을 보유하며, 이와 같이 변형된 바이러스의 추가적인 계대에 사용될 수 있다.
유럽 PRRS 바이러스 단리물 또는 렐리스타트 바이러스의 감염성 클론의 제조는 본 명세서에 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제6,268,199호에 기재되어 있다. P129라 불리는 북미 PRRS 바이러스 단리물(Lee et al., 2005; Yoo et al., 2004)의 감염성 cDNA 클론의 제조는 본 명세서에 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제6,500,662호에 기재되어 있다. P129 cDNA의 서열은 젠뱅크 수탁번호 AF494042 및 미국 특허 제6,500,662호에 개시되어 있다. 이하의 본 발명자들의 연구는, 플라스미드의 맥락에서 CMV 즉시 초기 프로모터에 의해 발현되고 pCMV-S-P129라 불리며 또한 미국 특허 제6,500,662호에 개시된 이러한 감염성 클론을 사용한다. 미국 특허 제6,500,662호에 기재되어 있는 바와 같이, 본 명세서에서 사용하기에 적합한 다른 플라스미드 및 프로모터들이 있다.
관심대상의 임의의 오픈 리딩 프레임의 완전한 서열 및 관심대상의 아미노산 잔기의 위치를 고려해 볼 때, 당업자는 원하는 특정 위치에서 변화를 설계하기 위해 코돈 표를 단지 찾아보기만 할 필요가 있다.
코돈은 mRNA 및 그의 대응하는 cDNA 분자에서 뉴클레오타이드의 삼중 서열을 구성한다. 코돈은, mRNA 분자에 존재할 때에는 유라실(U) 염기를 특징으로 하지만, DNA에 존재할 때에는 티미딘(T) 염기를 특징으로 한다. 폴리뉴클레오타이드 내에서 동일한 아미노산 잔기에 대한 코돈의 단순한 변화는 암호화된 폴리펩타이드의 서열 또는 구조를 변화시키지 않을 것이다. 어구가, 특정 3개 뉴클레오타이드 서열이 임의의 특정 아미노산을 "암호화하는" 것을 기술할 때, 당업자라면 상기 표가 당해 특정 뉴클레오타이드를 확인하는 수단을 제공하는 것임을 인식하는 것은 명백하다. 예로서, 특정 3개 뉴클레오타이드 서열이 라이신을 암호화한다면, 상기 표는 2개의 가능한 삼중 서열이 AAA 및 AAG라는 것을 개시한다. 글라이신은 GGA, GGC, GGT(RNA에 있다면 GGU) 및 GGG에 의해 암호화된다. 암호화된 단백질에서 라이신을 글라이신 잔기로 변화시키기 위해, 암호화 핵산에서 AAA 또는 AAG 삼중 서열을 GGA 및 GGC, GGT 또는 GGG 중 어느 하나로 대체할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 PRRS의 백신 균주의 제공에 관한 것이되, 여기서, 다른 반응들 중에서 인터페론 경로에 의해 매개된 바이러스에 대한 숙주 반응은 하향조절되지 않는다. 이하에서 상세하게 기재하는 바와 같이, 이와 관련하여 효과적인 바이러스 게놈에 대한 다양한 변형, 특히 본 명세서에 개시된 바와 같은 ORF1a에서 발견된 것들 및 이들의 조합이 있다. 유사한 변형점은, 본 명세서에 또한 개시된 바와 같이(표 9 참조), PRRS 게놈의 추가적인 오픈 리딩 프레임에서 발견될 수 있다는 점에 유의해야 한다.
PRRS 폴리뉴클레오타이드의 변형에 대한 소정의 다른 선행 접근법이 PRRS 바이러스를 약독화시키기 위하여 성공적이어서, 백신 사용에 대한 적합성을 제공 가능하게 한 점은 괄목할 만하지만, 얻어진 약독화의 정확한 원인은 일반적으로 공지되어 있지 않다. 예를 들어, 오픈 리딩 프레임 7(open reading frame 7: ORF7)에서 결실을 포함하기 위해, 바이러스의 뉴클레오캡시드 또는 N 단백질(ORF7에 의해 암호화됨) 내 NLS-2 영역, NoLS 영역 또는 NES 영역을 돌연변이시키거나 또는 결실시킴으로써 악성 PRRS 바이러스를 약독화시키는 것이 개시되어 있었다. 다른 양태에서, ORF7 결실은 캡시드 단백질의 핵 편재화 신호(nuclear localization signal: NLS)를 암호화하는 서열 내에 있다. NLS를 암호화하는 서열 내의 ORF7 결실은 위치 43 내지 48에서의 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 위치 43 및 44 중 하나 또는 둘 다에서의 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 참조로 포함되는 미국 특허 제7,544,362호의 전체 개시내용을 참조한다. ORF7에 의해 암호화되는 PRRSV의 뉴클레오캡시드 단백질(N)은 인산화되고(Wootton, Rowland, and Yoo, 2002), 호모다이머를 형성하는(Wootton and Yoo, 2003) 작은 염기성 단백질이다. 결정 구조는 최근에 밝혀졌다(Doan and Dokland, 2003). N 단백질은 감염된 세포에서 다수의 기능을 가지는 것으로 보인다. 세포질에서 일어나는 과정인, 게놈 RNA가 패키징되는 구체 캡시드 구조를 형성하는 것에 부가해서, N 단백질의 일부는 감염된 세포의 핵에, 구체적으로는, 핵소체에 수송된다. N 단백질의 아미노산 서열은, 핵 및 핵소체 내로의 수송 및 핵으로부터의 유출을 용이하게 하는, 2개의 핵 위치 신호(NLS), 핵소체 편재화 신호(NoLS) 및 핵유출 신호(nuclear export signal: NES)를 각각 보유한다(Rowland et al., 1999; Rowland et al., 2003; Rowland and Yoo, 2003). 핵소체에서, N 단백질은 작은 핵소체 RNA-관련 단백질 피브릴라린과 상호작용하며, 바이러스 복제를 유리하게 하기 위해 감염된 세포에서 rRNA 처리 및 리보솜 생체내합성을 조절할 수 있다(Yoo et al., 2003). 이런 유형의 바이러스 돌연변이는, 신규한 PRRS 백신을 설계하기 위하여, 단독으로 또는 다른 약독화 돌연변이와 조합하여 가치가 있다. 약독화된 PRRS 바이러스의 다른 예에서, ORF1a에 대한 변형이 사용되었다. ORF1a의 비구조적 단백질 2 암호 영역 내 초가변 영역에서 아미노산 616 내지 752의 항원성 에피토프를 암호화하는 DNA 서열의 결실이 사용되었으며, 이에 대해서는, 본 명세서에 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제7,618,797호를 참조한다.
PRRS 바이러스의 면역생물학에 대한 연구는 PRRS 바이러스와 PDC의 상호작용이 시험할 만한 가치가 있다는 것을 시사한다. 이 세포 유형은 인간, 마우스, 래트, 돼지 및 원숭이에서 0.2% 내지 0.8%의 말초 혈액 단핵 세포를 나타낸다. 이 세포는, 그의 부족에도 불구하고, 선천성 면역계의 중요한 성분이며, 바이러스 자극 후 엄청난 양의 IFN-α를 분비할 수 있다. IFN-α의 분비를 통해, PDC들은 항바이러스의 선천성 및 적응 면역을 조절하는데 중요한 역할을 하는데, 그 이유는 그들이 천연 킬러 세포, B 세포 및 T 세포의 기능을 촉진시키기 때문이다. 더 나아가, 돼지 단핵구 유래 수지상 세포(monocyte derived dendritic cell: MoDC)의 성숙은 PDC들에 의해 분비된 IFN-α에 의해 보조되어서 항원을 제시하고 T 세포를 활성화시키는 MoDC들의 향상된 능력을 초래한다. 바이러스 감염의 이후의 단계에서, PDC들은 T세포의 기능을 직접적으로 조절하고, T 세포의 IFN-γ(이는 PRRS 바이러스를 포함하는 바이러스에 대해 항바이러스 면역의 주된 매개자임)를 분비할 수 있는 세포로의 분화를 지시하는 독특한 유형의 성숙 수지상 세포로 분화된다. IFN-α를 분비하는 PDC의 능력을 억제하는 것으로 알려진 인간 바이러스, 예컨대, 호흡기 세포융합 바이러스 및 홍역 바이러스가 있다는 것은 놀랍지 않다. 이 저해 효과는 체액성 면역 반응 및 이들 바이러스에 의한 감염 결과로서 관찰된 관련된 면역병리학의 우위에서뿐만 아니라 2차 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 숙주의 증가된 감수성에서 임의의 역할을 하는 것으로 생각된다.
대조적으로, 야생형 PRRSV 단리물뿐만 아니라 인겔백 PRRS 백신 균주들 둘 다(이하의 실시예 5 및 그 이후 참조)는 IFN-α를 생성하는 돼지 PDC의 정제된 집단의 능력을 저해한 한편, 신규한 P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44 바이러스 저장액(이하 참조)은 이 PDC 기능에 대한 최소 내지 무저해 효과를 나타내었다. 이들 관찰의 의의는, 부분적으로는, 바이러스에 대한 적응 면역 반응의 발생을 조절함에 있어서 IFN-α의 중요성에 있다. 따라서, 최소로 IFN-α 억제 바이러스로부터 유래된 약독화된 바이러스 백신은 강한 항바이러스 방어 면역 반응을 유발할 것이 분명하다. 인겔백 PRRS MLV 백신에 대한 IFN-α의 애주번트 효과는 바이러스-특이적 T 세포 매개 IFN-γ 반응을 유발하였고, 백신에 의해 유발된 바이러스-특이적 T 세포 매개 IFN-γ 반응의 강도는 현장 및 실험실 조건 하에서 바이러스에 대한 보호적 면역과 양의 상관관계를 가진다는 것이 이미 입증되어 있다. 따라서, 이론에 대하여 제한되지 않고, 비-IFN-α-저해 PRRSV에 의해 유발된 보호적 면역 수준 및 세포-매개 면역 반응은 야생형(IFN-α 저해) 표현형을 나타내는 PRRSV 단리물의 것보다 유의하게 더 클 것으로 예상하는 것이 합리적일 것이다.
본 발명을 참조하면, P129-PK-FL 바이러스뿐만 아니라 pCMV-S-P129-PK 감염성 cDNA 클론으로부터 유래된 모두 5개의 결실 돌연변이가 IFN-α 생산을 저해하는 능력을 상실한 것은 주목할 만하다. 따라서 이러한 통상의 표현형은 단독으로 결실에 기인하지 않을 수 있지만, 적어도 부분적으로는 감염성 클론의 구축 동안 고정된 유전적 변화에 기인하는 것은 틀림없다. 흥미롭게도, PK-9 세포에 대해 연속으로 63회 계대된 비클로닝 P129 바이러스는 IFN 유도를 저해하는 능력을 보유하였다(표 1). 모든 감염성 클론-유래 바이러스에서 보이는 흔한 IFN 표현형에 대한 분명한 설명은 감염성 클론의 발생 동안 하나 이상의 돌연변이의 편입(incorporation)이다. 이들 돌연변이는 감염성 클론을 구축하는데 사용된 바이러스 RNA에서 가능하게는 저수준으로 존재하였다. 궁극적으로, 돌연변이들은 돼지에서 본래(계대 0) 바이러스에서 존재할 수 있거나 또는 그들은 16 계대를 위하여 PK-9 세포 상의 성장에 바이러스를 적응시키는 과정 동안 생성되어 풍부하게 될 수 있다. 돌연변이가 결과적인 PCR-유발 오류 또는 클로닝 인공물이었다는 가능성은 제외할 수 없다. 어쨌든, IFN-α 저해 기능의 손실을 초래하는 돌연변이(들)는 감염성 클론 구축 동안 "고정되게" 되었고, 이 특정 감염성 클론으로부터 유래된 모든 바이러스에서 존재할 것으로 예상되었다.
PRRSV가 바이러스 RNA-의존적 RNA 폴리머라제에 의한 오류의 결과로서 무작위 유전적 다양성을 용이하게 생성시키는 것으로 알려져 있는 것을 고려하면, 변경된 IFN-α 저해 표현형을 초래하는 돌연변이가 cDNA 클론을 구축하는데 사용된 바이러스 RNA에 이전부터 존재했다는 가능성이 있을 수 있다. 바이러스 준종(quasi-species)은 생체내 바이러스 복제 동안 자연적으로 생기는 밀접하게 관련된 유전적 변이체들의 이종성 혼합물로 구성된다. 감염성 cDNA 클론으로부터 유래된 PRRSV의 다수의 시험관내 계대 후의 바이러스 준종의 관찰이 훨씬 더 적절하다. 이는 이전에 수행된 연구에서의 바이러스 게놈의 출발 집단이 유전적으로 상동성인 집단으로 이루어졌고, 서열 다양성이 세포 배양물에서 계대 동안 신속하게 생성되었기 때문에 주목할 만하다. 현재의 연구에서, 게놈 이종성 수준은 더 높았는데, 그 이유는 원래의 P129 바이러스가 감염성 클론의 구축으로 이어지는 16 PK-9 계대 전에 (생물학적으로 또는 분자적으로) 클로닝되지 않았기 때문이다. 따라서, 준종들 중에서 IFN-α 저해 기능의 손실을 초래하는 PRRSV RNA 변이체의 기회 선택, 및 pCMV-S-P129-PK17-FL 감염성 cDNA 클론 내로의 편입은 그럴듯하게 보인다. 모든 유도적 바이러스가 효과적인 차세대 PRRS 백신의 개발에 중요한 것으로 입증될 수 있는 이런 별개의 생물학적 표현형을 공유하여야 한다는 것을 고려해 볼 때, 감염성 클론 내로의 이들 돌연변이의 편입은, 몇몇 환경 하에서, 우연한 것으로 여겨질 수도 있다.
야생형 PRRS 바이러스 균주 P129는, 이 바이러스의 다른 균주와 마찬가지로, 인터페론(IFN)-α를 생산하는데 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 및 형질세포양 수지상 세포(PDC)의 능력에 대한 강한 저해 효과를 나타내었다. 반면에, P129(pCMV-S-P129-PK17-FL)의 감염성 cDNA 클론으로부터 유래된 바이러스는 IFN-α 저해 표현형의 유의한 감소를 나타내었다. 이 감염성 클론은 연속적 16 계대 과정에 걸쳐서 CD163-발현 돼지 신장 세포주 PK-9 상에서 성장하는데 미리 적합하게 된 바이러스로부터 구축되었다(본 명세서에 전문이 참조로 포함된 미국 특허 제7,754,464호 참조). P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44의 IFN-α 저해 표현형은, 낮은 범위 내지 무시할 만한 범위에 있었고, 2개의 인겔백 PRRS 변형된 생 바이러스 백신 균주(이들 둘 다 고도로 저해성임) 중 하나에 의해 나타난 것과는 현저하게 대조적이었다. 이들 결과는 P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44 바이러스가 모체의 낮은-계대 P129 단리물, 다른 야생형 PRRS 바이러스 및 인겔백 PRRS 백신 둘 다와 생물학적으로 별개라는 것을 나타낸다. 감소된 IFN-α-저해 표현형의 잠재적 영향뿐만 아니라 표현형 변화에 대한 가능한 이유가 논의된다.
본 발명의 아미노산 변형
본 발명의 실시에 따르면, ORF1로부터 암호화된 단백질 내 특정 위치에 특정 아미노산을 함유하고, 이들 바이러스에 대해 바람직한 표현형을 부여하는 PRRS의 신규한 단리물은, 북미 유전자형이든 중국 유전자형이든지 간에, 현장 확인될 수 있다. 대안예에 있어서, 상기한 바와 같이, 표준 유전적 절차는 암호화된 ORF1 단백질의 유전적 서열(및 이에 따른 아미노산 서열)을 변형시키고, 재차, 변형된 북미 및 중국 PRRS 바이러스 및 감염성 클론 그리고 그들로부터의 백신을 생산하기 위해 사용될 수 있으며, 이들 모두는 이러한 표현형을 제공한다. 바람직한 예에서, 표현형은 야생형 PRRS 바이러스에 비해 감소된 인터페론-α 저해 효과, 및 선택적으로 검출가능한 병인이 거의 없이 숙주 동물(돼지)에서 번식하거나 또는 지속되는 한편, 강한 면역 반응을 촉발시키는 능력을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 실시에서, 유용한 출발점으로서 작용할 수 있는 북미 PRRS 균주 또는 단리물은, 예를 들어, 미국 특허 제6,500,662호; 제7,618,797호; 제7,691,389호, 제7,132,106호; 제6,773,908호; 제7,264,957호; 제5,695,766호; 제5,476,778호; 제5,846,805호; 제6,042,830호; 제6,982,160호; 제6,241,990호; 및 제6,110,468호에 개시된 것들을 포함한다. 유용한 출발점으로서 작용할 수 있는 중국 PRRS 균주 및 단리물에 관해서는, 예를 들어, TJM-92 바이러스에 관한 중국 특허 출원 CN201633909로부터 공개된 중국 특허 출원 CN200910091233.6호를 참조한다.
다음의 논의와 관련하여, 국제적으로 인식되는 1글자 및 3글자 명칭은 DNA에 의해 암호화되는 가장 흔한 아미노산들: 알라닌(Ala, A); 알기닌(Arg, R); 아스파라긴(Asn, N); 아스팔트산(Asp, D); 시스테인(Cys, C); 글루탐산(Glu, E); 글루타민(Gln, Q); 글라이신(Gly, G); 히스티딘(His, H); 아이소류신(Ile, I); 류신(Leu, L); 라이신(Lys, K); 메티오닌(Met, M); 페닐알라닌(Phe, F); 프롤린(Pro, P); 세린(ser, S); 트레오닌(Thr, T); 트립토판(Trp, W); 티로신(Tyr, Y) 및 발린(Val, V)에 대해 사용된다.
표 9 및 표 10은 인터페론 알파 활성의 감소된 저해와 상관관계가 있는 북미(및 중국) PRRS에서의 독력(virulence) 약독화를 초래하는 관찰된 아미노산 변화를 확인하며, 이에 의해 백신에 대해 안전하고 강한 면역 반응을 허용한다. 표 10은, 이와 관련하여 ORF1a 내에서 고도로 바람직한 아미노산 변형을 확인하고, 이들 돌연변이가 다른 P129 배양물로부터의 계대에 관하여 어떻게 일어났는지를 나타낸다(이런 이력의 검사는, 필요에 따라, 본 발명의 아미노산 변화들 중 임의의 것을 갖는 암호화 DNA를 (재)구축하는 돌연변이유발 전략의 설계를 용이하게 한다는 것에 주목해야 한다). 이와 관련하여, ORF1a에 대한 가장 바람직한 아미노산 개선(P129 계대 52에 의해 증명되는 바와 같음)은, 182에서 아스파라긴, 189에서 아스파라긴, 273에서 티로신, 302에서 히스티딘, 665에서 트레오닌, 943에서 시스테인, 1429에서 트레오닌, 1505에서 알라닌, 2410에서 아스파라긴을 포함하는데, 이는 또한 수많은 글라이코실화 기회를 잠재적으로 부가하며, 단백질 기능을 더욱 변경시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 단리된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRS)를 제공하되, ORF1a에 의해 암호화된 PRRS의 단백질은 하기 중 임의의 것을 함유하는 해당 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다:
아미노산 서열 AMANVYD 내의 아미노산 N(서열번호 9);
아미노산 서열 IGHNAVM 내의 아미노산 N(서열번호 12);
아미노산 서열 TVPDGNC 내의 아미노산 D(서열번호 15);
아미노산 서열 CWWYLFD 내의 아미노산 Y(서열번호 18);
아미노산 서열 HGVHGKY 내의 아미노산 H(서열번호 21);
아미노산 서열 AAKVDQY 내의 아미노산 V(서열번호 24);
아미노산 서열 PSATDTS 내의 아미노산 T(서열번호 27);
아미노산 서열 LNSLLSK 내의 아미노산 L(서열번호 30);
아미노산 서열 APMCQDE 내의 아미노산 C(서열번호 33);
아미노산 서열 CAPTGMD 내의 아미노산 T(서열번호 36);
아미노산 서열 PKVAKVS 내의 아미노산 A(서열번호 39);
아미노산 서열 AGEIVGV 내의 아미노산 I(서열번호 42);
아미노산 서열 ADFNPEK 내의 아미노산 N(서열번호 45); 및
아미노산 서열 QTPILGR 내의 아미노산 I(서열번호 48).
더 구체적으로는, 본 발명은 단리된 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRS)를 제공하되, 여기서, ORF1a에 의해 암호화된 PRRS의 단백질은 하기 나열된 것들 중 임의의 것을 함유하는 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
아미노산 서열 ANV 내의 아미노산 N(서열번호 9 참조);
아미노산 서열 HNA 내의 아미노산 N(서열번호 12 참조);
아미노산 서열 PDG 내의 아미노산 D(서열번호 15 참조);
아미노산 서열 WYL 내의 아미노산 Y(서열번호 18 참조);
아미노산 서열 VHG 내의 아미노산 H(서열번호 21 참조);
아미노산 서열 KVD 내의 아미노산 V(서열번호 24 참조);
아미노산 서열 ATD 내의 아미노산 T(서열번호 27 참조);
아미노산 서열 SLL 내의 아미노산 L(서열번호 30 참조);
아미노산 서열 MCQ 내의 아미노산 C(서열번호 33 참조);
아미노산 서열 PTG 내의 아미노산 T(서열번호 36 참조);
아미노산 서열 VAK 내의 아미노산 A(서열번호 39 참조);
아미노산 서열 EIV 내의 아미노산 I(서열번호 42 참조);
아미노산 서열 FNP 내의 아미노산 N(서열번호 45 참조); 및
아미노산 서열 PIL 내의 아미노산 I(서열번호 48 참조).
상기한 바와 같이, 북미 및 중국 PRRS의 수많은 공지된 균주 및 단리물이 있으며, 신규한 균주는 계속해서 진화하거나 또는 단리된다. 고수준의 아미노산 서열 상동성이 모든 이들 균주 간에 존재하지만, 당업자라면, 일부 변이가 존재하고, 사실 모든 백신 균주의 표현형 특성을 더욱 개선시키기 위하여 이들 차이 및 유사점을 이용할 수 있다는 것을 바로 인식할 것이다.
우선, 바로 위에서 (본건 대응 국제 특허 공보의 27 내지 28페이지 상에서) 명시된 바와 같은 서열번호에 의해 정해진 모든 아미노산 모티프에 관하여, 밑줄친 그리고 바람직한 아미노산(P129 계대 52로부터 제공된 바와 같음)은, 인접한 아미노산이 명시된 서열번호 서열과는 다르게 변화된다고 하더라도, 일반적으로 여전히 충분히 유익하다. 따라서, AMANVYD(서열번호 9)에 관해서는, 구체적이며 대표적인 예로서, 이러한 다른 균주에서 추가적인 변화가 일어나, 진화의 결과로서, 치환 및/또는 결실 또는 부가를 일으켰다고 해도, 대응하는 아미노산 모티프를 발견하기 위해 임의의 북미 또는 중국 PRRS로부터 대응하는 ORF1-발현 단백질 서열을 조사하는 것이 일반적으로 가능하다. 당업자라면 이해할 수 있는 바와 같이, 따라서 P129 계대 52에 의해 증명되는 바람직한 아미노산 변화는, 또한 계대 52의 명시된 아미노산에 대해 직접적으로 5' 또는 3'인 전반적인 아미노산 서열에서의 다른 변화에도 불구하고 여전히 조작가능한 채로 있어야 한다. 이는 비교하는 아미노산 변화가 상보적으로 여겨진다면, 특히 그럴 것이다. 따라서 AMANVYD(서열번호 9), 및 그의 하위서열 ANV에 관해서는, 예를 들어, 그 안의 발린이 아이소류신 또는 류신, 또는 임의의 다른 잔기로 대체된다면, 또는 잔기가 단순히 빠지거나 또는 추가적인 잔기가 부가된다면, 다른 PRRS 균주에서 필적하는 모티프를 확인하는 것이 용이하게 가능하여야 한다. 정렬을 확인하기 위한 수많은 컴퓨터 프로그램이 존재하며, 이에 따라서 폴리펩타이드 서열 모티프가, 예를 들어, 소위 블로섬(Blosum) 표(주어진 수준의 동일성%를 기초로 함)에 대응하는지의 여부를 결정한다. 이에 대해서는, 문헌[S. Henikoff et al. "Amino Acid Substitution matrices from protein blocks", Proc Natl Acad Sci, USA, 89(22), pp. 10915-10919, Nov 15, 1992.], 및 문헌[A. L. Lehninger et al. Principles of Biochemistry, 2005, MacMillan and Company, 4th edition]을 참조한다. 보존적 아미노산 변화는 또한 다섯 가지 전체 그룹, 즉, 설프하이드릴(Cys); 방향족(Phe, Tyr 및 Trp); 염기성(Lys, Arg, His); 지방족(Val, Ileu, Leu, Met) 및 친수성(Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser 및 Thr)으로의 분류에 기초하여 인식된다. 따라서, 지정된 위치에 인접한 다른 아미노산들 중 하나 이상이 부가, 결실 또는 치환된다고 해도, 적절한 대응하는 위치에서 P129 계대 52에 대해 특정된 아미노산 변화들 중 임의의 것을 편입시키기 위해 임의의 북미 또는 중국 PRRS 암호화 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것은 본 발명의 실시 범위 내이다.
추가적으로, 유사한 원칙에 기반하여, 당업자라면, 일단 바람직한 아미노산이 본 발명의 실시에 따라서 ORF1a에 대해 확인된 특정 계대 52 변화로부터 확인된다면, 임의의 이러한 계대 52 아미노산에 대한 보존적 치환이, 또한 P129 변이체에서 또는 다른 북미 또는 중국 균주에 관하여, 의도된 계대 52 표현형의 실질적 보존과 함께 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 대표적인 예로서: SLL(서열번호 30 내)에 관하여, 지정된 류신 잔기는 아이소류신, 발린 또는 메티오닌으로 추가로 대체될 수 있고; FNP(서열번호 45 내)에 관하여, 지정된 아스파라긴은 Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Ser 및 Thr 중 임의의 것으로 대체될 수 있으며; VAK(서열번호 39 참조)에 관하여, 지정된 알라닌은 Asn, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Ser 및 Thr 중 임의의 것으로 대체될 수 있지만; 임의의 이러한 대체 아미노산이 그 지정된 위치에서 기능할 뿐만 아니라 본래 확인된 독특한 계대 52 아미노산이 그 지정된 위치에서 변하는 것이 본 발명의 요건이 아니라는 점은 용이하게 인식될 것이다. 물론, 임의의 다른 인식 모델에 따른 표준 보존적 아미노산 변화의 이용도 본 발명에서 실시된다. 예를 들어, 모든 경우에 그 반대의 경우를 포함하는 바, Glu에 대해 Asp 및 반대의 경우, Gln에 대해 Asn, Lys에 대해 Arg, Cys 또는 Thr에 대해 Ser, Tyr에 대해 Phe, Leu 또는 Ileu에 대해 Val, Gly에 대해 Ala 등이다.
추가로, 본 발명의 실시 범위 내에서, 개별적인 계대 52 아미노산 변화들(상기 ORF1a에 대해 확인한 바와 같음) 중 임의의 것도 원하는 표현형 효과를 지니는 임의의 북미 또는 중국 PRRS에 유용하게 위치될 수 있지만, 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열의 적절한 변형에 의해 전형적으로 제공되는 바와 같이, 최종 구축물에서 가능한 한 많은 표 9 또는 표 10의 아미노산 선택을 포함하는 것이 더 바람직하다. 따라서, 본 발명의 실시는, 모든 전체 확인된 계대 52 아미노산 변화의 임의의 특정 쌍, 삼중 또는 다른 더 고차의 조합을 포함하도록, 최종 바이러스 서열 내 전체인 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 대략 17까지의 확인된 계대 52 ORF1a 변화 중 임의의 것(표 9)을 제공하는 중국 또는 북미 PRRS 바이러스(및 대응하는 암호화 폴리뉴클레오타이드)의 제공을 포함한다. 물론, 이러한 아미노산 변화는 부위-지정 돌연변이유발, PCR, 및 당업계에 충분히 공지된 바와 같은 기타 기법들에 의해 바이러스의 대응하는 암호화 뉴클레오타이드 서열 내로 도입될 수 있다.
특정 유전자 변형된 균주가 약독화된 것을 입증하기 위해, 이하에 기재된 실험이 사용될 수 있다.
그룹 당 적어도 10마리의 어린 암퇘지가 각 시험에 포함되는데, 이들은 PRRSV가 없는 농장으로부터 유래된다. PRRS 바이러스 특이적 혈청 항체가 없고 PRRSV에 대해 음성인 동물이 시험된다. 시험에 포함된 모든 동물은 동일한 공급원 및 혈통을 가진다. 동물의 그룹에의 할당은 무작위로 한다.
콧구멍마다 105 TCID50을 지니는 PRRSV 1㎖의 비강내 적용에 의해 임신 제90일에 시험감염을 수행한다. 각 시험 구성에 대해, 적어도 3개의 그룹, 즉, P129 시험감염을 위한 하나의 그룹; 가능하게는 약독화된 바이러스에 의한 시험감염을 위한 하나의 그룹; 및 하나의 엄격한 대조군 그룹이 있다.
엄격한 대조군이 연구의 시간 과정에 걸쳐 PRRSV-음성으로 남아있고, 적어도 25% 미만의 살아있는 건강한 새끼 돼지가 엄격한 대조군에 비해서 P129 시험감염 그룹에서 태어났을 때, 연구는 타당한 것으로 간주된다.
약독화, 다시 말해서, 더 적은 독력은, 번식 능력 또는 다른 증상을 결정하는 하나 이상의 파라미터의 통계상 유의한 변화로서 정의된다:
미변형 모 균주 감염그룹에 비해 시험그룹(가능하게는 약독화 바이러스)에 대한 다음의 파라미터들 중 적어도 하나의 유의한 감소는 약독화의 표시이다:
a) 사산 빈도
b) 임신 제112일에 또는 그 전의 유산
c) 미라가 된 새끼돼지의 수
d) 덜 활발하고 약한 새끼돼지의 수
e) 이유기 전 사망
더 나아가, 비변형 모 균주 감염그룹에 비해 시험그룹에 대한 다음의 파라미터들 중 하나의 유의한 증가가 바람직하다:
f) 암퇘지 당 이유 새끼돼지의 수
g) 암퇘지 당 태어난 살아있는 건강한 새끼돼지의 수
대안으로서, PRRSV 감염의 호흡기 증상 및 다른 증상은 약독화를 확립하기 위해 검사될 수 있었다.
약독화된 균주는 백신의 제형화를 위하여 가치가 있다. 본 발명의 백신은 그것이 PRRS 바이러스에 의한 감염에 대해 돼지를 보호한다면 효과적이다. 한 마리 이상의 미감염 돼지에 대한 백신의 투여 후, 생물학적으로 순수한 바이러스 단리물(예를 들어, VR 2385, VR 2386, P129 등)에 의한 후속적 시험감염이, 미보호된 (즉, 적절한 대조군에 대해) 유사한 돼지에서의 단리물에 의해 전형적으로 초래되는 증상 또는 변화에 비해, 임의의 중대한 또는 조직병리학적 변화(예를 들어, 폐에서의 병변) 및/또는 질병의 증상의 줄어든 중증도를 야기한다면, 백신은 PRRS 바이러스에 의한 감염에 대해 돼지를 보호하는 것이다. 더 구체적으로는, 본 백신은, 치료가 필요한 한 마리 이상의 적합한 돼지에 백신을 투여한 다음, 적절한 길이의 시간(예를 들어, 4주) 후에, 생물학적으로 순수한 PRRSV 단리물의 거대 샘플(10(3-7) TCID(50))로 시험감염시킴으로써 효과적인 것으로 나타날 수 있다. 그 다음에 약 1주 후 시험감염 돼지로부터 혈액 샘플을 회수하고, 이어서 혈액 샘플로부터 바이러스를 단리시키기 위한 시도가 수행된다. 다량의 바이러스의 단리는 백신이 효과적이지 않을 수도 있다는 표시인 한편, 감소된 양의 바이러스의 단리(또는 바이러스 없음)는 백신이 효과적일 수 있다는 표시이다.
따라서, 본 백신의 유효성은 정량적으로(즉, 적절한 대조군에 비해 강화된 폐조직의 백분율의 감소) 또는 정성적으로(예를 들어, 혈액으로부터의 PRRSV의 단리, 폐에서의 PRRSV 항원의 검출, 면역분석에 의한 편도 또는 림프절 조직 샘플) 평가될 수 있다. 돼지 번식 및 호흡기 질병의 증상은 정량적으로(예를 들어, 체온/발열) 또는 준정량적으로(예를 들어, 청색증, 폐렴, 폐 병변 등과 같은, 하나 이상의 증상의 존재 유무, 또는 하나 이상의 증상의 중증도의 감소) 평가될 수 있다.
미감염 돼지는 돼지 번식 및 호흡기 질병 감염성 작용제에 노출되지 않거나, 또는 돼지 번식 및 호흡기 질병 감염성 작용제에 노출되었지만 질병의 증상을 나타내지 않는 돼지이다. 감염된 돼지는 PRRS의 증상을 나타내거나 또는 PRRSV가 단리될 수 있는 것이다.
본 발명의 백신은 인간(적용가능하다면)을 포함하는 동물에 대해 허용가능한 담체, 예컨대, 표준 완충제, 안정제, 희석제, 보존제 및/또는 가용화제를 포함하도록 허용되는 관례에 따라 제형화될 수 있고, 또한 지속 방출을 용이하게 하기 위하여 제형화될 수 있다. 희석제는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글라이세롤 등을 포함한다. 등장성을 위한 첨가제는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨 및 락토스를 포함한다. 안정제는 특히 알부민을 포함한다. 변형된 생백신을 제형화하는데 특히 유용한 것들을 비롯한, 다른 적합한 백신 비히클 및 첨가제는 공지되어 있거나 또는 당업자에게 명백할 것이다. 이에 대해서는, 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., 1990, Mack Publishing]을 참조한다.
본 발명의 백신은, 예를 들어, 특히 애주번트 또는 사이토카인과 같은 1종 이상의 추가적인 면역조절 성분을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 백신에서 사용될 수 있는 애주번트의 비제한적 예로는 RIBI 애주번트 시스템(미국 몬타나주 해밀턴에 소재한 리비 인코포레이티드(Ribi Inc.)), 명반, 미네랄 겔, 예컨대, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 수중유 에멀전, 유중수 에멀전, 예를 들어, 프로인트의 완전 및 불완전 애주번트, 블록 공중합체(미국 조지아주 애틀란타에 소재한 사이트알엑스(CytRx)), QS-21(미국 매사추세츠주 캠브릿지에 소재한 캠브릿지 바이오테크 인코포레이티드(Cambridge Biotech Inc.)), SAF-M(미국 캘리포니아주 에머이빌에 소재한 카이론(Chiron)), 암피겐(AMPHIGEN)(등록상표) 애주번트, 사포닌, Quil A 또는 기타 사포닌 분획, 모노포스포릴 지질 A, 및 아브리딘(Avridine) 지질-아민 애주번트를 포함한다. 본 발명의 백신에서 유용한 수중유 에멀전의 비제한적 예로는 변형된 SEAM62 및 SEAM 1/2 제형을 포함한다. 변형된 SEAM62는 5%(v/v) 스쿠알렌(시그마(Sigma)), 1%(v/v) 스팬(SPAN)(등록상표) 85 세정제(ICI 계면활성제), 0.7%(v/v) 트윈(TWEEN)(등록상표) 80 세정제(ICI 계면활성제), 2.5%(v/v) 에탄올, 200pg/㎖ Quil A, 100[mgr]g/㎖ 콜레스테롤, 및 0.5%(v/v) 레시틴을 함유하는 수중유 에멀전이다. 변형된 SEAM 1/2는 5%(v/v) 스쿠알렌, 1%(v/v) 스팬(SPAN)(등록상표) 85 세정제, 0.7% (v/v) 트윈(Tween) 80 세정제, 2.5%(v/v) 에탄올, 100㎍/㎖ Quil A, 및 50㎍/㎖ 콜레스테롤을 포함하는 수중유 에멀전이다. 백신에 포함될 수 있는 다른 면역조절제는, 예를 들어, 하나 이상의 인터류킨, 인터페론 또는 다른 공지된 사이토카인을 포함한다.
본 발명의 백신은 선택적으로 본 발명의 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 지속 방출을 위해 제형화될 수 있다. 이러한 지속 방출 제형의 예로는, 예를 들어, 폴리(락트산), 폴리(락틱-코-글라이콜산), 메틸셀룰로스, 하이알루론산, 콜라겐 등과 같은 생체적합성 중합체들의 복합체와 조합하여 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 약물 전달 비히클 중에서의 분해성 중합체의 구조, 선택 및 사용은, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3: 279-292]을 포함하는 몇몇 간행물에서 검토되어 있다. 약제학적 제형에서 중합체를 선택하고 사용하는데 추가적인 지침은 당업계에 공지된 텍스트, 예를 들어, 본 명세서에 또한 참조로 포함되는 문헌들[M. Chasin and R. Langer (eds), 1990, "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems": Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 45, M. Dekker, N.Y.]에서 찾을 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 바이러스, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 마이크로캡슐화되어 투여 및 효능을 개선시킬 수 있다. 항원을 마이크로캡슐화하는 방법은 당업계에 충분히 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제3,137,631호; 미국 특허 제3,959,457호; 미국 특허 제4,205,060호; 미국 특허 제4,606,940호; 미국 특허 제4,744,933호; 미국 특허 제5,132,117호; 및 국제특허공개 WO 95/28227호(이들 문헌은 모두 본 명세서에 참조로 포함됨)에 기재된 기법을 포함한다.
리포좀은 또한 바이러스, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 지속 방출을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 리포좀 제형의 제조 및 사용방법에 관한 상세는 특히 미국 특허 제4,016,100호; 미국 특허 제4,452,747호; 미국 특허 제4,921,706호; 미국 특허 제4,927,637호; 미국 특허 제4,944,948호; 미국 특허 제5,008,050호; 및 미국 특허 제5,009,956호(이들 문헌은 모두 본 명세서에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다.
상기 기재한 임의의 백신들의 유효량은 저용량의 바이러스, 바이러스 단백질 또는 바이러스 벡터로 시작한 다음, 효과를 모니터링하면서 투약량을 증가시키는 통상적인 수단에 의해 결정될 수 있다. 유효량은 백신의 1회 투여 후에 또는 백신의 다회 투여 후에 얻어질 수 있다. 동물마다 최적의 용량을 결정할 때, 공지된 인자를 고려할 수 있다. 이들은 동물의 종, 크기, 연령 및 일반적 상태, 동물 내의 다른 약물의 존재 등을 포함한다. 실제 투약량은 바람직하게는 다른 동물 연구로부터의 결과를 고려한 후 선택된다(예를 들어, 이하의 실시예 2 및 3 참조).
적절한 면역 반응이 달성되었는지의 여부를 검출하는 하나의 방법은 백신접종 후 동물에서 혈청전환 및 항체 역가를 결정하는 것이다. 백신접종 시간 및 추가접종의 수는, 만약에 있다면, 모든 관련 있는 인자(이들 중 일부는 위에 기재되어 있음)의 분석에 기초하여 의사 또는 수의사에 의해 바람직하게 결정될 것이다.
본 발명의 바이러스, 단백질, 감염성 DNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 유효한 용량은, 백신접종되는 동물의 체중과 같은 당업자에 의해 결정될 수 있는 인자를 고려하여, 공지된 기법을 이용해서 결정될 수 있다. 본 발명의 백신에서 본 발명의 바이러스의 용량의 범위는 바람직하게는 약 101 내지 약 109pfu(플라크 형성 단위), 더 바람직하게는 약 102 내지 약 108pfu, 가장 바람직하게는 약 103 내지 약 107pfu이다. 본 발명의 플라스미드의 용량의 범위는, 바람직하게는 약 0.1㎎ 내지 약 100㎎, 더 바람직하게는 약 1㎎ 내지 약 10㎎, 더욱 더 바람직하게는 약 10㎎ 내지 약 1㎎이다. 본 발명의 백신에서 본 발명의 감염성 DNA 분자의 용량의 범위는, 바람직하게는 약 0.1㎎ 내지 약 100㎎, 더 바람직하게는 약 1㎎ 내지 약 10㎎, 더욱 더 바람직하게는 약 10㎎ 내지 약 1㎎이다. 본 발명의 백신에서 본 발명의 바이러스 벡터의 용량의 범위는, 바람직하게는 약 101pfu 내지 약 109pfu, 더 바람직하게는 약 102pfu 내지 약 108pfu, 더욱 더 바람직하게는 약 103 내지 약 107pfu이다. 적합한 투약 크기의 범위는, 약 0.5㎖ 내지 약 10㎖, 더 바람직하게는 약 1㎖ 내지 약 5㎖이다.
본 발명의 실시에 따른 바이러스 단백질 또는 펩타이드 백신을 위한 적합한 용량의 범위는, 일반적으로 용량 당 1 내지 50 ㎍, 또는 표준 방법에 의해 결정될 수 있는 더 많은 양이고, 애주번트의 양은 각각의 이러한 물질에 관하여 인식된 방법에 의해 결정된다. 돼지의 백신접종에 관한 본 발명의 바람직한 예에서, 동물에 대한 최적 연령 표적은 약 1 내지 21일이며, 이는 이유 전에 또한 다른 계획된 백신접종에, 예컨대, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 또는 PCV 등에 대해 대응될 수 있다. 추가적으로, 암퇘지 이유를 위한 백신접종의 바람직한 스케줄은 연간 재백신접종 스케줄과 유사한 용량을 포함할 것이다.
상기 기재된 백신들 중 임의의 것의 유효량은 저용량의 바이러스, 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 시작한 다음, 효과를 모니터링하면서 투약량을 증가시키는 통상적인 수단에 의해 결정될 수 있다. 유효량은, 백신의 1회 투여 또는 백신의 다회 투여 후에 얻어질 수 있다. 동물마다 최적의 용량을 결정할 때, 공지된 인자를 고려할 수 있다. 이들은 동물의 종, 크기, 연령 및 일반적 상태, 동물 내 다른 약물의 존재 등을 포함한다. 실제 투약량은 바람직하게는 다른 동물 연구로부터의 결과를 고려한 후 선택된다.
적절한 면역 반응이 달성되었는지의 여부를 검출하는 하나의 방법은 백신접종 후 동물에서 혈청전환 및 항체 역가를 결정하는 것이다. 백신접종 시간 및 추가접종의 수는, 만약에 있다면, 모든 적절한 인자(이들 중 일부는 위에 기재되어 있음)의 분석에 기초하여 의사 또는 수의사에 의해 바람직하게 결정될 것이다.
본 발명의 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 유효한 용량은, 백신접종되는 동물의 체중과 같은 당업자에 의해 결정될 수 있는 인자를 고려하여, 공지된 기법을 이용해서 결정될 수 있다. 예로서, 백신은 경구로, 비경구로, 진피내로, 피하로, 근육내로, 비강으로 또는 정맥으로 전달될 수 있다. 구강 전달은, 예를 들어, 동물의 사료 또는 음용수에 조성물을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 백신 투약량에 대한 인자는, 예를 들어, 돼지의 체중 및 연령을 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 PRRS 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함하는 백신의 제조방법을 추가로 제공하되, 이 방법은 본 발명의 PRRS 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 중 하나의 유효량을 약제학적 또는 수의과적 용도로 허용가능한 담체와 조합하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 생 약독화 백신은 공지된 재조합 기법을 사용하여 PRRS 바이러스 게놈 내로 삽입된 이종성 항원 에피토프를 암호화하기 위하여 미국 특허 제6,500,662호에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 이에 대해서는, 또한 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제7,132,106호를 참조한다. 본 발명에 대한 이종성 항원 에피토프로서 유용한 항원성 에피토프는 PRRS 바이러스 이외의 돼지 병원균으로부터의 항원 에피토프를 포함하며, 이는 돼지 파보바이러스, 돼지 써코바이러스, 돼지 로타바이러스, 돼지 인플루엔자, 위광견병 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 돼지 호흡기 코로나바이러스, 돼지 열병 바이러스, 아프리카 돼지열 바이러스, 뇌심근염 바이러스, 돼지 파라믹소바이러스, 토크 테노 바이러스, 악티노바실러스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실러스 수이스(Actinobacillus suis), 바실러스 안트라시(Bacillus anthraci), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 클로스트리디움 하에몰리티쿰(Clostridium haemolyticum), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 에리시펠로트릭스 루시오파티아(Erysipelothrix rhusiopathiae), 하에모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 렙토스피라 종(Leptospira spp .), 마이코플라스마 하이오뉴모니애, 마이코플라스마 하이오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 마이코플라스마 하이오시노비아(Mycoplasma hyosynovia), 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 살모넬라 콜레라에수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 스트렙토코커스 에퀴스밀리스(Streptococcus equismilis) 및 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)로 이루어진 군으로부터 선택된 돼지 병원균으로부터의 항원성 에피토프를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 위에서 언급된 돼지 병원균들로부터의 항원성 에피토프를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 월드와이드 웹 상의 공개된 유전자 데이터베이스, 예컨대, (미국) 국립생물공학정보센터로부터 젠뱅크로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 추가적인 특징 및 변형은 상세한 설명을 비롯한 본원의 전문으로부터 당업자에게 명백할 것이며, 이러한 모든 특징은 본 발명의 양태로서 의도된다. 마찬가지로, 특징들의 조합이 본 발명의 양태 또는 실시형태로서 상기에서 구체적으로 언급되었는지의 여부와 관계없이, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특징은 본 발명의 양태로서 또한 의도되는 추가적인 실시형태로 재차 조합될 수 있다. 또한, 본 발명에 중요한 것으로 본 명세서에 기재된 이러한 제한만이 고려되어야 하며; 중요한 것으로서 본 명세서에 기재된 적이 없는 제한을 두지 않은 본 발명의 변형은 본 발명의 양태로서 의도된다. 본 발명이 상기 설명 및 실시예에 특별히 기재된 바와 같은 것과는 달리 실행될 수도 있다는 것은 명확할 것이다.
본 발명의 수많은 변형 및 변화는 상기 교시에 비추어 가능하며, 따라서 본 발명의 범주 내이다.
다음의 실시예는 본 발명을 예시하지만, 본 발명을 제한하지 않는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1
PRRSV 단리물 P129의 PK-9 세포에 대한 적응 및 약독화
퍼듀 대학(Purdue University)의 동물 질병 진단 연구소에서 1995년에 인디애나주의 병든 돼지로부터 악성 PRRS 단리물 P129를 단리시켰다. 이 돼지로부터의 혈청 샘플을 매우 건강한 상태의 돼지에서 1회 계대시켜 혈청 및 폐 균질물(homogenate) 저장액을 확장시켰다. 혈청 및 폐 균질물로부터 바이러스 RNA를 추출하고, 이를 사용하여 P129 계대 0 바이러스의 완전 게놈 공통서열을 결정하였다. RNA를 우선 무작위 헥사머로 프라이밍시키고, 이를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 고 정확도(프루프리딩: proofreading) PCR을 사용하여 3개 중첩 조각에서 게놈을 증폭시켰다. 3회의 별개 PCR 반응(게놈 분절 당)으로부터의 PCR 산물을 T/A 클로닝시켜, DNA 서열분석을 위해 사용하여 전장 게놈 공통서열을 작성하였다(서열번호 1 참조).
P129 계대 0을 함유하는 DNA 서열분석을 위해 사용한 동일한 돼지 혈청의 분액을 사용하여 1차 돼지 폐포 대식세포(porcine alveolar macrophage: PAM) 세포를 감염시켰다. PAM 감염으로부터의 자손 바이러스(계대 1)를 0.1 ㎛ 주사기 필터를 통해 여과시키고, 이를 사용하여 PK-9 세포를 감염시켰다.
PK-9 세포는 돼지 CD163 유전자 및 네오마이신 저항 유전자의 결실 형태를 암호화하는 플라스미드로 PK0809 돼지 신장 세포주를 안정적으로 형질감염시킴으로써 유래된 이식유전자 세포주이다. PK-9 세포주의 구축 및 특성규명의 상세한 설명은 앞서 기재되었다.
PAM 세포로부터 PK-9 세포에 대한 성장까지의 계대 1 바이러스의 적응은 어려우며, 다수의 유사한 계통에 의한 몇몇 시도를 필요로 하였다. 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질(미국 사우스다코타주 브루킹스에 소재한 루랄 테크놀로지즈 인코포레이티드(Rural Technologies Inc))에 특이적인 FITC-컨쥬게이트된 단클론성 항체 SDOW17을 사용하여 복제 웰의 면역형광에 의해 감염을 모니터링하였다. 조기 계대는 소수의 작은 군집을 초래하였지만, 신선한 단일층의 감염을 개시하기 위한 충분한 무세포 바이러스 입자를 만들지는 못하였다. 감염된 단일층을 아큐타제(Accutase)(트립신 치환물)로 처리하고, 미감염 PK-9 세포의 첨가에 의해 또는 첨가 없이, 신선한 배지를 구비한 다수의 웰에 세포를 재차 파종함으로써 이들 계대를 수행하였다. 몇몇 이러한 계대 후에, 일부 계통은 형광 군집의 빈도 및 크기에서 명확한 증가를 나타내었다. 이들 중 일부는 무세포 바이러스 유체를 사용하여 계대되는 능력을 획득하였다. 계대 17(PAM 세포에 대해 1, PK-9에 대해 16)에 의해, 하나의 계통이 이전의 계대로부터 무세포 유체의 희석액을 사용하여 신뢰성 있게 지속될 수 있었고, 며칠 내에 전체 단일층의 감염을 초래하였다. 바이러스는 임의의 계대 수준에서도 PK-9 세포에 대한 세포병변효과를 야기하지 않았다. 바이러스 계대 17에서 감염된 PK-9 세포로부터 RNA를 추출하고, 이를 사용하여 감염성 cDNA 클론을 구축하였다.
실시예 2
P129-PK 계대 17의 감염성 cDNA 클론의 구축
상기한 바와 같은 백본 플라스미드를 사용하여, P129-PK 계대 17 바이러스의 감염성 cDNA 클론을 구축하였다. 중첩 영역에서 자연적으로 생긴 고유한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 지니는 3개의 중첩 분절에서 바이러스의 게놈을 역전사 및 PCR에 의해 증폭시켰다. 3회의 개별의 PCR 반응으로부터의 산물을 클로닝시키고, 서열분석 후, 정렬시켜, 각 게놈 분절에 대한 공통서열을 작성하였다. 주어진 분절의 3개의 클로닝 산물 중 임의의 것도 그 분절에 대한 공통서열의 예측된 아미노산 서열과 매칭되지 않았다면, 클론들 중 하나는, 공통서열의 예측된 아미노산 서열과 매칭될 때까지 서브클로닝 및/또는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 변형시켰다. 표준 클로닝 기법 및 제한 엔도뉴클레아제 부위를 사용하여 3개의 게놈 분절와 플라스미드 백본을 연결하였다. pCMV-S-P129-PK17-FL이라 지칭되는 얻어진 전장 클론은, PK-9 세포 내로 형질감염시켰을 때, 감염성이었다. 이 감염성 cDNA 클론의 서열은 서열번호 2로 부여되어 있다. 게놈은, 진정한 말단을 지니는 그것이 구축되는 계대 17 바이러스와 본질적으로 동일하고, 계대 17의 공통서열에 관하여 어떠한 삽입이나 결실도 결여되어 있다. 이 감염성 cDNA 클론의 바이러스 게놈 내에 유전자조작된 제한 부위 또는 다른 표적화된 변화는 없다.
P129 계대 0의 완전 게놈 공통서열과 감염성 클론 pCMV-S-P129-PK17-FL의 게놈 서열 간의 뉴클레오타이드 및 아미노산 차이를 표 6에 개별적으로 나열한다. 표 6은 모든 뉴클레오타이드 차이 및 게놈 위치에 의해 얻어진 아미노산 차이를 포함한다. 이들 돌연변이의 서브세트는 IFN 저해(계대 0)로부터 IFN 비저해까지의(계대 17 감염성 cDNA 클론으로부터 유래된 모든 바이러스) 표현형의 변화를 초래한다. 표 7은 PRRSV 오픈 리딩 프레임(ORF) 또는 비구조적 단백질(nsp)에 의한 뉴클레오타이드, 아미노산 및 비보존 아미노산 차이를 요약한다. 표 7의 목적을 위해, 그 중에서, 다음의 아미노산 그룹, 즉, [K, R], [D, E], [L, I, V, A] 및 [S, T]가 보존적인 것으로 여겨진다.
실시예 3
P129-PK 계대 17에서의 결실 돌연변이체
5개의 유전자 변형된 감염성 클론을 작성하기 위하여, 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129-PK17-FL 내에 게놈의 2개 영역의 결실을 공학적으로 조작하였다.
변형을 받은 게놈의 1개 영역은 뉴클레오캡시드 단백질(PRRSV ORF 7에 의해 암호화됨)의 아미노산 위치 41 내지 47에 위치된 핵 편재화 서열(NLS)이었다. 두 가지 유형의 결실이 행해졌다. 이들 결실은 다른 PRRSV 감염성 클론의 맥락에서 이미 기재한 바 있다. 아미노산 잔기 41 내지 49의 야생형 서열은 PG…KN이다. "PG--KS"로도 알려진 돌연변이체 "d43/44"에서, 라이신 잔기 43 및 44를 결실시키고, 아스파라긴 잔기 49를 세린으로 변화시킨다. "PG--S-KS"로도 알려진 돌연변이체 "d43/44/46"에서, 라이신 잔기 43, 44 및 46을 결실시키고, 아스파라긴 잔기 49를 세린으로 변화시킨다. 이들 결실을 포함하는 pCMV-S-P129-PK17-FL로부터 유래된 감염성 클론은 각각 pCMV-S-P129-PK17-d43/44 및 pCMV-S-P129-PK17-d43/44/46이다. 이에 대해서는, 미국 특허 제7,544,362호를 참조한다.
변형을 받은 게놈의 제2 영역은 ORF1a 내에서 nsp2의 초가변 영역에 있었다. 131개의 아미노산(393개의 뉴클레오타이드)의 결실은 다른 PRRSV 감염성 클론의 맥락에서 이미 기재한 바 있다. 이 결실을 내포하는 pCMV-S-P129-PK17-FL로부터 유래된 감염성 클론은 pCMV-S-P129-PK17-nsp2이다.
NLS 및 nsp2 결실을 겸비하는 감염성 클론들이 또한 pCMV-S-P129-PK17-FL 백본 내에 작성되었으며, 이들은 pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44 및 pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44/46로 명명되었다.
실시예 4
PK-9 세포에 대한 바이러스의 생성 및 성장
실시예 3에서 기재한 6개의 감염성 클론을 PK-9 세포 내로 형질감염시켜 표 1에서 나타낸 바와 같은 6개의 바이러스를 생성하였다. 리포펙타민 2000을 사용하여 PK-9 세포 내로 원형 플라스미드의 직접적 형질감염에 의해 이들 감염성 클론으로부터 바이러스를 만들었다. 형질감염 후, 회수한 바이러스를 재차 PK-9 세포 상에서 연속 계대배양시켜 역가를 추가로 증가시키고 독력을 약독화시켰다. 백신 후보로서 시험관내 테스트 및 생체내 평가를 위한 저장액을 만들었다. 미변형 pCMV-S-P129-PK17-FL 감염성 클론으로부터 유래된 P129-PK17-FL 바이러스의 경우에, 돼지로부터 총 52 계대에 도달될 때까지 바이러스를 배양시켰다. 이 바이러스의 완전 게놈을 계대 24(서열번호 3) 및 52(서열번호 6)에서 서열분석하였다.
실시예 5
P129-PK 계대 17 감염성 cDNA 클론으로부터 유래된 바이러스는 IFN -α 유도를 저해하는 감소된 능력을 가진다
바이러스 및 세포. MARC-145 및 ST 세포를 5% 소태아 혈청(fetal bovine serum: FBS) 및 항생제(50㎍/㎖ 겐타마이신, 100UI 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신)로 보충한 변형된 이글 배지(modified Eagle's medium: MEM)에서 성장시켰다. 돼지 폐포 대식세포 ZMAC-1 세포를 10% FBS로 보충한 RPMI-1640에서 성장시켰다. TGE 바이러스 균주 퍼듀(Purdue)를 변형된 이글 배지 중 다중도 0.01에서 컨플루언트(confluent) ST 세포 단일층의 감염에 의해 준비하였다. 1시간 후 바이러스 접종원을 제거하고, 5% CO2 분위기 중 37℃에서 2.5% FBS로 보충한 MEM에서 세포를 인큐베이션시켰다. 80% 세포병변 효과가 관찰된 후에 세포 단일층을 동결 및 해동시킴으로써 바이러스를 방출하였다. TGE 바이러스 저장액을 3,500rpm에서 4℃에서 15분 동안 원심분리시키고, 사용까지 -80℃에서 저장하였다. (PK-9 세포로부터의) 바이러스 저장액은 다음과 같았다: P129-PK-FL 및 P129-PK-dnsp2-d43/44/46은 계대 8/25에 있었다(감염성 클론으로부터 8, 돼지로부터 25). 다른 네 가지 바이러스(P129-PK-d43/44, P129-PK-d43/44/46, P129-PK-dnsp2 및 P129-PK-dnsp2-d43/44)는 계대 21/38에 있었다. 상업적 백신 인겔백 PRRS MLV 및 인겔백 PRRS ATP를 제조사의 설명서에 따라 재구성하고, 감염을 위해 직접 사용한 것을 제외하고, ZMAC-1 세포에 대한 단일 계대를 행함으로써 다양한 PRRS 바이러스의 작업 저장액을 준비하였다.
돼지 PBMC의 단리. 갓 헤파린 처리한 정맥혈을 행크(Hank)로 희석시키고, 피콜-하이파크 1077(Ficoll-Hypaque 1077)(시그마) 구배를 통한 밀도 원심분리에 의해 PBMC를 단리시켰다. 세포를, 행크로 2회 세척한 후, 5% 소태아혈청(집코(Gibco)), 100U/㎖ 페니실린, 0.1㎎/㎖ 스트렙토마이신, 1mM 피루브산나트륨, 1x 비필수 아미노산(메디아테크) 100U/㎖ 겐타마이신 및 250mM 2-머캅토에탄올(시그마)로 보충한 L-글루타민(메디아테크(Mediatech))을 지니는 RPMI 배지에 현탁시켰다.
돼지 형질세포양 수지상 세포의 정제. 돼지 형질세포양 수지상 세포의 정제는 상기한 바와 같이 행하였으며(칼자다-노바(Calzada-Nova), 제출함), 이는 이들 세포에 의한 CD4 및 CD172의 특징적 발현에 기반하였다(Summerfield et al., 2003). 요약하면, 신선한 돼지 PBMC를 0.5% BSA와 함께 PBS 중에서 현탁시키고, 돼지 CD172(74-22-15, VMRD)를 인식하는 최적량의 mAb로 표지하였다. 세포를, 1회 세척한 후, 이어서 PE(서던 바이오테크(Southern Biotech))에 컨쥬게이션된 2차 염소 항마우스 항체와 함께 인큐베이션시키고, 세척한 후, FITC를 항-CD4(74-12-4, VMRD)로 표지하였다. PDC를 반사 세포 분류기(Reflection Cell Sorter: iCyt) 상에서 분류하였고, 분류 게이트를 CD4+/CD172low 집단에 대해 설정하였다. 분류 후, 세포의 순도를 재분석에 의해 확인하였다. 모든 경우에, 순도는 95%를 초과하였다.
사이토카인 분비의 측정에 대한 검정. PBMC 또는 PDC를 상이한 자극원에 의해 16시간 동안(37℃, 5% CO2) 자극시키거나 또는 모의자극시켰다. 인큐베이션 후, 자극한 세포 위에 놓인 배지에 대해서, 상업적으로 입수가능한 단클론성 항체(항-돼지 IFN-α mAbs K9 및 F17)에 의해 제조한 샌드위치 ELISA를 사용하여 IFN-α의 존재를 검정하였다. 요약하면, 이뮬론(Immulon) II 플레이트(다이나테크 인코포레이티드(Dynatech Inc.))를 밤새 4℃에서 인큐베이션에 의해 항돼지 IFN-α mAb F17(PBL 래버러토리즈)로 코팅한 후, 5% 소태아 혈청으로 보충한 RPMI 배지로 차단하였다. 1시간 후, 배지를 폐기하였고, 시험할 50 ㎕의 상청액을 검정용 웰에 2회 첨가하였다. 1시간 인큐베이션 후, 검정용 웰을 4회 세척한 다음, 바이오틴 표지된 항-돼지 IFN-α mAb K9(PBL 래버러토리즈), HRP-컨쥬게이트된 스트렙타비딘(자이메드 래버러토리즈(Zymed Laboratories)) 및 TMB 기질(KPL)과 함께 순차적으로 인큐베이션시켰다. ELISA 플레이트 판독기를 이용해서 광학 밀도를 결정하였다.
P129-PK 계대 17 감염성 cDNA 클론으로부터 유래된 바이러스는 IFN-α 유도를 저해하는 능력이 없다. 돼지 폐포 대식세포 세포주 ZMAC-1을 이용하여 네 가지 상이한 PRRS 야생형 바이러스 단리물(P3412, P129, IND5, NADC20)의 그룹으로부터 작업 바이러스 저장액을 준비하였다. 또한 PK-9, FK.D4 또는 MARC-145 세포에서 반복된 계대에 의해 세포 배양물에서 성장시키는데 적합한 처음 두 가지 야생형 바이러스의 유도체로부터 추가적인 저장액을 준비하였다. 네 가지 야생형 단리물 중 3가지(P129, IND5, NADC20)는 약 107 TCID50/㎖의 역가로 ZMAC-1 세포에서 용이하고 효율적으로 성장한 반면, P3412 야생형 단리물은 단지 105 TCID50/㎖의 역가에 도달하였다. 주목할 만하게, ZMAC-1 세포주에서 준비한 P129 바이러스의 저장액은 바이러스에 적합한 PK-9 또는 MARC-145 세포에서 얻어진 것보다 10배 더 높은 역가에 도달하였다. PBMC에 의해 IFN-α 분비를 자극하는 이들 바이러스 능력의 시험은, 한 가지 예외로(단리물 P3412 클론 C), 테스트한 PRRS 바이러스 저장액 중 임의의 것에 대해 그의 노출에 반응하여 이들 세포에 의해 매우 소량(50pg 미만)의 IFN-α가 분비되었다는 것을 나타내었는데, 이는 돼지 코로나바이러스, 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus: TGEv)에 대한 그들의 노출의 결과로서 동일한 세포에 의해 생산된 IFN-α의 풍부한 분비(17,540 pg)에 비해 무시할 만하다.
PRRSV는 돼지 PBMC에 의해 IFN-α 생산을 자극할 뿐만 아니라 그의 생산을 적극적으로 저해한다. PRRSV의 존재 또는 부재 시 TGEv에 대한 노출에 반응하여 PBMC에 의해 분비된 IFN-α의 양을 측정함으로써 PRRSV 저장액의 저해 효과를 결정하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 모두 네 가지의 테스트한 야생형 PRRS 바이러스 단리물뿐만 아니라 모든 세포 배양 적응 유도체는, TGEv에 대한 PBMC의 IFN-α 반응에 대해 강한 저해 효과(80% 초과)를 나타내었다. 전장 P129-PK-FL 바이러스 및 몇몇 유전적으로 조작된 결실 돌연변이체를 포함하는, 감염성 cDNA 클론으로부터 유래된 바이러스 저장액 그룹(pCMV-S-P129-PK17-FL)의 분석을 수행하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 모 야생형 단리물 P129(계대 1)의 강한 저해 효과(95%)와 비교할 때, P129-PK-FL 바이러스 및 모든 결실 돌연변이체는 PBMC에서 TGEv에 의한 IFN-α의 유도를 저해하는 유의하게 감소된 능력을 나타내었다. 이들 바이러스의 IFN-α 표현형을 더욱 평가하기 위하여, 후속적 실험은 P129-PK-FL과 P129-PK-d43/44 바이러스, 모 P129 야생형 균주, 및/또는 베링거인겔하임(Boehringer Ingelheim)에 의해 생산된 두 가지의 상업적으로 입수가능한 변형된 생 PRRSV 백신(인겔백 PRRS MLV 및 인겔백 PRRS ATP)의 직접 비교를 수행하는데 중점을 두었다. 추가적인 낮은 계대 기준 단리물인 NVSL-14를 또한 테스트하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 네 가지의 독립적 실험에서, P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44는 모 P129 바이러스, 두 가지의 인겔백 약독화 균주, 또는 기준 균주보다 유의하게 더 낮은 IFN-α 저해 효과를 나타내었다. 일례에서, P129-PK-FL 또는 P129-PK-d43/44 바이러스에 의한 공동감염은 TGEv에 대한 IFN-α 반응의 명확한 향상을 초래하였다.
표 2에 나타낸 결과는 세포 배양물에서 성장에 적합한 야생형 PRRS 바이러스 및 유도체의 인터페론-α 저해 효과를 나타낸다. 표기된 PRRS 바이러스 저장액을 ZMAC-1 세포에서 성장시키고, 이들 새로 작성한 저장액의 역가를 ZMAC-1 세포를 사용하여 결정하였다. TGE 바이러스의 존재 또는 부재 시 상기 표기된 PRRS 바이러스 저장액에 18시간 동안 노출된 돼지 말초 혈액 단핵 세포의 배양 상청액에 존재하는 IFN-α의 양을 ELISA에 의해 결정하였다. *TGEv 단독에 대한 반응.
표 3에 나타낸 결과는 CD163-발현 PK-9 세포에서 성장하는데 적합한 야생형 PRRS 바이러스 P129 및 그의 유전적으로 조작된 유도체의 인터페론-α 저해 효과를 입증한다. TGE 바이러스의 존재 또는 부재 시 표기된 PRRS 바이러스 저장액에 대해 18시간 동안 노출된 돼지 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 배양 상청액에 존재하는 IFN-α의 양을 ELISA에 의해 결정하였다. *TGEv 단독에 대한 반응.
표 4는 야생형 P129 바이러스 및 PRRS 인겔백 백신에 비해 P129-PK-FL 바이러스 및 P129-PK-d43/44 바이러스의 감소된 인터페론-α 저해 효과를 나타낸다. TGE 바이러스의 존재 또는 부재 시 표기된 PRRS 바이러스 저장액에 대해 18시간 동안 노출된 돼지 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 배양 상청액에 존재하는 IFN-α의 양을 ELISA에 의해 결정하였다. *TGEv 단독에 대한 반응.
TGEV에 대한 노출에 반응하여 PBMC에 의해 분비된 다량의 IFN-α는 0.3% 미만의 PBMC 집단을 포함하는 세포의 서브세트로부터 주로 유래된다. 이 덜 빈번하지만 중요한 세포 서브세트는 형질세포양 수지상 세포(PDC)로 구성되는데, 이는 특징적 형질세포 유사 형태 때문에 이런 명칭을 부여받았다. P129-PK-FL 바이러스 및 P129-PK-d43/44 바이러스의 IFN-α 표현형을 더욱 검사하기 위하여, 95%를 초과하는 순도로 PBMC로부터 갓 단리된 PDC를 이용한 것을 제외하고, 상기 기재한 것과 마찬가지로 일련의 실험을 수행하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 이런 일련의 실험은 P129-PK-FL 바이러스 및 P129-PK-d43/44 바이러스가 TGEV에 의한 IFN-α 유도의 무시할만한 저해를 야기하였다는 것을 확인하였다. 더 나아가, 하나의 실험에서 P129-PK-FL 바이러스 및 P129-PK-d43/44 PRRS 바이러스에 반응하여 PDC에 의한 TGEV-매개 IFN-α 유도에 대해 명확한 증대 효과가 관찰되었다. 대조적으로, 인겔백 PRRS MLV 바이러스는 도 1에 나타낸 바와 같이 IFN-α 반응에 대해 강한 저해 효과를 나타내었다.
실험 부문에서 기재한 결과는 P129-PK-FL 바이러스 및 P129-PK-d43/44 PRRS 바이러스뿐만 아니라 pCMV-S-P129-PK17-FL 감염성 cDNA 클론의 다른 유도체가 감염된 PBMC 또는 PDC 세포에서 TGEV에 의해 IFN-α의 유도를 저해하는 능력이 크게 감소되었다는 것을 나타낸다. 이는 야생형 (낮은 계대) PRRS 바이러스에 의해 그리고 두 가지의 상업적으로 입수가능한 변형된 생 바이러스 백신(인겔백 PRRS MLV 및 인겔백 PRRS ATP)에 의해 관찰된 IFN 억제 효과와 현저하게 대조적이다. P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44 바이러스가 PDC들의 이런 중요한 기능을 최소로 억제했다고 하는 관찰은, 이들 세포가 바이러스 감염에 대해 선천성 면역을 매개하는 것에서 중요한 역할을 하는 것을 고려하면, 잠재적으로 유의하다.
또한 본 발명은 CD163 수용체를 재조합적으로 발현시키는 허용적 세포 상에서 성장에 적합한 임상적으로 효과적인 상업적 백신 바이러스를 제공하고, 이러한 바이러스 및 백신이 조직학적 "유인원 세포" 배양 기법에 의존하지도 않고, 또는 유인원 세포 배양 기법에 의한 임의의 시점에서 발생하지도 않는다는 것을 주목하여야 한다. 이에 대해서는, 구체적으로 미국 특허 제7,754,464호를 참조한다.
실시예 6
백신 후보의 안전성 및 효능
PRRS에 대한 백신으로서 이들의 안전성 및 효능을 평가하기 위해, pCMV-S-P129-PK17-FL 감염성 cDNA 클론, P129-PK-FL(계대 7/24), P129-PK-d43/44(계대 17/34) 및 P129-PK-d43/44/46(계대 17/34)으로부터 유래된 바이러스 중 3개를 어린 돼지 호흡기 질병 모델에서 평가하였다. 이들 바이러스의 유래를 도 8에 나타내고, 실험 설계(처리군)를 표 5에 열거한다. 낮은 계대 악성 PRRSV 단리물 NADC20을 사용하여 7주령(백신접종 후 4주)에 이종성 시험감염을 위해 사용하였다. 대조 처리군은 모의 백신 및 상업적 PRRS 백신 인겔백 MLV를 포함하였다.
미처리(Non-treated: NT)군은 다음과 같았다: NT1 돼지들은 공급원 돼지의 건강상태를 모니터링하기 위한 파수 역할을 하였다. 그들을 별도로 수용하였고, PRRSV 시험감염 전에 검시하였다. NT2 돼지들을 각각 T02 내지 T05에 대해서 처리군 당 총 2마리인 백신접종 돼지의 2개의 우리 사이의 하나의 우리에서 별도로 수용한 대조군과 접촉시켰다. NT3 돼지들을 처리군(T01 내지 T05) 당 총 2마리인 백신접종한 돼지가 있는 우리마다 한 마리씩 수용한 대조군과 접촉시켰다. NT3 돼지들만을 T01 그룹에 할당하였다.
백신접종 후에 백신접종한 동물의 직장 온도를 측정하고, T01(모의 백신) 처리군과 비교하였다. 결과를 도 1에 나타낸다. 백신 중 임의의 것도 열을 유발하지 않았다. 모든 그룹은 백신접종 후 관찰 기간 내내 평균 104℃ 미만이었다.
시험감염 후에 돼지의 직장 온도를 측정하였다. 결과를 도 2에 나타낸다. 백신접종하지 않은 T01 돼지는 104℃ 초과의 열이 지속되었다. 대조적으로, 백신들 중 세 가지는 시험감염 후 발열이 유의하게 감소되었다. P129-PK-FL은 발열을 감소시키는데 가장 효과적이었다.
동물의 체중을 백신접종 전 및 후에 기록하였다. 결과를 도 3에 나타낸다. 체중을 연구의 -제1일(백신접종 전), 제10일, 제24일, 제27일(시험감염 전) 및 제37일에 기록하였다. 백신접종하지 않은 돼지에서, 악성 NADC20 바이러스에 의한 시험감염은 10일 관찰 기간 동안 체중 증가가 거의 완전하게 제거되었다. 백신은 다양한 정도로 이 효과를 무효화하였다.
시험감염 후 검시할 때 시험감염한 동물의 폐를 검사하였다. 병변에 관여된 각 폐의 백분율을 도 4에 나타낸다. T01 모의 백신 그룹은 폐 병변 관여도가 평균 25.1%였다. 백신은 다양한 정도로 폐 병변을 감소시켰다. P129-PK-FL은 가장 효능있었고, 폐 병변 관여도를 1.1%로 감소시켰다.
폐 병변의 중증도를 도 5에 나타낸 바와 같은 폐 평가 스코어(lung assessment score: LAS)를 사용하여 평가하였다. 백신 중 3가지는 LAS가 감소되었다. P129-PK-FL은 모의 백신접종 그룹에서 평균 LAS가 1.63으로부터 0.14로 감소되었다.
PRRSV에 대한 혈청 항체를 백신접종과 시험감염 둘 다에 의해 유발하였다. IDEXX ELISA S/P 비를 연구의 제27일 및 제37일에 측정하였다. 결과를 도 6에 나타낸다. P129-PK-FL에 의한 백신접종은 가장 높은 항-PRRS 항체 수준을 유발하였다.
시험감염시킨 돼지 혈청에서의 바이러스혈청을 PAM 세포에 대해 적정하였다. 결과(TCID50/㎖)를 도 7에 제공한다. P129-PK-FL은 시험감염 후 바이러스 혈증을 감소시키는데 가장 효과적이었다.
본 발명은 상기 실시예 및 부속 문서들(이들 각각의 전체 내용은 그들의 전체가 참조로 포함됨)를 참조하여 기술되었지만, 변형 및 변화가 본 발명의 정신과 범주 내에 포함되는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 다음의 특허청구범위에 의해서만 제한된다.
실시예 7
감염성 cDNA 클론 PCMV -S-P129로부터 감염성 cDNA 클론 PCMV -S-P129-PK17-FL의 유도
본 발명 pCMV-S-P129-PK17-FL의 PRRSV 감염성 cDNA 클론은 상기한 PRRSV 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129로부터 부위-지정 돌연변이유발 기법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 유도될 수 있다. PRRSV 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129는 미국 특허 제6,500,662호에 기재되어 있으며, ATCC에 수탁번호 203489 하에 기탁되어 있다. 이 클론에서 PRRSV 게놈의 DNA 서열은 또한 수탁번호 AF494042로서 젠뱅크(NCBI) 데이터베이스에서 입수가능하다. 부위-지정 돌연변이유발 키트는 다수의 공급업자로부터 상업적으로 입수가능하며, 거대 플라스미드 내의 다수의 부위에서 수많은 동시 뉴클레오타이드 변화를 만들 수 있다. 이러한 키트는 체인지-아이티(Change-IT)(상표명) 다중 돌연변이 부위-지정 돌연변이유발 키트(아피메트릭스(Affymetrix)/USB), 퀵체인지 라이트닝 다중 부위-지정 돌연변이유발 키트(QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit)(애질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies) - 스트라겐(Stratagene) 제품), 및 AMAP 다중 부위-지정 돌연변이유발 키트(MBL 인터내셔널(International))을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
PRRSV 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129(ATCC로부터 입수가능)와 본 발명 pCMV-S-P129-PK17-FL의 PRRSV 감염성 cDNA 클론 사이의 뉴클레오타이드 변화 목록을 표 8에 제시한다. 모든 변화는 게놈의 단백질 암호 영역에 있다. 상업적 부위-지정 돌연변이유발 키트에 의해 74개의 돌연변이유발 프라이머 및 다수의 순차적 반응을 이용하여 pCMV-S-P129 감염성 클론에 도입될 수 있는 총 74개의 뉴클레오타이드 변화가 있으며, 이것으로 본 명세서에 기재된 pCMV-S-P129-PK17-FL에 대한 서열과 동일한 플라스미드 분자를 얻는다. 실제로, 74개보다 적은 돌연변이유발 프라이머에 의해 동일한 결과를 얻을 수 있는데, 그 이유는 서로의 약 50 내지 60개의 뉴클레오타이드 내에서의 돌연변이 클러스터는 단일 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 변화시킬 수 있기 때문이다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 735, 750 및 756은 단일 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 변화시킬 수 있으며, 뉴클레오타이드 965, 992 및 1009도 마찬가지일 수 있다. 따라서, 프라이머의 수는 약 60까지 감소된다.
74개의 뉴클레오타이드 변화 중에서, 대다수(42개)는 동의적 또는 "침묵"인데, 이는 그들이 동일한 아미노산을 암호화한다는 것을 의미한다. 이들 뉴클레오타이드 변화는 바이러스의 인터페론 유도 또는 저해 표현형에 대해 임의의 측정가능한 효과를 가질 가능성이 없다. 나머지 32개의 뉴클레오타이드 변화는 비동의적이거나 또는 "비침묵"이고, 바이러스 단백질에서 아미노산 변화를 초래한다. 이들 32개의 뉴클레오타이드 변화는 바이러스의 인터페론 유도/저해 표현형을 직접적으로 초래하는 것으로 예측되며, 감염성 클론 pCMV-S-P129에 의해 암호화된 바이러스를 감염성 클론 pCMV-S-P129-PK17-FL에 의해 암호화된 바이러스에 의해 제시된 바와 같은 동일한 인터페론 표현형으로 전환하도록 변화되어야 한다. 관련된 뉴클레오타이드들의 일부를 클러스터링하는 것을 고려하지 않는다면, 이러한 변화는 최대 32개의 돌연변이유발 프라이머를 필요로 한다.
실시예 8
감염성 cDNA 클론 PCMV -S-P129-PK17-FL의 데노보 합성(de novo synthesis)
부위-지정 돌연변이유발에 대한 대안으로서, 본 발명의 PRRS 바이러스 게놈을, 적절한 5' 및 3' 어댑터 서열을 이용해서 화학적으로 데노보 합성하여, PRRS 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129(수탁번호 203489로서 ATCC로부터 입수가능)에 사용되는 플라스미드 백본 또는 유사한 플라스미드 백본으로 클로닝할 수 있다. 50kb를 초과하는 길이의 유전자의 관습적 합성(PRRSV 게놈은 약 15.5 kb임)은, 젠스크립트(GenScript), DNA 2.0, 및 바이오 베이직 인코포레이티드(Bio Basic Inc.)를 포함하는(이들로 제한되지 않음) 수많은 공급업체로부터의 상업적 서비스로서 이용가능하다. 합성 바이러스 게놈은 게놈에 측접하는 5' PacI 및 3' SpeI 제한 효소 부위를 사용하여 감염성 클론 pCMV-S-P129에서 바이러스 게놈을 대체함으로써 pCMV-S 벡터 내로 방향성 클로닝된다. 합성 게놈을 절단하기 위해, 24-뉴클레오타이드 연장부(5'-GCAGAGCTCGTTAATTAAACCGTC-게놈-3', 이는 밑줄친 PacI 부위를 포함함)는 합성 게놈의 5' 단부에 들어가고, 83-뉴클레오타이드 연장부(5'-게놈-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCATATTTAAATCCCAAGCCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGAGCGGCCGC-3', 이는 밑줄친 SpeI 부위를 포함함)는 합성 게놈의 3' 단부에 들어간다. PacI 및 SpeI를 이용한 플라스미드 및 합성 게놈의 절단 후, 적절한 단편을 정제하고, DNA 리가제를 사용해서 연결시키고 나서, 당업자에게 잘 공지된 표준 클로닝 기법을 사용하여 선별 및 증식을 위해 에스케리키아 콜라이 내로 형질전환시킨다.
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실시예 9
P129- PKC12 -FL 바이러스로 이루어진 백신은 1일령 돼지에서 사용하는데 안전하며, 적어도 26주 동안 효능이 있다.
기존의 PRRS 변형된 생백신은 2주령 이상의 돼지에서의 사용에 대해서만 권장된다. 계대 57에서 약독화된 P129-PKC12-FL 바이러스(2㎖ 용량에서 2.13 log10 TCID50 )가 1일령 신생 돼지에서 사용에 대해 안전하며, 백신접종 후 6개월(26주)까지 악성 이종성 시험감염에 대한 보호를 제공하도록 충분히 면역원성인지의 여부를 결정하기 위해 연구를 수행하였다(이는 서열번호 6에 기재한 바와 같이 계대 52 바이러스와 본질적으로 동일함).
공급된 24마리의 PRRSV 음성혈청의 임신 암퇘지 중 총 22마리가 건강한 새끼돼지를 출산하였다. 이들 돼지(새끼돼지)를 할당량에 따라 대략 제1일령(제0일)에 근육내 주사로서 모의 백신 또는 P129-PKC12-FL 바이러스 백신의 1회 2.0㎖ 용량을 투여하였다. 한배 새끼/분만틀 내 모든 건강한 새끼 돼지에 동일한 날에 동일한 모의 백신(11마리의 한배 새끼, 100마리의 새끼 돼지) 또는 P129-PKC12-FL 바이러스 백신(11마리의 한배 새끼, 91마리의 새끼 돼지)을 투여하였다. 모의 백신접종 암퇘지 및 새끼돼지는 백신접종 기간 내내 PRRSV 음성인 채였다. 교란 질병 인자(confounding disease factor)는 검출되지 않았다. 1일령에 백신접종한 새끼돼지에서 안전성을 입증하기 위해 사용한 1차 변수는 백신접종 후의 임상적 관찰이었다. 혈청학을 사용하여 모든 새끼돼지의 성공적인 백신접종을 확인하였다.
백신접종 후 제1일 내지 제10일에 모든 새끼 돼지에 대해 임상적 관찰을 관찰하고, 기록하였다. 대조군 제품(T01)을 투여한 100마리 돼지(새끼 돼지) 및 시험 제품(T02)을 투여한 91마리 새끼돼지 중에서 각각 15마리 및 14마리 돼지가 정상이 아닌 것으로 관찰되었다(표 11, 이 구체적 실시예에서 번호 매긴 바와 같은 표를 참조). 정상이 아닌 것으로 관찰된 돼지는 비정상의 일반적 상태 및/또는 우울증을 갖는 것으로 더욱 나타났다.
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IDEXX ELISA는 모든 돼지가 백신접종 전에 PRRSV에 대해 음성이라는 것을 확인하였고(S/P 비 < 0.4), 모든 모의 백신 대조군은 이 연구의 백신접종 단계 동안 혈청학적으로 음성인 채로 있었다. 백신접종 후, P129-PKC12-FL 백신 그룹에서의 모든 돼지는 제21일 또는 제22일에 혈청양성이었다(S/P 비 > 0.4)(이하의 표 12).
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데이터는, 21일 또는 22일령에 이유를 통해 관찰하였을 때, 계대 57에서 약독화된 P129-PKC12-FL 바이러스가 음성 혈청 암퇘지가 출산한 새끼돼지에 1회 2㎖ IM 용량으로서 투여된 경우에 안전하다는 결과를 뒷받침한다.
시험감염 전에, 모의 백신접종하고, P129-PKC12-FL 바이러스 백신접종한 새끼돼지를 방 안의 우리에 재수용하였으므로(우리마다 동일한 백신접종 그룹으로부터의 2마리의 새끼돼지), 각각의 방은 각 백신접종 그룹으로부터 12개의 우리를 수용하였다. 백신접종 후 제7주, 제18주 또는 제26주에 악성 이종성 PRRS 단리물 NADC20으로 시험감염시켰다. 시험감염 용량은 2.27 log10 TCID50/㎖(2.87 log10 TCID50/4㎖ 용량)에서 NADC20 저장용액 4.0㎖(콧구멍마다 1.0㎖ + 2.0㎖ 근육내 주사)와 동일하였다. NADC-20은 USDA 국립 동물 질병 센터(미국 아이오와주 에임즈에 소재)의 켈리 라거(Kelly Lager) 박사에 의해 제공된 매우 악성인 악성 유전자형 2 PRRS 바이러스이다. NADC-20 ORF5 아미노산 서열은 P129-PKC12-FL에 대해 94.5% 동일하다.
질병 예방을 결정함에 있어서 1차적 변수는 병변을 지니는 폐의 백분율이었다. 검시 시(시험감염 후 10일) 폐 병변을 점수화하여, 각 폐엽(좌측 두개골, 좌측 허리, 좌측 꼬리, 우측 두개골, 우측 허리, 우측 꼬리 및 부속물)에 대한 응고화 백분율을 점수화하였고, 병변에 의해 관찰한 폐엽의 백분율로서 기록하였다.
백신접종 후 7주에, 병변을 지니는 폐의 백분율은 P129-PKC12-FL 바이러스 백신접종된 새끼돼지에 비해 모의 백신접종된 돼지에서 유의하게 더 컸다(P≤.0001)(표 13).
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백신접종 후 제18주에, 병변을 지니는 폐 백분율은 P129-PKC12-FL 바이러스 백신접종된 새끼돼지에 비해 모의 백신접종된 새끼돼지에서 유의하게 더 컸다(P≤.0001)(표 14).
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백신접종 후 26주에, 병변을 지니는 폐 백분율은 P129-PKC12-FL 바이러스 백신접종된 새끼돼지에 비해 모의 백신접종된 새끼돼지에서 유의하게 더 컸다(P≤.0001)(표 15).
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이 결과는 약독화된 백신 바이러스 P129-PKC12-FL이 1일령 새끼돼지에서 안전하고, 이례적으로 우수한 면역의 지속과 함께 강한 면역학적 반응을 유발할 수 있다는 것을 나타낸다. 1회 용량은 1일령 새끼돼지를 적어도 26주 동안 악성 이종성 PRRS 시험감염으로부터 보호한다.
1일령 새끼돼지에서의 안전성 및 PRRS 면역의 26주 지속의 이들 특성은, 1가 PRRSV 백신뿐만 아니라, 2가 PRRSV/마이코플라스마 하이오뉴모니애 백신, 2가 PRRSV/돼지 써코바이러스 2형(PCV2) 백신 및 3가 PRRSV/마이코플라스마 하이오뉴모니애/PCV2 백신과 같은 다가 조합 돼지 백신에 대해서도 유용하다.
실시예 10
P129- PKC12 -FL 바이러스로 이루어진 백신은 보호적 면역의 조기 개시를 제공한다.
기존의 변형된 생 PRRS 백신은 악성 PRRS 균주에 대한 노출 전 적어도 3 내지 4주에 백신접종이 권장된다. 이 시간 간격은 보호적 면역을 확립시키기 위하여 필요한 것으로 여겨진다. 본 명세서에 기재된 연구는, 악성 이종성 PRRS 바이러스 시험감염에 대해 유의한 보호가 P129-PKC12-FL 바이러스 백신 및 2개의 다른 상업적 PRRS 백신에 의한 백신접종 후 단지 14일만 전달되었다는 것을 입증한다. 백신접종 단계 동안, 18마리의 돼지(3주령)의 처리군은, 4개의 개별의 방에서 각각 6마리 동물의 우리에 수용하였다. 돼지(새끼 돼지)들에게 제조사의 설명서에 따라 대략 3주령(제0일)에 모의 백신(2㎖), 약독화된 P129-PKC12-FL 계대 57 바이러스 백신(2㎖ 용량에서 3.62 log10 TCID50), 인겔백 PRRS MLV 백신, 또는 인겔백 PRRS ATP 백신의 1회 근육내 주사를 투여하였다.
시험감염 전, 모든 남아있는 동물을 각각 3마리 동물의 우리에 재수용하였고, 하나의 비어있는 우리는 각각의 사용되고 있는 우리 사이에 있으며, 각 처리군으로부터의 다수의 동물 우리를 각각 4개의 방에 수용하였다. 대략 5주령(제14일)에 악성 이종성 PRRS 단리물 NADC20으로 시험감염시켰다. 시험감염 용량은 2.07 log10 TCID50/㎖(2.67 log10 TCID50/4㎖ 용량)에서 NADC20 저장 용액 4.0㎖(콧구멍 당 1.0㎖ + 2.0㎖ 근육내 주사)와 동일하였다.
질병 감소를 결정함에 있어서의 주된 변수는 모의 백신그룹에 대한 백신접종 그룹에서의 폐 병변 백분율이었다. 모의 백신접종 그룹과 비교할 때 모든 백신접종 그룹(P129-PKC12-FL, P=0.0177; 인겔백 PRRS ATP, P=0.0255; 인겔백 PRRS MLV, P=0.0137) 간에 유의한 차이가 확인되었다. 백신접종한 그룹을 서로 비교한 경우에는 유의한 차이가 확인되지 않았다(표 16).
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이들 결과는 백신접종 후 14일까지 부분적 면역 및 질병의 감소를 유발하는 변형된 생 PRRS 바이러스 백신의 일반적 특성일 수 있다는 것을 입증한다. 이 특성은 돼지(새끼돼지)에서 조기 획득된 면역(예를 들어, 특이적 항체 및 세포독성 T 세포), 선천성 면역(예를 들어, 유도된 인터페론 및 자연살해 세포) 및/또는 제한된 수의 허용적 숙주 세포(예를 들어, 폐포 대식세포)에 대한 백신 바이러스와 시험감염 바이러스 간의 경쟁의 조합으로부터 초래될 수 있다. 메커니즘(들)에 상관없이, 이 특성은 자연적 또는 의도적 PRRS 감염(예컨대, 새로 이주한 교체 어린 암퇘지의 악성 PRRS의 풍토성 농장 균주에 의한 의도적 노출)과 관련된 질병으로부터 돼지를 보호하는데 이용될 수 있다.
따라서, 상기한 바와 같이, PRRS 면역의 조기 개시의 이런 특성은, 1가 PRRSV 백신뿐만 아니라, 2가 PRRSV/마이코플라스마 하이오뉴모니애 백신, 2가 PRRSV/돼지 써코바이러스 2형(PCV2) 백신 및 3가 PRRSV/마이코플라스마 하이오뉴모니애/PCV2 백신과 같은 다가 조합 돼지 백신에 대해서도 유용하다. 본 발명의 실시에 유용한(즉, 새끼돼지가 1일령일 때 일찌감치 조기의 안전한 백신을, 선택적으로 이후 2주에 면역의 개시와 함께 제공하기 위한) 이러한 백신의 성분에 대해, 2012년 4월 4일 출원된 니첼(Niztel) 등의 미국 특허 가출원 제61/620189호(발명의 명칭: PCV/Mycoplasma hyopneumoniae/PRRSZ Combination Vaccine)에 기재된 것과 같은 모든 조합 백신 성분이 참조될 수 있으며, 이 문헌의 완전하고 전체적인 개시내용은 그의 전문이 제시되는 것과 같이 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명의 실시에서 사용될 수 있는(즉, 새끼돼지가 1일령일 때 일찌감치 조기의 안전한 백신을, 선택적으로 이후 2주에 면역의 개시와 함께 제공하기 위한) 구체적 PRRS 백신(또는 PRRS 백신 균주)과 관련하여, 문헌[Murtaugh et al., Vaccine, vol 29, pp.8192-8204, (2011)]의 표 1(이 문헌의 8196 페이지 참조)을 주목할 수 있고, 여기서 인겔백 PRRS MLV, 인겔백 PRRS ATP 및 수백신(Suvaxyn) PRRS(아이오와주 균주 ISU-55로부터 유래됨)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 수많은 이러한 바이러스/백신이 동정되어 있다. 상기 언급한 성능 특징을 제공하는 백신은 또한 약 6개월의 면역 기간의 지속을 제공할 것으로 예상된다는 것을 주목하여야 한다.
생물학적 시료의 기탁
다음의 생물학적 시료(또한 미국 특허 제6,500,662호 참조)는 1998년 11월 19일에 미국 버지니아주 20110-2209 매너서스 블루버드 유니버시티 10801에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC)에 기탁되었으며, 다음의 수탁번호를 부여받았다.
플라스미드 pT7P129A, 수탁번호 203488
플라스미드 pCMV-S-P129, 수탁번호 203489
다음의 미국 특허들의 완전한 본문 및 개시내용은, 충분히 기술되는 것처럼, 본 명세서에 참조로 포함된다: 미국 특허 제6,500,662호 및 미국 특허 제7,618,797호.
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 ATCC203488 19981119 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 ATCC203489 19981119
<110> ZOETIS LLC <120> EFFECTIVE VACCINATION AGAINST PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME (PRRS) VIRUS PRIOR TO WEANING <130> PC71939A <140> PCT/US2013/041118 <141> 2013-05-15 <150> 61/648,461 <151> 2012-05-17 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P129-PK-FL passage 17 complete genome (15,450 nt) full length infectious clone <400> 1 atgacgtata ggtgttggct ctatgccacg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60 ggcacagccc aaaacttgct gcacggaaaa cgcccttctg tgacagcctt cttcagggga 120 gcttaggggt ctgtccctag caccttgctt ctggagttgc actgctttac ggtctctcca 180 cccctttaac catgtctggg atacttgatc ggtgcacgtg cacccccaat gccagggtgt 240 ttatggcgga gggccaagtc tactgcacac gatgtctcag tgcacggtct ctccttcctc 300 tgaatctcca agttcctgag cttggggtgc tgggcctatt ttataggccc gaagagccac 360 tccggtggac gttgccacgt gcattcccca ctgtcgagtg ctcccctgcc ggggcctgct 420 ggctttctgc gatctttcca attgcacgaa tgaccagtgg aaacctgaac tttcaacaaa 480 gaatggtgcg ggttgcagct 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Lys 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 3019, ORF1a: 943, Nsp2: 560, passage 0 amino acid <400> 31 Ala Pro Met Tyr Gln Asp Glu 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 3019, ORF1a: 943, Nsp2: 560, passage 17 amino acid <400> 32 Ala Pro Met Cys Gln Asp Glu 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 3019, ORF1a: 943, Nsp2: 560, passage 52 amino acid <400> 33 Ala Pro Met Cys Gln Asp Glu 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 4477, ORF1a: 1429, Nsp3: 72, passage 0 amino acid <400> 34 Cys Ala Pro Lys Gly Met Asp 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 4477, ORF1a: 1429, Nsp3: 72, passage 17 amino acid <400> 35 Cys Ala Pro Thr Gly Met Asp 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 4477, ORF1a: 1429, Nsp3: 72, passage 52 amino 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Sequence <220> <223> genome position 14,578, ORF6: 74, passage 52 amino acid <400> 54 Val Ala Leu Ala Met Gly Ala 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 14,780, ORF6: 141, passage 0 amino acid <400> 55 Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 14,780, ORF6: 141, passage 17 amino acid <400> 56 Pro Gly Ser Ile Thr Val Asn 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 14,780, ORF6: 141, passage 52 amino acid <400> 57 Pro Gly Ser Ile Thr Val Asn 1 5

Claims (11)

  1. 북미 또는 중국 돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome: PRRS) 바이러스에 대해 돼지 동물에서 유효한 면역보호 반응을 야기시키는 방법으로서,
    천연 돼지 CD163 수용체를 발현하는 숙주 세포에서 생 북미 또는 중국 PRRS 바이러스를 배양하는 단계; 및
    (a) 상기 배양된 생 북미 또는 중국 PRRS 바이러스;
    (b) 상기 PRRS 바이러스 (a)를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자;
    (c) 상기 PRRS 바이러스 (a)를 암호화하는 감염성 RNA 분자;
    (d) 플라스미드 형태의 상기 폴리뉴클레오타이드 분자 (b); 및
    (e) 상기 감염성 RNA 분자 (c)를 포함하는 바이러스 벡터
    로 구성된 군에서 선택되는 백신 조성물을 감염에 대한 면역보호를 야기시키는 데 유효한 양으로, 수의과적 용도에 적합한 담체와 함께, 출생 후 12시간 내지 2주령 사이의 상기 동물에 백신접종하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    제공되는 보호 면역이 26주까지 지속되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    백신의 배양된 생 바이러스가, 서열번호 6, 또는 65℃에서 0.5M NaHPO4, 7% 도데실 황산나트륨(SDS), 1mM EDTA 중에서의 필터 결합된 DNA에 대한 혼성화 및 68℃에서 0.1 x 샐린 시트르산나트륨(saline sodium citrate: SSC)/0.1% SDS 중에서의 세척으로 정의된 고도로 엄격한 조건 하에서 상기 서열번호에 혼성화되는 임의의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    백신접종 시 돼지 동물이 1일령인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    백신 조성물이, 2가 PRRS 바이러스/마이코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 백신, 2가 PRRS 바이러스/돼지 써코바이러스 2형(Porcine Circovirus type 2: PCV2) 백신 및 3가 PRRS 바이러스/마이코플라스마 하이오뉴모니애/PCV2 백신으로 구성된 군에서 선택되는 조합 백신인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    백신접종 후 늦어도 14일까지는 보호 면역이 발생하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 보호 면역이, 출생 제1일에 백신접종 후 늦어도 제15일, 출생 제7일에 백신접종 후 늦어도 제21일 또는 출생 제14일에 백신접종 후 늦어도 제28일까지는 발생하는, 방법.
  8. 돼지 동물의 백신접종을 위한 PRRS 바이러스의 능력을 최적화하여 돼지 동물에서 조기 면역 보호를 촉발하는 방법으로서,
    천연 돼지 CD163 수용체를 발현하는 숙주 세포에서 백신 바이러스를 배양하는 단계, 및
    상기 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 출생 후 12시간 내지 2주령 사이의 돼지 동물에 백신접종하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 출생 후 12시간 내지 2주령 사이의 돼지 동물의 백신접종에 사용하기 위해 변형된 PRRS 바이러스를 제조하는 방법으로서,
    천연 돼지 CD163 수용체를 발현하는 숙주 세포에서 백신 바이러스를 배양하여, 돼지 세포를 감염시키고 돼지 동물에서 조기 면역 보호를 촉발하는 PRRS 바이러스의 능력을 최적화하는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    백신접종 시 돼지 동물이 1일령인, 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    백신접종 시 돼지 동물이 1일령인, 방법.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA108902C2 (uk) * 2010-11-10 2015-06-25 Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (prrs) та його застосування
US9120859B2 (en) 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
JP6386999B2 (ja) 2012-05-17 2018-09-05 ゾエティス・エルエルシー ブタ生殖および呼吸症候群（ｐｒｒｓ）ウイルスに対する離乳前の効果的なワクチン接種
EA039060B1 (ru) 2013-12-20 2021-11-29 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх Вариант вируса ppcc, способ его получения с помощью молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции днк или клетки и его применение для лечения и профилактики ррсс
CN105087506B (zh) * 2015-03-20 2020-06-30 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用
EP4361279A3 (en) 2015-08-06 2024-07-17 The Curators of the University of Missouri Pathogen-resistant animals having modified cd163 genes
AU2015404563B2 (en) * 2015-08-06 2022-11-17 The Curators Of The University Of Missouri Pathogen-resistant animals having modified CD163 genes
WO2018024677A1 (en) * 2016-08-05 2018-02-08 Hipra Scientific, S.L.U. PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS cDNA CLONE AND USES THEREOF
BR112019010830A2 (pt) * 2016-11-30 2019-10-01 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc vacinas atenuadas de influenza suína e métodos de produção e uso das mesmas
CN110072547B (zh) * 2016-12-14 2024-04-30 硕腾服务有限责任公司 断奶前对抗欧洲猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒株的有效疫苗接种
US11160260B2 (en) 2018-04-17 2021-11-02 The Curators Of The University Of Missouri Methods for protecting porcine fetuses from infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
CN110055251B (zh) * 2019-04-25 2022-05-27 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种调控pcv2病毒增殖的序列及其应用
JPWO2020261952A1 (ko) 2019-06-27 2020-12-30
CN110862435B (zh) * 2019-12-05 2021-09-24 中国农业大学 非洲猪瘟ctl表位多肽及其应用
CN111996213A (zh) * 2020-02-06 2020-11-27 广西大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法
KR102646305B1 (ko) * 2021-03-04 2024-03-13 주식회사 이노백 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방을 위한 다가 백신 조성물
WO2024032805A1 (en) * 2022-08-12 2024-02-15 Zhejiang University Recombinant porcine coronavirus
CN116284454B (zh) * 2023-03-15 2023-11-21 中国科学院微生物研究所 用于预防猪繁殖与呼吸综合征的融合蛋白组合物及其相关生物材料与应用

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3137631A (en) 1959-12-01 1964-06-16 Faberge Inc Encapsulation in natural products
US3519710A (en) * 1967-08-10 1970-07-07 Edmund P Bass Direct active modified live virus vaccine immunization against transmissible gastroenteritis in swine piglets at birth
US3959457A (en) 1970-06-05 1976-05-25 Temple University Microparticulate material and method of making such material
JPS5186117A (en) 1975-01-27 1976-07-28 Tanabe Seiyaku Co Johoseibiryushiseizainoseiho
US4205060A (en) 1978-12-20 1980-05-27 Pennwalt Corporation Microcapsules containing medicament-polymer salt having a water-insoluble polymer sheath, their production and their use
US4452747A (en) 1982-03-22 1984-06-05 Klaus Gersonde Method of and arrangement for producing lipid vesicles
US4744933A (en) 1984-02-15 1988-05-17 Massachusetts Institute Of Technology Process for encapsulation and encapsulated active material system
US5008050A (en) 1984-06-20 1991-04-16 The Liposome Company, Inc. Extrusion technique for producing unilamellar vesicles
US4921706A (en) 1984-11-20 1990-05-01 Massachusetts Institute Of Technology Unilamellar lipid vesicles and method for their formation
US4606940A (en) 1984-12-21 1986-08-19 The Ohio State University Research Foundation Small particle formation and encapsulation
US5009956A (en) 1987-02-24 1991-04-23 Univ Minnesota Phospholipase A2-resistant liposomes
US4927637A (en) 1989-01-17 1990-05-22 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US4944948A (en) 1989-02-24 1990-07-31 Liposome Technology, Inc. EGF/Liposome gel composition and method
US5132117A (en) 1990-01-11 1992-07-21 Temple University Aqueous core microcapsules and method for their preparation
HU218431B (hu) 1991-06-06 2000-08-28 Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut A rejtélyes sertésvészt okozó Lelystad-vírus, a vírusból származtatható polipeptidek, antigének és nukleinsavak és rejtélyes sertésvész elleni vakcinakészítmények
DK0601062T4 (da) 1991-08-26 2001-03-14 Univ Minnesota SIRS-vaccine og diagnosefremgangsmåde
US5846805A (en) * 1991-08-26 1998-12-08 Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells
MX9204885A (es) * 1991-08-26 1994-05-31 Boehringer Animal Health Inc Composicion de vacuna que comprende virus del sindrome de infertilidad y respiratorio de los cerdos.
US6982160B2 (en) * 1991-08-26 2006-01-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions that include SIRS virus
US6042830A (en) 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
US6592873B1 (en) 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
US6380376B1 (en) * 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6251397B1 (en) 1992-10-30 2001-06-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same
US20040087521A1 (en) 1993-03-18 2004-05-06 Merck & Co., Inc. Nucleic acid pharmaceuticals-influenza matrix
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
US5789543A (en) 1993-12-30 1998-08-04 President And Fellows Of Harvard College Vertebrate embryonic pattern-inducing proteins and uses related thereto
CA2187768A1 (en) 1994-04-15 1995-10-26 Moser, Charlotte A. Aqueous solvent encapsulation method, apparatus and microcapsules
DE69532369T3 (de) 1994-07-18 2010-11-04 Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr. Rekombinantes infektiöses nicht-in-Segmente-geteiltes, negativ-Strange-RNS-Virus
CA2196555C (en) 1994-08-05 2012-07-03 Michael P. Murtaugh Vr-2332 viral nucleotide sequence and methods of use
ES2102971B1 (es) * 1996-01-25 1998-03-01 Hipra Lab Sa Nueva cepa atenuada del virus causante del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs), las vacunas y medios de diagnostico obtenibles con la misma y los procedimientos para su obtencion.
US5866401A (en) * 1996-03-01 1999-02-02 Schering Corporation Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
JPH09313188A (ja) 1996-05-31 1997-12-09 Kazuaki Chayama Ｇ型肝炎ウイルス遺伝子
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
WO1998055626A2 (en) 1997-06-05 1998-12-10 Origen, Inc. Recombinant porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) for use as a vaccine
AUPO856097A0 (en) * 1997-08-14 1997-09-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Vector
US5951977A (en) * 1997-10-14 1999-09-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Competitive exclusion culture for swine
US7691389B2 (en) * 1998-12-22 2010-04-06 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7132106B2 (en) * 1998-12-22 2006-11-07 Pfizer Inc. Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
NZ513289A (en) * 1998-12-22 2003-04-29 Pfizer Prod Inc Infectious cDNA clone of north american procine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7618797B2 (en) * 1998-12-22 2009-11-17 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US6943152B1 (en) * 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
MXPA03007751A (es) * 2001-03-09 2004-11-12 Boehringer Ingelheim Vetmed Cepas vivas atenuadas del virus prrs.
BRPI0508928B1 (pt) 2004-04-23 2015-10-06 Pah P & U Llc Processo de falicitação da infecção de uma célula de vertebrado por PRRSV e para medir a propensão de uma linhagem de células teste à referida infecção
KR100863381B1 (ko) * 2004-04-23 2008-10-13 파마시아 앤드 업존 캄파니 엘엘씨 바이러스에 대한 세포성 증식 허용성 인자, 및 이의 용도
KR100996105B1 (ko) * 2005-02-25 2010-11-22 화이자 프로덕츠 인크. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ｎ 단백질돌연변이체
UA95778C2 (ru) 2005-06-24 2011-09-12 Риджентс Оф Зе Юниверсити Оф Миннесота Вирусы репродуктивно-респираторного синдрома свиней, их инфекционные клоны и мутанты и способы применения
US8398994B2 (en) * 2005-07-15 2013-03-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Lawsonia vaccine and methods of use thereof
US8202717B2 (en) * 2007-01-12 2012-06-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Non-simian cells for growth of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus
TW200914043A (en) * 2007-04-30 2009-04-01 Mj Biolog Inc PRRSV GP5 based compositions and methods
CA2694476C (en) 2007-07-27 2017-06-27 Universiteit Gent Permissive cells and uses thereof
CN101280292B (zh) * 2008-05-13 2010-10-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株、其弱毒疫苗株及其应用
UA108902C2 (uk) * 2010-11-10 2015-06-25 Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (prrs) та його застосування
EA038012B1 (ru) * 2011-02-17 2021-06-23 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх Композиция на основе нового штамма prrsv или его белков, продукт, их применение, вирус prrsv, выделенная нк и рекомбинантный вектор экспрессии для получения этого вируса
JP6386999B2 (ja) * 2012-05-17 2018-09-05 ゾエティス・エルエルシー ブタ生殖および呼吸症候群（ｐｒｒｓ）ウイルスに対する離乳前の効果的なワクチン接種
CN110072547B (zh) * 2016-12-14 2024-04-30 硕腾服务有限责任公司 断奶前对抗欧洲猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒株的有效疫苗接种

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
청려원 동물건강 증진센터 인터넷 게시물 (2009.11.05.)*

Also Published As

Publication number Publication date
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MX2014013964A (es) 2015-03-04
PH12014502534A1 (en) 2015-01-21
WO2013173443A1 (en) 2013-11-21
US20170136117A1 (en) 2017-05-18
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